Procédures modérées

156 macaques, à longue queue et rhésus, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales par injection stéréotaxique, des prélèvements sanguins tous les quinze jours, des ponctions mensuelles de liquide céphalorachidien et des IRM répétées, avant sa mise à mort par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ni cellulaire ne permet d'étudier ces maladies et présente le primate comme "nécessaire" du fait de sa proximité avec l'humain. Les bénéfices annoncés, de nouvelles cibles thérapeutiques contre Alzheimer et Parkinson, restent formulés au conditionnel.

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum espacées de 1 mois. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère. IRM, avant l’injection stéréotaxique, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une fibrose du foie, elles reçoivent des injections intrapéritonéales puis des gavages quotidiens pendant quatorze jours, avant d'être anesthésiées et vidées de leur sang pour analyse des tissus. Le porteur décrit des nuisances limitées à un stress, une perte de poids ou une déshydratation, sans détailler davantage les effets du modèle de fibrose. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour étudier ces molécules de façon intégrée, la communication entre organes ne pouvant selon lui être reproduite in vitro.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose hépatique à la stéatose hépatique inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose, la cirrhose et le cancer hépatocellulaire. Nous nous intéressons aux mécanismes impliqués dans le développement de ces maladies hépatiques. L’objectif du projet est de tester des molécules à potentielles thérapeutiques pouvant reverser ces pathologies. Cette étude sera réalisée sur un modèle de souris invalidé de manière inductible pour notre gène d'intéret spécifiquement dans le foie. Ces souris développent une fibrose spontanée sans phénotype dommageable.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans l'urgence clinique de trouver des traitements thérapeutiques contre les maladies du foie, puisqu’aucun traitement n'a été cliniquement approuvé à l'heure actuelle. Ainsi, cette étude permettra de tester des molécules pharmacologiques intéressantes et de comprendre à partir de quel stade de développement de la maladie ces molécules peuvent avoir un effet positif. Nous étudierons également les mécanismes mis en jeu dans l’amélioration du phénotype.

Procédures

Il y aura une identification permettant aussi le génotypage des animaux ( durée 15 secondes). Les animaux auront des injections par voie intrapéritonéale (durée 15 secondes) pendant 3 jours de suite. Ensuite, les animaux auront des gavages oraux quotidiennement pendant 14 jours. Cet acte dure 1 minute/souris. Enfin ils auront une injection par voie intrapéritonéale d'un mélange anésthésique. L'injection se fait en 15 secondes. Une fois endormie, nous prélèverons le sang par exsanguination, cet acte prend 45 secondes.

Impact sur les animaux

Nous réaliserons des injections par voies intrapéritonéale ensuite les souris seront gavées quotidiennement pendant 14 jours. Un stress de l'animal peut être observé avec éventuellement une perte de poids ou une deshydration.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'analyser des paramètres biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Les molécules pharmacologiques ont déjà été testées in vitro cependant l’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier les effets de ces molécules de manière intégrée puisque ces molécules agissent sur différents organes, la communication entre les organes est indispensable. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine. La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Notre expertise chez la souris et un nombre minimum de 10 animaux par groupe est requis pour avoir des données statistiquement analysables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 4 à 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le traitement pouvant induire une variation de poids, nous suivrons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. De plus, des points limites ont été définis, s'ils sont atteints, une mise à mort anticipée sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie des méladies hépatiques et de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes entre 8 semaines et 18 semaines. A ce stade développement, toutes les voies métaboliques hépatiques et les voies de l'inflammation sont mises en place.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie par voie vaginale de trois à quatre heures pour l'implantation d'un filet, matrice biologique ovine ou prothèse synthétique, puis est gardé en vie de deux à six mois avant sa mise à mort et le prélèvement des organes du bassin. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer un non-réveil, des saignements abondants, des infections et des douleurs. Il justifie le recours à la brebis par la proximité anatomique de sa région pelvienne avec celle des femmes et par l'absence d'alternative in vitro reproduisant le système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement du Prolapsus des Organes Pelviens (POP). Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser sa biointégration. Nous souhaitons montrer qu’un filet de MAC ovine peut être implanté avec succès dans un modèle de gros animal pertinent et allogénique. Pour cela, nous souhaitons évaluer le remodelage du filet de MAC, incluant sa stabilité mécanique et la réponse immunitaire (innée et adaptative) de l’hôte, dans la région urogénitale de brebis en comparaison avec une prothèse synthétique (Ex : Restorelle® de Coloplast Corp.). Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Les greffons seront implantés entre le vagin, le péritoine pariétal et le rectum et fixés avec des sutures non résorbables. Notre hypothèse est que le greffon de MAC entraine moins de complications qu’une prothèse synthétique (réponse immunitaire moins importante, pas d’exposition et moins de contraction de la prothèse, etc.) démontrant ainsi la supériorité de ce matériau. Après euthanasie des animaux, les implants seront récupérés et des analyses mécaniques et histologiques à différents temps de suivi (2 et 6 mois) seront effectuées. Les temps de suivi de 2 et 6 mois ont été choisis car ce sont des temps classiquement décrits dans la littérature pour suivre l’évolution de prothèses implantées dans la région urogénitale de brebis permettant la comparaison des résultats obtenus. Cette première expérimentation permettra de montrer le potentiel clinique du greffon de MAC, c’est-à-dire valider si le filet de MAC présente des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le POP dans un modèle de gros animal. En effet, les données récoltées permettront la comparaison directe des greffons de MAC avec un traitement standard du POP en termes de stabilité mécanique, de réponse immunitaire, d’intégration tissulaire et de taux de complications.

Bénéfices attendus

Le Prolapsus des Organes Pelviens (POP), aussi appelé descente d’organe, est un problème médical important pour les femmes. On estime qu'1 femme sur 10 subira une intervention chirurgicale pour traiter un POP au cours de sa vie. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente pour soutenir l’organe « descendant », elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques robustes et rigides permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues (jusqu’à 3x moins de récidive). En revanche, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale ont été retirées du marché dans de nombreux pays, comme la France, les Etats-Unis…, en raison d’un taux de complications élevé (douleurs, expositions, infections). Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des filets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) les plus adaptés pour produire un greffon de MAC aux caractéristiques cliniques pertinentes pour traiter le POP. Les gains attendus par la nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : cette approche biologique apportera une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : la réduction des complications/récidives bénéficiera économiquement au système de santé en évitant les coûts des réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 3 à 4h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 12 jours (non consécutifs). Chaque brebis recevra une condition expérimentale : un filet de matrice extracellulaire assemblée par des cellules ou une prothèse synthétique. Après réveil, les animaux seront gardés en vie sur des périodes différentes : 2 à 6 mois. Dans le cas où l’une des brebis ne se réveillerait pas suite à l’intervention, nous prévoyons un animal supplémentaire pour remplacer l’animal décédé (pour chaque lot). Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Les brebis seront transportées dans un véhicule adapté par deux afin de limiter l’isolement social. La durée du trajet est limitée (45 minutes maximum). Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : non-réveil de l'animal du fait de l'anesthésie, saignements (abondants), infections, constipations, douleur, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirable sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’anesthésie et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de la procédure, les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Bien qu’un modèle humain puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles permettent d’évaluer la prothèse implantée dans la région abdominale uniquement. Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe allogénique et une région anatomique pertinente simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 75 brebis sont nécessaires (3 lots de 25 brebis). Chaque animal recevra un filet de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) ou une prothèse synthétique. Nos objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l'intégration supérieure des greffons de MAC dans la paroi vaginale en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et contraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique du remodelage et de la réponse immunitaire (innée et adaptative). Nous souhaitons également montrer que les greffons de MAC possèdent des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le prolapsus des organes pelviens dans un modèle de gros animal (pas de récidive). Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. D’après la littérature, nous avons sélectionné 6 brebis par groupe et par temps de suivi pour montrer une différence significative entre le filet de MAC et la prothèse synthétique standard, principalement au niveau des complications liées à l’implant (exposition et contraction de la prothèse) et de la réponse immunitaire. En effet, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, 100% de cas de contraction de l’ordre de 30 à 50% pour les prothèses synthétiques avec, autour, des marqueurs de la réaction à corps étranger (cellules géantes à corps étranger). Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec le filet de MAC, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et moins de contraction du filet, ce qui démontrerait une grande supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour ajouter des animaux à l’étude. Ces expérimentations seront potentiellement effectuées jusqu’à 3 fois afin de confirmer certains résultats, de tester des conditions de production des greffons de MAC supplémentaires, ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue). Concernant l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons non appariés avec le test t de Student.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et seront gérées par une anesthésie générale durant toute la procédure chirurgicale. Les paramètres vitaux seront suivis pendant l’intégralité de la chirurgie. Un protocole d’analgésie post opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront gérés par l’unité d’hébergement et de stabulation de l'établissement utilisateur (EU). Les animaux seront suivis dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté, et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Un suivi quotidien sera réalisé. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pré, per et post- opératoire par admission d’antalgiques. Cependant, l’animal sera rapidement euthanasié (Pentobarbital sodique en IV pour l'euthanasie indiqué dans le paragraphe 3.3.3., soit 80 mg/kg) si : - le rythme cardiaque est >150 bpm ou 41°C ou < 32°C - une hémorragie importante est constatée. Les points limites identifiés se situent principalement au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement. • Perte d’appétit, anorexie • Altération du comportement, grincements de dents excessifs • Apathie, abattement • Position anormale ou prostration • Locomotion ou déplacements anormaux • Difficulté respiratoire • Auscultation et/ou examen cardiaque anormaux • Décubitus prolongé ou isolement • Hypovigilance ou hypervigilance anormale Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points cités ci-dessus ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’EU assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire de l’EU assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de prolapsus des organes pelviens bien établi dans la littérature. Par ailleurs, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir des feuillets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) similaires à ceux produits par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réaction immunitaire et le remodelage des greffons de MAC par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Nous souhaitons réaliser une cure du prolapsus. Pour que les brebis aient une descente d’organe, nous sélectionnerons des brebis âgées (≥ 5 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas).

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage puis une injection de toxine diphtérique destinée à détruire les cellules de leur épithélium intestinal, pour étudier la régénération de la paroi de l'intestin. Le porteur décrit une simple étude pilote visant à établir la dose de toxine, en amont d'un projet ultérieur. Il affirme que l'infection provoque une colite modérée et transitoire et qu'aucune alternative non animale n'est possible pour ce processus.

Objectifs

Il s'agit d'une étude pilote visant à évaluer les effets de la toxine diphtérique chez les animaux sauvages par rapport aux animaux déficients en molécule SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), vise à déterminer l'importance de la sumoylation dans le processus de régénération de l'épithélium intestinal après une lésion induite. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude pilote, nous allons déterminer la cinétique de la toxine diphtérique dans le modèle de souris déficient en SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier). Cela nous permettra de réaliser un projet ultérieur, dans lequel nous administrerons de la toxine diphtérique à ce modèle pour générer une lésion intestinale, ce qui nous permettra de déterminer le rôle de SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que ces maladies sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Ce modèle murin offre ainsi une bonne opportunité pour explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la maladie puisqu’il permet d’induire une lésion ponctuelle et ciblée dans l’intestin, qui entraînera la mort des cellules épithéliales associée à une inflammation marquée et d’ainsi reproduire chez la souris un phénotype proche de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale de tamoxifène par gavage (20s), trois frois ; une tous les 5 jours puis il y aura une seule injection intrapéritonéale de toxine diphtérique à J17 (5s).

Impact sur les animaux

Le projet soumis est basé sur l'étude de la régénération intestinale à la suite d’une lésion induite par injection de toxine diphtérique, qui entraîne l'élimination de tous les types de cellules épithéliales de l’intestin. Les effets attendus seront ceux provoqués par la perte de l'épithélium intestinal. Comme aucun autre type cellulaire n'est affecté par la toxine, nous n’attendons ainsi que des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent néanmoins souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, comme aucun effet secondaire n’est induit par le tamoxifène ou son véhicule et que les animaux seront maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration de toxine diphtérique, nous n’attendons pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période. Le stress lié au gavage/contention, douleur au point de piqure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure afin de récupérer les organes pour étudier les effets de la toxine diphtérique en fonction des doses sur l’animal. Dans le but de déterminer pour l’avenir, la dose idéale à utiliser afin d’étudier les processus de régénération musculaire sans induire de souffrance aux souris.

Remplacement

Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de l'intestin lumen, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.

Réduction

Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois, à des jours différents, pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétition principalement) en utilisant es modèles à effets mixtes. Les animaux témoins seront comparés aux animaux de laboratoire expérimentaux par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus avec suffisamment de puissance. - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.

Raffinement

En ce qui concerne le futur projet, cette procédure nous permettra d'effectuer un affinage important puisque, grâce à cette étude pilote, nous connaîtrons la cinétique de la toxine diphtérique dans notre modèle, et nous établirons les temps d'étude et le dosage, de sorte que dans le projet sur l'étude du rôle de SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), dans la régénération intestinale, les animaux auront les conditions optimales impliquant moins de souffrance, sans effets secondaires attendus. En ce qui concerne cette procédure : - Les animaux seront gardés dans un nombre maximum de 5 par cage. - Les injections et gavages seront administrés par une personne formée et compétente dans ce type de techniques. - Un criblage de différentes doses de toxine diphtérique sera effectué afin d'établir une dose minimale de toxine qui ne cause ni douleur ni stress aux animaux. - L'état de santé des animaux sera contrôlé 2 fois par jour tous les jours pendant toute la durée de l'expérience. Des points limites seront mis en place, basés sur une observation clinique de l’animal, des seuils d’intervention et des interventions adaptées (utilisation d’analgésique, mise à mort).

Choix des espèces

La souris de laboratoire Mus musculus est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'il n'interfère en aucune façon dans l'obtention de résultats, ainsi qu'ils soient pas trop âgé, de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement ne le fasse pas.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare et subissent des radiographies sous anesthésie tous les quinze jours, jusqu'à sept injections intrapéritonéales, un séjour en cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. Le projet vise à décrire l'apparition de la maladie pour définir une fenêtre thérapeutique. Le porteur minimise les nuisances, évoquant une simple "gêne très passagère", et présente la création de ce modèle murin comme nécessaire faute de pouvoir suivre la maladie chez les patients.

Objectifs

L’ostéopathie striée avec sclérose crânienne (OSSC) est une maladie osseuse génétique caractérisée par une augmentation de la formation osseuse par suractivation des ostéoblastes, cellules fabriquant le tissu osseux. Cette activation incontrôlée des ostéoblastes est due à une suractivation de la voie Wnt dans les ostéoblastes. Les patients présentent du fait de la formation osseuse exagérée, des compressions de structures vasculaires et nerveuses, notamment au niveau du crâne, de la mâchoire ou encore du rachis. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement à proposer aux patients, qui subissent des interventions chirurgicales à répétition pour lever ces compressions. Un modèle murin de la pathologie a été généré. Cependant, seuls les animaux à 6 semaines ont été caractérisés. L’objectif de ce projet est d’analyser le phénotype osseux de ces animaux afin de définir une fenêtre d’intervention thérapeutique. Pour cela, les animaux seront suivis de 4 à 12 semaines.

Bénéfices attendus

Le suivi du développement de l’ostéosclérose n’est pas possible chez les patients puisque lorsque les patients sont diagnostiqués l’ostéosclérose est déjà établie. La description de cette apparition est la première étape qui permettra de définir une fenêtre thérapeutique afin de tester des médicaments candidats, préalable indispensable avant de pouvoir proposer un traitement aux patients qui pour le moment n’en ont pas.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique tous les 15 jours qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection) et enfin, le prélèvement sanguin intracardiaque pour l’analyse des marqueurs osseux sanguins.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum à 7 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 2h de cage métabolique et à une ponction cardiaque terminale. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et de définir une fenêtre de traitement.

Remplacement

L'OSSC est caractérisée par une augmentation de la densité osseuse ou sclérose. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette pathologie mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand l’ostéosclérose est déjà installée. C’est pourquoi un modèle de souris où le gène responsable est invalidé a été généré. Ce modèle nous permettra de décrire la mise en place de l’ostéosclérose et de définir une fenêtre thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (120) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’établissement de la cinétique d’apparition de l'ostéoslcérose de l'OSSC. L’analyse initiale du modèle à 6 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 7 injections intrapéritonéales , 2h maximum d’isolement en cage métabolique. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards.

Choix des espèces

L'OSSC est caractérisée par une augmentation de la densité osseuse ou sclérose. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette pathologie. Cependant, la définition d’une fenêtre thérapeutique nécessite au préalable la caractérisation du phénotype osseux. Il a été nécessaire pour mettre en oeuvre ce projet de générer un modèle murin répondant aux besoins de notre étude, ce qui n’a jamais été fait pour le moment. A 6 semaines, les souris mutées ont une augmentation de la masse osseuse, comme précédemment décrit. Nous voulons caractériser l’évolution du phénotype osseux entre 4 et 12 semaines afin de définir une fenêtre d’intervention thérapeutique. L’etude commencera à 4 semaines correspondant au sevrage des animaux et qui correspond à un stade plus précoce que ce qui a été décrit dans la littérature et 12 semaines où le phénotype ne devrait plus s’accentuer ; les animaux étant adultes.

588 animaux non-humains, 307 souris et 281 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une injection d'oligonucléotides antisens dans le liquide céphalo-rachidien ou le cerveau, suivie de séances d'imagerie TEP ou ultrasonore sous anesthésie et, pour certains, d'une chirurgie d'amincissement du crâne. Le porteur mentionne des tests comportementaux chez soixante rats sans en préciser la nature, et signale des risques de paralysie, d'œdème et d'ataxie. Il justifie l'usage de deux espèces par le besoin de disposer de données chez le rat comme chez la souris pour de futurs candidats-médicaments.

Objectifs

Il existe aujourd’hui plus de 5 000 maladies neurologiques rares qui touchent près de 350 millions de personnes dans le monde. 70% d’entre elles se manifestent pendant l’enfance et la majorité ne dispose d’aucun traitement. La plupart de ces maladies orphelines présentant une origine génétique, il est envisageable d’utiliser des traitements ciblant la cause génétique de ces maladies. Les oligonucléotides antisens (ASOs), qui sont capables d’interagir spécifiquement avec l’ARN messager, ont montré des résultats prometteurs pour certaines de ces maladies, mais atteignent très difficilement le système nerveux central. La voie intrathécale (consistant à injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien) a montré de meilleurs résultats, mais cette voie reste encore méconnue. Il est nécessaire de réaliser des études dédiées afin de mieux comprendre comment obtenir une diffusion dans le cerveau et un effet thérapeutique optimal des ASOs après injection intrathécale. Afin de répondre à cette problématique, nous souhaitons développer et évaluer chez le rat et la souris des techniques d’imagerie qui permettront de mesurer la distribution et l’effet d’ASOs dans le cerveau par voie intrathécale. La mise en place de tels outils est cruciale pour guider le développement préclinique et clinique de futurs candidats-médicaments ciblant l’ARN dans les maladies neurologiques. Nous évaluerons la possibilité de marquer directement des ASOs à l’aide d’isotopes radioactifs ou de groupements chimiques fluorescents, permettant leur visualisation directe, respectivement en imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) ou par microscopie. Nous utiliserons également des approches d’imagerie indirectes qui permettront d’étudier l’intensité et la durée des effets spécifiques des ASOs sur des cibles et mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques. Les oligonucléotides antisens ont le potentiel de traiter efficacement ces maladies mais leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques ne sont pas suffisamment connues, en particulier par voie intrathécale. Cette étude sera donc très importante à la fois pour le développement préclinique (et à plus long terme, clinique) des ASOs en apportant des informations inédites.

Procédures

La quasi-totalité des animaux (237 rats sur 281 et 249 sur 307 souris) recevra une injection intrathécale (au niveau des lombaires, entre les méninges dites de l’arachnoïde et de la dure-mère, afin d’atteindre le liquide céphalo-rachidien), sous anesthésie et analgésie locale (10 minutes). Les autres animaux (44 rats et 58 souris) recevront une injection intracérébrale, également sous anesthésie et analgésie générale et locale (1h). Ensuite, les animaux pourront : - soit n’être exposés à aucune autre nuisance à part une anesthésie terminale nécessaire au prélèvement du cerveau (total de 179 rats et 115 souris), - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie de TEP sous anesthésie d’une durée d’une heure (total de 72 rats, dont 60 recevront également des tests comportementaux pendant 70 minutes le lendemain de chaque imagerie, et 36 souris) ou de 2 à 6 heures (30 rats et 30 souris) - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie ultrasonore sous anesthésie (1h), la première session étant précédée la veille par une chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie (96 souris) - soit être utilisés pour plusieurs sessions d’imagerie fUS éveillée (30 min) puis imagerie TEP sous anesthésie (20 min), avec une première chirurgie (30 min) sous anesthésie et analgésie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée (quelques jours avant la première session), suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie en tête-fixée sur une à deux semaines (sessions d’habituation de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour), puis d’une seconde chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie la veille de la première session (30 souris).

Impact sur les animaux

La procédure d’injection par voie intrathécale peut s’accompagner d’effets indésirables tels une paralysie ou une fuite de liquide céphalo-rachidien entraînant un œdème. Certains ASOs sont susceptibles d’entraîner des symptômes d’anxiété, ou des troubles moteurs de type ataxie, voire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort afin de permettre diverses analyses histologiques ou moléculaires du tissu cérébral.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de mieux comprendre la biodisponibilité et l’effet d’oligonucléotides antisens administrés par la voie intrathécale, et ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro. La voie intrathécale étant assez invasive et peu d’ASOs étant à ce jour validés pour une utilisation clinique, il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires par groupe en prenant en compte la possibilité d’échec de l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (le taux de succès de l’injection étant rapporté autour de 80% dans la littérature). Pour les groupes de validation préliminaire des ASOs par stéréotaxie ou les approches ex vivo telles que l’autoradiographie ou la microscopie, les groupes de 3 à 6 animaux seront constitués étant donné les besoins statistiques plus limités pour ces analyses et la meilleure résolution spatiale de ces techniques. Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués, ou de tests non paramétriques équivalents, en fonction de la distribution normale ou non de nos données. Dès lors que la question expérimentale le permet, les mêmes animaux seront étudiés pour plusieurs sessions d’imagerie, permettant une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection intrathécale, voire aux troubles liés à la baisse d’expression des protéines étudiées dans les procédures 2 et 3. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont deux espèces utilisées très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et pour modéliser des pathologies du système nerveux central. Nous souhaitons donc obtenir des informations pertinentes chez les deux espèces qui seront utiles par la suite lors de l’évaluation de candidats-médicaments ASOs dans des modèles rongeurs d’intérêt, qui pourront être le rat ou la souris en fonction des pathologies. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des ASOs sur des cerveaux pleinement développés.

4 000 poulets de chair vont être utilisés, tous envoyés à l'abattoir ou vendus au personnel à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole vise à provoquer volontairement des boiteries douloureuses, par nécrose des têtes fémorales, au moyen d'un sol modifié pendant les quarante-deux jours d'élevage. L'objectif est de tester une trentaine de solutions alternatives aux antibiotiques et de réduire une pathologie fréquente en élevage industriel. Le porteur qualifie les nuisances de légères tout en euthanasiant les animaux dès qu'une boiterie atteint un stade modéré, et décrit l'espèce visée comme le seul modèle possible.

Objectifs

Depuis plusieurs années, les boiteries avec composante bactérienne (nécroses des têtes fémorales) constituent un problème majeur en élevages de poulets de chair. Les germes associés à cette pathologie sont multiples (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus caecorum etc.) et conduisent à des utilisations d’antibiotiques qui peuvent être importantes. En effet, une émergence de maladies avicoles liées au germe Escherichia coli, avec davantage de problèmes locomoteurs a été observée depuis les années 2000, passant de 0.3% en 2006 à 8% en 2017 et 7% en 2018. L’infection et la nécrose des cellules du cartilage de l’os sont douloureuses pour l’animal, qui réduit ses déplacements, donc sa fréquentation des abreuvoirs et des mangeoires, ce qui peut conduire à la mort par déshydratation et/ou arrêt de la prise alimentaire. Il s’agit donc à la fois d’un problème de bien-être animal, d’un problème sociétal lié à l’utilisation d’antibiotiques et d’un problème économique, les pertes (mortalité, morbidité, baisses de croissance) pouvant être conséquentes. La compréhension de ce phénomène fait l’objet de quelques travaux dans la littérature mais la recherche de solutions est complexe, notamment car nous ne disposons pas à ce jour d’un modèle expérimental reproductible et représentatif du problème terrain en station expérimentale. Un tel modèle permettrait de comparer rapidement et avec une intensité de symptômes contrôlée un grand nombre de solutions alternatives aux antibiotiques potentielles.

Bénéfices attendus

Ce modèle présente plusieurs avantages : - il est représentatif du problème observé sur le terrain. Il assure que les solutions mises en évidence pour leur efficacité en station le soient également dans le futur dans les élevages. - il est mis en œuvre dans une station avec des conditions d’élevage standardisées et homogènes. Il permet ainsi de comparer en un minimum de temps un maximum de solutions potentielles, sans biais lié à l’environnement de travail. Les 5 essais réalisés permettront de tester 30 solutions différentes (avec dans chaque essai un témoin négatif et un témoin positif pour en valider le bon déroulement), et pourraient conduire en 5 ans à l’élaboration d’une solution permettant de réduire notablement les problèmes de boiteries sur le terrain. Il faut également noter que la mise en évidence d’une solution efficace à travers ces tests sur 4000 poulets permettra à terme de réduire une pathologie qui concerne plusieurs milliers d’animaux sur le terrain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des conditions spécifiques d'hébergement (strucuture du sol modifié) pendant 42 jours (durée d'élevage des animaux). Aucune autre intervention ne sera réalisée sur les animaux hormis des relevés de poids par parquet 8, 21, 35 et 42 jours après le début de l’essai (environ 5 minutes par parquet).

Impact sur les animaux

Le modèle a pour but de favoriser l’apparition de troubles locomoteurs chez le poulet de chair. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont donc des douleurs/lésions/maladies au niveau des pattes des poulets, douleurs liées à un environnement non adapté (qualité de la litière). Ces nuisances seront de classe légère. Un animal qui présentera une de ces nuisances à un niveau de classe modérée sera retiré de l'étude (euthanasie).

Devenir

L’élevage des poulets jusqu’à 42 jours en station conduit à un poids vif équivalent aux poulets lourds engraissés jusqu’à 49 jours sur le terrain. Les animaux sont donc envoyés en abattoir dans des conditions identiques à celles des poulets élevés sur le terrain ou vendus au personnel de la station.

Remplacement

Les nécroses des têtes fémorales sont une pathologie complexe, d’origine multifactorielle, et dont les causes ne sont pas encore clairement établies. De ce fait, il n’est pas possible à ce jour de développer un système prédictif des boiteries ou un modèle mathématique (qui supposerait d’ailleurs que nous connaissions les solutions efficaces pour réduire cette pathologie, alors qu’il s’agit justement de l’objectif du projet). De même, il n’existe pas de modèle in vitro validé sur ce sujet. Pour le moment, seul un modèle in vivo peut permettre d’évaluer des solutions transposables sur le terrain, c’est-à-dire qui seront aussi efficaces en élevages qu’en essai.

Réduction

Lors de leur mise en place, les poussins sont placés à raison de 50 individus par parquet. Cela permet de tenir compte du taux de mortalité « naturelle » avant 14 jours (poussins porteurs de pathologies ou de défauts non décelées au couvoir), mais aussi d’éliminer les animaux présentant des symptômes de pathologies non liées au modèle expérimental, qui pourraient fausser les résultats. Le dispositif permet de tester 8 traitements, à raison de 2 parquets par traitement, ce qui constitue un compromis entre tester plusieurs solutions simultanément et avoir au moins 2 répétitions pour assurer la fiabilité des données.

Raffinement

La capacité de déplacement des animaux est régulièrement évaluée sur une échelle de 0 (déplacement normal) à 3 (incapacité à se déplacer). A minima 2 fois par semaine, les poulets présentant un score de boiteries supérieur ou égale à 2 (défaut évident qui affecte la capacité de déplacement) sont euthanasiés selon la méthode décrite au point 3.3.3. Ainsi, aucun animal présentant une boiterie affectant visiblement sa capacité à accéder à l’eau ou à l’aliment n’est laissé en souffrance. Afin de réduire le stress des animaux dans les conditions particulières de cet essai : - L’eau et l’aliment sont laissés en accès libre et les niveaux nutritionnels couvrent les besoins d’entretien et de croissance des animaux. - Les manipulations d’animaux vivants sont réduites au minimum et le modèle n’est pas invasif : pesée collective à la mise en lot, trois fois pendant l’essai (J8, J21, J35) et une fois à la fin de l’essai (J42).

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Par ailleurs, la méconnaissance des processus métaboliques à l’origine des nécroses des têtes fémorales chez l’oiseau ne permet pas d’établir un parallèle avec une autre espèce. Enfin, le cycle d’élevage court de la volaille permet de limiter la durée des dommages dans les conditions de la procédure expérimentale. Il est communément admis que les nécroses des têtes fémorales trouvent leur origine dès la phase de démarrage de l’élevage des poulets, ce qui nécessite de commencer l’essai dès 1 jour d’âge. L’expression maximale des boiteries s’observe en fin d’élevage, et elles sont plus marquées sur des poulets dits « lourds », élevés jusqu’à 49 jours sur le terrain. Les conditions sanitaires préservées de la station permettent néanmoins d’obtenir un poids vif proche du poids final du terrain dès 42 jours. De ce fait, la durée de l’essai sera de 1 jour d’âge jusqu’à 42 jours d’âge, afin de permettre l’expression des boiteries jusqu’au poids vif représentatif du terrain.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des maladies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires imposés pendant huit à seize semaines, avec gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés. Le projet vise à tester l'effet de l'inhibition de la mort cellulaire dans la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non alcoolique. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier" et attend de l'étude une simple preuve de concept.

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique sont des maladies ne disposant d’aucun traitement pharmacologique formel validé. La stéatose hépatique non-alcoolique va devenir la première cause de transplantation hépatique et la cholangite sclérosante primitive est une maladie dont les mécanismes moléculaires sont très mal caractérisés, il est dit d’elle que c’est la dernière boîte noire de la médecine qui s’intéresse à l’étude du foie. Ce projet a donc pour objectif de mieux caractériser rôle de la mort des différentes populations cellulaires dans le développement de ces maladies. Il permettra d’identifier et de cibler des populations clés dans le développement de la maladie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques dans ces pathologies pourra constituer la base d’un dépôt de brevet. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux caractériser des maladies du foie sans traitement pharmacologique disponible actuellement. D’un côté la cholangite sclérosante primitive, maladie rare mais grave exposant au risque de cirrhose et de cancer. Actuellement, le seul traitement efficace de cette maladie est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. De l’autre côté, la stéatose hépatique non alcoolique est la maladie hépatique la plus commune car elle suit la courbe de progression de l’obésité. Bien que sa prévalence explose, aucun traitement n’est disponible à ce jour, et le nombre de patients au stade terminal de la maladie (c’est-à-dire cirrhose) nécessitant une transplantation hépatique est en croissance perpétuelle. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique de l’inhibition de la mort cellulaire sur le développement de ces maladies.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de pathologies hépatiques et à leurs traitements. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime)+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime) )+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et trouver des thérapies innovantes. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les molécules sont bien tolérées par les souris. Les administrations par gavage, les injections intra-péritonéales, et les prélèvements sanguins nécessaires durant les tests métaboliques peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, ils peuvent induire des microlésions ou des irritations. Les tests métaboliques effectués peuvent également induire un stress pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun ou encore l’isolement en cas d’utilisation de cage métabolique. De même, le transport des animaux qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=720) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures. L'euthanasie sera pratiqué au sein de l'établissement d'origine des animaux. En effet, pour rappel, la présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cholangite sclérosante primitive ou la stéatose hépatique non-alcoolique, la complexité cellulaire ne pouvant être répliqué in vitro. Nous avons besoin étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de nos gènes d’intérêts dans un type cellulaire donnée, sur les autres types cellulaires dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 720 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui sont malheureusement nécessaires pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les inhibiteurs sont bien tolérés par les souris. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d’étudier le rôle de la nécroptose dans les processus physiopathologiques aboutissant à la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique. Afin de répondre à cet objectif, l’expression de certains gènes d’intérêts dans les modèles animaux utilisés doit être altérée génétiquement dans des types cellulaires choisis, ce qui justifie le choix de cette espèce (souris). Justification des stades : Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 et 8 semaines pour chaque procédure. Cela correspond à l’âge adulte, deux semaines après le temps du sevrage. De plus, les variations entre les souris sont minimales ce qui permet de diminuer la variabilité (aspects métaboliques) entre animaux avant le début des traitements. Cet âge de départ permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Justification du sexe : Nous favoriserons l’utilisation des deux sexes (idéalement 50/50) afin de ne pas introduire un biais dans nos études notamment lors des tests d’inhibiteurs pharmacologiques dans le développement des maladies étudiées. En effet, il est maintenant établi que lors des expérimentations et autres tests médicamenteux, les souris mâles sont plus exploitées que les souris femelles. Cela introduit donc un énorme gap puisque les femelles peuvent réagir différemment sur le plan de toxicité, du métabolisme ou encore de la biodisponibilité. Étant donné que notre but est de proposer de nouveaux traitements, il nous apparait essentiel d’analyser les deux sexes afin que les résultats puissent être transposés à l’homme.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-nasales d'un dérivé de plastique, le DEHP, jusqu'à quarante-quatre injections par animal sur cinq mois, puis passent des tests de locomotion, de mémoire de reconnaissance et de localisation d'objets et de mémoire spatiale. Le projet cherche à établir si ce phtalate aggrave une maladie du cerveau modélisée chez la souris. Le porteur qualifie l'inconfort de léger et affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer le recours à l'"animal entier".

Objectifs

Les molécules comme le DEHP (phtalate) sont des produits chimiques synthétiques largement utilisés dans de nombreux produits plastiques de consommation courante. Ils ne sont pas chimiquement liés aux polymères plastiques et sont facilement libérés dans l'environnement. Des études récentes rapportent pour la première fois une contribution potentielle du DEHP à une maladie du cerveau chez l’Homme (la maladie à corps de Lewy). L’objectif de ce projet est de déterminer si les dérivés de plastiques (comme le DEHP) représentent un facteur de risque d’une maladie du cerveau, en tant que polluants environnementaux. Cette maladie est modélisée chez le rongeur (souris), et ce projet vise à tester l’effet du DEHP sur le comportement des animaux et d’étudier les mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi le mode d'administration intra-nasal car nous pensons que l'entrée par la voie respiratoire imitera mieux l'influence environnementale de la toxicité du DEHP chez les humains. De plus, il a été démontré que ce mode d'administration permet d'obtenir une délivrance rapide et concentrée au cerveau. Une étude pilote visera tout d’abord à définir la dose de phtalate qui sera administrée aux souris saines ou modèles de la maladie, permettant la détection cérébrale de ces produits (et dérivés) dans le cerveau après injection. Un phénotypage comportemental et un phénotypage moléculaire et cellulaire seront ensuite réalisés suite à l’administration chronique de DEHP. Les objectifs sont de comprendre si le DEHP aggrave la maladie en touchant des paramètres impliqués dans la progression de la pathologie, ainsi que les fonctions de mémoire.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration d’une molécule dérivée de plastique présent dans de nombreux produits usuels, le DEHP, représente un facteur de risque dans une maladie du cerveau (maladie à Corps de Lewy). De plus, nos études montreront également si cette molécule affecte le cerveau de l’animal sain. La mise en évidence d’un lien de cause à effet permettra de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles permettront d’adapter de nouvelles thérapeutiques chez l’Homme. En apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet toxique de ces molécules sur le cerveau. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes pour la mise en garde contre certaines toxicités environnementales. Elles permettront de mettre en place des politiques de prévention. Enfin, ce projet comprend les analyses sur les souris mâles et femelles. Le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets différents sur les deux sexes, avec notamment une baisse de la testostérone chez le mâle. En apportant une analyse complète des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes spécifiquement liés au sexe, dans la toxicité cérébrale de DEHP, mais aussi dans les facteurs de risque de la maladie.

Procédures

72 souris vigiles adultes (6 mois) recevront des injections (5 secondes) à raison de 1X/jour pendant 6 jours. 216 animaux vigiles recevront des injections (5 secondes) à raison de 2X/semaine pendant 5 mois (22 semaines), soient 44 injections par animal. Comportement réalisé sur 72 animaux vigiles sur une période de 41 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester leur locomotion (2 nuits et 3 jours), leur mémoire de reconnaissance et de localisation d’objets (15 minutes par essais, 2 essais/jours, 5 jours) et enfin test de mémoire spatiale à long terme (1 minute/essai, 4 essais/jours, 6 jours) suivis d’1 test après 24h (1 minute/animal) et 21 jours (1 minute/animal). Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 12 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Selon notre hypothèse que le DEHP représente un facteur de risque de la MCL, nous attendons une aggravation de la pathologie. Les animaux pourraient présenter des signes de détresse si une forte toxicité du DEHP devait se répercuter au niveau systémique. Cependant, la littérature ne documente pas ce type d’effet aux doses testées dans ce projet chez des souris adultes. Les études de comportement pourront induire du stess aux animaux.

Devenir

Tous les animaux (288) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires et 24 souris/groupe (soit 12 mâles et 12 femelles) pour l’imagerie cérébrale. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration de molécule DEHP: la surveillance des souris se fait à chaque instillation, soit 2X par semaine (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge de 7 mois au début du projet et seront analysés à l'âge adulte de 12 mois, ce qui correspond environ à la moitié de la vie d’une souris en laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.