Procédures modérées

Équipés d'un dispositif d'enregistrement fixé en permanence sur le crâne sous anesthésie générale, 36 prosimiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyser leur cerveau. Ils portent pendant les séances jusqu'à 15 grammes de matériel, soit 20 % de leur poids, explorent une arène une heure par jour pendant trois à six semaines, puis passent en cage plus petite et en volière individuelle. Le porteur indique que la ration alimentaire quotidienne dépend de l'exploration active du dispositif, ce qui fait du rationnement un ressort de l'expérience, et signale une gêne possible dans les sauts et la locomotion. Il affirme que l'expérimentation animale reste "le seul moyen" d'accéder à ces circuits, l'objectif annoncé portant sur l'évolution du système visuel des premiers primates.

Objectifs

L’exploration de notre environnement est cruciale dans notre quotidien et la vision, notamment chez les primates, est particulièrement sollicitée lors de cette activité. Due à des limitations techniques, la plupart des études sur la vision des primates est faite sous anesthésie ou en éveil, mais avec des dispositifs d’enregistrement filaires, limitant ainsi les mouvements de la tête. Comment sont représentés les différents éléments de l’espace environnant au niveau neuronal pendant l’exploration libre reste une question encore ouverte. Dans ce projet, nous essaierons de répondre à cette question en étudiant des primates de petite taille, ce qui va nous permettre d’utiliser une série d’outils d’enregistrement optiques et électrophysiologiques innovants (légers, portables et sans fil), initialement développés pour la recherche avec les rongeurs, et permettant une liberté totale de mouvements pendant l’exploration comportementale. Nous allons en particulier étudier l’activité neuronale dans les aires visuelles du cortex, ainsi que dans l’hippocampe, une région du cerveau où les paramètres spatiaux sont bien représentés. Cette recherche promet donc de nous donner des informations importantes sur la façon dont le système visuel a évolué chez nos ancêtres et de mieux comprendre comment notre cerveau traite l’information visuelle lors de l’exploration active.

Bénéfices attendus

Cette étude livrera des informations précieuses sur la façon dont les primates, y compris les humains, perçoivent visuellement leur environnement pendant l’exploration active. En particulier, nous espérons mieux comprendre comment les informations spatiales et des objets sont intégrés avec des paramètres internes (mémoire, prise de décision, motivation). La compréhension fondamentale des circuits cérébraux impliqués dans la vision des primates peut avoir des implications importantes pour trouver de nouvelles solutions lorsque la vision est altérée au cours du développement, lors de maladies neurodégénératives ou lors d’un AVC. Les résultats de cette étude pourraient également être généralisés à d’autres circuits cérébraux, tels que les systèmes sensitifs (ex : le toucher) et moteurs.

Procédures

La procédure 1 consiste en une étude histologique de l’anatomie du système visuel par injection sous anesthésie générale d’un marqueur fluorescent dans le cerveau. Après une durée de 3-4 semaines, temps d’action du marqueur, les animaux seront euthanasiés pour une analyse histologique des cerveaux. L’objectif des procédures 2 et 3 est de combiner l’enregistrement de l’activité neuronale par électrophysiologie (résolution temporelle, procédure 2) et imagerie optique (résolution spatiale, procédure 3) pendant l’exploration active des animaux. Pour cela, des dispositifs permanents (maximum 3.5g, soit moins de 5% du poids de l’animal) seront disposés sur la tête des animaux sous anesthésie générale et seront gardés par les animaux jusqu’à la fin de chaque procédure. Dans la procédure 2, les animaux seront également équipés d’un collier (4gr ; dispositif temporaire) pourvu d’une diode pour suivre les mouvements des animaux. Les animaux seront ensuite suivis dans une grande arène, pendant des sessions d’exploration (1 session de 1h par jour). Les animaux porteront alors, en plus du dispositif permanent et du collier (pour la procédure 2), un dispositif temporaire permettant soit l’enregistrement électrophysiologique (procédure 2) ou optique (procédure 3) de l’activité neuronale. Dans les deux cas, la charge totale portée par les animaux pendant l’exploration libre sera au maximum de 15g, soit au maximum 20% du poids de l’animal. Les dispositifs temporaires seront enlevés à la fin de chaque session exploratoire (1 session de 1h par jour). Cette première phase durera 3 à 6 semaines, en fonction du temps nécessaire pour obtenir assez de données exploitables. Les animaux suivront ensuite une évaluation psychophysique (3 à 6 semaines, 1 session de 1h par jour) dans une petite cage offrant un meilleur contrôle expérimental. A l’issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des analyses histologiques des cerveaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles liées aux différents actes expérimentaux pourraient être: risque de complications (douleurs résiduelles ou gêne) après les chirurgies pour la pose sur la tête des dispositifs permanents d'enregistrement (prise en charge des douleurs éventuelles et protocole analgésique); inconfort (gêne au niveau des sauts et de la locomation par exemple) liée au port de dispositifs temporaires d’enregistrement automatiques sur la tête pendant les sessions expérimentales; inconfort ou stress lié à l'hébergement provisoire dans des systèmes automatisé pour tests et volière individuelle; inconfort ou stress lié au conditionnement alimentaire nécessitant une exploration active du dispositif pour que l'animal reçoive sa ration alimentaire journalière.

Devenir

Les animaux impliqués dans les 3 procédures seront euthanasiés pour étudier leur anatomie cérébrale.

Remplacement

Nos recherches sont axées sur la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans la vision active des primates. Pour comprendre ces fonctions complexes et intégrées du système nerveux central et périphérique nous allons travailler avec des animaux éveillés et libres de déplacement pendant des tâches d’exploration comportementale. Les alternatives in vitro telles que les cultures cellulaires et les organoïdes (une version simplifiée d'un organe, fabriquée in vitro) n'ont pour le moment pas atteint le niveau approprié d'organisation biologique pour étudier ces questions. Finalement, en ce qui concerne les alternatives in silico, l'éthologie computationnelle est un domaine qui n’en est encore qu'à ses débuts. Les modèles théoriques sont encore très loin de la complexité comportementale des animaux. Ils ne peuvent ni proposer, ni empiriquement prouver les réponses à nos questions. L'expérimentation animale nous semble donc le seul moyen de découvrir les processus constitutifs de ces comportements visuels, les algorithmes sous-jacents et les circuits neuronaux impliqués.

Réduction

Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. Tout d'abord, nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au strict minimum nécessaire statistiquement. Le nombre d’animaux maximum prévu par expérience (N=12) est calculé sur notre expérience de taux de succès (études publiées sur des modèles rongeurs) et sur le pouvoir statistique requis. Compte-tenu du fait que les animaux seront inclus séquentiellement dans les procédures (par groupe de 2 à 4) et dans le cas où le taux de succès serait atteint plus tôt que prévu, cela nous permettrait d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux finalement utilisés dans chaque procédure. Les méthodes proposées, notamment l’imagerie optique, vont permettre d’enregistrer plusieurs centaines de neurones en parallèle, ce qui réduit aussi le nombre d’expériences nécessaires. Enfin, nous allons documenter et rendre les données accessibles à la communauté scientifique afin de réduire la nécessité de futures expériences sur le terrain.

Raffinement

La prise en charge de la douleur avant, pendant et après les interventions chirurgicales est assurée par une anesthésie et une analgésie optimisées, ainsi que par une surveillance quotidienne. Des mesures compensatoires telles que l’utilisation d’un tapis chauffant ou la réhydratation (pour limiter la déshydratation des animaux pendant l’anesthésie) sont mises en place pour toutes nos interventions. Les animaux inclus dans les procédures seront habitués à être manipulés régulièrement par des biologistes, en accord avec leur rythme journalier d’activité, ce qui contribue à diminuer leur stress. Dans leur cage, ils bénéficient d’un enrichissement environnemental multimodal (aménagement cage, social, alimentaire, cognitif). La recherche active de la nourriture pendant les tâches comportementales complexes, bien que réalisée dans un contexte de conditionnement alimentaire, motive l’animal à développer des stratégies flexibles, ce qui réduit le risque de développer des stéréotypies motrices. Enfin, nous avons réduit le nombre de session à 1 par jour, limitant ainsi à 1h le temps passé par un animal avec une charge dépassant 5% de son poids, notamment pour les procédures 2 et 3.

Choix des espèces

Dans notre recherche nous voulons déterminer les éléments essentiels qui ont permis l'émergence des adaptations visuelles chez les premiers primates et de les comparer à d’autres primates (y compris à l’humain). Les lémuriens sont d’excellents modèles vivants aux caractéristiques primitives très similaires aux primates ancestraux. Ils présentent la plupart des traits des premiers primates: petite taille, yeux dirigés vers le devant, mains préhensiles, métabolisme rapide, vie nocturne et arboricole, alimentation omnivore, etc. L'objectif de ce projet est d’utiliser une combinaison de tests comportementaux et d’enregistrements neuronaux complémentaires chez un petit primate, à l’âge adulte (2-4 ans, après la phase de développement, avant les effets du vieillissement) pour découvrir si et comment le système visuel des premiers primates était adapté (et potentiellement optimisé) pour l’exploration visuelle dans un environnement nocturne et arboricole.

Pour tester de nouveaux agents d'embolisation, 100 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. L'arthrose du genou leur est provoquée par chirurgie, suivie d'une embolisation artérielle de deux heures, d'imageries hebdomadaires pendant dix semaines et d'une ponction de liquide synovial. Le porteur indique que l'induction peut entraîner un œdème et une boiterie gênant les déplacements, et que les microsphères injectées peuvent atteindre des zones non ciblées. Il décrit une présélection des produits in vitro, puis conclut que seule l'expérimentation sur l'animal vivant permet d'évaluer l'efficacité attendue chez l'humain.

Objectifs

L'arthrose du genou est une maladie courante qui peut provoquer des douleurs, un handicap fonctionnel voire une dépression chez les personnes affectées. La prévalence mondiale de l'arthrose du genou est estimée à 22,9 % chez les individus âgés de ≥ 40 ans, soit 654,1 millions de personnes dans le monde en 2020, et la plupart des patients vivent des décennies avec la maladie. De nouveaux traitements non chirurgicaux sont nécessaires pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits. Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) sur un modèle de lapin arthrosique induit mécaniquement au niveau du genou. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) in vivo. La comparaison de nouveaux AE entre eux et par rapport à des agents déjà commercialisés ou en développement dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients.

Procédures

-Induction de l'arthrose par chirurgie (durée : 1h) -Traitement par radiologie interventionnelle (durée : 2h) -Imagerie pour suivre l'efficacité du traitement (durée: 1h, fréquence : maximum 1 fois / semaine durant le suivi de 10 semaines) -Prélèvements de sang sur animal vigile (durée: 5-10min dans une cage à contention, prélèvement rapide puis point de compression efficace jusqu'à l'arrêt du saignement, fréquence : maximum 3 fois durant le suivi de 10 semaines espacé de plusieurs semaines) pour mesurer les marqueurs systémiques de l'inflammation -Prélèvement de liquide synovial sur animal anesthésié en point final (durée: 5-10 min, fréquence : uniquement avant l’euthanasie de l’animal) pour mesurer les marqueurs locaux de l'inflammation.

Impact sur les animaux

L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins. L'induction de l'arthrose de genou peut entrainer un oedème/hématome provoquant une boiterie génant l'animal lors de ses déplacements. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une légère ischémie de ces zones. L'administration des différents médicaments (analgésie / anesthésie) sur l'animal vigile induit une douleur légère.

Devenir

La procédure sera considérée comme modérée puisqu'un même animal aura une imagerie et/ou des prélèvements sanguins, une induction chirurgicale de la pathologie et/ou une procédure d'embolisation artérielle. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude afin de prélever les tissus pour une analyse histologique.

Remplacement

La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des produits. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'Homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation...

Réduction

Chaque étude sera composée de n= 5 animaux par groupe pour chaque agent d’embolisation étudié. Il est nécessaire de comparer le nouvel agent d’embolisation à une référence clinique dans les mêmes conditions expérimentales. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe. Le nombre de 5 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi l'efficacité des traitements.

Raffinement

Comme indiqué dans la description détaillée de la procédure, une prémédication à la buprenorphine est systématiquement mise en place avant la chirurgie / embolisation pour assurer une bonne analgésie. Pour pallier aux nuisances ou effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place : une hydratation sous cutanée avec 50 mL de NaCl est réalisée avant la chirurgie / embolisation, une injection IV d’héparine (bolus et maintien toutes les heures) est réalisée pour prévenir les complications post opératoires. Une couverture par un Anti Inflammatoire Non Stéroïdien (flunixine) est également mise en place sur les 7 jours post induction de l'arthrose de l’animal. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage pour leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. L'enrichissement (balle, morceaux de bois...) est conservé dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par le zootechnicien quotidiennement.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi car, du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait par progression d'un microcathéter assisté d'un microguide (comme en clinique) via l'artère auriculaire. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer de la meilleure inclusion des animaux. Animaux adultes de plus de 10 semaines, d'environ 3 kg - 3.5 kg au moment de l'induction mécanique de l'arthrose. En effet, il faut que l'animal ait une croissance squelettique stable au moment de l'induction de la pathologie.

273 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur ovarienne humaine leur est greffé sous la peau, puis celles qui développent une tumeur subissent une ponction intracardiaque avant la mise à mort et le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer une perte de poids ou une gêne au déplacement, la mise à mort intervenant quand elle dépasse 12 mm. Il affirme le recours à la souris "indispensable" faute de modèle alternatif, tout en annonçant que les tumeurs entretenues sur ces souris serviront ensuite à démontrer l'intérêt des organoïdes tumoraux.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire restant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles (association carboplatine/paclitaxel), le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance constitue un enjeu majeur pour l’amélioration de leur prise en charge. Il est donc indispensable de s’appuyer sur des modèles expérimentaux qui représentent de façon pertinente la pathologie afin d’identifier et valider de nouvelles cibles thérapeutiques, évaluer de nouveaux médicaments et leurs biomarqueurs associés, ainsi qu’étudier les mécanismes de résistance. Il existe donc un réel besoin de s’appuyer sur des modèles expérimentaux capable de refléter au mieux la situation chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire. Il est maintenant largement reconnu que les tumeurs dérivées de patients ou patient-derived tumor xenografts (PDXs) sont très proches de la tumeur du patient et constituent les modèles de référence dans l’industrie pharmaceutique. Ces modèles sont obtenus en implantant des morceaux de tumeurs de patients chez des souris avec un système immunitaire déficient pour permettre la croissance de la tumeur, puis la tumeur est maintenue in vivo par passage successifs de souris en souris. L’objectif de ce projet est de finaliser l’établissement d’un panel de modèles de PDX (22 sont déjà établis et 13 sont en cours d’établissement) afin de pouvoir disposer d’une cohorte représentative de l’hétérogénéité intra- et intertumorale de la maladie.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet en premier lieu qu’il permette de mettre en place un panel de PDX de cancer de l’ovaire qui puisse être utilisé pour les différents projets de recherche du laboratoire. Ces modèles seront utilisés pour tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques identifiées par le laboratoire, permettre l’évaluation de leur biodistribution et de leur toxicité, et identifier/valider des biomarqueurs (dans le sang ou dans la tumeur). Ces modèles seront aussi pour démonter l’intérêt de nouveaux modèles alternatifs tels que les organoïdes tumoraux.

Procédures

Un petit fragment tumoral de cancer de l’ovaire sera implanté en sous-cutané sur un nombre maximal de 273 souris immunodéprimées sous anesthésie générale et après administration d’un dérivé morphinique (analgésie). La plaie est refermée ensuite à l’aide de 3 agrafes. Cette procédure est très rapide (5 minutes maximum). Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels à la suite de l’implantation de fragment tumoraux humains sont : le développement d’un abcès (assez rare en raison de la localisation de tumeur d’origine et de l’expertise du laboratoire dans la réalisation de la chirurgie), la cachexie (perte de poids liée à la tumeur qui est limitée puisque les souris seront euthanasiées dès lors que la tumeur atteindra un diamètre de 12 mm x 12 mm), la formation de métastases (peu fréquentes dans le cadre d’implantations sous-cutanées), ou l’ulcération de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’au développement d’une tumeur atteignant la taille éthique. En cas d’absence de pousse tumorale après 12 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Afin d’éviter d’avoir à maintenir les tumeurs sur les souris, des fragments de tumeurs prélevées après euthanasie des animaux seront congelés au fur et à mesure pour permettre de futures réimplantations. Un test de décongélation sera réalisé 2 mois après congélation de fragments tumoraux afin de valider la bonne cryopréservation de ces échantillons. Par ailleurs, à plus long terme, ces modèles pourront être utilisés pour démontrer la pertinence de modèles aternatifs tels que les organoïdes tumoraux, des microtumeurs cultivées dans des boites, étant donné que plusieurs modèles de PDXs et organoïdes tumoraux ont été établis à partir de la même tumeur de patiente. De plus, les molécules à tester pourront être présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages avec de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée différents matériaux pour permettre aux animaux de confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique : 2 jours suite à l’implantation afin de vérifier le comportement de l’animal. Concernant la procédure chirurgicale (implantation de fragments tumoraux), les souris seront injectées avec un analgésique (dérivé de la morphine) afin de réduire la douleur péri- et post-opératoire. Une anesthésie générale est ensuite réalisée lors de l’implantation sur une table chauffante. Le réveil des souris s’effectue sous lampe rouge afin d’éviter la baisse de température de l’animal. Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal. Une inspection détaillée et quotidienne de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal. Une souffrance visible liée au développement tumoral (poids tumoral supérieur à 10% du poids de la souris, diamètre supérieur à 12 mm, ulcération de la tumeur ou gêne au déplacement/motricité) est considérée comme point limite. De même, une détresse caractérisée par une perte de poids supérieure à 15% ou une prostration de l’animal sont considérées comme des points limites.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris immunodéprimées sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris et constaté que les souris nude de 4 semaines permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux).

Tous tués à l'issue, 185 rats reçoivent par gavage de la quétiapine à la moitié de la dose létale 50, seule ou associée à des opioïdes et des benzodiazépines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit s'attendre "possiblement au décès" en raison de la dose choisie, et décrit une sédation pouvant aller jusqu'au coma, avec hypothermie et dépression respiratoire. Chaque rat subit une chirurgie de vingt minutes à une heure, certains jusqu'à vingt prélèvements sanguins sur animal vigile, et ceux porteurs de sondes de télémétrie sont hébergés seuls jusqu'à la fin. L'objectif déclaré est de comprendre la toxicité d'un médicament de plus en plus impliqué dans des surdoses humaines.

Objectifs

La quétiapine est un antipsychotique de plus en plus prescrit dans la prise en charge de la dépression chez les patients bipolaires et dans la prise en charge de la schizophrénie ainsi que chez les patients présentant des troubles anxieux généralisés. En raison de la fragilité de ces patients et l’accès encore peu restreint en comparaison à d’autres médicaments tels que les opioïdes, le quétiapine est de plus en plus mésusée et se retrouvent impliqués dans un nombre d’overdoses grandissant au cours des 4 dernières années en particulier en Europe. Bien que la quétiapine ne soit décrite comme agissant directement sur les récepteurs aux opioïdes, la prise massive de quétiapine semble induire une dépression respiratoire en plus d’un effet cardiovasculaire qui peut aller jusqu’à entrainer le décès du patient, et pour laquelle le mécanisme d’action reste à ce jour inconnu. Ainsi, les effets neurorespiratoires délétères constatés en clinique en cas de surdosage à la quétiapine seule ou lors de poly-intoxications, nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs de caractériser selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique, les effets toxiques (neuro-respiratoires et cardiovasculaires) induits par l’administration par voie orale de quétiapine seule à forte dose, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central, notamment les opioïdes et les benzodiazépines que l’on retrouvent fréquemment détectés dans les prélèvements sanguins post-mortem des intoxications attribuées à la quétiapine.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité en particulier d’ordre neurorespiratoires et cardiovasculaires induits par l’administration de la quétiapine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre ce neuroleptique et les psychotropes étudiés que l’on retrouve de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients dépressifs, plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques au-delà du simple traitement symptomatologique pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour la caractérisation de la fonction ventilatoire, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (20 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage). Pour l'étude cinétique et métabolique, les animaux subiront tous une procédure chirurgicale (30 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (20 prélèvements ; 1 prélèvement : 30 secondes). Pour l'évaluation de la fonction respiratoire périphérique ou la fonction cardiaque, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (45 mins à 1h) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage).

Impact sur les animaux

On s’attend surtout à des effets indésirables de type sédation pouvant aller d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma en particulier dans le cas des associations médicamenteuses avec hypothermie et dépression respiratoire. De par le choix de la dose (50% de la dose létale 50), on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction des molécules et des associations qui seront administrées. De plus, un stress lié au gavage, aux anesthésies et aux injections pourrait être perçu par l’animal lors des procédures expérimentales. Un risque de fausse route suite au gavage est à prendre en compte. En outre, lors de la quantification de la réponse ventilatoire, les rats seront isolés seuls dans le système dédié pendant 6 heures. De plus, après la chirurgie d’implantation des sondes de télémétrie pour les mesures de la fonction diaphragmatique et cardiaque, les rats seront hébergés en cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation ce qui pourra également induire un stress.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire et cardiovasculaire intégrée sur animal entier ainsi que la caractérisation du comportement pharmacocinétique de la quétiapine dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.

Réduction

D'après nos expériences précédentes avec des modèles animaux similaires, il a été déterminé que l'utilisation d'un groupe de 8 animaux est suffisante pour conduire une analyse statistique fiable. Ce nombre de 8 rats par groupe a été prédéfinie par une approche statistique adéquate. De plus, il est prévu d'utiliser le même animal pour les mesures des gaz du sang artériel, les mesures de lactatémie, ainsi que l’étude pharmacocinétique, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux nécessaires grâce à une technique de dosage par microprélèvements. Enfin, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu à la suite des associations médicamenteuses, celles-ci ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des antalgiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées . Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.

Choix des espèces

Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est un modèle très pertinent notamment du fait de sa physiologie respiratoire et cardiovasculaire très proche de la physiologie humaine. En plus de sa taille importante qui permet une facilité et une répétabilité des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données pharmacocinétiques à l’Homme. Pour les études télémétriques (pléthysmographie, éléctromyographie et électrocardiographie), la pose des sondes est plus aisée et donc plus reproductible. Des rats jeunes adultes âgés de 6 à 8 semaines ayant un poids de 250 à 350 g seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec ce que l'on retrouve dans la littérature scientifique, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances en particulier dans un contexte de pathologie psychiatrique sous-jacente.

Implantées de cellules de glioblastome dans le crâne, 864 souris immunodéficientes reçoivent ensuite deux à trois injections de lymphocytes T humains, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Deux des trois voies d'injection testées passent par une nouvelle chirurgie intracrânienne de vingt-cinq minutes. Le porteur attend des douleurs post-opératoires, une cicatrisation difficile, une perte de masse musculaire, un comportement qu'il qualifie de névrotique, de l'agressivité, de la prostration et un penchement de la tête. Après une première phase sur 324 souris, la voie retenue sera appliquée à 540 souris supplémentaires.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes, affectant 3 personnes sur 100 000. Elles sont caractérisées par leur grande agressivité, et leur résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique conduit à une survie inférieure à 15 mois chez la moitié des patients atteints. La mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc primordiale. Les immunothérapies, basées sur l’exploitation du système immunitaire du patient, sont extrêmement prometteuses dans le traitement des glioblastomes, et contribuent au développement actuel de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous nous intéressons a une sous-population spécifique de cellules immunitaires, appelés lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs, qui a déjà montré son potentiel pour le traitement de différents cancers, mais n’a pas été exploitée jusqu’ à présent pour le traitement des glioblastomes. Nous avons effectué de nombreuses expériences préliminaires in-vitro montrant que ces lymphocytes T sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses provenant de tumeurs cérébrales de patients. Néanmoins, pour compléter ces études in-vitro, il nous faut valider et approfondir les résultats, notamment en déterminant si les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs sont capables d’infiltrer et d’éliminer durablement les tumeurs de cerveau dans un organisme vivant (in-vivo), et ce en utilisant des modèles animaux. L’objectif de cette étude est donc de mettre en évidence les propriétés anti-glioblastome de ces lymphocytes T γδ in-vivo, pour permettre ensuite leur utilisation en essais cliniques.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’améliorer la connaissance fondamentale des propriétés anti-tumorales de cette sous-population de cellules immunitaires, les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs. Il nous permettra notamment de mieux comprendre comment ces cellules peuvent atteindre la tumeur, la reconnaitre spécifiquement, et l’éliminer. D’autre part, ce projet constituera la première évaluation de l’efficacité de cette thérapie cellulaire chez des organismes vivants. Cette évaluation préliminaire est nécessaire avant tout développement d’essai clinique chez les patients atteints de glioblastome. Ainsi, si les résultats obtenus dans ce modèle sont satisfaisants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en essais cliniques et plus généralement pour la prise en charge des patients atteints de glioblastomes. Améliorer la survie de ces patients est actuellement un enjeu de santé public majeur.

Procédures

La totalité des animaux de ce projet (864 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’implantation intracrânienne de cellules de glioblastome. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de dix minutes par souris. Suite à cette chirurgie, la taille des tumeurs sera suivie par une méthode d’imagerie non invasive, qui dure 20 minutes environ, et sera réalisée 2 fois par semaine, entre le jour 0 et le jour 28 d’expérimentation (post-implantation). Suite à l’implantation de cellules de glioblastome, les animaux seront injectés 2 à 3 fois par la thérapie cellulaire de lymphocytes T (aux jours 7 puis 14 puis après implantation). Cette injection sera faite selon trois procédures différentes. Les deux premières seront des procédures chirurgicales d’implantation intracrânienne de lymphocytes T, soit au niveau de la tumeur, soit au niveau du ventricule, réalisées sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de 25 minutes par souris. La troisième procédure d’injection sera intraveineuse. Ces trois méthodes d’injection de lymphocytes T concerneront chacune 108 souris dans un premier temps (324 souris au total). Puis, dans un second temps, la méthode associée au meilleur bénéfice pour les souris sera sélectionnée, et concernera alors 540 souris supplémentaires.

Impact sur les animaux

Suite à l'implantation dans le cerveau des souris de cellules de glioblastome puis de lymphocytes T, les effets indésirables suivants peuvent être attendus : des douleurs post-opératoires, des points sautés suite à la chirurgie, une cicatrisation difficile, un comportement anormal (dont agressivité, perte de masse musculaire, comportement névrotique, prostration), ou encore un penchement de la tête. Par ailleurs, sur la durée totale des expérimentations, une perte de poids des animaux peut être attendue.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris concernées par ce projet (864 animaux) devront être euthanasiées pour permettre l'analyse de leur cerveau et ainsi l'étude des lymphocytes T injectés et du bénéfice apporté par cette thérapie sur la progression de la tumeur et la survie des souris.

Remplacement

La capacité des lymphocytes T utilisés ici à éliminer des cellules tumorales de glioblastomes issues de différents patients a déjà été démontrée in vitro, posant ainsi de solides bases pour cette étude in vivo. L’utilisation de ce modèle animal répondra uniquement aux questions ne pouvant être élucidées in vitro, notamment en déterminant si les lymphocytes T peuvent migrer jusqu’à la tumeur, l’infiltrer, éliminer les cellules tumorales et améliorer significativement la survie des souris.

Réduction

Grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques, nous utiliserons le minimum nécessaire d’animaux pour être statistiquement significatifs et scientifiquement irréprochables. Par ailleurs, un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera effectué par imagerie, ce qui permettra de réduire le nombre de souris par groupe expérimental. Enfin, nous utiliserons toutes les femelles et tous les mâles issus de croisements, ce qui réduit de 50% l’utilisation des animaux.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être sera pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalué par le personnel zootechnique expérimenté. Notamment, afin de réduire les douleurs liées aux chirurgies d'implantation de tumeurs et aux procédures de transfert de lymphocytes T, des protocoles analgésiques et antalgiques seront mis en place. Un suivi quotidien des animaux permettra aussi de prévenir leur affaiblissement et de prendre une décision rapide quant à leur sacrifice. Enfin, le suivi non invasif de la croissance des tumeurs par imagerie participera à maximiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Un modèle de souris (Mus musculus) immunodéficientes est utilisé. Leur système immunitaire ne possède pas de lymphocytes. Ce modèle présente un double intérêt pour ce projet : -Les tumeurs de glioblastomes issues de patients s’y développent de manière très reproductible, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce modèle est très pertinent d’un point de vue préclinique, car les tumeurs y reconstituent les caractéristiques complexes observées chez les patients humains. - Ce modèle immunodéficient permet le transfert de lymphocytes T humains sans que ceux-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Nous utiliserons des souris âgées de 7 à 9 semaines, qui permettent une croissance tumorale optimale en s’affranchissant de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

200 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés dans des eaux saumâtres puis acclimatés à l'eau douce, jusqu'à 96 d'entre eux sont privés de nuit pendant un mois par un éclairage continu, jusqu'à 96 reçoivent une alimentation contaminée par un biocide, et 33 à 48 cumulent les deux. Le porteur reconnaît que les effets du biocide sont difficiles à anticiper faute de littérature, et envisage dans le pire des cas des lésions internes, un arrêt de la prise alimentaire ou une mortalité. 36 poissons sont isolés une heure dans une chambre de choix, ce que le porteur décrit lui-même comme potentiellement très stressant pour une espèce grégaire.

Objectifs

L’objectif général du projet est d’acquérir des connaissances concernant les effets de stress urbains sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Plus précisément, il s’agira d’évaluer les impacts de la pollution lumineuse nocturne et d’une pollution par un produit chimique sur le mulet-porc Chelon ramada, un poisson très commun dans les eaux côtières et saumâtres urbanisées européennes (ex : les ports, le long des quais). Le produit chimique, un biocide largement utilisé dans les détergents et produits ménagers en Europe, a été choisi car il est fréquent d’en retrouver dans l’eau. Les poissons que nous allons impliquer seront exposés soit à la pollution lumineuse, soit à la contamination de leur alimentation, soit aux deux, pendant un mois. A l’issue de cette période, nous mesurerons les effets de ces pollutions sur 1) leur niveau de stress via l’hormone « cortisol » que l’on pourra retrouver dans l’eau de leur bac et dans leur sang et via la présence de lipides spéciaux qui témoignent de la dégradation des cellules de l’animal ; 2) l’accumulation du polluant dans les organes des poissons ; 3) la façon dont les poissons se nourrissent et s’ils continuent à acquérir des acides gras qui leur sont essentiels ; 4) quelle(s) zone(s) en fonction de leur luminosité les poissons favorisent. Les résultats obtenus auront une portée internationale, les facteurs de pollution étudiés étant largement répandus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de l’étude sont, à court terme, de compléter les connaissances en matière de réaction, par le mulet-porc, à un stress lumineux d’une durée d’un mois. A moyen terme, les résultats obtenus permettront d’appréhender les effets singuliers et combinés de deux facteurs de stress urbains sur cette espèce largement répandue dans le monde. A long terme, cette démarche expérimentale qui intègre des analyses sur plusieurs éléments biologiques (biofilms, poissons), permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique robustes sur les effets de la lumière artificielle nocturne et d’une pollution chimique émergente provoquée par le polluant testé et leurs éventuelles interactions, sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains. Ces connaissances permettront de proposer des solutions pour optimiser la gestion des espaces publics en ville, en facilitant notamment l’arbitrage entre suppression, réduction ou mitigation des éléments susceptibles d’avoir des répercussions sur l’environnement.

Procédures

Les mulets-porcs seront pêchés dans des eaux saumâtres impactées par l’urbanisation. Des filets seront maintenus face au courant pendant 5 mn permettant de limiter le risque de les blesser. Ils seront transportés en moins de 2 h dans des sacs adaptés, dans un véhicule agréé, jusqu’au lieu de l’expérimentation où ils recevront un traitement antibiotique contre les pathologies. Les mulets-porcs étant une espèce capable de s’adapter à des changements de salinité, c’est-à-dire pouvant vivre aussi bien en eau douce qu’en eau salée, il faut qu’ils s’acclimatent à l’eau de rivière qui alimentera les dispositifs expérimentaux et qui est d’une salinité inférieure à celle du milieu de capture. Pour cela, des seuils d’acclimatation progressifs seront réalisés, accompagnés d’observations comportementales continues. Les poissons seront nourris avec un aliment commercial dont l’appétence en captivité a été éprouvée lors d’une étude préalablen. Un mois après, les poissons seront répartis en 12 lots de 11 à 16/17 individus (selon la survie des surnuméraires), exposés à des cycles d’éclairage différents (c’est-à-dire à une photopériode normale avec un cycle journalier comprenant des successions jour/nuit et une photopériode altérée avec un éclairage en continu) et à une alimentation saine ou contaminée à une concentration retrouvée dans le milieu naturel (comme dit dans le point 5.5.1). 36 poissons seront ensuite soumis à des tests comportementaux d’une durée d’1 h : une fois placés individuellement dans un dispositif appelé « chambre de choix », ils pourront se déplacer dans des zones plus ou moins éclairées. Ceci permettra d’évaluer l’effet de leur conditionnement précédent (exposition à une photopériode altérée ou normale, alimentation saine ou contaminée), sur leur comportement en matière de choix d’ambiance lumineuse. Tous les poissons seront anesthésiés à diverses étapes pour la réalisation d’une prise de sang par individu, nécessaire à l’évaluation de leur niveau de stress via le dosage du cortisol suite à leur exposition. Ils seront ensuite tous euthanasiés aux diverses étapes du projet (pêche, tests d’éclairage et d’alimentation et des chambres de choix).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à d’éventuelles blessures (écaillage, lésions externes) et à un stress lors de leur capture, puis lors du transport et de la phase d’acclimatation à l’eau de rivière. Une mortalité, faible selon une précédente étude, est possible au cours de ces étapes. Duant le projet, 66 à 96 individus (selon la survie des surnuméraires) seront exposés à une absence totale de nuit pendant un mois. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne en milieu urbain, qui sera quantifié par l’expérimentation. Les effets attendus sont d’ordres comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire) et physiologique (accumulation du cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau). Dans un deuxième temps, 66 à 96 individus selon la survie des surnuméraires seront exposés, pendant un mois, à une alimentation contaminée par le biocide à des doses similaires à celles que l’on retrouve dans la nature. Des effets physiologiques ou comportementaux pouvant potentiellement affecter l’état de santé des animaux sont là aussi possibles, mais ils sont difficiles à anticiper en raison du faible nombre, voire de l’absence, d’articles scientifiques à leur sujet. On peut toutefois, dans le pire des cas, s’attendre à des lésions internes, une modification du comportement des animaux (arrêt de la prise alimentaire, mobilité accrue ou au contraire comportement de prostration) voire une mortalité (bien que peu probable de par les faibles concentrations de polluant utilisées). Ce sont ces effets qui seront analysés. Enfin, 33 à 48 animaux selon la survie des surnuméraires seront soumis à ces deux facteurs de stress réunis : la pollution lumineuse et la pollution chimique dans l’alimentation. Les effets attendus sont identiques à ceux décrits précédemment, avec une intensité éventuelle plus importante liée au cumul des stress. Enfin, 36 poissons seront transférés individuellement dans les chambres de choix décrites dans le point 5.6.1 où ils seront isolés durant une heure, ce qui peut générer un stress important. Les effets attendus sont dans ce cas d’ordre comportemental (agitation ou prostration) et physiologiques (excrétion et accumulation de cortisol).

Devenir

Les 200 poissons impliqués seront tous euthanasiés pour des analyses de leurs tissus et organes.

Remplacement

L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues par cette expérimentation ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle et dans un contexte appliqué et adapté aux objectifs du projet de recherche.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé correspond au strict minimum requis pour l’obtention de résultats fiables et interprétables vis-à-vis de la question de recherche abordée. Ce nombre a été contraint pour respecter le principe de réduction en se limitant à tester l’interaction entre absence ou présence d’un à deux facteurs de stress. Les nombres impliqués permettront néanmoins d’obtenir des conclusions statistiques robustes. Chaque lot de poissons impliqués est constitué d’un nombre minimum d’animaux suffisant dont un total de 63 mulets-porcs surnuméraires pour pallier une mortalité éventuelle au cours des étapes de l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux ne seront manipulés à l’aide d’épuisettes à mailles fines que lorsque ce sera strictement nécessaire (étapes de capture/transport puis répartition dans les bacs d’accueil). Tous les transferts opérés sur le lieu de l’expérimentation se feront à l’aide d’un pichet avec couvercle, grâce auquel seront évités les émersions et les risques de blessure. Les pêches seront réalisées selon des protocoles utilisés en routine par notre établissement ce qui permettra d’en optimiser l’efficacité. Les poissons seront capturés avec des haveneaux de surface positionnés face au courant (pas de tractage actif) pendant 5 min seulement afin de limiter les dommages causés par le filet. La sélection d’individus immatures juvéniles limitera l’impact des pêches sur les ressources naturelles. Un traitement antibiotique post-pêche sera appliqué pour limiter l’incidence de pathologies pouvant affaiblir les poissons. Une surveillance quotidienne de leur état sanitaire et général sera garantie. Les poissons seront nourris à satiété avec un aliment dont l’appétence a été éprouvée au cours d’une précédente étude. Des mesures continues de température, salinité et oxygène dissous et hebdomadaires des produits azotés garantiront la qualité de l’eau. Les bassins offriront un espace de mobilité confortable aux animaux : en fonction des étapes du projet, la quantité de poissons par bac sera faible et donc garante de leur bien-être. Les poissons seront tout le temps conservés en groupe, ce qui correspond à leur mode de vie habituel, à l’exception d’une durée d’une heure pendant laquelle 36 poissons seront placés dans des chambres de choix comme évoqué précédemment. A l’exception de cette dernière étape, un couvercle transparent sera posé sur chaque bac pour éviter tout échappement (saut) tout en permettant la diffusion de la lumière et le contrôle des poissons par les animaliers sans les perturber. Les bacs seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile grégaire se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires sur le fond. Les bacs seront en matériau opaque de couleur sombre, ce qui permettra de les distinguer visuellement les uns des autres et de produire une ambiance proche de celle du milieu d’origine des poissons.

Choix des espèces

Le mulet-porc Chelon ramada est présent dans la majorité des masses d’eaux saumâtres urbanisées de climat tempéré, ce qui en fait un modèle d’étude pertinent pour aborder l’impact des stress urbains sur les écosystèmes aquatiques. Son statut de conservation est non-préoccupant et c’est l’espèce dominante dans la zone de pêche ciblée si bien que l’impact de sa capture sur les ressources naturelles sera minimisé. Les animaux seront des juvéniles de 10 ± 3 cm de longueur totale, un stade de développement où ils consomment exclusivement du biofilm. Les jeunes mulets constituent ainsi un vecteur essentiel des transferts d’énergie entre compartiments benthique (fond) et pélagique (colonne d’eau) des réseaux alimentaires. Cette caractéristique permet d’appréhender l’effet des stress urbains non seulement sur l’espèce cible mais plus largement sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains où l’espèce est représentée. La sélection d’individus juvéniles limitera également les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Leur forte capacité d’adaptation à l’eau salée et à l’eau douce permettra de faciliter leur acclimatation à l'eau douce au sein des dispositifs expérimentaux. Enfin, le savoir-faire scientifique et technique de notre équipe, ainsi que ses connaissances de l’espèce cible, permettront d’optimiser l’ensemble des interventions durant le projet.

Une partie réutilisée dans d'autres protocoles, 163 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré : les 69 chez qui une polyarthrite rhumatoïde est induite seront tués pour des analyses après leur mort, les 94 autres, contrôles ou sans symptômes, seront réaffectés après avis vétérinaire. Le porteur décrit une maladie provoquée qui détruit les cartilages et bloque les articulations, avec douleur, gonflement, perte de mobilité et perte de poids. Chaque animal subit quinze anesthésies, quinze prélèvements sanguins, trois biopsies ganglionnaires et des séances d'imagerie pouvant durer jusqu'à trois heures. Le porteur indique que de nombreux tests sont réalisés in vitro avant de passer au primate non-humain, sans que la dynamique des cellules immunitaires à l'échelle du corps entier puisse selon lui s'étudier autrement.

Objectifs

En France, 5 millions de personnes sont touchées par des maladies auto-immunes (comme le diabète de type 1, ou la polyarthrite rhumatoïde). Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire. Ce dysfonctionnement peut se traduire par la production d’anticorps dirigés contre les propres cellules du malade ou par une atteinte et une inflammation des organes touchés. Certaines d’entre elles évoluent en maladies inflammatoires chroniques (comme la polyarthrite rhumatoïde). Le domaine de l'imagerie médicale avec la Tomographie à Emission de Positons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique et l’imagerie optique est en plein essor. Cependant son application à la mesure et à la surveillance du suivi de l'état immunitaire des patients en est encore à ses débuts. Le développement d’outils, comme des immuno-traceurs, permettrait de visualiser directement in vivo certaines populations cellulaires spécifiques du système immunitaire et de pouvoir le suivre au cours du temps en conditions saines ou pathologiques. Ceci permettrait de caractériser la réponse immunitaire survenant lors de pathologies d’intérêt. Le développement de traceurs pour l’imagerie contribuera à une approche personnalisée de prise en charge de ces pathologies. Ainsi, le développement et l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques sera simplifié. Ce projet a ainsi pour but de développer des approches en imagerie pour mieux caractériser les processus inflammatoires dans un modèle de polyarthrite rhumatoïde et par la suite de pouvoir disposer d’outils permettant de tester l’efficacité thérapeutique de nouvelles immunothérapies. Cette maladie auto-immune se manifeste par une inflammation chronique des articulations conduisant à la destruction de certaines d’elles. Il serait donc pertinent de pouvoir visualiser, par imagerie immuno-TEP, les cellules impliquées dans l’inflammation. Cette application d’imagerie in vivo est la combinaison de modalité d’imagerie TEP avec l’injection de radiotraceurs à base d’anticorps ou dérivés d’anticorps ayant une grande spécificité pour leur cible. Localement, la microscopie optique permettra de visualiser les recrutements cellulaires au niveau des articulations inflammées. Ces données d’imagerie permettront de mieux comprendre et de prédire la réponse immune à l’inflammation et par conséquent d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Ce projet se déroulera par études successives afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune se manifestant notamment par un dérèglement des cellules immunitaires de la première ligne de défense de l’organisme déclenchant à elles seules une inflammation chronique qui conduit à la destruction de certaines articulations. Il est donc important de visualiser, par imagerie TEP, de manière préventive les cellules impliquées dans l’inflammation. Par conséquent, le bénéfice de ce projet est de disposer d’outils, comme des immuno-traceurs, permettant de cibler et visualiser les cellules du système immunitaire dans un contexte inflammatoire de manière minimalement invasive. De cette manière et dans le but ultime de mieux comprendre et prédire la réponse immune à l’inflammation et par la suite d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Actuellement, les traitements utilisés sont adaptés à chaque personne selon l’importance de la pathologie, l’efficacité et tolérance des personnes face aux médicaments. Il existe des traitements antirhumatismaux de fond qui agissent directement sur la maladie. Malheureusement, ces traitements sont insuffisants pour certains patients. De ce fait, les immunothérapies cherchent à moduler plus précisément la réponse immunitaire et inflammatoire pour éviter son dérèglement. Ainsi, cette thérapie contribue à rétablir l’équilibre dans l’organisme en tenant compte de ses mécanismes naturels.

Procédures

- Anesthésie générale (15 anesthésies, durée 30min) pour les prélèvements et observations cliniques (température, poids…) - Prélèvement de sang pendant 6 semaines (15 prélèvements). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. - Biopsie ganglionnaire : 3 biopsies lors de l’études espacées d’au moins deux semaines - Imagerie TEP sur corps entier (4 séquences). Les séquences d’imagerie effectuées sur animaux anesthésiés pourront durée jusqu’à 3h. - Imagerie Bi-photon sur les articulations distales (2 séquences). Les séquences d’imagerie pourront durer jusqu’à 2h

Impact sur les animaux

La polyarthrite rhumatoïde est une affection inflammatoire chronique qui touche principalement les articulations distales de la main et du pied. Sa progression mène à une destruction des cartilages articulaires et une ankylose (diminution voire impossibilité de mouvement) des articulations. Cela se traduit cliniquement par de la douleur, un gonflement articulaire, une perte de mobilité, une perte de poids, qui peuvent être source de stress chez l’animal. D’un point de vue biologique, la polyarthrite rhumatoïde peut entraîner une anémie, une neutropénie, une éosinophilie ou encore une thrombopénie. Ainsi que les anesthésies nécessaires aux prélèvements de suivi de la pathologie et aux examens d’imagerie peuvent provoquer une légère perte de poids et un stress transitoire chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant développés une arthrite rhumatoïde seront euthanasiés en fin d’étude pour des analyses post-mortem. Ces analyses permettront d’identifier les cellules immunitaires présentes dans les articulations inflammées et de pouvoir les corréler aux résultats d’imageries in vivo réalisés précédemment. Les animaux contrôles ou ne présentant pas de symptômes seront réutilisés dans d’autres protocoles après évaluation favorable par le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies d’imagerie, transposables directement chez l’homme, permettant de détecter spécifiquement des cellules immunitaires spécifiques dans le contexte du modèle de pathologies auto-immunes. Ainsi, les radiotraceurs mis en œuvre et testés permettront d’évaluer la distribution et dynamique de certains acteurs de la réponse immunitaire à l’échelle de l’organisme entier et à l’échelle cellulaire au niveau des sites d’inflammation dans un modèle de maladie inflammatoire chronique, la polyarthrite rhumatoïde. L’impact de molécules thérapeutiques sur cette réponse avant leur utilisation chez l’homme sera aussi évalué. Ces analyses nécessitent un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire) ainsi que le changement induit par un traitement. A ce jour, la distribution et la dynamique des cellules immunitaires au niveau du corps entier ne peuvent pas être étudiés in vitro. Néanmoins, un grand nombre de tests (toxicité, criblage…) seront réalisés in vitro avant de le tester sur le modèle primate non humain.

Réduction

Pour mettre en place ce modèle d’arthrite rhumatoïde chez le macaque Cynomolgus et de permettre de tester des molécules thérapeutiques, nous nous baserons, dans la mesure du possible, sur les modèles déjà décrit dans la littérature afin de maximiser nos chances de réussites. Nous commencerons sur des groupes de 3 animaux. Le nombre d’animaux pourra être réduit, dans la procédure 1, si les premiers schémas d’induction de polyarthrite rhumatoïde sont satisfaisants. Concernant les tests statistiques, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques non paramétriques pour comparer les groupes entre eux.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés. Nous serons cependant très vigilants lorsque nous mettrons en place le modèle et ferons des analyses d’indicateurs réguliers en utilisant des grilles de score (la fréquence des observations augmentera pendant la phase aigüe). De plus, nous possédons, par exemple, un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours, des numérations formules sanguines anormales ou bien atteinte de critère d’arrêt spécifique au projet. Lors de la mise en place du modèle, un vétérinaire examinera lui-même les animaux régulièrement (en fonction de l’apparition des symptômes) afin d’anticiper une détérioration trop importante de la santé de l’animal et, au besoin, pouvoir procéder à une euthanasie en cas d’atteinte des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et plusieurs grilles de score permettant d’évaluer l’état clinique d’avancement de la pathologie, le comportement et la douleur de l’animal seront mises en place. De plus, une analgésie sera instaurée en fonction de l’état clinique de l’animal, ou même en amont pour prévenir un phénomène douloureux. Enfin, ce projet ne nécessite pas de mise en hébergement en individuel, ainsi les liens sociaux seront conservés dans les groupes.

Choix des espèces

Le macaque Cynomolgus est retenu pour ce projet pour plusieurs raisons : - La réponse immunitaire similaire à celle de l’homme, et évaluation de la réponse immune possible dans les tissus. - Les réponses aux vaccins et aux traitements dans cette espèce sont semblables à celles observées chez l’homme - Ils ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles de polyarthrite rhumatoïde Les animaux utilisés seront au stade de développement adulte (à partir de 3 ans) car ils ont un système immunitaire mature. Le système immunitaire évolue en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Les candidats radiotraceurs ou candidats traitements étudiés pourront faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature ».

Pour un premier criblage in vivo de radiotraceurs à visée diagnostique ou thérapeutique, 2 400 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses après leur mort. Certaines portent une tumeur greffée sous la peau, et toutes reçoivent une injection intraveineuse puis, si besoin, un prélèvement sanguin par jour pendant dix jours sur animal vigile maintenu dans un appareil de contention. Ce projet ne teste aucun traitement, il sélectionne les molécules qui feront l'objet d'études ultérieures, elles-mêmes soumises à une nouvelle demande d'autorisation. Le porteur présente ce criblage comme un raffinement, au motif qu'il réduira les effectifs des études suivantes.

Objectifs

Notre équipe de recherche est spécialisée depuis de nombreuses années dans le développement de radiotraceurs à visée diagnostique et/ou thérapeutique dans le domaine de l’oncologie. Après validation de nos molécules in vitro, il est indispensable d’effectuer un premier criblage in vivo des molécules précédemment sélectionnées afin de déterminer leur biodistribution et leur spécificité pour leur cible in vivo grâce à un suivi par imagerie nucléaire. Après injection du radiotraceur, l’imagerie nucléaire est réalisée in vivo chez l’animal anesthésié à différents temps. Les animaux utilisés pourront être des individus sains ou être porteurs de tumeurs implantées en sous-cutané en fonction du modèle d’étude et de la spécificité des molécules à tester. Ce premier criblage permettra d’identifier les molécules les plus prometteuses afin de pouvoir les engager dans un second temps dans des études plus conséquentes qui feront l’objet d’une demande d'autorisation de projet spécifique.

Bénéfices attendus

L’imagerie permettra de sélectionner plus rapidement des molécules potentiellement candidates au transfert clinique dans différentes pathologies cancéreuses et permettra de réduire le nombre d’animaux en engageant dans de plus grosses études seulement les molécules les plus pertinentes. A plus long terme, une sélection rapide des molécules candidates, permettra d'engager plus rapidement ces molécules dans des études plus appronfondies en vue d'un passage en "first into Human".

Procédures

Pour tous les animaux : - une injection intra veineuse (durée

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle (tumeur sous cutanée) peut entrainer une gêne voir une douleur légère en terme de déplacement de l'animal et de ressenti cutanée. Les injections intraveineuses se faisant sur animal vigile dans un appareil de contention (durée inférieur à 1 minute), l'animal peut ressentir un stress modéré pendant la procédure.

Devenir

Des analyses ex vivo sont prévues à l'issue de la procédure. Ainsi, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de cette procédure.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostique et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation statistique des résultats en prenant en compte l’homogénéité des modèles notamment pour les animaux porteurs de tumeur. De plus, les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Nous prévoyons au plus performant de notre activité 2400 souris immunocompétentes et souris immunodéprimées. Il s’agit ici d’un nombre maximal sur 5 ans.

Raffinement

Ces études préliminaires constituent un raffinement à part entière car elles permettront une présélection des molécules sur un faible effectif d’animaux. Les molécules ayant montré le meilleur potentiel pourront être ensuite engagées dans des études requérant un effectif plus important et feront l’objet d’une nouvelle demande d’autorisation. Les examens d’imagerie permettent de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal au cours duquel chaque animal est son propre contrôle. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être réduits par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Certaines lignées cancéreuses provenant de la souris, il est possible d’utiliser des souris immunocompétentes. Souris adultes âgées de 5 à 6 semaines pour optimiser la prise de greffe et éliminer toute modification du statut hormonal des animaux due à la puberté