Procédures modérées

Tués à l'issue, pour les prélèvements ou en raison d'une difficulté supposée à les remettre en groupe après 24 heures d'isolement, 1 900 rongeurs, 750 souris et 1 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris passent jusqu'à 24 heures seules en cage à métabolisme après administration du produit, tandis que des rats sont opérés pour recevoir un cathéter dans le canal biliaire, parfois deux autres dans le duodénum et la veine fémorale, une chirurgie qui peut durer jusqu'à deux heures. Les rats porteurs de deux ou trois cathéters peuvent repasser en cage à métabolisme une semaine plus tard, la mesure de la diurèse sur 24 heures peut être répétée jusqu'à trois fois, et les deux espèces peuvent être privées d'eau ou de nourriture. Le porteur range parmi les bénéfices destinés aux rats et aux souris eux-mêmes "une amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané ou en intraveineux d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être répétée jusqu’à 3 fois en faisant 1 session par semaine après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h ou 2ou3X 24h séparée d’environ 1 semaine) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun 12 à 15 heures avant chaque test pour être motivées à boire des solutions sucrées, reçoivent une solution sur la langue sous anesthésie générale, et pour un groupe une chirurgie stéréotaxique du cerveau suivie d'une semaine d'hébergement isolé. Le porteur détaille les tests, accès bref à sept solutions sucrées, consommation libre pendant vingt minutes, et test de tolérance au glucose avec cinq prélèvements de sang à la queue. Il rattache le projet à l'obésité et au diabète, tout en renvoyant les applications thérapeutiques à un "plus long terme".

Objectifs

Les informations sensorielles provenant de la bouche sont essentielles pour reconnaitre les sources de nutriments dans l’environnement et déclencher leur consommation. Or, la détection et la consommation de nourriture contenant du glucose est indispensable à la survie car ce nutriment est une source d’énergie primordiale pour le corps. Cependant, les mécanismes dans le système gustatif spécifiquement impliqués dans la détection du glucose et la différenciation avec les autres composants sucrés (fructose, autres sucres, …) ne sont pas encore compris. De plus, l’ingestion orale de glucose induit une production rapide d’insuline au début du repas, avant même que les taux de glucose sanguin augmente. Cette réponse anticipée est appelée phase céphalique de sécrétion d’insuline (PCSI), et permet une meilleure tolérance au glucose. Cette PCSI est médiée par le nerf gustatif depuis le système du goût, mais les mécanismes responsables de la PCSI dans le système du goût ne sont pas définis. L’information sucrée perçue dans le système gustatif est transmise dans les régions postérieures du cerveau, d’où le signal est ensuite distribué dans des circuits cérébraux spécifiques qui déterminent la perception du goût, la motivation à consommer ou non l’aliment, et/ou les réflexes physiologiques nécessaires pour préparer le corps à l’arrivée de cet aliment. Or, comment l’information provenant de différents composants sucrés (le glucose, le fructose, …) est traitée dans le cerveau pour induire une réponse spécifique à chaque composant est mal compris. Le but de ce projet sera donc 1) de mieux comprendre les mécanismes impliqués spécifiquement dans la perception sensorielle du glucose et la régulation de la glycémie au niveau du système gustatif, et 2) comment l’information sucrée est traitée au niveau cérébral. De plus, des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne la perception gustative, la motivation et la prise alimentaire, ont été observées dans la littérature. Par exemple, les femelles ont une sensibilité différente de celle des mâles à l’égard de certains goûts. Le dernier objectif de ce projet sera donc d’analyser 3) d’éventuels effets du sexe sur les résultats obtenus.

Bénéfices attendus

Le glucose est un nutriment important pour l’être humain. A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ce dernier est spécifiquement détecté et sa consommation régulée au niveau du système du goût, et comment l’information est traitée au niveau du cerveau. Il permettra également de mieux comprendre les différences entre les mâles et les femelles dans les comportements ingestifs. De plus, l’évolution rapide de nos sociétés modernes vers un accès facilité à des aliments transformés riches en sucres ajoutés est l’un des déterminants majeurs de l’émergence dans le monde de l’obésité et du diabète. Ces résultats sont donc importants pour permettre sur un plus long terme le développement de moyens thérapeutiques plus ciblés et plus efficaces contre l’obésité/diabète, ayant moins d’effets indésirables. Ils sont également importants pour les décisions sociétales et politiques concernant l’utilisation des sucres ajoutés dans l’alimentation et leurs effets indésirables sur la santé humaine.

Procédures

1er groupe de souris (durée maximale 5 semaines) : Protocole diminuant l’expression d’une protéine d’intérêt dans le système du goût (mise à jeun alimentaire/hydrique d’1 heure, anesthésie générale, application sans incision d’une solution sur la langue à l’aide d’une pipette) puis souris soumises deux fois (différents stimuli) à un des trois tests comportementaux (A : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions, 4 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès bref à 7 solutions sucrées, 10 secondes par solution, pendant 20 minutes ; B : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 2 fois pour l’entrainement ; 2 fois pour les tests puis accès à une solution sucrée pendant 20 minutes ; C : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures, 3 fois pour l’entrainement ; mise à jeun alimentaire de 6 heures, 2 fois pour les tests de tolérance au glucose : consommation de glucose 5 minutes puis prélèvements de sang à la queue 5 fois une minute) puis souris mise à mort par injection d’euthanasiant chimique. 2ème groupe (durée maximale 2 semaines) : Prélèvement des cerveaux après consommation de solutions sucrées : mises à jeun alimentaire de 12 à 15 heures pour motiver l’animal à consommer les solutions (2 fois pour l’entrainement ; 1 fois pour le test), mises à jeun hydrique/alimentaire d’1 heure (1 fois avant le protocole de diminution d’expression linguale décrit groupe 1, 1 fois après le test), mise à mort par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié. 3ème groupe (durée maximale 12 semaines) : Chirurgie stéréotaxique (1 heure par animal), surveillance post-opératoire d’une semaine avec hébergement individuel et injections d’analgésique, puis souris soumises deux fois à chacun des trois tests comportementaux (même interventions que précédemment décrites groupe 1), puis mise à mort dérogatoire par perfusion intracardiaque sur animal profondément anesthésié.

Impact sur les animaux

Les effets sur les animaux seront : - un stress (maximum une journée) au réveil de l’anesthésie générale effectuée pour l’application sur la langue de la solution induisant une diminution d’expression de la molécule d’intérêt, - une douleur locale et passagère (maximum 5 minutes) lors des injections systémiques ainsi que lors de prélèvements sanguins, - un stress et une douleur locale post-opératoire (en moyenne trois jours) après l’anesthésie générale et la procédure chirurgicale au niveau du cerveau, - un léger risque d’hémorragie ou d’infection du site chirurgical les jours suivants la chirurgie, - un stress chronique lors de l’hébergement individuel des animaux suite à la chirurgie stéréotaxique (maximum une semaine), - un stress chronique et une perte de poids à chaque mise à jeun alimentaire des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 heures chacune).

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort et les tissus et organes seront prélevés pour analyses histologiques ou moléculaires. En effet, suite au protocole d’infusion linguale ou d’injection au niveau cérébral, il est nécessaire de vérifier la localisation correcte et l’effet sur le tissu/l’organe, pour pouvoir les associer aux modifications comportementales observées. D’autres tissus/organes seront également prélevés pour analyser des variations potentielles dans l’expression de diverses molécules d’intérêt liées à la régulation du glucose ou de la prise alimentaire.

Remplacement

La vérification du rôle précis de la protéine d’intérêt présente dans le système gustatif dans la consommation alimentaire et le métabolisme glucidique, ainsi que l’analyse du traitement de l’information au niveau cérébral, ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants. La motivation à consommer des aliments ainsi que la régulation du métabolisme impliquent une communication entre différents organes. Il n’existe pas actuellement de modèle de substitution permettant d’étudier les dialogues inter-organes. Ce projet sera donc réalisé chez la souris, modèle de référence pour les études métaboliques et de physiologie alimentaire.

Réduction

Le nombre optimal d’animaux, c’est-à-dire nécessaire à l’obtention de résultats significatifs sans être trop élevé, est calculé grâce à des analyses de puissance statistique. Différents tests statistiques seront ensuite utilisés pour analyser les différences significatives entre les groupes expérimentaux. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux sont utilisés pour différents tests comportementaux après une période de repos et de récupération.

Raffinement

Dès la réception des animaux à l’animalerie, tout est mis en place pour réduire leur stress et inconfort. A leur arrivée, une semaine d’acclimatation au nouvel environnement et personnel, sans expérimentation, sera observée. Les animaux seront hébergés dans un environnement avec taux d’humidité et température contrôlés, en cycle jour-nuit 12h-12h. Ils seront élevés en environnement enrichi grâce à des dômes de nidation et carré de coton, et seront répartis à quatre par cage sauf lorsqu’un isolement sera nécessaire. Dans ce cas, pour réduire le stress les animaux bénéficieront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage d’hébergement. Un suivi quotidien par le personnel compétent sera effectué. Les animaux seront manipulés régulièrement par les expérimentateurs dans le but de réduire le stress. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés pour s’assurer de l’état de santé des animaux. Les différentes manipulations seront réalisées par du personnel compétent, conformément à la législation. Lors des prélèvements de sang, la douleur des animaux sera diminuée grâce à l’application locale d’un analgésique, suivi après le prélèvement d’une désinfection à la bétadine. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et une analgésie appropriée seront fournies. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant et surveillée jusqu’à leur réveil complet. Un suivi post-opératoire de minimum trois jours sera effectué, avec ajout d’analgésique chaque jour, et il sera prolongé jusqu’à une semaine si l’animal n’a pas atteint son état pré-opératoire. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort. Tout au long des expérimentations, si un animal présente un comportement anormal (perte de poids, prostration, piloérection, activité ralentie, …), il sera surveillé avec attention et retiré de l’étude. Si son état clinique ne s’améliore pas dans les 2 jours, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Les résultats préliminaires obtenus ainsi que les données bibliographiques dans ce domaine d’étude sont pour la grande majorité réalisés avec le modèle souris. Afin d’éviter la duplication inutile de travaux déjà publiés, et de pouvoir effectuer des comparaisons avec les travaux précédents, il est important de continuer sur des modèles similaires. Des souris âgées de 9 semaines à leur arrivée à l’animalerie seront utilisées dans ce projet de recherche. Cela correspond au stade de l’état jeune adulte, la maturité sexuelle est atteinte par les deux sexes. Il n’y aura pas d’effet confondant sur les résultats dû au développement du système du goût ou du système nerveux central lors de la phase juvénile et adolescente de la souris.

Greffées d'une tumeur sous la peau puis irradiées sous anesthésie, 2 800 souris sont toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections d'immunomodulateurs dans l'abdomen après l'irradiation, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut gêner leurs déplacements et provoquer des douleurs modérées. Les souris qui ne développent pas de tumeur, ou dont la tumeur n'atteint pas la taille voulue, sont tuées sans même avoir servi à l'expérience, un taux d'échec de greffe d'environ 20 % étant intégré aux effectifs. Le porteur revendique l'absence d'"alternative non animale" pour étudier les cellules immunitaires dans leur environnement tumoral.

Objectifs

La radiothérapie constitue l’un des trois piliers de l’arsenal thérapeutique contre les cancers. Elle est utilisée dans plus de la moitié des nouveaux cas de cancer, ce qui représente environ 200 000 patients en France chaque année. Pour augmenter les chances de guérison, les techniques de radiothérapie peuvent être associés à des molécules capable de réguler la réponse immunitaire l'avantage des combinaisons radiothérapie et immunothérapie ont été parfois démontrés mais sont souvent associé à des échecs thérapeutiques car de nombreux patients ne répondent pas dans l'identification des mécanismes moléculaires et cellulaire capable d'augmenter l'efficacité thérapeutique des associations radiothérapie + immunothérapie est en plein essor. En effet d'un point de vue conceptuel, ces combinaisons permettraient potentiellement de réduire le volume d'irradiation de la tumeur et ceci pour des tumeurs soit trop grosses soit placées à des endroits trop à risque pour les patients. In fine l'association radiothérapie en condition d'irradiation partielle plus immunomodulateur permettrait de limiter à la fois la toxicité aux tissus sains mais aussi de pouvoir traiter des patients pour lesquels aujourd'hui il y a des échecs thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous proposons dans différents modèles de tumeurs de souris chez la souris d'étudier le potentiel d'une association entre une radiothérapie en condition partielle et un traitement ayant un effet sur le système immunitaire. Nous proposons d'étudier en profondeur les mécanismes associés à cette réponse dans les 2 modèles les plus pertinents. Ces données permettront d’apporter la preuve de concept de la faisabilité de ce type d'approche dans un modèle intégré mais aussi potentiellement d'identifier de nouvelles cibles moléculaires capables d'optimiser ces associations thérapeutiques.

Procédures

Injections de cellules tumorales en sous cutanée chez tous les animaux : une injection par animal sous anesthésie gazeuse. La souris aura préalablement été rasée sur le flanc ou minium un jour avant l’injection des cellules tumorales. L’injection des immunomodulateurs se fera par injection intrapéritonéale. La première injection aura lieu après l‘irradiation et sera renouvelée tous les 2 à 3 jours sur une période de deux semaines suivants l’irradiation (soit au maximum 8 injections par animal). L’irradiation des tumeurs sera réalisée sous anesthésie pour tous les animaux chez qui la tumeur aura atteint la taille attendue, excepté pour le groupe contrôle. Après l’irradiation, les souris sont placées en thermacage pour le réveil. Les animaux n’ayant pas développé de tumeurs ou n’ayant pas de tumeurs à la taille souhaitée seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et par la croissance des tumeurs. La croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté à se déplacer et des douleurs modérées. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur au maximum. A cette fin, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de tissus et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Dans sa globalité, ce projet a pour but d'objectiver et de comprendre comment une tumeur irradiée partiellement peut être traiter en association avec une molécule capable de réguler la réponse immunitaire. Les données obtenues sont primordiales pour pouvoir in fine passer à des applications potentielles chez l'homme. Dans ce projet les modèles animaux permettront d'étudier finement la relation entre la radiothérapie et l’immunothérapie dans un organisme vivant et intégré. Nous proposons d'étudier ceci sur plusieurs modèles de tumeurs afin de savoir si les mécanismes identifiés sont associés à des caractères oncologiques généraux. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et des cellules immunitaires dans leur environnement tumoral, ce qui justifie l’utilisation d’animaux vivants dans cette étude.

Réduction

Les modèles animaux d’expérimentation pour l’étude des tumeurs implantées présentent un certain taux d’échec de prise de greffe (environ 20%) et sont, d’autre part, influencés par la physiologie des animaux, ce dont nous devons tenir compte pour établir les effectifs de souris par groupe. L’approche go/no go entre la procédure 1 et la procédure 2 va nous permettre également in fine de réduire le nombre d'animaux. Pour l’étude de la survie et de la croissance des tumeurs, nous envisageons des groupes de 30 animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, du plasma et en cytométrie, des groupes de 30 animaux sont également nécessaires. Pour les analyses génétiques, des groupes de 10 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton et des niches en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Du papier Craft pour également être ajouté si besoin. Les souris seront suivies quotidiennement et des mesures des tumeurs seront réalisés 2 à 3 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales. Les points limites seront strictement appliqués. Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de poids, prostration) seront évalués trois fois par semaine. L’euthanasie des souris sera envisagée dès qu’un point limite sera atteint.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de biologie des rayonnements. Elle est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. Les outils de biologie sont très développés chez la souris, ce qui permet des études poussées. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez cette espèce en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus vers des applications cliniques. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour ce type d’étude.

Pour tester des vésicules extracellulaires issues de cellules infectées par un virus candidat, 948 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, trois injections de virus et deux prélèvements sanguins, avec apparition attendue de tumeurs sous-cutanées ou pulmonaires pouvant entraîner perte de poids, mobilité réduite et cyanose. Un amendement porte les groupes de 15 à 21 souris parce qu'au cinquième jour toutes ne présentaient pas de tumeur palpable. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne récapitule les mécanismes de la mise en place des tumeurs.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires (EVs) circulent dans l’organisme et agissent comme des messagers entre les cellules. Elles suscitent un intérêt croissant lié à leur capacité à transférer du contenu biologique entre cellules. En effet, les EVs ouvrent la porte à de nouveaux concepts et opportunités tant biologiques que thérapeutiques. Les cellules cancéreuses sont particulièrement de bonnes productrices d’EVs. Elles peuvent favoriser la croissance tumorale ou jouer un rôle dans l'inhibition de la croissance tumorale. Ainsi, les EVs ont un double rôle dans la régulation du cancer. Les données actuelles montrent que l'immunothérapie basée sur l’utilisation d’EVs est une approche prometteuse dans le cadre du cancer, suggérant que les EVs pourraient devenir des vaccins très efficaces. Ainsi, des études récentes avec un virus candidat dans le cadre de la thérapie contre le cancer ont montré l'apparition d'EVs contenant des protéines codées par ce virus thérapeutique. Le but de ce projet est donc d’analyser l'effet des EVs libérées par des cellules infectées par des candidats viraux et leur utilisation potentielle dans la thérapie anticancéreuse. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet des EVs sur des lignées de tumeur greffées dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d'un candidat médicament sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place un candidat médicament permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée ou intra-veineuse à la queue, durée 1 minute. Par la suite, des injections de virus seront pratiquées (3 fois), durée moins d’une minute. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués chacun durant environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées ou pulmonaires, qui pourraient déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage, une cyanose. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours. Deux prélèvements sanguins d'un volume de 200μL seont effectués ainsi que trois injections de virus, pouvant entriner un léger incomfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de candidats médicaments dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, pour l’étude pilote 6 animaux par condition seront suffisants sur conclure sur la toxicité et l’immunogénicité des EVs. Puis d’après nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés et intra-veineux chez la souris des groupes de maximum 15 animaux par condition seront suffisants. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Nous analyserons ces données par analyse statistique à deux paramètres (avec ou sans EVs/ concentration de cellules). Amendement : Nous souhaitons augmenter le nombre d’animaux de la PE2 suite à l’obtention de nos premiers résultats. En effet, lorsque nous démarrons le traitement à J5 toutes les souris ne présentent pas de tumeurs palpables. Afin de conserver cette chronologie de traitement nous souhaitons augmenter le nombre d’animaux dans la procédure sur les modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris (PE2) ainsi les groupes de 15 animaux par condition seront remplacés par des groupes de 21 souris.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement avec la présence d’un enrichissement (Maisonnettes en carton ou de kraft). Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du candidat médicament sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique tiédi. Nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray désinfectant seront attribués.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une apporche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux agés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet age, le système immunitaire est suffisamment développé.

Pour savoir si un additif alimentaire nanoparticulaire déclenche l'allergie à l'œuf, 360 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. Chacune subit quatre prises de sang et quatre prélèvements de selles, et 240 d'entre elles reçoivent trois injections intrapéritonéales de sensibilisation avant un gavage destiné à déclencher la réaction allergique. Le porteur indique que des symptômes d'anaphylaxie peuvent apparaître dans la demi-heure suivant le gavage et persister une trentaine de minutes, avec chute de la température corporelle mesurée par voie rectale. Il compare la forme en aiguilles des particules de phosphate tricalcique aux fibres d'amiante dans les poumons, tout en rappelant que cet additif entre dans les préparations infantiles.

Objectifs

L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultra-transformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. L’un de ces additifs, le phosphate de calcium, contient 100% de nanoparticules et se présente sous la forme d’hydroxyapatite. Il a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant pour amplifier la réponse immune et est actuellement employé dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium. Le projet vise à identifier comment cet additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène (ici le lysozyme).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire, le phosphate tricalcique dans l’allergie à l’œuf (via le lysozyme). Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses mécanistiques formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) Le phosphate tricalcique (E341) participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des épitopes et/ou limitant la dégradabilité des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités d’adsorption du phosphate tricalcique pour les protéines dont les allergènes. 2) Les particules de phosphate tricalcique (E341), de par leur forme en aiguilles pointues, irritent mécaniquement la barrière intestinale (à la manière des fibres d’amiante dans les poumons), la rendant perméable et facilitant le passage d’allergènes dans l’organisme, auquel le système immunitaire réagit en produisant des anticorps.

Procédures

Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles et 4 prises de sang espacées d’une semaine au minimum, une juste après l’acclimatation, une avant la sensibilisation 1 = S1, une avant la sensibilisation 2 =S2 et une avant la sensibilisation 3 =S3. Les groupes sensibilisés soit 120 souris par sexe subiront 3 Injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 360, subiront 1 gavage oral.

Impact sur les animaux

La sensibilisation par voie intrapéritonéale et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les immunoglobines IgG conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Le modèle murin est reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception, 5 semaines de vie au début du protocole d’exposition, puis 7 semaines à la première sensibilisation, 10 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort.

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le gros intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par gavage ou par injection intramusculaire, et leur abdomen est massé jusqu'à neuf fois pour provoquer la défécation. Le porteur prévoit douleur, stress, réactions d'hypersensibilité locale et diarrhées, et indique que les rats perdant 15 à 20 % de leur poids ou montrant des signes de douleur persistants seront mis à mort. L'objet du projet reste l'effet d'un antibiotique courant sur la flore intestinale, une question que le porteur affirme ne pouvoir trancher qu'in vivo pour mesurer directement la quantité d'antibiotique au contact du microbiote.

Objectifs

Le microbiote intestinal (MI) est fondamental pour la santé des mammifères. Les traitements antibiotiques causent un déséquilibre qui comporte l'augmentation d'espèces pathogènes et/ou porteurs de mécanismes de résistance, au détriment d'espèces bénéfiques à la santé de l'hôte. De plus, les antibiotiques sont souvent associés à l'inflammation des tissus intestinaux. Les voies d'administration par injection semblent avoir un effet moins important sur la sélection des résistances dans le MI, mais peuvent l'affecter en causant des déséquilibres au niveau de la composition du MI. L'association amoxicilline - acide clavulanique (AMC) est active contre plusieurs espèces bactériennes. L'AMC est utilisé chez l'Homme et les animaux. Les études sur l'impact de l'AMC sur la composition du MI, conduites chez l'Homme et certaines espèces animales, ne sont pas concluantes. Deux limites principales ont été observées: i) l'absence de comparaison avec un groupe contrôle constitué de sujets sains non traités; ii) dans certaines expérimentations chez l'animal, l'administration de l'AMC via la consommation ad libitum d'eau ne reflète pas la réalité d'un traitement et de l'exposition de l'indivdu à l'antibiotique. Les objectifs de cette étude sont : i) étudier l'impact de l'AMC sur la composition du MI chez le rat après administration par voie intramusculaire ou orale, versus des groupes contrôles sains non traités ; ii) quantifier les gènes de résistances dans les fèces avant et après l'administration d'AMC et en absence de traitement; iii) évaluer l'exposition du MI, selon les deux voies d'administration, par dosages de l'AMC dans les fèces et le gros intestin ; iv) évaluer la résilience (retour à la composition initiale) du MI après un traitement à l'AMC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent plusieurs aspects. L'analyse du MI via une analyse métagénomique par séquençage aléatoire à haut débit permettra de déterminer quelles communautés bactériennes et fonctions biologiques sont perturbées par l'AMC. Ces connaissances mettront les bases pour développer des stratégies afin de préserver les fonctions du MI. Chez l'Homme, la voie par injection est plus courante dans les hôpitaux avec un relais par voie orale dès que possible. En santé animale, selon les espèces, l'une des deux voies est privilégiée (injectable chez les bovins, orale chez les carnivores domestiques). Cette étude permettra de confirmer l'éventuel impact de la voie injectable sur le MI et donnera les bases pour privilégier une voie d'administration. La plupart des études se sont focalisées sur l'impact d'un traitement antibiotique sur la composition du MI sans évaluer, en parallèle, la quantification des gènes de résistance aux antibiotiques. Cette étude fournira, pour la première fois, une connaissance plus approfondie sur ces deux aspects.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration d'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par voie orale (groupe B), soit par voie intramusculaire (groupe A). L'administration par voie intramusculaire se fera sous sédation gazeuse (durée : 1 minute) pour soulager l'inconfort et la douleur occasionnée par l'injection (durée : 30 secondes). Le gavage (durée : 1 minute) ne nécessite pas de sédation, puisque la pratique repose sur un geste techniqué et maîtrisé. Afin de réaliser les prélèvements de matières fécales, les rats seront disposés dans des boites préalablement désinfectées et l'abdomen de chaque animal sera massé pour favoriser la défécation spontanée. Cette manipulation sera effectuée neuf fois sur 24 rats et 8 fois sur 36 rats. Le gros intestin de tous les rats sera prélevé après sédation gazeuse et mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont la douleur et le stress dus à l'administration de l'antibiotique ainsi que des réactions d'hypersensibilités locales après l'administration intramusculaire de la solution d'AMC. Potentiellement des diarrhées peuvent émerger.

Devenir

J11 et J100, les rats seront mis à morts afin de prélever le gros intestin.

Remplacement

Le modèle animal choisi pour cette étude ne peut pas être remplacé. Seulement les études in vivo permettent de reproduire l'exposition di MI dans le cadre d'une thérapie antibiotique. La quantification directe de l'AMC dans l'intestin permettra d'objectiver directement la quantité d'AMC présente au contact du microbiote.

Réduction

Il est prévu d'utiliser le minimum de sujets nécessaires dans chaque groupe pour pouvoir rendre les résultats interprétables. Selon une approche statistique, il a été estimé qu'un total de 36 rats seraient nécessaires pour la totalité du projet. L'étude nécessite 4 groupes de 9 rats, en tenant compte d'un tiers sera utilisé pour une analyse du microbiote intestinal après la fin de l'administration de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique, et les deux tiers restants pour l'analyse à trois mois après la fin de l'administration de l'antibiotique.

Raffinement

Les rats auront une période d'acclimatation de 3 semaines avant d'effectuer le protocole. Les rats seront hébergés dans des cages spéciales rats qui leurs permettront la stature bipède. Un tunnel, des Sizzle-Nest et des os à ronger sont disponibles dans les cages. La socialité des animaux sera garantie en hébergeant 3 rats par cage. Pour réduire le stress dû à l'administration de l'AMC, les rats auront une sédation. Pour soulager la douleur due à l'injection d'AMC ou à une éventuelle hypersensibilité locale, de la pommade contenant de la lidocaïne sera placée sur la cuisse concernée. Pendant l'administration d'AMC, le poids des animaux sera monitoré. Si une perte de poids importante (-15 à -20% dans les 3 jours et comparée au poids pré-administration ou aux groupes contrôles) est observée, l'animal sera mis à mort. Si l'animal montre des signes de douleur( le poil hérissé, le dos arrondi, le faciès contracté et/ou l'isolement), du paracétamol (200 mg/kg) sera administré par voie orale (biberon), 3 fois maximum pendant 24h. Si les signes de douleur persistent au-delà de 3 jours, l'animal sera mis à mort. La diarrhée est un effet secondaire possible. L'incidence de la diarrhée associée à l'administration d'AMC chez le rat n'est pas connue. En se basant sur les observations conduites chez l'Homme, si une diarrhée de courte durée sans signes de douleurs et sans déshydratation (pli de peau persistant) émerge, aucune modification ne sera apportée au protocole. Cependant, en cas de signes de douleur, du paracétamol sera administré à tous les animaux pour éviter un biais lié à cette administration. Si la diarrhée se prolonge sur plus de 3 jours, associée à des signes de déshydratation et une perte de poids, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des rats comme modèle d'étude nous permet de contrôles les facteurs, comme l'âge, l'alimentation ou encore l'état de santé , qui peuvent jouer un rôle dans la composition du MI et donc être confondant pour l'évaluation de l'impact de l'AMC. Les rats sont le modèle le plus utilisé dans les études du microbiote intestinal. De plus, le rat est souvent utilisé pour les études sur le MI humain, car son MI conserve des caractéristiques communes à tous les mammifères, permettant la généralisation des résultats. Dans le cadre de l'étude de l'impact de l'AMC sur le MI, les rats seront adultes (8 semaines). En effet, à ce stade, la composition du MI est stabilisée. Ainsi, les perturbations observées après l'administration d'AMC peuvent être attribuées à l'antibiotique et non au sevrage des rats.

Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.