Procédures modérées

Déjà exploitées dans un projet précédent, 5 femelles macaques à longue queue vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis pourront être réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire. Sous anesthésie, elles reçoivent dans le nez un anticorps antiviral radiomarqué, passent en imagerie scintigraphique, subissent des lavages nasaux et sont intubées sous assistance respiratoire pendant une heure. Les prises de sang s'étalent de quinze minutes à quatre semaines après l'inhalation, une partie sans anesthésie, sous contention pour les femelles qui refusent l'entraînement par renforcement positif. Le porteur affirme que le principe de remplacement "est appliqué", en citant des répliques de cavités nasales de macaque qui permettent de calibrer les expériences sur ces 5 femelles.

Objectifs

Selon l’organisation mondiale de la santé, les infections des voies respiratoires basses demeurent la maladie transmissible qui fait le plus de morts dans le monde, et se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité. Ces infections dues, entre autres, à des virus respiratoires entraînent des millions d’hospitalisations chaque année et est une cause importante de décès chez les personnes fragiles (âgées, jeune enfant…). Face à l’hésitation vaccinale, la moindre efficacité des vaccins dans certaines populations et l’émergence et une propagation rapide des virus pharmaco-résistants, de nouveaux traitements sont nécessaires pour contrôler les infections virales respiratoires. Pour de nombreux virus respiratoires, comme celui de la grippe, le virus respiratoire syncitial et celui de la Covid-19, les cavités nasales sont le site d’entrée, de réplication primaire du virus, et constitue un réservoir pour la transmission du virus aux poumons, où l’infection peut provoquer une pneumonie potentiellement mortelle. Le contrôle de la réplication des virus respiratoires et de l’infection dans les cavités nasales offre donc une réelle opportunité de limiter les pneumonies lorsqu’une épidémie émerge. Aujourd’hui, de nombreuses biothérapies à visée intranasale (protéines et vaccins) sont en cours de développement ou commercialisés pour diverses applications. S’appuyant sur des décennies de recherche translationnelle en immunothérapie sur les infections respiratoires, en ingénierie des anticorps et en inhalation le but de ce projet européen est de développer des traitements inhalables (par voie intranasale), à base d’anticorps contre différents virus respiratoires (grippe, COVID) afin de bloquer l’infection dans les cavités nasales. Plus concrètement, cela implique : 1/ d’évaluer le dépôt de l’anticorps dans les voies respiratoires après inhalation par voie intranasale chez le primate non humain afin de déterminer la dose délivrée dans les cavités nasales et 2/ d’analyser le devenir et l’impact de l’anticorps inhalé dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’impact sociétal potentiel du projet est immense. La prévention des décès et des hospitalisations dus aux virus respiratoires avec des anticorps inhalés aura un avantage direct pour la santé humaine et un potentiel économique et sociétal important. Cette approche anticorps/voie intranasale offrirait une opportunité de mieux contrôler les épidémies. L’approche par inhalation intranasale avec des anticorps capables de neutraliser différentes virus respiratoires est très attractive pour limiter la transmission entre personnes et pour prévenir des pneumonies sévères.

Procédures

- Pose des points de repère spatiale : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Mesure du coefficient d’atténuation des cavités nasales : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Administration par voie intranasale de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 1 minute au total - Imagerie scintigraphique du dépôt dans les voies respiratoires de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 15 minutes - Intubation par sonde intratrachéale : sera réalisée à l’occasion des gestes nécessitant l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane- le geste lui-même dure environ 2 minutes mais les animaux seront intubés et sous assistance respiratoire pendant 1 heure. - Prélèvements sanguins : sous anesthésie–5-10 minutes par prise de sang Et sur animaux vigiles – 5-10 minutes par prise de sang. - Lavage nasal : sous anesthésie 5 -10 minutes par lavage.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié quelques nuisances attendues/prévues : - Stress causé par la contention et manipulation des animaux, - Douleur causée par l’injection d’anesthésiques chimiques De plus, nous avons identifié des facteurs engendrant des potentiels effets indésirables/secondaires : l’utilisation d’anesthésiques pouvant éventuellement entraîner des troubles cardio-respiratoires, des hématomes lors des prises de sang, une irritation locale lors de l’inhalation par voie intranasale de l’anticorps radiotracé et lors des lavages nasaux.

Devenir

Au vu de l'espèce utilisé dans ce projet et de la classification de la gravité de la procédure (moderée), les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire réferent.

Remplacement

Le principe de remplacement de la règle de bien-être animal est appliqué. En effet, les résultats in vitro préalables à l’utilisation des animaux, notamment l’utilisation de répliques anatomiques de cavités nasales macaques, nous permettrons de calibrer les différentes expériences in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire et d’utiliser d’emblée des posologies et modalités d’administration adaptées.

Réduction

Les animaux seront réutilisés d’un autre projet, mais naïfs vis-à-vis de l’anticorps anti-viral. L'étude est réalisée sur un effectif réduit (n=5) et servira à obtenir des données qualitatives, sans analyse statistique, du devenir et de l’impact de l’anticorps inhalé. Comme indiqué dans la saisine, les temps de prélèvements (sanguin et nasal) pourront varier selon les animaux car ils seront ajustés, au cours de l'étude, sur la base des données issues des premiers animaux. Une analyse statistique n'apparaît donc pas compatible compte tenu du n faible à chacun des temps (n

Raffinement

Pour réduire au maximum l’utilisation d’anesthésiques, du renforcement positif est inclus pour les prélèvements sanguins (PS) à T3h-72h post-inhalation (PS sans lavage nasal concomitant). A ces temps les PS seront réalisés sur animaux vigiles sans contention uniquement sur les animaux répondants car, d’après des études, certains animaux n’adhèrent pas à ce type de démarche même après plusieurs semaines d’entrainement. Pour les animaux non réceptifs les PS seront réalisés sur animal vigile mais immobilisé par contention. Le renforcement n’est pas envisagé pour les PS aux temps T15min->T60min car le respect de ces temps précis est primordial pour l’analyse pharmacocinétique. Il n’est pas envisagé pour les lavages nasaux pour des questions de sécurité du personnel car, d’après les zootechniciens, il est difficile d’entrainer un PNH à accepter l’administration nasale d’un soluté et d’en récupérer un volume. Ce geste sur un animal non coopérant amène des questions de sécurité (risque morsures). La totalité des lavages nasaux se fera donc sur des animaux anesthésiés avec des molécules et dosages adaptés. Enfin, vu que les lavages nasaux impliquent une anesthésie nous réaliserons les PS aux temps T0, T1sem, T2sem, T3sem, T4sem durant l’anesthésie. Pour réduire la douleur et éviter des hématomes la taille de l’aiguille sera adaptée et un point de compression sera appliqué. Si insuffisance respiratoire des mesures d’oxygénothérapie et réanimation seront mis en place. Pour réduire le risque d’irritation locale, la taille des embouts narinaires sera adaptée et les lavages seront réalisés avec soin. Au cours de l’anesthésie prolongée : -Gel oculaire pour prévenir la sècheresse des yeux - Humidification et réchauffement des voies aériennes par filtre échangeur d’humidité chaleur - Sonde d’intubation de taille adaptée avec ballonnet pour éviter une lésion trachéale et garantir une bonne ventilation. - Tapis chauffant pour maintien d’une température - Fluides de remplacement (solution isotonique) après des PS multiples. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 et de 2 dans 2 volières conformes aux normes en vigueur. Ils disposent dans leur hébergement de plateformes surélevées, de tunnels, de jouets et de piscine. L’alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises. La nourriture pourra être cachée dans des jouets pour stimuler la recherche alimentaire. Les friandises distribuées sont différentes d’un jour à l’autre.

Choix des espèces

Le primate non humain est une espèce de référence pour les études de dépôt de particules inhalées dans le tractus respiratoire, permettant de mettre en place différentes conditions de ventilation et d’utiliser des dispositifs à qui seront directement utilisés chez l’homme. Le choix de l’espèce macaque se justifie par : - La tenue bipède, la morphologie du nez et le volume des cavités nasales. La tenue assise lors de l’administration de la molécule et la taille du nez permet l’utilisation de dispositif à visée humaine avec un embout adapté. Le volume des cavités nasales est compatible avec les volumes administrés avec les différents dispositifs. - Proximité anatomique de l’espèce. Les cavités nasales des macaques sont plus similaires à celle de l’homme, que celles d’autres espèces. - Proximité physiologique de l’espèce. La morphologie et la distribution de l’épithélium nasal (où se réplique le virus de la grippe et cible de l’anticorps) chez le macaque est plus proche de celles de l’homme que celles d’autres espèces (rongeurs, chiens) - Similarité des réponses immunologiques et biologique avec l’humain, faisant du PNH une espèce de référence pour les études réglementaires avec des anticorps thérapeutiques. 5 animaux adultes de 3-4 kg réutilisés de projets précédents après accord du vétérinaire référent.

Pour tester un peptide anticancéreux sur une leucémie lymphoïde aiguë, 100 souris immunodéficientes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules leucémiques, jusqu'à seize séances d'imagerie hebdomadaires et autant d'injections sous anesthésie générale, jusqu'à trente injections de traitement et deux prélèvements sanguins, sur une durée pouvant atteindre seize semaines. Le porteur affirme qu'aucune nuisance spécifique n'est attendue de l'injection de cellules tumorales dans le sang "vu la durée de maintien des animaux en procédure", tout en indiquant plus loin que tous les animaux seront porteurs de tumeurs au moment de leur mise à mort. Il écrit être arrivé au stade où l'évaluation du peptide chez la souris devient "indispensable", alors que la molécule a déjà montré son efficacité chez l'être humain sur des tumeurs solides.

Objectifs

Le laboratoire développe des peptides, petites molécules qui ont la capacité de perturber les mécanismes de mort cellulaire. L'un de ces peptides a déjà montré son efficacité sur des tumeurs solides chez la souris mais également chez l'être humain et son mode d'action et les premiers résultats in vitro nous amènent à envisager une efficacité sur les cancers du sang, telles que les leucémies lymphoïdes aiguês. Après avoir mis en place le modèle de croissance tumorale et le suivi en imagerie d'une lignée cellulaire de leucémies lymphoïde aiguê, nous sommes arrivés au stade où l'évaluation du peptide sur un modèle de souris de la maladie est indispensable. Ceci pourra potentiellement améliorer la stratégie de prise en charge de ce type de cancer en élargissant l'éventail thérapeutique proposé aux patients.

Bénéfices attendus

Si une efficacité de notre peptide est établie sur ce modèle in vivo, cela permettra d'élargir son utilisation aux tumeurs liquides et d'orienter son développement clinique, au bénéfice des patients concernés par cette maladie.

Procédures

Injection : 1 par souris, durée 1 min sous anesthésie. Suivi en imagerie 1 fois par semaine pendant 16 semaines maximum, soit 16 séances/souris. Elles durent entre 5 et 15 min. Injection pour imagerie: 1 fois par semaine pendant 16 semaines soit 16 injections/animal sous anesthésie générale. Ce geste dure moins de 30 sec. Traitement médicamenteux par injection, sous anesthésie locale, 5 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines (selon l'efficacité du traitement), soit 30 injections/souris max. Cette injection dure moins de 30 secondes. Prélèvements de sang: n=2, durée 2 minutes, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang entraîneront un stress physique léger et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légères et transitoires (injections sous anesthésie locale ou générale). Les séances d'imagerie entraineront une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). Aucune nuisance spécifique n'est attendue de l'injection de cellules tumorales dans le sang (tumeurs hémtatologiques) vu la durée de maintien des animaux en procédure.

Devenir

En fin de procédures, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et pour examen sur cellules et tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier, les interactions avec le microenvironnement, la dissémination métastatique, ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ce modèle animal va permettre d'étudier l’efficacité de la molécule testée sur la leucémie lymphoïde aiguë afin de proposer le meilleur traitement aux patients lors d’études cliniques.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, 2 concentrations cellulaires sont suffisantes pour optimiser le schéma de croissance tumorale. Cette étape permettra également d'optimiser le protocole de bioluminescence, non décrits dans la littérature. De même, 2 doses de la molécule d'intérêt seront suffisantes pour évaluer l'efficacité du traitement, car notre molécule a déjà montré son efficacité sur d'autres types tumoraux. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés pour chaque étape du projet.

Raffinement

Le suivi par imagerie permet une évaluation précise et précoce de la croissance tumorale. Les souris sont greffées sous anesthésie générale par inhalation ou par anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les administrations intraveineuses et intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limite précis ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté. L'atteinte d'un point limite entraînera l'euthanasie de l'animal sous 24h.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine. La leucémie lymphoïde aiguë est un cancer qui touche essentiellement les enfants. Les animaux seront utilisés à partir de 4-5 semaines.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par injection intranasale de lipopolysaccharides, de bléomycine ou d'élastase sous anesthésie, puis elles reçoivent des candidats médicaments dont le mode d'administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du "sponsor". Le porteur écrit que l'injection intranasale "ne provoquera pas de nuisance" et que le principal effet indésirable se limite à une modification de la respiration, alors qu'il décrit par ailleurs une maladie d'issue fatale par insuffisance respiratoire. Il annonce aussi que l'administration des candidats médicaments "aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie", ce qui pose comme acquis le résultat que l'étude est censée établir.

Objectifs

Les maladies pulmonaires sont généralement associées à une inflammation des voies respiratoires. Parmi les plus graves on retrouve la fibrose pulmonaire, caractérisée par une détérioration progressive du tissu pulmonaire conduisant à une inflammation généralisée et à la formation de cicatrices pulmonaires. Cette pathologie perturbe les échanges gazeux du poumon entraînant une insuffisance respiratoire à l'issue fatale. Elle affecte environ 3 millions de personnes dans le monde, et son taux moyen de survie est de 3 à 5 ans avec un âge moyen de début de 66 ans (75% ont plus de 65 ans). De nombreux facteurs de risque sont décrits, à commencer par la fumée de cigarette, les maladies de reflux gastro-œsophagien, ou certains agents infectieux. Si les risques sont identifiés, les causes sont encore inconnues. Le diagnostic de la fibrose est souvent difficile. Il nécessite la corrélation de plusieurs observations issues des examens physiques et de l’historique physiopathologique précis du patient, parfois associés à une biopsie pulmonaire ou à un lavage broncho-alvéolaire. Aucun traitement n’est actuellement disponible. Seuls certains médicaments sont utilisés pour freiner l’avancée de la maladie, mais ils ne sont que de faible efficacité. L’ultime recours est la greffe pulmonaire mais ne permet, en cas de succès, qu'un léger rallongement de l’espérance de vie. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments sur des modèles murins de fibrose pulmonaire induits par un agent inflammatoire (lipopolysaccharides ou bléomycine ou élastase) injecté par voie intranasale. Les candidats médicaments à tester seront administrés en curatif ou préventif et plusieurs voies d’administration seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés dans le modèle murin utilisé. Ce projet prévoit 240 souris par an soit 1200 animaux sur la totalité du projet.

Bénéfices attendus

Ces pathologies étant incurables, il est donc nécessaire de pouvoir évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques ou cellulaires pour mieux traiter ces pathologies. Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la fibrose pulmonaire afin de répondre à un besoin important de santé. Plusieurs voies d’administration des candidats médicaments seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression des manifestations cliniques de la fibrose pulmonaire.

Procédures

L'injection intranasale permettant l'induction de la fibrose pulmonaire sera réalisée sous anesthésie générale. Au moment du réveil de l'anesthésie, tous les animaux seront réhydratés. Le jour de l'euthanasie, un analgésique sera injecté au moins 30 minutes avant la mise à mort. Un prélèvement de sang pourra être réalisé 1 fois par semaine, selon la demande du sponsor. Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor. En point final, un prélèvement de sang, un lavage bronchoalvéolaire et d'autres organes/fluides pourront être collectés après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo.

Impact sur les animaux

L'injection intranasale ne nécessitant pas l'introduction de corps étranger dans la cavité nasale, ce mode d'administration ne provoquera pas de nuisance. Le principal effet indésirable induit par ce modèle murin est une modification de la respiration des animaux. L'administration des candidats médicaments aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin de l'étude et des prélèvements seront réalisés post-mortem.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la fibrose pulmonaire. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non- paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Une étude se composera de 5 groupes de 12 souris, soit 60 souris par étude. Au sein de chaque groupe, la moitié des souris (n=6) sera dédiée à une étude histologique et l'autre moitié (n=6) à une étude cellulaire, biochimique, moléculaire sur les différents prélèvements effectués. A raison de 4 études par an, ce projet nécessitera donc 240 souris par an, soit 1200 souris pour la durée totale du projet.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Nous utiliserons un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des animaux suite à l'anesthésie. Lors du réveil de l'anesthésie, les souris seront réhydratées par voie sous-cutanée avec une injection de NaCl chauffée à température corporelle. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle murin dans l’étude des maladies pulmonaires est très fortement documentée. Il est impossible d’explorer l’ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. L’approche cellulaire reste cependant absolument nécessaire pour la validation des cibles et la mise en évidence de la première preuve de concept d’efficacité. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 7 semaines car leur système immunitaire est mature.

Tous tués à l'issue d'une opération unique, 190 souris et 20 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques d'un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels à la chirurgie expérimentale. Chaque animal reçoit d'un stagiaire une injection d'anesthésique et une injection d'analgésique, subit une intervention pouvant durer deux heures trente, avec un risque d'hémorragie en cas de mauvaise hémostase ou de souffrance en cas de monitoring insuffisant de l'anesthésie, puis est mis à mort. Le porteur justifie cette mise à mort par le fait que le suivi post-opératoire ne peut pas être intégré à la formation et qu'aucun autre projet ne prévoit d'utiliser les animaux opérés. Il décrit cinq heures de travaux pratiques préalables sur substituts synthétiques, cuisses de poulet et cadavres de rongeurs, avant de conclure que l'apprentissage sur tissus vivants reste "indispensable" et que la Commission nationale de l'expérimentation animale impose le recours à des animaux vivants.

Objectifs

L’objectif du projet est la formation obligatoire des personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales dans le cadre des projets scientifiques, plus précisément la partie travaux pratiques (8h) de cette formation d’une durée totale de 22h. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes réalisant des procédures chirurgicales sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Les animaux sont d’abord soumis à une anesthésie : Après contention de l’animal, le stagiaire effectue une injection intrapéritonéale unique d’un anesthésique, et une injection sous-cutanée unique d’un analgésique afin de raffiner au mieux la technique et d’éviter toute douleur à l’animal. La durée de la chirurgie, depuis l’induction de l’anesthésie jusqu’au réveil est de 2h30 maximum. Chaque animal subit une seule intervention et à l'issue de la procédure l'animal est mise à mort

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont :- une hémorragie en cas de mauvaise réalisation de l’hémostase - une souffrance liée à une monitoring insuffisant de l’anesthésie Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire)

Devenir

Mise à mort Cela est justifié par le fait que le suivi post-opératoire sur plusieurs jours ne peut pas être intégré à la formation et que l’utilisation d’animaux ovariectomisés n’est pas prévue dans un autre projet.

Remplacement

Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, la première et majeure partie des travaux pratiques (les 5 premières heures) se déroule sur substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie (cuisses de poulets) et cadavres de rongeurs préférentiellement issus d’euthanasies indépendantes des besoins de la formation (A chaque session : au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). L’utilisation de substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie est un atout pour les participants et les intervenants qui peuvent ainsi rapidement se concentrer sur les gestes chirurgicaux, sans avoir à gérer les contraintes inhérentes à l’accès en animalerie et au suivi d’animaux opérés, disposer aisément de leurs notes et supports vidéo ou Power point. En outre, les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant. Cela favorise la sérénité et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente. La Commission Nationale de l’Expérimentation Animale (CNEA) impose donc l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations à la chirurgie expérimentale. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour cette partie des travaux pratiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons préférentiellement des animaux de réforme (sortis de procédures expérimentales légères ou modérées et dont l’état général n’est pas affecté, ou surnuméraires) ou de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus de l’établissement d’accueil. Dans le cas où de tels animaux ne seraient pas disponibles en quantité suffisante dans cet établissement, des animaux de réforme étant alors demandés à un élevage agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire : Pour la première partie des travaux pratiques, sur cadavres, au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). Pour la partie sur animal vivant, un seul rongeur par participant (rat ou souris, choix de l’espèce en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation et des besoins pédagogiques exprimés par les participants) est utilisé pour la réalisation d’une chirurgie complète. 2 animaux supplémentaires sont prévus à chaque session, dans le cas où un décès surviendrait avant la réalisation complète de la chirurgie par un ou 2 stagiaires (problème lors de l’anesthésie ou atteinte d’un point limite lors de la chirurgie). Afin de limiter également le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques sur animaux en dernière partie de formation. Dans l’attente, les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment. Toutes les techniques enseignées font d’abord l’objet d’une démonstration et d’un apprentissage sur support inerte ou animal mort afin de remplacer l’animal vivant par des méthodes alternatives tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé pour pratiquer sur animal vivant. Pour limiter toute douleur per-opératoire, un analgésique adapté est administré aux animaux opérés dès l’induction de l’anesthésie et sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie et observation des phases du réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques (manipulation atraumatique et aseptique des tissus, lutte contre l’hypothermie, soins post-opératoires…) Les personnes encadrant les travaux pratiques sont particulièrement attentives à tout signe de douleur ou de détresse. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure chirurgicale en cours sera immédiatement interrompue et une personne compétente prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Néanmoins, les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche in vivo, certains concepts sont particulièrement développés pour les rongeurs, et les travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs également. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.

Soumis à un régime enrichi en glucose ou en methylglyoxal et à des prises de sang répétées par ponction de la veine de l'aile, 90 diamants mandarins subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique attendre du traitement une accélération de leur vieillissement, et prévoit de les suivre jusqu'à leur mort, celle-ci pouvant être provoquée quand l'amaigrissement, la diarrhée ou l'état du plumage rendent leur état incompatible avec le maintien en captivité. Les oiseaux retenus ont déjà été utilisés dans des expériences antérieures sur le stress social ou les stratégies de reproduction, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction. Il affirme qu'aucune alternative sur culture cellulaire n'existe et que "les études sur l'animal entier restent la seule alternative scientifique".

Objectifs

Ce projet fait partie des projets pluridisciplinaires mêlant approches biologiques et chimiques pour une meilleure compréhension des adaptations animales à leurs environnements. L’approche expérimentale décrite ci-dessous forme une tâche d'un programme de recherche plus global nommé « AGEs : résistances des oiseaux aux glycations », et ayant obtenu un financement international en 2021.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension du métabolisme des oiseaux (ici du glucose) associé à leur plus grande longévité. Test de causalité entre stress du glucose et durée de vie. Caractérisation potentielle de mécanismes protecteurs vis à vis d'une glycémie élevée. Pistes d'études futures chez les mammifères et l'Homme.

Procédures

Nous réaliserons les prélèvements répétés suivants : -Prise de sang : Les prises de sang se font en effectuant un petit trou avec une aiguille (0.45*12 mm) dans la veine alaire (oiseaux). Le sang sera récupéré dans un capillaire de 75 microlitres. La fréquence des prélèvements est de 10 jours pour l’expérimentation pilote et mensuelle ou trimestrielle pour l’expérimentation finale. Les prises de sang à jeun se feront au réveil, après retrait de la nourriture et de la boisson la veille au soir. Les oiseaux étant inactifs dans le noir, cela ne perturbera que peu leur cycle physiologique. Les prises de sang se feront selon un protocole déjà décrit. Nous effectuerons également un suivi mensuel de la biométrie des individus (mesures masse, oiseaux [longueur du tarse, longueur tête-bec] et trimestriel de leur taux métabolique (respirométrie indirecte sur la nuit).

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux soumis aux traitements glucose ou methylglyoxal sont une accélération du taux de vieillissement. Mais cette prédiction est basée sur l'idée que ceux-ci ne pourront montrer d'augmentation de leurs mécanismes putatifs de protections vis à vis du stress du glucose. Post-expérimentation : À l’issue de l’expérimentation pilote (45 j), une prise de sang spécifique sera effectuée et diluée dans un milieu de culture cellulaire, pour des essais de mesure des aberrations télomériques. Si cet essai est couronné de succès, cette mesure sera répétée au début et à la fin de l’expérimentation finale. Les oiseaux de l’expérimentation pilote seront aussi dans l’expérimentation finale (objectif éthique de réduction). Le but de celle-ci étant de suivre les animaux jusqu’à leur mort naturelle, les individus seront sacrifiés lorsque leur état sera jugé incompatible avec le maintien en captivité (voir procédure expérimentale). Conditions de captivité : Pour l'expérimnetation test, les diamants mandarins seront en cages standards (150 cm de long, 70 cm de large et 100 cm de hauteur) placées en extérieur (voir ci-après). Pour l'expérimentation ultime, les diamants mandarins seront maintenus dans des cages extérieurs qui font 400 cm de long, 400 cm de large et 215 cm de hauteur, permettant de larges vols. Nous maintiendrons les individus par groupes expérimentaux ad libitum, avec abris chauffés. Les animaux sont déjà acclimatés en élevage extérieur, et sont donc non-stressantes pour les individus. Le diamant mandarin étant une espèce sociale, les individus seront répartis soit par groupe de 3 (expérimentation pilote) ou de 15 (expérimentation finale).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie (sauf détérioration drastique de leur état général, voir plus haut). Jusqu’à leur mort naturelle, qui pourra être induite si l’état général de l’animal le nécessite (e.g. amaigrissement marqué détecté par dynamique de masse ou réduction des muscles pectoraux (bréchet saillant), diarrhée, plumage mal entretenu, animal toujours au sol…). Le décision sera prise en accord avec la SBEA et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Notre but est de mesurer les effets in vivo d’une diète enrichie en glucose ou en methylglyoxal sur la physiologie des individus, plus précisément les relations entre réactions de glycation et marqueurs pro-vieillissement. Il est donc nécessaire d’avoir recours à des animaux vivants pour mener ce projet à bien.Enfin, les expériences sur la résistance aux glycations nécessite une approche physiologique qui ne peut être réalisée que chez l’animal vivant, mais nous utiliserons des animaux issus de la population maintenue dans notre animalerie ou en provenance d’un laboratoire partenaire, tous ayant été déjà utilisés en partie dans des expériences passées sur l’évolution des stratégies de reproduction des 2 sexes utilisant une approche de génétique quantitative (oiseaux du laboratoire partenaire) ou sur l’effet du stress social sur le vieillissement (oiseaux de notre animalerie). Il n’existe aucune alternative sur culture cellulaire pour étudier les effets des glycations sur le vieillissement. Le vieillissement étant un phénomène multifactoriel, les études sur l’animal entier restent la seule alternative scientifique.

Réduction

Avant de mettre en place notre étude finale, nous effectuerons une courte étude pilote visant à évaluer sur un groupe restreint d’oiseaux (n=18) les effets plasmatiques de différentes doses de glucose et methylglyoxal. Une fois la dose expérimentale déterminée, le projet sera réalisé en accord avec la règle des 3R. Nous allons utiliser 72 individus supplémentaires (pour un total de 90 individus) répartis en 3 groupes de 30 individus chacun (Contrôle, glucose, Methylglyoxal), afin d’avoir une puissance de test statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d’animaux impliqués dans l’expérience ; en effet une partie des animaux (les 18 individus initiaux) sera utilisée à la fois dans l’étude pilote et l’étude finale.

Raffinement

Les volières extérieures sont suffisamment grande pour permettre un vol important des animaux, des interactions sociales nombreuses et une densité d'individus faible. Pour l’enrichissement des cages nous utiliserons des perchoirs et branchages naturels, et des abris chauffés.

Choix des espèces

1) Espèce largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution et en biologie de la santé, notamment sur l’immunité ou l’étude des facteurs environnementaux modulant le stress oxydatif et le vieillissement. 2) Facilité de manipulation et de maintien en élevage de ce modèle. Les prises de sang de 75 microlitres peuvent être réalisées de manière peu ou non invasive (sans seringue, aiguille et récupération des gouttes de sang avec un capillaire). 3) Le responsable du projet a plus de 15 années d'expérience concernant l'utilisation de ce modèle pour la recherche en biologie évolutive. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 4-6 ans, c’est à dire relativement vieux (espérance de vie maximale en captivité 9 ans). Le but étant d’évaluer l’impact du traitement sur le taux de vieillissement sur 3-4 ans, l’utilisation d’adultes à mi-parcours de leur vie est une option clef.

Pour évaluer si les aloses franchissent des barrages de navigation, 50 grandes aloses adultes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes remises à l'eau vivantes après marquage. Capturées au filet puis anesthésiées, elles reçoivent un émetteur acoustique implanté dans l'estomac et subissent un prélèvement d'écailles, la manipulation ne dépassant pas une minute. Le porteur reconnaît que la capture, le transport, la stabulation, l'anesthésie et le marquage peuvent induire un stress, et son propre calcul d'effectif intègre de rares cas de mortalité post-opératoire ainsi que la régurgitation possible des émetteurs. Il affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à des animaux autochtones, et justifie la limite de 50 individus autant par la réduction que par le coût élevé des émetteurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1-évaluer les conditions actuelles de franchissement de barrages par un poisson migrateur menacé, la grande alose, en analysant les voies de passages, les conditions environnementales favorables et les temps de migration ; 2-produire des connaissances permettant l’évaluation des pratiques de gestion des ouvrages de navigation (écluses) situés au niveau de ces barrages, pour faciliter la migration de cette espèce.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration de la grande alose, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Il permettra également d’évaluer quelles sont les voies de passages prioritaires (écluses ou passes à poissons) et d’adapter le cas échéant les modalités d’ouverture des écluses.

Procédures

Les aloses capturées seront anesthésiées puis marquées par implantation gastrique d'émetteur acoustique sans chirurgie (50 individus), et feront l’objet de prélèvements d’écailles. La manipulation n’excédera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation, l’anesthésie et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Toutefois, les opérateurs ont réalisé ces étapes lors de deux phases précédentes du projet sans aucun dommage.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. Nous attendons des données sur la propension des individus à se déplacer et à poursuivre migration jusqu’aux frayères potentiellement accessibles pour elles. Par ces observations écologiques, il s’agira d’évaluer l’impact cumulé des obstacles physiques sur l’accessibilité des grandes aloses aux habitats de reproduction. Il est donc nécessaire d'avoir recours à des animaux autochtones pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le projet prévoit le marquage de 50 aloses, sur une ou plusieurs années en fonction de la capturabilité (maximum 5 ans), ce qui est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements, et évaluer la franchissabilité des différents ouvrages, les temps d’attente moyens et les voies de passage (écluses / passes à poissons). En effet, chez cette espèce migratrice et selon le type d’ouvrages de franchissement, il peut être attendu un taux de montaison de 50 à 70 %. Cet effectif théorique tient compte des rares cas de mortalité post-opératoire, de la régurgitation possible des émetteurs chez de rares individus et de la mortalité des animaux par prédation. Les redétections attendues grâce à la télémétrie acoustique seront a priori importantes, d’où une limitation à un maximum de 50 aloses marquées ; cet effectif est également justifié par le coût élevé des émetteurs. Cet objectif apparaît comme une cible réaliste au vu des effectifs en migration sur la rivière étudiée, en dépit d’un caractère très aléatoire des remontées attendues chez les poissons migrateurs, en particulier chez l'alose.

Raffinement

Le protocole a été pensé pour tenir compte de la grande sensibilité des aloses, particulièrement aux opérations de capture-biométrie-marquage. Les techniques de captures ont été éprouvées et visent à limiter les traumatismes physiques et les temps d’attente. Le transport des aloses sera limité et réalisé dans des conditions permettant de réduire le stress. Toutes les étapes du protocole, de la capture au réveil, seront réalisées précisément sur le même site, sur le bateau ou à proximité de la rivière. La manipulation s’effectuera à l’aide d’une épuisette non abrasive. Les animaux seront gardés en stabulation uniquement en cas de nécessité et le moins longtemps possible dans des bacs adaptés constamment alimentés en eau de rivière fraîche. L’utilisation d’un brancard pour l’anesthésie puis le marquage permet de réduire le stress durant la phase d’induction. Les poissons seront régulièrement observés et la physico-chimie surveillée. La méthode de marquage tient compte des spécificités et de la sensibilité de l’espèce et a déjà été expérimentée et validée. Des mesures sont prises (anesthésie individuelle, faible poids de la marque, maintien en immersion) pour réduire les effets délétères sur la survie et le comportement de l’animal. La phase de réveil se déroule dans des cages flottantes positionnées dans la rivière. Ceci permet de limiter les manipulations des poissons après marquage. Dès reprise de la nage, les aloses seront relâchées.

Choix des espèces

L’espèce cible est la grande alose (Alosa alosa). Cette espèce migratrice remonte les fleuves de la côte atlantique, et peut être considérée comme un indicateur pertinent de connectivité des grands cours d’eau (latérale, longitudinale). Grâce à l’aménagement de passes à poissons au niveau des barrages et à l’adaptabilité de l’espèce, l’alose voit sa population s’accroître sur certains bassins. Mais compte-tenu du faible recul disponible sur ces migrations, il semble d’intérêt de suivre plus finement les comportements des individus à l’approche des barrages. Ces éléments de connaissance permettront d’envisager des aménagements futurs (passes à poissons, gestion des écluses, habitats écologiques favorables) de manière plus objective. Les poissons seront au stade adulte reproducteur. Ils seront marqués avant la maturation complète des gonades (soit entre avril et début mai). Quelle que soit la taille des géniteurs marqués (dès 400 mm pour les petits mâles), le ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » sera en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique pour la plupart des espèces de poissons.

Pour mettre au point une reconstruction de mâchoire par ingénierie tissulaire, 19 brebis subissent des chirurgies sous anesthésie générale de plusieurs heures, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les échantillons osseux. Chaque animal subit un prélèvement de moelle osseuse, puis la pose d'au moins huit implants pendant deux heures, et pour sept d'entre elles un transfert microchirurgical de trois à quatre heures. Le porteur prévoit une gêne à l'alimentation après la chirurgie maxillo-faciale et la mise à mort immédiate en cas de rupture de la plaque d'ostéosynthèse. Il annonce comme bénéfice d'éviter aux patients des prélèvements osseux "lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques", après un premier passage par le rat jugé trop limité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale visant à s’affranchir des prélèvements osseux autologues. Un travail précédent a permis de poser les bases d’une procédure de régénération ostéo-cutanée couplant un biomatériau osseux synthétique, un pédicule perforant et un lambeau cutané. Il a été effectué chez le rat, avec pour preuve de concept finale, la régénération d’un défaut massif ostéo-cutané (hémi-mandibule) chez le rat. Aujourd’hui, l’objectif de ce projet est de s’affranchir des limites du modèle murin pour élaborer la preuve de concept finale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes ostéo-cutanées en s’affranchissant de prélèvements dommageables. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéo-cutanés tels qu’un lambeau de fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire) et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelles sur la zone donneuse.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Le temps de prélevement de la moelle osseuse est estimée à 30 minutes. Ce dernier permet d'enrichir les implants afin de favoriser l'ossification. La durée d'implantation des 8 implants est de 2h et le transfert microchirurgical est estimé à 3-4h. Après un période postopératoire (plus ou moins longue selon les procédures), les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les echantillons osseux.

Impact sur les animaux

Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la mise en place de l’implant autour du pédicule in situ - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier Les éventuels effets dureront 8 semaines lors de la procédure de mise en place d’implants. Concernant la chirurgie maxillo-faciale de la preuve de concept, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée. L'alimentation sera donc adaptée en fonction des possibles difficultés observées. Potentiellement, dans le pire des cas, une exposition ou rupture de la plaque d'ostéosynthèse pourrait advenir, ce qui engendrera directement une euthanasie de l'animal concerné.

Devenir

A la suite de la procédure,les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prelever et analyser les échantillons osseux.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux n’est possible : les systèmes de bioréacteurs in vitro n'étant pas assez avancés pour réaliser le projet. Seul un modèle animal vivant permet de nos jours la génération d'une construction ostéo-cutanée transplantable selon les principes du bioréacteur in vivo. L’utilisation d’un modèle animal plus petit a montré des limites lors de la preuve de concept finale (procédure trop lourde, limite technique et anatomique). C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle ovin est indispensable pour mener ce projet innovant.

Réduction

Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de brebis nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente, le nombre d’animaux pour les procédures d’implantation a été évalué à 5 avec une implantation d’au minimum 8 implants par animal. 7 animaux seront nécessaires pour la réalisation de la preuve de concept microchirurgicale.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille présentée en annexe 1 : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (Echelle de scoring). De façon générale, la gestion de la douleur per et post-opératoire est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles d’analgésie et d’antalgie en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

La brebis permet une poursuite de l’approche in vivo réalisée précédemment chez le rat avant de tester les hypothèses thérapeutiques chez l’Homme. Il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des brebis femelles adultes, c'est-à-dire, âgées de 4 à 7 ans, leur poids sera d’environ 80 kg, ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années.

Greffées sous la peau du dos d'un fragment de tumeur nasopharyngée, puis traitées chaque jour pendant deux semaines par voie intraveineuse ou par gavage, 2 700 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres sont dépourvues du gène p53 et développent des cancers spontanés en vieillissant, avec les douleurs et les difficultés de déplacement que le porteur décrit. Il indique que la tumeur greffée peut gêner les déplacements et se nécroser, et que les administrations répétées peuvent ulcérer le point d'injection ou irriter le tube digestif. Le projet teste six composés déjà utilisés en clinique humaine contre d'autres cancers, et le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier la réponse antitumorale.

Objectifs

La protéine p53, appelée gardienne du génome, a pour rôle d’empêcher l’émergence et la prolifération de cellules cancéreuses lorsque des évènements favorisant leur apparition surviennent. En effet, dans de nombreux cancers cette protéine est modifié ou absente. Une autre protéine, MDM2, est décrite comme empêchant l’activité protectrice de p53 et jouerait donc un rôle dans l’apparition de cancers. Des composés thérapeutiques visant à empêcher la fonction de régulation de MDM2 sur p53 ont été développés, mais sans réel succès. Ceci signifie que MDM2 pourrait avoir un rôle plus important que ce qui est actuellement connu et agir sur d’autres molécules. Ce projet cherche à définir plus précisément l’implication de MDM2 dans le développement des cancers.

Bénéfices attendus

Les connaissances obtenues grâce à ce projet de recherche seront bénéfiques pour la communauté scientifique à court terme, afin de permettre d’appréhender la complexité du rôle de notre molécule d’intérêt dans la progression tumorale. A moyen terme, si l’un des composés que nous testons sur les différents types de cancers est efficace (composés déjà indiqués pour un autre type de cancer en médecine humaine), cela pourra alors donner lieu à un essai clinique (dont l’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité du médicament) pour ce type de pathologie.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous réaliserons trois types de protocoles expérimentaux utilisant des souris. Dans le premier axe, nous testerons l’effet de composés thérapeutiques déjà validés chez le patient pour certains cancers sur des tumeurs nasopharyngés (cancer où l’action protectrice de la molécule p53 est empêchée par notre molécule d’intérêt) qui auront été greffées sous la peau du dos de souris. Cette implantation se fait par chirurgie (petite incision de la peau) sous anesthésie générale et traitement anti-douleur (durée de la procédure maximum 10 minutes). Un mois plus tard, le traitement (6 composés différents administrés seul soit par voie intraveineuse soit par gavage) débute avec une administration quotidienne pendant 2 semaines. Chaque administration est réalisée sur souris éveillée et après contention et dure moins d’une minute. Dans le second axe, nous utiliserons des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53. Cela nous permettra de caractériser l’effet des composés thérapeutiques en absence de l’action de notre molécule d’intérêt sur la protéine protectrice du cancer. Pour cela ces souris recevront les traitements comme décrits pour l’autre modèle. Chaque semaine pendant un mois, un prélèvement de sang au niveau de la joue (geste réalisé sans anesthésie et d’une durée de 10 secondes) permettra de suivre l’effet des traitements sur la composition du sang. Enfin, nous testerons 3 des 6 drogues sur un autre modèle de cancer qui sera mis en place en injectant sous la peau une suspension de cellules tumorales (sous anesthésie; durée 3 min). Les traitements seront administrés par gavage à l'aide d'une sonde (sans anesthésie; durée 1 min) lorsque les tumeurs seront palpables (environ 3 mm) et à raison d'une fois par jour pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Dans la mise en place du premier axe de recherche, l’implantation chirurgicale du fragment tumoral va impliquer une suture avec un risque de mauvaise cicatrisation. Lorsque le fragment tumoral greffé va croître, sa taille pourra donc entraîner une gêne dans le déplacement des souris et une nécrose pourrait également apparaître. L’administration répétée des composés thérapeutiques (une fois par jour pendant deux semaines) pourrait entrainer une ulcération au site d’injection (pour les administrations dans la veine) et une irritation du tube digestif (dans le cas de l’administration orale avec une sonde de gavage). Enfin les souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53 peuvent développer plus facilement des cancers spontanés en vieillissant (apparition de tumeurs affectant le bien-être de l'animal: difficulté de déplacement, douleur liée à la présence de la tumeur). Dans la troisième partie du projet, il y a un risque de nécrose des tumeurs pouvant générer une douleur à l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Dans le cas du modèle de greffe d’un tissu tumoral sous la peau, cela permettra de faire l’analyse de ce tissu après le traitement avec nos différents composés thérapeutiques. Dans le cas des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule pouvant jouer un rôle dans le développement du cancer, nous récupérerons la moelle osseuse après l’euthanasie afin d’en faire une fine caractérisation (effet des thérapies sur les différentes types de cellules présentes).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale (caractérisée par une régression de la tumeur), ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte normal ou pathologique. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels n'utilisant pas d'animaux. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimal de souris nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement interprétables. Des expériences in vitro, n'utilisant pas d'animaux, ont été réalisées au préalable.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement mis en place, les procédures de chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie adaptée. Nous surveillerons dans les premiers jours la suture (absence d’infection, bonne cicatrisation). Une surveillance quotidienne (visuelle) sera mise en place et complétée par un suivi clinique toutes les 48h. Nous avons établi une grille d’évaluation clinique prenant en compte la croissance de la tumeur et l’état général de la souris nous permettra de mettre en place des actions correctives nécessaires (analgésie, euthanasie). Dans le cas de douleur liée à l’administration répétée des composés thérapeutiques, une analgésie sera administrée. Si aucune amélioration n'est observée dans les 24h, la souris sera euthanasiée. Enfin, les souris seront hébergées en groupe et dans des cages contenant un enrichissement (papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d’utiliser un modèle transgénique bien établi. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes (7 semaines au début du projet) car cette maladie touche essentiellement des sujets adultes. Dans le cas des souris transgéniques, nous les utiliserons avant l’âge de 16 semaines afin de ne pas être confrontées à l’apparition de tumeurs spontanées.

324 souris seront tuées et 36 gardées pour entretenir les lignées, dans un projet qui teste le resvératrol contre une maladie génétique rare, la maladie CblG, à un niveau de souffrance modéré. Le gavage commence avant leur naissance, sur les mères gestantes, et se poursuit jusqu'au sevrage. Les souriceaux passent ensuite un examen d'imagerie sous anesthésie ou des tests comportementaux que le porteur qualifie de non douloureux, parmi lesquels un test de suspension, un test d'acuité visuelle et un labyrinthe aquatique. Les mises à mort sont programmées à 21 jours, 8 semaines et 6 mois, et les souris surnuméraires dépourvues de la mutation sont tuées dès le sevrage ou utilisées pour des dissections de formation.

Objectifs

La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.

Impact sur les animaux

Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.

Devenir

Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).

Remplacement

tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.

Réduction

Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Choix des espèces

La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.