Procédures modérées
Rôle, impact et modulation des cellules myéloïdes immunosuppressives dans les cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 570 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales dans la glande mammaire ou le poumon, puis des injections d'hormonothérapie, de facteurs de croissance ou de lymphocytes, pour étudier des cellules immunitaires qui favorisent les cancers. La croissance tumorale provoque une asthénie et les souris sont tuées par dislocation cervicale avant d'atteindre les points limites, pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système in vitro ni non-vertébré ne peut mimer ces interactions immunitaires.
Objectifs
Le système immunitaire protège généralement contre l'apparition des cancers. Cependant, dans certains cas, les cancers peuvent échapper à protection par le système immunitaire. Des cellules immunitaires particulières, appelées « cellules myéloïdes suppressives (CMS) » contribuent à cet échappement. Ces cellules sont en partie responsables du manque d’efficacité des immunothérapies chez de nombreux patients. De nombreux sous-types de CMS ont été décrites, ce qui rend leur identification problématique. En dehors de leur capacité à bloquer le système immunitaire, les CMS participent à la mise en place de vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au processus métastatique. La notion que ces cellules pourraient s’associer avec les cellules tumorales circulantes (cellules tumorales présentes dans le sang, migrant depuis la tumeur primaire vers des sites distants métastatiques) est un concept récent sur lequel notre laboratoire travaille activement. Ce projet a pour objectifs de caractériser l’influence des CMS sur l’immunité anti-tumorale, la préparation des sites pré-métastatiques et la réponse aux thérapies en utilisant des modèles de cancer murins établis, représentatifs de cancers humains et avec lesquels notre équipe a précédemment publié. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Déterminer la cinétique d’apparition de différentes sous-types de CMS dans différents organes au cours du développement tumoral. En parallèle, une caractérisation précise d’amas cellulaires associant cellules tumorales et cellules immunitaires (dont ces CMS) dans le sang sera réalisée. 2) Déterminer l’influence de sous-types distincts de CMS sur l’apparition de micro-métastases dans des organes distaux ; 3) Evaluer si l’hormonothérapie, des facteurs de croissance ou des chimiothérapies utilisées dans le traitement de nombreux cancers modifient le nombre et les fonctions de ces cellules dans un modèle de cancer mammaire et pulmonaire ; 4) Evaluer le rôle de ces cellules dans la réponse aux immunothérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des informations nouvelles concernant les multiples rôles des cellules myéloides suppressives dans les cancers. 1) Les données obtenues devraient d'abord permettre de mieux définir les fonctions protumorales de sous-populations différentes de cellules myéloides suppressives. 2) de nouveaux résultats devraient être générés concernant la capacité de ces cellules à préparer les organes situés à distance de la tumeur primaire à l'arrivée de cellules tumorales migrantes (métastatiques). 3) Enfin, ces travaux apporteront des informations essentielles sur l’impact de l’hormonothérapie et de facteurs de croissance (utilisés cliniquement pour prévenir les risques d'infection) sur les différentes sous-populations myéloïdes et le développement tumoral.
Procédures
Model de souris de cancer du sein : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Model de cancer du poumon : injection intrapulmonaires de cellules tumorales (~2min). Des injections intrahépatiques, intraspléniques et intrapulmonaires de cellules myéloïdes seront effectuées (
Impact sur les animaux
Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la préhension et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une asthénie générales. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puis les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux.
Devenir
A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires
Remplacement
L'utilisation de modèles de souris de cancers est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives: en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permet pas la génération de résultats interprétables puisque ne prenant pas en compte les multiples interactions cellulaires et facteurs solubles jouant un rôle à distance dans l'organisme impliqués dans la régulation du système immunitaire. Il n'est pas possible de mimer in vitro les influences réciproque entre les très nombreuses populations de cellules présentes in vivo. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules myéloïdes suppressives in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs lorsque possible les groupes contrôles seront communs à différentes expériences. Les animaux sont hébergés e à raison de 5 souris par cage. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu.
Raffinement
La procédure majeure commune à toutes les expériences proposése consiste en l’implantation orthotopique de cellules tumorales syngénéiques. Cette procédure est largement reconnue et adaptée à l’étude des cancers in vivo. Elle présente les avantages suivants : • une mise en œuvre aisée ne nécessitant pas d’acte chirurgical. • un suivi longitudinal simple donc sans manipulation engendrant une douleur ou un stress important de l’animal D’un point de vue éthique cette méthode permet de : • restreindre le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal. En effet il n'y aura pas besoin de mettre à mort des animaux pour obtenir le suivi de points intermédiaires dans l'évolution tumorale, tout sera fait sur les mêmes animaux qui iront jusqu'au point final avant d'être mis à mort. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. Les animaux seront anesthésiés comme indiqué lorsque requis, lors de procédures spécifiques.
Choix des espèces
Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle (limité a des endpoints partiels, au niveau du compartiment sanguin). L'impact du microenvironnement tumoral sur le système immunitaire, et les modifications dynamiques de la fonction et du phénotype des cellules immunitaires étudiées sont impossibles éthiquement et techniquement à mettre en évidence chez l'homme. L'étude chez la souris (6-8 semaines) est la seule approche permettant une analyse spatio-temporelle de la régulation des réponses immunitaires antitumorales. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro (absence des complexes réseaux d'interraction cellulaire et cytokinique régulant l'immunité antitumorale) et sans l'utilisation de souris immunodéficientes. Des systèmes non-vertébrés ne sont en outre pas adaptés puisque ne possèdant pas de système immunitaire équivalent à celui des mammifères. La souris comme animal modèle est Sources: PubMed, CEVMA.
Evaluation de l’efficacité d’un nouveau traitement dans un gliome pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe des cellules tumorales dans le tronc cérébral au deuxième jour après la naissance, puis suit la croissance de la tumeur sous anesthésie trois fois par semaine et administre des agents anticancéreux, pour un cancer pédiatrique incurable. Les souris sont euthanasiées pour prélever et analyser les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Nos études récentes ont mis en évidence une nouvelle combinaison de deux composés chimiques validée chez la souris, mais nos données sur les lignées cellulaires montrent que certaines cellules tumorales résistent à ce traitement en se transformant en cellules souches tumorales. Le projet vise à mieux comprendre ce phénomène afin d’optimiser l’efficacité de notre combinaison médicamenteuse. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux drogues et de la combinaison sur la pourcentage de cellules souches cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.
Bénéfices attendus
Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seules ou en association, sur la proportion de cellules souches tumorales aau sein des tumeurs. Mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs continuent de se développer en présence de ces composés, même si elles se développent moins vite que les tumeurs chez les souris contrôles.
Procédures
Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress termique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.
Devenir
Les 120 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.
Réduction
Nos effectifs seront déterminés de façon adéquate et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
AMENDEMENT : Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans des modèles murins de diabète de type 1
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
6 194 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection virale intra-péritonéale, un transfert de flore intestinale par gavage d'eau fécale et un suivi de glycémie, pour étudier le rôle de certains lymphocytes dans le diabète de type 1. Les souris devenues diabétiques développent une hyperglycémie et sont mises à mort dans les huit jours suivant sa détection, puis disséquées pour l'analyse du pancréas, du foie et de l'intestin. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" parce que ces cellules immunitaires ne s'étudient pas in vitro.
Objectifs
Notre projet porte sur le rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune qui se caractérise par la destruction des cellules productrices d’insuline par le système immunitaire. Les cellules immunitaires infiltrent les îlots pancréatiques en déclenchant une inflammation qui aboutit à la destruction des cellules productrices d’insuline principalement par des lymphocytes T auto-réactifs. Cependant, les mécanismes de recrutement et d’activation de ces cellules par les îlots ne sont pas encore connus. Certaines infections virales et le microbiote sont impliqués dans la destruction des cellules productrices d’insuline mais aussi dans les altérations intestinales dont souffrent les malades atteints d’un diabète de type 1. Les lymphocytes T invariants associés aux muqueuses sont fortement perturbés chez les enfants et les modèles murins à l’apparition du diabète. De manière intéressante, ces cellules répondent à la fois face au microbiote, mais également aux infections virales.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes d'action par lesquels les cellules MAIT participent à l'apparition du diabète de type 1 et des complications associées aux infections virales.
Procédures
L'infection virale est induite par une injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Les différents traitements de molécules inhibitrices sont réalisés par injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Le transfert de flore intestinale est réalisé par gavage d'eau fécale (durée 1 minute). Certains animaux subirons une anesthésie de 5 minutes pour permettre une injection intraveineuse pour limiter le stress. Pour le suivi de la glycémie, une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent développer une hyperglycémie, mais cette hyperglycémie reste modérée car les animaux sont suivis quotidiennement et sacrifiés dans les huit jours après la détection d'une hyperglycémie. L'infection virale peut induire un état fébril modéré et transitoire. Les injections intra-péritonéales ainsi que la mesure de la glycémie sont une nuisance pour l'animal.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses des tissus implliqués dans le diabète (pancréas, foie, intestins) : histologie, cellules immunes présentes dans les tissus, cytokines.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas et l'analyse de leurs interactions dans l’organisme au cours du développement de la maladie ne peut être faite in vitro. Néanmoins ce projet est associé à de multiples manipulations in vitro visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisés in vivo pour valider ces donnés est calculé sur la base d'un plan expérimentale stéréotypé permettant d'obtenir la puissance statistique nécéssaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Notre stratégie vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant des tests staistiques appropriés à chaque procédure expérimentale, de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. De plus, en amont des procédures expérimentales, des expériences in vitro seront réalisées afin de mieux sélectionner les échantillons à tester in vivo. Chaque procédure fait l'objet d'analyses complètes qui permettent d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants et un panel large d’informations.
Raffinement
Pour chacune de ces procédures, le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement (maison et coton) est ajouté dans leurs cages de façon systématique. L’expertise des responsables de projet avec les procédures permet également de limiter le stress et l’inconfort des animaux. Pour les procédures necessitant une injection par intraveineuse, les souris subirons une anesthésie isoflurane d'une durée de 5 minutes. Toute souris diagnostiquée diabétique aura une attention plus poussée ainsi qu’un change de biberon d’eau et de litière plus fréquent. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les procédures expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Le modèle murin du diabète de type 1 est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : -Sa physiopathologie est très proche de la maladie humaine avec notamment une destruction auto-immune progressive des cellules productrices d’insuline de manière spontanée; -Ce modèle est une souris, ce qui permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour pouvoir isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie ; -Le système immunitaire de la souris est très proche de l’homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune, et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines d’âge (jeunes adultes), stade auquel on observe les premières anomalies du système immunitaire chez ce modèle de souris. AMENDEMENT : Les souris sous fond B6 permettent de déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections virales au delà du diabète.
Impératifs d’Élevage (génotypage et isolement) dans le cadre de projets de recherche chez le rongeur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 2560
45 260 souris et rats vont être utilisé·es, la grande majorité tuée à l'issue et 500 souris réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces animaux forment des lignées élevées pour fournir leurs tissus après mise à mort à des équipes de neurosciences travaillant sur Parkinson, Alzheimer ou la schizophrénie. Chaque petit subit un prélèvement de l'extrémité de la queue à 10 jours pour le génotypage, et certains mâles peuvent être isolés jusqu'à six mois pour caler les dates d'accouplement. Le porteur affirme que l'expérimentation animale est "nécessaire" en neurosciences et que ces techniques d'élevage couvrent les "besoins" des chercheurs.
Objectifs
Cette demande couvrira les lignées élevées pour l’utilisation de leurs tissus en post-mortem dans le cadre de projets en neurosciences pour réaliser des cultures, du développement de lignées cellulaires, d’organoïdes…. Les recherches associées à l’établissement utilisateur portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur pour développer nos connaissances sur le sujet et trouver des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Nous produirons des modèles pour nos équipes de recherche avec des caractéristiques génotypiques précises.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont d’apporter des modèles animaux (souris et rats) à nos équipes de recherche possédant le bon génotype et au bon stade de développement de manière, à ce que les connaissances progressent en neurosciences, et qu’in fine de nouveaux axes thérapeutiques puissent émerger, pour améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies neurodégénératives, troubles autistiques, dépressions qui sont au cœur des recherches menées dans notre établissement utilisateur.
Procédures
Il y aura la réalisation d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours, période où l’animal est moins sensible à la douleur et cicatrise rapidement. Cet acte n'est réalisé qu’une seule fois et dure environ 1 minute par animal. Rarement un reprélevement à l’oreille ou sanguin (1 seule fois, moins d’une minute) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal. Chez le Rat, ce prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie pour faciliter la manipulation de l’animal. Dans le cadre de mise en accouplement pour obtenir des souriceaux à des dates précises, certaines souris mâles pourraient être isolées de manière intermittente et pour une durée de 6 mois maximum avec une mise en accouplement au minimum une fois toutes les deux semaines.
Impact sur les animaux
Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage (ou du pavillon de l’oreille chez les souris adulte). L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment. Dans les rares cas où le prélèvement sanguin sera préféré pour vérifier le génotypage, il y aura une légère douleur à la piqure, un risque d’hématome ou de saignement sur le site de prélèvement (veine sous mandibulaire (souris) ou saphène externe (Rat)). Chez le Rat, le prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie avec les risques inhérents à celle-ci (hypothermie, dépression cardio-respiatoire, recouvrement de la vigilance). Lors de l’isolement, les souris mâles qui sont des animaux grégaires, peuvent ressentir du stress.
Devenir
Exception faite des animaux n’ayant pas un génotype d’intérêt qui pourraient être inclus pour de la formation aux gestes techniques dans un projet autorisé dans notre animalerie, tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure : les reproducteurs sont maintenus pour un temps donné, et les animaux produits sont euthanasiés pour des raisons expérimentales pour permettre l’analyse de leurs tissus ou la culture cellulaire en utilisant les prélèvements réalisés en post-mortem. Il n’y aura pas d’utilisation continue de ces animaux en les incluant par la suite dans d’autres projets de recherche.
Remplacement
Malgré l’élaboration de projets in vitro en amont, l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifique est nécessaire dans de nombreux projets de recherche en Neurosciences. De plus, les techniques d’isolement et de prélèvement sont nécessaires à la production d’animaux pour couvrir les besoins des chercheurs. L’utilisation des animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet car ils sont à la base de travaux sur tissus ou la production de lignées cellulaires sur lesquels pourront être réalisés un bon nombre d’expériences.
Réduction
Le maintien de 32 lignées différentes (souris et rats confondus) sera nécessaire pour répondre à l’ensemble des projets de recherche. D’après le cumul du nombre d’animaux maximum utilisés dans tous les projets de recherche à l’année, nous estimons que nous prélèverons un maximum de 43200 souriceaux et 2560 petits rats. Les projets de recherche associés à l’élevage seront conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en s’assurant de résultats scientifiques robustes. Etant donné la nature du projet, aucun test statistique n’a été réalisé en dehors de ceux utilisés dans les projets de recherche associés. Un maximum de 900 souris mâles pourra être isolées au cours du projet afin de définir précisément la date d’accouplement, ces animaux étant issus de notre élevage et donc inclus dans le nombre de petits générés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont agréées et les animaux reçoivent des enrichissements correspondants à leur besoin : matériel de nidification, maisonnette, bâtonnet à ronger. La quantité de ces enrichissements pourra être adaptée pour les animaux isolés. A la moindre anomalie qui est observée un suivi et des conseils sont données par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) de manière à assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux notamment en ce qui concerne la durée d’isolement des mâles, le nombre de portée par femelle et le temps de reproduction des géniteurs. Les animaux isolés sont identifiés par des cartes spécifiques pour qu’ils puissent bénéficier d’une surveillance adaptée (présence de comportements anormaux, durée de l’isolement). Le prélèvement tissulaire est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulation des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprèlèvement est nécessaire à l’oreille ou sanguin sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien être animal.
Choix des espèces
Il existe de nombreuses lignées génétiquement modifiées chez la souris pour apporter des modèles aux équipes de recherche. Nous avons également des équipes qui travaillent chez le Rat, pour des raisons génétiques et de la taille des rats qui permet d’accéder à un cerveau plus grand, à des embryons de taille supérieure et en nombre important, et de réaliser ainsi certaines expériences plus aisément. Les animaux produits seront tatoués et prélevés à l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours (pour limiter la douleur et permettre une cicatrisation rapide) pour connaitre leur patrimoine génétique et pouvoir les reconnaitre. Exceptionnellement, Il pourra être nécessaire parfois de prélever une nouvelle fois sur les adultes mais cela sera fait à l’oreille ou par prélèvement de sang avec une demande justifiée par l’équipe et évaluée par la structure chargée du bien-être animal. Les reproducteurs sont utilisés à l’âge de 6 semaines pour les femelles et 8 semaines pour les mâles jusqu’à l’âge d’environ 8 mois pour les souris et 12 mois pour les rats. Les mâles souris susceptibles d’être isolés seront donc des adultes.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur associés à différents tests chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 800 d'entre elles étant réutilisées pour de la formation et les autres tuées. Différents modèles de douleur inflammatoire, post-opératoire et neuropathique leur sont induits, avec stimulations douloureuses thermiques ou mécaniques des pattes, mise à jeun et prélèvements de sang, pour tester environ 80 candidats-médicaments analgésiques. Le porteur indique que les animaux des procédures sévères ne peuvent être réutilisés à cause de la douleur persistante et sont mis à mort. Il affirme que l'efficacité d'un analgésique ne peut être démontrée que chez l'animal vigile, la douleur associant une composante sensorielle et émotionnelle.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur (inflammatoire, post-opératoire, neuropathique) chez la souris et pour différent type de douleurs (mécanique, aigue, chronique). L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus (80 composés estimés). Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne l’apparition de symptômes douloureux. Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. Ces nuisances sont modérées à sévères. Pour une procédure , les animaux subissent une mise à jeun d’une durée maximale de 20h (nuisance modérée). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisances légères < 1minute). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère
Devenir
Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. De plus, certains tests peuvent induire des douleurs intenses a posteriori. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de certaines procédures les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein de notre structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en plastique rouge, briquettes en bois, sizzle nest) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux de 3 à 8 ou 10 souris (selon le poids final attendu) dans des cages de dimensions appropriées selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines au début de toutes les procédures. Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Rôle de FGF21 hépatique dans le comportement alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.
Objectifs
Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Identification de nouveaux acteurs de l’identité de cellules souches germinales testiculaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
2480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie pour génotypage, certaines étant des donneuses tuées en période néonatale pour prélever des spermatogonies, d'autres recevant une transplantation de ces cellules par chirurgie du testicule. Le porteur indique une douleur liée à la chirurgie de transplantation via le rete testis et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune approche alternative ne permet d'étudier le maintien de la spermatogenèse sur plusieurs mois.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle de l'homéostasie des cellules souches germinales, à l'origine de la spermatogenèse à partir de la puberté et pendant toute la vie de l'individu. Cela devrait permettre d'identifier des gènes impliqués dans les infertilités masculines d'origine encore non identifiée; et de proposer de nouveaux marqueurs de diagnostic voire de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans 30% des cas les infertilités masculines restent de cause inconnue. L'analyse du rôle de différents gènes grâce à la transplantation de cellules souches pour l'étude de leur capacité à recoloniser les tubes séminifières ainsi que pour l'étude de leur capacité à donner sur le long terme de nouvelles vagues de spermatogenèse devrait nous permettre d'identifier de nouvelles causes des infertilités masculines et ainsi de proposer de nouvelle pistes de diagnostiques voire thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie pour le génotypage (procédure 1). Des animaux serviront de donneurs de spermatogonies souches suite à leur mise à mort en période néonatale. D'autres animaux seront utilisés pour la réalisation des transplantations de spermatogonies souches et l'analyse de leur capacite de recolonisation testiculaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances que vont subir les animaux sont les douleurs et contraintes associées à la chirurgie pour la transplantation des spermatogonies via le rete testis. Il est à noter que ce modèle, selon la littérature, ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu.
Devenir
Suite à la procédure de génotypage, certains animaux seront utilisés pour le maintien des colonies. Les animaux de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort. D'autres animaux serviront de donneurs de spermatogonies souches suite à leur mise à mort. Enfin d'autres animaux receveurs seront utilisés pour la réalisation des transplantations. Ces animaux transplantés seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour la récupération de tissus pour l'analyse phénotypique de recolonisation des tubes séminifères et restauration de la spermatogenèse à partir des spermatogonies transplantées.
Remplacement
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Nous utiliserons 20 animaux par type de spermatogonies réimplantées afin d’obtenir des résultats statistiquement valides pour les différences entre les différents groupes.
Raffinement
Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre et du poids des souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. Des mesures spécifiques seront mises en place pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales. Un traitement préventif analgésique sous-cutané sera réalisé au moment de la chirurgie. Il y aura une surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur. Un suivi post opératoire individuel des animaux inclus dans la procédure chirurgicale sera matérialisé par le renseignement d’une fiche de suivi. Il n’est pas attendu d’effets dommageables durables. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de la laparotomie abdominale. Les contrôles prévus prendront place pendant l’intervention chirurgicale, au réveil de l’animal le même jour, le lendemain de l’intervention et le jour suivant. Des points limites gradés précis et adaptés ont été défini pouvant conduire à l'arrêt de l'expérimentation. Ainsi, des difficultés opératoires (hémorragies, temps d’intervention trop long) ou post-opératoires majeures (réveil retardé, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) conduiront systématiquement à l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Notre étude reposera sur la technique de transplantation de cellules germinales souches. Nous utiliserons des lignées de souris transgéniques avec des gènes traceurs afin de suivre les cellules germinales transplantées. En parallèle, nous utiliserons une lignée bien définie permettant d'obtenir des souris stériles receveuses pour le transfert de cellules germinales souches. Les femelles et les mâles héterozygotes de la lignée receveuse seront utilisées pour l'entretien de la colonie et sacrifiées à 4 mois; Les femelles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront sacrifiées après génotypages soit à 30 jours postnatal. Les mâles receveurs seront utilisés pour la transplantation des cellules germinales souches à 1 mois. Pour les mâles du génotype d'intérêt, pour analyser les capacités de régénération de la spermatogenèse, les souris transplantées seront mis à mort après 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines, 8 semaines, 3 mois ou 6 mois. Les souris mâles "traceurs" seront mis à mort à 6 jours après la naissance pour la récupération des spermatogonies souches par tri cellulaire.
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans trois modèles de mémoire chez le rongeur: le test du labyrinthe de Barnes, le test du labyrinthe en Y et le test de reconnaissance de nouvel objet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1440
6 240 rongeurs, 4 800 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, et la déclaration en compte 3 520 en souffrance légère et 2 720 en souffrance modérée. Selon les groupes, ils passent sous candidats médicaments un labyrinthe de Barnes, un labyrinthe en Y, dont une version impose huit jours de restriction alimentaire, ou un test de reconnaissance d'objet nouveau, et l'un des protocoles les expose à une lumière et un bruit forts pour les pousser à chercher un refuge. Les souris des lignées présentées comme reproduisant la trisomie 21 et le syndrome de l'X fragile passent les trois tests. Ces molécules viennent du centre de recherche du porteur, qui les trie selon leur effet sur la mémoire et renvoie les retombées pour les patients à "plus long terme", où le projet "pourrait permettre" de fournir des données qu'il dit "indispensables". Les souris de ces lignées et les rongeurs traités par des composés qui risqueraient d'interférer avec d'autres expériences sont tués, et les témoins pourront être réutilisés dans d'autres projets, 960 souris et 360 rats selon la déclaration.
Objectifs
Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouveaux candidats médicaments, ce projet permettra de caractériser leur effet sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale, mémoire à court ou long terme). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des candidats médicaments présentant des effets promnésiques (c'est à dire favorisant la mémoire) intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits de mémoire (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Ou à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus deux modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile), qui permettront de tester l’effet de nos nouveaux candidats médicaments sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique chez l’humain, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments pour traiter des déficits de mémoire dans différentes pathologies.
Procédures
Ce projet comporte 3 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, des groupes distincts seront soumis à ces 3 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 2 modèles souris de la trisomie 21 et du syndrome de l’X Fragile, les mêmes souris seront soumises aux 3 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déoulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes; la seconde version impliquera une restricton alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Pour chacun des 3 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitive et d’attention fonctionnelles.
Evaluation du rôle des intégrines β1 et β3 plaquettaires dans les saignements inflammatoires (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une inflammation cutanée, pulmonaire ou cérébrale, ce dernier modèle incluant une chirurgie du cou pour provoquer un AVC, avec prélèvements de sang, injections et pose de cathéter à la queue. Le porteur indique une détresse respiratoire possible et des difficultés motrices et alimentaires liées à l'AVC, les animaux étant mis à mort sous anesthésie pour quantifier les saignements. Il affirme que le rôle des intégrines plaquettaires ne peut être étudié sans le métabolisme entier de la souris.
Objectifs
L’arrêt des saignements implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, adhèrent, s’activent et agrègent pour former le clou plaquettaire qui limite le saignement. Il a été mis en évidence que les plaquettes jouent un rôle particulièrement important également dans l’arrêt des saignements en conditions inflammatoires. En effet, l’inflammation induit un recrutement des neutrophiles qui traversent la paroi vasculaire entrainant la formation de brèches vasculaires. Les plaquettes jouent alors leur rôle et colmatent les brèches. Cependant, les mécanismes impliquant les plaquettes dans ce processus restent encore peu compris à ce jour. Ce projet vise donc à évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements inflammatoires, ce qui à terme pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour l’inflammation cutanée, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections intradermiques et rétro-orbitales et à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h). Pour l’inflammation pulmonaire, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h) et à une inoculation intranasale. Pour l’inflammation cérébrale, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections rétro-orbitales, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h), à une chirurgie au niveau du cou qui permettra d’induire un AVC (maximum 30min) et à une imagerie IRM (maximum 1h).
Impact sur les animaux
Un effet indésirable attendu est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. De plus, une inflammation locale sera observée. Dans le modèle pulmonaire, on pourra observer une surcharge de liquide dans les poumons conduisant à une détresse respiratoire légère à modérée. Pour le modèle d’AVC, on s’attend à des douleurs suite à la chirurgie, à des difficultés motrices et pour s’alimenter dues aux manifestations de l’AVC.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux encore anesthésiés sont mis à mort afin de prélever et quantifier les saignements dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales), il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par d’autres méthodes du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal sous anesthésie • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de tétracaïne sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux effectués sur la souris démontrant le rôle primordial des plaquettes dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés, il est nécessaire de réaliser ce modèle dans la même espèce animale. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Mise en place d’un nouveau traitement dans le gliome pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées dans le tronc cérébral sous anesthésie, puis un traitement anticancéreux est injecté par voie intrapéritonéale ou intracrânienne, avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare deux voies d'administration d'une combinaison de médicaments contre le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique incurable. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Ici, le projet vise à comparer deux voies d’administration afin de déterminer si la voie d’administration intracrânienne de notre thérapie est la plus adaptée pour un usage chez les patients. La combinaison de drogues utilisée sera celle validée il y a deux ans dans ce même modèle murin. Elle sera injectée soit par voie intrapéritonéale, soit par voie intracrânienne. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des drogues et de chaque voie d’injection sur les cellules cancéreuses et l’expression de leurs gènes dans un contexte in vivo.
Bénéfices attendus
Démontrer que la combinaison bloque la formation de la tumeur chez la souris qu’elle soit injectée par voie intrapéritonéale ou par voie intracrânienne. Ces données serviront de base à l’élaboration de stratégie thérapeutique chez les enfants atteints d’un gliome pédiatrique. Elles permettront aussi d’envisager l’utilisation de ce modèle pour tester de nouvelles combinaisons de drogue par voie intracrânienne, si cette dernière donne satisfaction.
Procédures
Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine pendant 3 semaines, 20 minutes). Injection intrapéritonéale ou intracrânienne sous anesthésie d’une solution chimique (2 fois par semaine pendant 3 semaines, 5 minutes ).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certains groupes de souris, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux par voie intrapéritonéal et intracrânienne afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à la combinaison et selon le mode d’administration. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale. Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, une large partie de ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.
Devenir
Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromaux et tumoraux en action in vivo chez la souris.
Réduction
En termes de test statistique et d’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50 pourcent de différence inter-lots avec 50 pourcent d’écart type intra-lots est de 15.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
Pré-conditionnement des cellules stromales mésenchymateuses ex vivo avec alpha-tocophérol : accélération de la régénération osseuse ?
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
133 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 28 mis à mort sans réveil comme donneurs de cellules et 105 opérés du crâne sous anesthésie en souffrance modérée. Un défaut osseux est créé chirurgicalement dans la calotte crânienne puis comblé par un biomatériau, les rats étant hébergés deux à huit semaines avant mise à mort pour analyser la régénération osseuse. Le porteur décrit une douleur post-opératoire prise en charge par analgésie et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme que ces études de reconstruction osseuse "ne peuvent être menées que sur des animaux".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle le traitement, pré-implantation, de cellules souches autologues avec une molécule nommée l’alpha-tocophérol (AT) peut améliorer leur participation au phénomène de réparation osseuse. Cette hypothèse est établie sur la base des résultats montrant que l’AT favorise la formation de cellules productrices de tissu osseux à partir de cellules souches mésenchymateuses. Ces effets sont obtenus sans effet toxique de l’AT.
Bénéfices attendus
Les précédentes expériences effectuées in vitro suggèrent que les CStroM traitées avec l’AT pourraient avoir une meilleure capacité de régénération osseuse se traduisant par une résolution des défauts plus rapide et de meilleure qualité. Dans ce cas, nous allons tester, sur un modèle animal, la preuve de principe d’une procédure thérapeutique (accélération de la régénération osseuse) innovante. La mise au point d’un essai préclinique sur grand animal est la perspective directe de ces expériences, utilisant les réactifs et consommables de grade clinique, compatibles avec une procédure ex vivo de médicament de thérapie innovante (MTI). Dans la même perspective, nous préparerons ces cellules pour le développement d’un MTI et d’un essai clinique de grade 1/2 en médecine humaine. De même, ces résultats peuvent orienter la recherche sur l’effet de l’AT ex vivo sur les cellules souches isolées à partir d’autres tissus, ce qui pourrait, à son tour, ouvrir des perspectives vers le développement d’autres MTI.
Procédures
Les animaux (rats) prévus pour ce projet seront soumis à une seule procédure chirurgicale (procédure 1, durée environ 30 minutes, 105 rats), à l'exception des rats donneurs de cellules qui seront euthanasiés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses (28 rats).
Impact sur les animaux
Durant ce projet, uniquement une douleur post chirurgie est attendue pour les animaux. Comme indiqué dans la suite du formulaire, l’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur et/ou par le personnel de l’animalerie. Cette estimation sera ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements [voir annexe 2 et 3]. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd.
Devenir
Les animaux (105 rats) ayant subi l'unique procédure 1 seront hébergés entre 2 et 8 semaines puis sacrifiés pour prélever les implants et réaliser les différentes analyses ayant pour but de quantifier la régénération osseuse induites par les matériaux implantés.
Remplacement
Le processus de développement et de validation des biomatériaux utilisés pour la reconstruction osseuse nécessite des études précliniques qui ne peuvent être menées que sur des animaux et, dans le cas de ce projet, sur des rongeurs. Les études faisabilité, de fonctionnalité et de régénération osseuse chez l’animal sont indispensables pour le développement des biomatériaux. Ces tests menés chez le rongeur sont une étape nécessaire pour permetre la suite de notre projet dirigé vers la clinique. Le principe général est de créer chirurgicalement un défaut osseux dans la calvaria puis de mettre en place un biomatériau de comblement permettant de stimuler la reconstruction osseuse. Les procédures d’évaluation comprennent un suivi clinique (inflammation, douleur), ainsi qu’un suivi histologique et radiologique par microscanner, après euthanasie des animaux.
Réduction
Afin d'utiliser le moins d'animaux possibles mais également afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, tout en prenant en compte le risque de perte d’animaux, une approche statistique nous a permis d'établir que notre projet comprendra des groupes de 5 rats pour l'expérience préliminaire puis de 8 rats pour chaque condition dans les expériences suivantes. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats obtenus avec les différents échantillons.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement adapté afin de leur offrir un cadre d'hébergement optimal: litière en copeaux de peupliers et des jouets. Après la chirurgie, chaque animal se réveillera dans une cage séparée pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, l’animal reviendra dans sa cage d’origine. L'anesthésie des animaux sera réalisée au masque (anesthésie gazeuse) par de l’isoflurane (4,5% pour l’induction, puis 2.5% pour le maintien). L'analgésie sera réalisée en pré oépratoire par une par une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne) et par une injection sous-cutanée de buprénorphine, 30 minutes avant l'intervention, ainsi qu'une injection en post-opératoire. L'estimation de la souffrance animale sera constamment mesurée: 1/ Tout au long de l’intervention chirurgicale, les signes avant-coureurs du réveil seront surveillés et, si un de ces signes apparait, une augmentation temporaire du taux d'isoflurane à 4,5% sera réalisée. Si les signes persistent, l'animal, qui sera toujours sous anesthésie sera euthanasié par dislocation cervicale. 2/ L’estimation de la souffrance sera mesurée dans les 5 premiers jours post chirurgie concernant leurs activités et comportements. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd et al. : le score limite est de 14 et au-delà, l’animal sera euthanasié. Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration quotidienne, par voie intra-péritonéale, de buprénorphine pendant 3 jours. La persistance de douleurs entraînera l’euthanasie de l’animal. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination du point limite : apparence de l’animal, prise d’eau et de nourriture, signes cliniques (rythme cardiaque et respiratoire), comportement naturel et provoqué. En cas de blessures corporelles suite à un combat, l’animal sera isolé et soigné avant de retourner dans sa cage pour être surveillé en continu. En cas de problème de cicatrisation des plaies, les soins nécessaires seront effectués. Selon la gravité, la plaie sera ré-ouverte pour enlever pus ou hématomes, et un traitement antibiotique. Les animaux ayant atteint les points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le défaut de calvaria chez le rongeur est un modèle largement utilisé dans notre recherche, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Pour ce projet, nous devons nous placer dans des conditions expérimentales in vivo qui miment l’allogreffe. Nous travaillerons ainsi avec une souche allogénique de rats couramment utilisé pour ce type d’expérimentation : des rats Sprague Dawley. Nous utiliserons un modèle de rat plutôt qu'un modèle plus petit (comme la souris) car ce modèle est mieux adapté aux types de matériaux (nature et taille) et car nous avons déjà une bonne expertise de la culture des CStroM de rats qui rend ce projet réalisable sans mise au point.. Les animaux seront commandés et hébergés environ 2 semaines avant l’intervention pour permettre leur acclimatation. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines pour les rats). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.
Production liquide d’ascite (produit dérivé)
- Production de routine
- Tests réglementaires
4800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules dans le péritoine, qui provoque une production de liquide d'ascite et un gonflement de l'abdomen surveillé chaque jour, le liquide étant récolté après mise à mort. Ce liquide d'ascite entre dans la fabrication de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. Le porteur indique que cette cellule ne peut à ce jour être conservée qu'in vivo et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".
Objectifs
La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.
Bénéfices attendus
Cette ascite issue de la multiplication d'une cellule qui est utilisé directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité des tests.
Procédures
Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.
Impact sur les animaux
La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne et une cotation est réalisée chaque jour afin d'évaluer la douleur engendrée par ce geste.
Devenir
Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, Le liquide d'ascite est récolté post mortem.
Remplacement
La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.
Réduction
La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé du fait de l'origines des cellules à multiplier Pour cette application, nous utilisons des animaux matures âgées à minima de 8semaines.