Procédures modérées

24 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit cinq anesthésies générales sur trois mois, une incision abdominale d'environ quinze centimètres et une chirurgie de l'estomac, avec des contrôles par endoscopie et imagerie, pour tester un dispositif de suture endoscopique destiné à traiter l'obésité. Le porteur décrit une gêne abdominale possible avec nausées et vomissements. Il présente le recours au porc comme nécessaire pour évaluer la solidité des sutures dans le temps, sa taille et son péristaltisme se rapprochant de ceux de l'humain.

Objectifs

La partition de l'estomac est une des méthodes thérapeutiques utilisées pour le traitement de l’obésité et du diabète de type 2. Cette partition peut être réalisée par une chirurgie de l'estomac conventionnelle (chirurgies dites de gastrectomie pariétale et de bypass gastrique), dont la morbidité et la mortalité inhérentes à la procédure sont non négligeables. Une partition par voie endogastrique (technique dite « endosleeve ») grâce à un nouveau dispositif de suture endoscopique « intelligent », permettrait de limiter les risques liés à l’intervention chirurgicale conventionnelle. Néanmoins, il est encore nécessaire de déterminer les types de sutures les plus adaptés à cette procédure et de s’assurer que les sutures ainsi réalisées sont suffisamment solides dans le temps malgré les contraintes mécaniques imposées par le fonctionnement de l’estomac.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif d'intérêt pourrait suppléer certaines techniques de chirurgie conventionnelle. Ce dispositif pourrait permettre la réalisation de 6 types de sutures différents en diminuant la morbi-mortalité des procédures de chirurgie de l'estomac.

Procédures

Tous les gestes interventionnels se feront sous anesthésie générale (5 anesthésies par animal sur les 3 mois de suivi) Acquisition d'imagerie médicale (tomodensitométrie) et endoscopie (30 minutes) Chirurgie gastrique (de l'estomac) (1heure).

Impact sur les animaux

Le projet nécessite de réaliser 5 anesthésies générales par animal. Les animaux seront isolés en duo du groupe social, ce qui peut induire un stress. Les animaux seront prémédiqués par piqure intramusculaire d'un mélange sédatif. La préparation de l'animal comprend la mise en place d'une perfusion veineuse et une intubation endotrachéale. Chaque animal subira une incision sus ombilicale d'environ 15cm. Une gêne abdominale peut être induite suite à la chirurgie de l'estomac, possiblement accompagnée de nausées/vomissements. Des contrôles endoscopiques et tomodensitométriques sous anesthésie seront réalisés à J0, J15, M1, M2 et M3 post-chirurgie. L'injection de produit de contraste iodé peut induire des réactions allergiques ( nuisance jamais constatée jusqu'alors chez le Porc).

Devenir

Tous les animaux (n=24) du projet seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des estomacs (avec sutures) est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Cette étude vise à vérifier la sécurité de sutures réalisées par abord endoscopique et d’évaluer leur résistance dans le temps. L’évaluation temporelle de cette méthode innovante nécessite l’utilisation du modèle animal. D’autre part, le modèle porcin présente un péristaltisme gastrique de forte intensité, permettant de tester la technique dans des conditions extrêmes. La taille de cet animal permet également de modéliser au mieux l’estomac humain dont la taille est proche de celle du Porc. Ce modèle permet donc de tester directement les appareils, dispositifs et protocoles dédiés à l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre de types de suture suffisant. Le nombre d’animaux nécessaires a été défini selon notre expérience. Nous estimons à 4 le nombre d’animaux nécessaires pour chaque type de suture (soit 24 animaux au total). En effet, le nombre de 4 animaux par groupe permet d’évaluer la sécurité et la durabilité de chaque suture réalisée de façon endoscopique. Une grande partie des résultats sera qualitative (expertise et ressenti per-opératoire du chirurgien, facilité d'utilisation)

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisés. Les animaux, issus de la même fratrie, seront hébergés ensemble dans un grand box avec de la fibre de bois au sol et des objets d'enrichissement renouvelés régulièrement (Kong, balles, jouets caoutchouc durs masticables, chaînes à mastiquer...). Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale avec utilisation de morphiniques, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal dans les phases de préparation (prémédication, pose de cathéter). Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Des points limites ont été définis à chaque étape, associés pour chacun à des actions spécifiques afin de garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le Porc est devenu l'animal de taille humaine de référence parce qu'il est très proche de l'Homme d'un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique). De nombreuses constantes biologiques sont très similaires à l'Humain. Une fratrie habituelle de 10 à 12 animaux fournit un groupe de stabulation et d'expérimentation homogène. Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez le Porc. D’autre part, le péristaltisme gastrique du Porc étant de forte intensité, l’utilisation du modèle porcin permet d’évaluer dans des conditions extrêmes la procédure de partition gastrique endoscopique et la longévité des sutures muquo-muqueuses. Les animaux seront des Porcs jeunes adultes de 50 +/-5Kg correspondant à des animaux de 4 à 5 mois dont la taille permet de modéliser au mieux l’estomac humain (les partitions gastriques sont majoritairement réalisées sur des patients adultes). Ce modèle permet donc de tester directement les appareils, dispositifs et protocoles dédiés à l’Homme.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines ou murines par injection dans le sang ou dans l'œil, une partie étant irradiée aux rayons X, puis subissent jusqu'à sept prélèvements sanguins au niveau de l'œil. Le porteur décrit le développement d'une tumeur chez la plupart des animaux, avec perte d'appétit, de poids et de sociabilité. Il justifie l'usage de la souris par l'absence de culture des cellules de leucémie hors de l'animal et conclut qu'il n'existe aucune alternative.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes induites par la prolifération anormale et incontrôlée de progéniteurs lymphoïdes T. Malgré l’amélioration de la prise en charge des LAL, le devenir des patients atteints de LAL-T reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux années qui suivent le diagnostic. Ainsi, les défis auxquels nous sommes confrontés dans le domaine des LAL-T sont de mieux comprendre les processus de leucémogenèse afin d’identifier les circuits moléculaires oncogéniques actifs (avec pour objectif, in fine, de les cibler thérapeutiquement) et d’autre part les mécanismes d’acquisition de la chimiorésistance. L’objectif de ce projet est de transplanter des leucémies T primaires humaines ou murines dans des souris receveuses afin de rendre possible des expériences de recherche fondamentale nécessitant des cellules viables/fraîches. La quantité de cellules leucémiques humaines étant limitée, les xénogreffes (ou PDX = ‘Patient derived xenograft’) permettent de conserver et d’amplifier ces cellules précieuses de LAL-T. De même, la transplantation syngénique de cellules leucémiques murines est un moyen d’amplifier ces cellules et de restreindre le nombre de souris utilisées pour développer les leucémies primaires. De plus, la transplantation syngénique permet d’étudier le rôle du système immunitaire dans la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Au cours de ce projet, nous obtiendrons des cellules fraîches de LAL-T qui nous permettront de réaliser diverses études de biologie moléculaire/cellulaire visant à identifier des gènes/circuits moléculaires impliqués dans la leucémogenèse, mais aussi d’étudier l’hétérogénéité intra-tumorale des LAL-T humaines.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d’interventions : injection intraveineuse et prélèvement sanguin. Les injections intraveineuses se feront par voie caudale ou rétro-orbitale, une seule fois dans la vie de l’animal. L’injection rétro-orbitale se fera dans le sinus sous anesthésie courte. Le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale est effectué deux mois après la transplantation des cellules humaines. Il est réalisé sous anesthésie courte. Le nombre de prélèvement sanguin dépend de la LAL-T et de sa capacité à se développer dans la souris immunodéficiente ; selon notre expérience ce nombre est compris entre 1 prélèvement et 7 prélèvements (étalés sur 10 mois). De plus, les animaux transplantés avec un type particulier de LAL-T (LAL-T immatures) subiront une irradiation au préalable via une exposition aux rayons X d'environ 77 secondes.

Impact sur les animaux

La principale nuisance est le développement d’une tumeur chez la plupart des animaux (suite à la transplantation des cellules leucémiques). Le développement tumoral pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité de la souris vis-à-vis de ses congénères. Les prises de sang, les anesthésies ainsi que les observations et pesées peuvent représenter une source de stress. De plus, l'irradiation peut entraîner une période de fragilité immunitaire.

Devenir

Les souris greffées seront euthanasiées dès que la prise de greffe est établie.

Remplacement

Les échantillons primaires de patients atteints de LAL-T sont rares et limités (pour certains échantillons nous n’avons qu’une ou deux ampoules de cellules congelées). Or, les cellules de LAL-T (qu’elles soient d’origine humaine ou murine) ne prolifèrent pas ex vivo ; de plus, un protocole de culture dans un système en 3 dimensions, du type organoïde, n’a pas encore été établi pour les LAL-T. Par conséquent, le seul moyen d’amplifier le nombre de cellules est de les transplanter dans un modèle animal. Il est à noter que nous utilisons des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique qui permettent de diminuer le nombre de cellules nécessaires pour certaines de nos analyses. De plus, nous utilisons des lignées humaines de LAL-T pour tester certaines de nos hypothèses, toutefois les résultats obtenus doivent être validés avec des cellules primaires obtenues grâce à des PDX. Dans la littérature il a été montré que les xénogreffes chez la souris miment la rechute des LAL-T humaines. Outre l’amplification des cellules leucémiques, notre objectif est d’utiliser les PDX afin d’étudier les mécanismes de rechute (les voies dérégulées, l’hétérogénéité intra-tumorale). Ainsi, le modèle animal est crucial pour cette étude et à ce jour, il n’existe aucune alternative.

Réduction

Bien que le recours aux modèles murins soit nécessaire dans notre projet, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux. Le nombre minimum d’animaux pour chaque transplantation (5 et 3 souris pour les cellules humaines et murines respectivement) a été défini grâce à la connaissance de nos modèles et notre expérience dans l’approche de transplantation. Ces procédures n’impliquent pas d’étude statistique et donc aucun test statistique n’est utilisé.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation et prélèvement sanguin) par du personnel compétent. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur, avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. L’hébergement des animaux se fera en confinement adapté pour les lignées murines immunodéprimées (cages ventilées) et maintenu en groupe pour éviter le stress et l’isolement. L’environnement sera enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien-être animal. Tout changement dans le comportement ou l’apparition de signes cliniques (perte de poids, posture, isolement, difficulté à se déplacer et à s’alimenter) sera relevé et indexé à la grille d’évaluation de la douleur.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire et des hémopathies. En effet, des cellules humaines primaires peuvent être transplantées avec succès dans des souris immunodéficientes. Dans ce contexte, la lignée de souris immunodéficiente est le modèle le plus couramment utilisé dans le cadre d’études réalisées à partir de cellules tumorales humaines. Concernant les transplantations murines, nous utiliserons des souris receveuses pour amplifier la tumeur. Le modèle murin est le modèle le plus pertinent pour les expérimentations exposées dans ce projet. Comme nous ne pouvons pas le remplacer, nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées. Nous utiliserons des souris adultes. Le temps nécessaire pour la prise de greffe des cellules leucémiques humaines varie entre 2 mois et ~10 mois ainsi nous privilégierons l’utilisation de souris immunodéficientes âgées entre 4 à 12 semaines. La prise de greffe des leucémies murines est en générale inférieure à 1 mois, donc cette procédure ne nécessite pas d’utiliser des souris jeunes. Les souris pourront être âgées entre 4 semaines et 6 mois. De plus, si cela est possible nous privilégierons l’utilisation de souris ‘replacées’ non utilisées dans les autres projets au sein de notre centre de recherche.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une lésion du muscle par injection de chlorure de baryum et deux prélèvements sanguins au niveau de l'œil, une partie étant des rats porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne qui se dégrade jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique administrer des analgésiques et présente la thérapie peptidique testée comme dépourvue de toxicité. Il renvoie les bénéfices pour les enfants malades au long terme et affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" ne peut se faire in vitro.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare qui est causée par différentes mutations qui peuvent survenir tout au long du gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante.notamment avec la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles respiratoires et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. L'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les fibres des muscles squelettiques induit une dysfonction et une fragilité puis une rupture des membranes cellulaires, soumises à des forces d'étirement lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux non contractile). Cette combinaison d’évènements empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec un peptide candidat sur les capacités régénératives du muscle compromises dans le modèle original du rat DMD. Ce peptide est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Il permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles atteints par la maladie. Plus particulièrement, il devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénérescence musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du coeur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de la marche et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires. Nous prévoyons également une étude comparative avec les glucocorticoides seuls ou en combinaison avec le peptide étudié afin de vérifier ses effets et de voir un potentiel effet conjugué des deux traitements. Le but est également de permettre d’obtenir un terrain favorable aux thérapies curatives ultérieures.

Procédures

Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital 2 fois. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus un traitement anti-douleur injectable. La procédure d’induction de la blessure du muscle tibial antérieur sera réalisée sous anesthésie générale et induite par l'injection intramusculaire d'un produit chimique après un traitement anti-douleur local. Cet acte nécessitera moins de 5 minutes. Les animaux seront ensuite réveillés et traités avec un anti-douleur injectable toutes les 8h pendant 2 jours au minimum et jusqu’à la mise à mort en cas de signe de douleur après ces deux jours. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

La lésion musculaire induite par le chlorure de baryum provoque la mort des cellules musculaires qui entraine une sensibilité excessive d'origine inflammatoire. Nous connnaissons bien les conséquences de ce processus temporaire et avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par les injections de buprénorphine, très efficace par expérience sur ce type de procédure. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie ce qui garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet n’incluent que des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. En ce qui concerne le traitement, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide étudié. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. Pour ce qui est du traitement avec le Déflazacort (anti-inflammatoire), sur la durée de traitement envisagée, nous n’attendons pas d’effet indésirable majeur mais nous serons particulièrement attentifs à la possible perte de poids observée précédemment avec d'autres molécules de la même famille.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.

Remplacement

Le peptide extracellulaire utilisé a été identifié comme une protéine cible de médicaments dans de nombreuses maladies, en particulier dans les troubles associés à l'inflammation. Le tests in vitro ont démontré son efficacité sur la prolifération cellulaire cependant la validation à l'echelle de l'organe ou de l'organisme entier ne peuvent être reproduit in vitro. Le traitement avec une forme ameliorée de cette protéine lors d’une lésion musculaire chez la souris, favorise la guérison du tissu en induisant la prolifération des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages sans accentuer dramatiquement l'inflammation. Sur la base de ces résultats préliminaires, nous souhaitons avec ce projet valider les effets d’un traitement avec ce peptide chez le rat DMD qui représente une modèle plus robuste de la dystrophie musculaire de Duchenne que le modèle souris mdx couramment utilisé.

Réduction

Le modèle de rats DMD est maintenant bien caractérisé et reproduit de façon très similaire le développement de la pathologie humaine. Les calculs de puissance statistique recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce qui a été validé avec d'autres projets terminés utilisants des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). La correction des données avant analyse statistique a été optimisée et adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wild type, WT) et DMD traités avec un placebo ou le diluant du produit à tester, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin. Pour la procédure de lésion musculaire induite, nous utiliserons des rats sauvages de 10 semaines puisqu'il s'agit ici de tester l'effet du composé sur la régénération musculaire dans un modèle de lésion induite bien calibré dans notre laboratoire. Pours les procédures de traitement avec les corticoides seuls ou en combinaison avec le composé à tester, nous utiliserons des animaux DMD à l'âge de 10 semaines. Notre étude de caractérisation du modèle rat DMD ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux) est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 10 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur les muscles.

Entre 6 et 10 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie, des ponctions de sang, de liquide céphalo-rachidien, de salive et de selles, dont un prélèvement sanguin terminal de 450 mL, et une partie reçoit un médicament destiné à réactiver un virus proche du HTLV-1 humain. Le porteur reconnaît un risque de traumatisme de la moelle épinière lors des ponctions et présente la mise à mort comme imposée par le statut sanitaire de ces animaux, qualifiant l'étude de "valorisation scientifique". Il décrit le modèle primate comme "incontournable" faute d'autre colonie naturellement infectée en Europe.

Objectifs

Le rétrovirus oncogène humain T-lymphotrope de type 1 (HTLV-1) infecte cinq à dix millions de personnes dans le monde. Trois à dix pourcents d’entre elles développeront une des maladies graves associées à l’infection, dont la leucémie / lymphome T de l’adulte, ou la paraparésie spastique tropicale / myélopathie associée à HTLV-1. Le dépistage des infections à HTLV-1 est réalisé par un test sanguin de type ELISA. Les individus ne présentant pas de réaction à ce test ELISA sont considérés HTLV-1-négatifs.. Le statut « infecté » des individus ayant réagi au test ELISA est confirmé par un autre test de dépistage sanguin, le plus souvent de type "Western Blot". En cas de réaction à ce test, le statut « infecté » est alors définitivement confirmé par recherche du virus dans le sang par une technique de biologie moléculaire (PCR). Le rétrovirus simien T-lymphotrope de type 1 (STLV-1) est un virus très étroitement apparenté au virus humain HTLV-1. Une colonie de Papio anubis naturellement infectée par STLV-1 est présente en France. Au cours de nos précédents projets, nous avons obtenus des résultats intrigants : quelques animaux négatifs en ELISA, et donc considérés comme « non infectés », se sont révélés positifs en PCR, indiquant que de telles infections « occultes » pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Nous proposons d’explorer les mécanismes virologiques et immunologiques à la base de ce profil d’infection « occulte », en réalisant le suivi longitudinal (i) du statut de dépsitage sanguin ; (ii) de la charge du virus dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et les fèces ; (iii) de l’expression virale dans le sang ; (iv) de la réponse immunitaire. En fin de protocole, la distribution du virus dans les organes sera explorée. Si seule une très faible présence du virus dans le sang est observée, nous posons l’hypothèse qu’elle pourrait expliquer l'absence de réaction au test de dépistage sanguin classique. Nous proposons de tester cette hypothèse en essayant de réactiver le virus dans le sang à l'aide d'un médicament et de voir si les animaux réagissent alors au test de dépistage classique. Ce projet permettra de mieux caractériser les bases virologiques et immunologiques des infections « occultes » à STLV-1, et pourrait permettre de plaider pour une ré-évaluation des méthodes de diagnostic chez l’homme.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, le dépistage des infections à STLV-1/HTLV-1 est réalisé par test sanguin de type ELISA, que ce soit lors des contrôles sanitaires dans les élevages de primates non humains, ou chez l’homme. Nos observations indiquent que des infections « occultes », caractérisées par une absence de réaction à ce tes, pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Si certains cas d’absence de réactions ont été rapportés chez l’homme, ces cas sont peu documentés, peu compris, et restent ignorés des politiques de dépistage mises en œuvre dans les populations. Ce projet permettra à court terme de caractériser ces infections « occultes », sur le plan virologique et immunologique. A moyen terme, il permettra d’obtenir les données indiquant qu’un dépistage par ELISA n’est pas suffisant, et qu’un dépistage par PCR pourrait être plus sensible, du moins chez Papio anubis. A plus long terme, ces données obtenues dans ce modèle de primates non humains pourront justifier la mise en place d’études épidémiologiques d’envergure chez l’humain, afin de déterminer la fréquence de ces infections « occultes » chez l’homme, et, le cas échéant, d’appeler à la révision des politiques de dépistage de cette infection grave.

Procédures

Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie qui devrait durer entre 20 min et 1h maximum. Le nombre de prélèvements pour chaque animal dépendra de l’évolution de son statut sérologique au fil du projet, mais chaque animal subira maximum : 4 prélèvements sanguins de 50mL, 4 prélèvements de LCR, 4 prélèvements de salive par écouvillon, 4 prélèvements de selles et 1 prélèvement sanguin terminal de 450 mL. Les animaux seront isolés 24h maximum après les prélèvements pour surveillance avant d'être réintroduits dans leurs groupes. Si une très faible expression du virus dans le sang est constaté lors des premières analyses, un médicament sera administré par voie orale à 4 animaux pendant 1 semaine pour stimuler l'activation du virus dans le sang.

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Anesthésies. Prélèvement sanguin (risque hématome). Prélèvement LCR (traumastisme iatrogène de la moelle épinière). Isolement par paire ou plus pour surveillance après le prélèvement de LCR (moins de 24h en général). Administration d'un médicament aux effets indésirables possibles suivants : nausées, tremblements, troubles digestifs (vomissements diarrhée), prise de poids, réaction allergique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en raison de leur statut sanitaire. En effet ces animaux sont porteurs d'une maladie contagieuse qui est en plus une zoonose, et la gestion sanitaire de l'élevage de la station de primatologie impose leur euthanasie. De plus, des prélèvements seront prélevés après l'euthanasie et permettront d'étudier la distribution du virus dans les organes.

Remplacement

Ces données épidémiologiques ne peuvent être obtenues que sur des animaux vivants. Pour l’étude de cette infection, le modèle primate est incontournable. Les individus qui participeront à cette étude sont des individus naturellement infectés par STLV-1 et, à notre connaissance, la seule colonie européenne de primates non humains présentant ces caractéristiques. Les observations ne peuvent donc être réalisées sur aucun autre modèle animal. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Notre objectif est de réaliser le suivi longitudinal pendant 12 mois de 6 animaux conservant un statut « ELISA-négatif / PCR-positif » sur la durée de l’étude. Si certains animaux deviennent positifs au test sanguin ELISA au cours de l’étude, ils seront euthanasiés, et d’autres individus seront inclus en remplacement, avec un maximum de 10 animaux inclus au total. L’inclusion sera arrêtée dès que le suivi longitudinal de 6 individus est obtenu. Le nombre final d’animaux inclus sera donc compris entre 6 et 10 animaux. Le protocole complet tel qu’il est prévu comporte deux groupes, un groupe sans médicament et un groupe avec médicament, ce dernier étant une expérience pilote pour tester l'hypothèse d'un lien entre l'expression du virus dans le sang et la réaction au test de dépistage sanguin classique. Un nombre de 6 animaux au total, et de 4 animaux dans le groupe médicament, est le minimum nécessaire pour obtenir caractériser de statut infecté « occulte », et le lien éventuel avec une expression virale faible. On s'attend à ce que l’expression virale soit fortement affectée par le traitement, dans environ 50% des animaux traités. Par conséquent, l'analyse de 4 animaux devrait permettre l'observation de 2 animaux au moins répondant bien, ce qui sera nécessaire pour établir un lien éventuel de cause à effet entre expression virale et réaction au test sanguin. L'effet du médicament sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l’administration. Si on obtient en effet 2 animaux au moins répondant au traitement, cela sera suffisant pour cette expérience pilote. Aucun test statistique ne sera réalisé. Dans le bras sans médicament, nous avons besoin de 2 animaux au minimum à euthanasier en fin de protocole, ce qui amène à 6 le nombre total d'animaux à inclure.

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par les responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie chimique par injection intramamusculaire avant d’être stabilisé sous anesthésie gazeuse. Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 1 heure maximum. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Les animaux ne seront isolés de leur groupe d’origine que transitoirement (24h à 36h, 2 jours maximum) et toujours avec un congénère. Les animaux seront réintroduits le lendemain des prélèvements après validation de l’état de santé par un vétérinaire, dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la SBEA. Des points limites sont définis et mis en place. Notamment, en cas d'effets secondaires liés au médicament, les animaux seront pris en charge par l'équipe vétérinaire par un traitement symptomatique et adapté.

Choix des espèces

D'autres modèles animaux existent pour l'étude du virus HTLV-1. Cependant, la colonie de Papio anubis proposée est la seule colonie, à notre connaisance, naturellement infectée par le virus STLV-1 en Europe. Dans le cadre de la gestion sanitaire des colonies, tous les animaux infectés par STLV-1 seront mis à mort. Il s'agit ici donc d'une valorisation scientifique des animaux dont l’euthanasie est par ailleurs inévitable, du fait de leur statut infecté. Dans la mesure du possible, tous les individus seront des individus adultes, présentant le même statut sanitaire. Si nous n’avons pas assez d’animaux adultes à inclure, alors des jeunes pourront être inclus.

369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

8 macaques rhésus vont être utilisés, dans des procédures classées modérées, avec une réutilisation prévue ou un placement en retraite envisagé selon l'avis vétérinaire. Chaque animal subit deux chirurgies implantatoires, dont une craniotomie de six heures, puis des enregistrements d'électrophysiologie et une stimulation transcrânienne par ultrasons, tête fixée dans une chaise de contention. Le porteur mentionne un protocole de contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif et un risque de brûlure superficielle de la peau lié aux ultrasons. Il affirme que les primates non humains sont le "seul choix possible" de modèle, cette recherche fondamentale sur le cortex préfrontal étant présentée comme impossible chez l'humain.

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées, dans le second volet d'un projet mené sur deux établissements. Comme dans le premier, des lignées privées d'un gène mitochondrial développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, avant une thérapie génique par injections pratiquées jusque sur des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque animal subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux restant non précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la production de protéine dans un organisme vivant et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le cœur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le cœur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le cœur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du cœur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Tout le projet se déroulera dans dans l'établissement 1, à l'exception des échographies qui auront lieu dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.

Devenir

Mise à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.

Réduction

Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.

Raffinement

Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.