Procédures modérées

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivi d'injections d'une thérapie combinant vésicules extracellulaires et un traitement moléculaire. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 % et des déficits neurologiques présentés comme réversibles en une semaine, et utilise des rats hypertendus pour se rapprocher des patients. Tous les rats sont mis à mort pour prélever le cerveau, les retombées cliniques étant renvoyées au long terme avec un impact socioéconomique décrit comme "très important".

Objectifs

Face au manque de l’efficacité des traitements actuels contre l’AVC et de leur courte fenêtre thérapeutique, ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie combinant les vésicules extracellulaires (VE) et un un traitement moléculaire mimétique des héparanes sulfates, à la suite d’une ischémie cérébrale chez le rat. Les effets bénéfiques des VE et du traitement moléculaire, administrés séparément, ont déjà été montrés dans des modèles in vitro et in vivo, y compris dans notre laboratoire. Les VE seront issues des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines préalablement traités ou non par le traitement moléculaire. La préexistence de l’hypertension artérielle chronique (HTA) est connue pour être un facteur de risque et un facteur aggravant important pour l’AVC. Aussi, pour se rapprocher le plus possible des conditions cliniques, nous utiliserons dans ce projet des rats normotendus et des rats hypertendus.

Bénéfices attendus

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé public. Ils représentent la 2ème cause de mortalité et la 1ère cause d’handicap chez l’adulte. Plusieurs facteurs de risque favorisent le déclenchement de cette pathologie dont l'hypertension artérielle chronique qui est le facteur de risque le plus important. Dans les AVC de types ischémiques, la thrombolyse et la thrombectomie mécanique sont les seules interventions approuvées par les autorités de santé. Cependant, ces interventions ne sont applicables que chez une minorité de patients. Aussi, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les AVC. Dans ce contexte, notre projet devrait permettre le développement d’une nouvelle intervention thérapeutique associant les VE et le RGTA pour protéger et réparer le cerveau et améliorer la récupération neurologique après un AVC. L’impact socioéconomique d’un tel développement sera très important.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (induction de l’AVC sous anesthésie générale) : 1 heure maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 240 animaux sont concernés. - Injection intra-artérielle (animal anesthésié ) : 1 fois (1 h après l’induction de l’AVC) ; 5 minmaximum par animal, les animaux du groupe 2, 5 et 6 sont concernés, donc 120 animaux au total. - Injection intraveineuse (animal anesthésié) : 1 fois, 24 h après l’induction de l’AVC ; 10 min maximum par animal. Les animaux des groupes 2, 3, 4, 5 et 6 sont concernés, donc 200 animaux au total

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’ischémie utilisé, les animaux décrivent une perte de poids (10% environ) ainsi que des déficits neurologiques (diminution de l’activité locomotrice) pendant les 3-4 jours suivant l’induction de l’ischémie cérébrale. Cependant, la perte de poids et les déficits neurologiques sont réversibles et les animaux récupèrent spontanément un bon état général au bout d’une semaine. Ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort , sous anesthésie profonde, dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses en post-mortem.

Remplacement

L’AVC, une pathologie complexe, fait intervenir différents acteurs moléculaires (molécules de signalisation cellulaire intervenant dans le fonctionnement cellulaire, l’inflammation et la mort cellulaire) ainsi que des acteurs cellulaires (y compris neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales). Bien que des tests aient déjà été réalisés sur des modèles cellulaires in vitro, pour l’instant, il n’existe aucun modèle de substitution qui permet de mimer dans sa complexité la physiopathologie de l’AVC. De plus, l’utilisation d’animaux présentant des facteurs de comorbidité (HTA) permet d’avoir un modèle se rapprochant de l’humain et de déterminer ainsi la stratégie à suivre pour le traitement de l’AVC ischémique.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’investigation non invasives telles que l’imagerie par IRM et les tests de comportements se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Celles-ci permettent de suivre l’évolution de l’AVC à différents temps sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. Dans le but de pouvoir réaliser des tests statistiques, l’estimation du nombre d’animaux par groupe est basée sur les données de nos études antérieures chez le rat et le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Par conséquent, nous estimons que 20 rats par groupe est suffisant pour réaliser les tests statistiques. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes Européennes. Ils auront un temps d’adaptation avant toute expérimentation et ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale : les modèles d’ischémie focale sont bien connus et de nombreux mécanismes de cette pathologie ainsi que des essais de neuroprotection ont ainsi été étudiés chez cette espèce animale. En effet, l’anatomie ainsi que la circulation cérébrale sanguine du rat sont bien décrites et, par ses grands traits, semblables à celles de l’Homme. De plus, cette espèce se prête facilement à l’étude fine des capacités sensorimotrices et cognitives par l’intermédiaire de tests comportementaux appropriés. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour l’étude de l’ischémie cérébrale. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 250-350 g, âgés de 12 semaines au début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC chez le rat. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

10 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs de la même mutation que les enfants atteints de la maladie de Sanfilippo B, ils reçoivent une injection intracérébrale et intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie de quatre heures, puis des prélèvements sanguins, des ponctions de liquide céphalorachidien et des IRM répétés sur trois à douze mois, avant leur mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et présente cette étape comme "indispensable" avant un essai clinique chez l'enfant. Il justifie le chien par sa prédisposition naturelle à cette mutation et sa proximité neurologique avec l'humain.

Objectifs

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l’organisme : ainsi le déficit d’une enzyme nommée l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), requise dans la voie de dégradation du sucre, l’héparane sulfate, engendre une accumulation toxique de ce dernier dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de Sanfilippo B est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central (SNC). La maladie débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère et dans la phase finale, ils deviennent grabataires, perdent tout contact avec leur entourage et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire. L’espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l’ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l’enzyme NaGlu à l’origine de la maladie. L’objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d’efficacité et d’évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPSIIIB après administration combinant une injection intracérébrale et une injection intraveineuse (IV) du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 12 mois post-injection.

Bénéfices attendus

Le syndrome de Sanfilippo est la conséquence d’une accumulation de molécules d’un sucre, l’héparane sulfate, partiellement dégradées, dans les tissus de l’organisme. Ceci est le fait d’une mutation génétique qui affecte l’activité d’une enzyme, l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), nécessaire pour la dégradation de l’héparane sulfate. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Ils apparaissent habituellement avant l’âge de 3 ans. Par la suite, l’atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d’autonomie vers l’âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 10 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques telles que les données de biodistribution du produit de thérapie génique dans le cerveau et les organes périphériques des animaux injectés, l'étude histologique, mais aussi la tolérance globale de cette approche avec le suivi IRM (Imagerie par Résonance Magnétique), les données des bilans biologiques sanguins et de dosage de biomarqueur spécifique. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo.

Procédures

Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : - Une procédure d’injection intra-cérébrale et intraveineuse concomitante, effectuées par des spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Durée intervention : environ 4h - Des prélèvements sanguins effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations) soit sous anesthésie (anesthésie destinés aux autres gestes décrits). Pour un total de 7 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 10 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 5 min - Des prélèvements du liquide céphalo rachidien (LCR) seront effectués par ponction, soit au niveau lombaire, soit au niveau atlanto-occipital. Ils seront réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 10-15 minutes - Des imageries par résonnance magnétique (IRM) qui seront faites sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 1h30 - Un traitement immunosuppresseur tout au long de l’étude par administration orale de corticostéroïdes et d’un immunosuppresseur

Impact sur les animaux

- L’injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable est attendu. Ces 2 actes seront réalisés lors des anesthésies prévues pour les autres gestes. - L’injection du vecteur thérapeutique par voie intracérébrale (IC) sera réalisée par des neurochirurgiens experts et maitrisant cette technique. Elle se fera sous anesthésie générale et analgésie. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n’est pas attendu de réaction douloureuse. - Les IRMs, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés - La ponction de LCR sera réalisée par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie et analgésie adaptées. Il n’est pas attendu d’effet indésirable. - Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections d’AAV, un protocole d’immunosuppression sera mis en place, à base de corticoïdes de façon temporaire (D-1 à D+8) et d’un immunosuppresseur tout au long de l’étude . Il n’est pas attendu d’effet secondaire à ce traitement. -Le phénotype ne devient dommageable qu’après 15 mois. L’évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux.

Devenir

Les 10 animaux concernés par la procédure décrite dans ce projet seront suivis 3 mois ou 12 mois puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements de tissus afin de réaliser les analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l’animal.

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été́ effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité́ du vecteur Adeno-Associated Virus (AAV), produit de thérapie génique. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d’essai clinique de phase I/II pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de cette lignée de chiens MPSIIIB. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type III B

Réduction

10 animaux au total maximum comprenant : 2 animaux injectés avec du véhicule (l’un sacrifié 3 mois post injection et l’autre sacrifié 12 mois post injection), 6 animaux recevant la double administration (IC + IV) dont 3 nécropsiés à 3 mois post injection et 3 nécropsiés à 12 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 12 mois).Le nombre d'animaux par groupe (3 injectés vecteur AAV par temps de suivi – 3 et 12 mois, ; 1 injecté véhicule par temps de suivi ; 1 non injecté par temps de suivi ) a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique (Test t et ANOVA) sera réalisée pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) .3) Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d’arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l’aide de mesures comme un traitement adapté ou une euthanasie anticipée. 4) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie). De plus, le nombre d'anesthésie sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction lombaire) au sein d'une même anesthésie.

Choix des espèces

La race de chien choisie (mix beagle et fox hound) est naturellement prédisposée à la même mutation génétique que chez l’homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III B. Elle conduit comme chez l’homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. Le choix de l’espèce est également basé sur son homologie avec l’homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central (SNC) et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l’étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de Sanfilippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 3 mois, soit 12 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous permettra d’effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette maladie de surcharge est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation peut devenir visible (troubles locomoteurs, troubles cognitifs) pour les animaux au delà de 15 mois.

154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.

Procédures

Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210

Impact sur les animaux

L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.

Remplacement

Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.

Réduction

Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).

Choix des espèces

Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par un parasite intestinal par voie orale, reçoivent des injections, sont mises à jeun, puis subissent une chirurgie du ventre sous anesthésie sans réveil pour prélever le contenu de l'intestin. Le porteur affirme que la balance "bénéfice/risque" est "clairement favorable" et présente l'enjeu comme une piste de santé publique contre les parasites. Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui d'étudier ces interactions et qu'il privilégiera les modèles ex vivo quand c'est possible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.

Procédures

Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.

Remplacement

Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.

Réduction

A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête, implantation de dispositifs ou craniotomie, puis des tests de course sur tapis et sur roue et des tests visuo-vestibulaires, la tête maintenue fixe et sous restriction hydrique pour le motiver, avant sa mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que certaines souris subissent une atteinte vestibulaire pouvant s'accompagner de déficits auditifs, et met en avant l'analgésie. Il présente ce projet de recherche fondamentale sur l'équilibre et le regard comme ne pouvant être mené que sur animal vivant et éveillé.

Objectifs

Le système vestibulaire est responsable de la stabilisation de la posture et du regard. Dans le cas de pathologies touchant le système vestibulaire, les patients souffrent de déséquilibres et d’oscillopsies liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en places des substitutions sensorielles qui visent à permettre le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. Ces mécanismes diffèrent selon que la perte vestibulaire est congénitale ou acquise. Les patients rapportent également des perturbations différentes selon la locomotion réalisée : de manière contre-intuitive, l’instabilité est parfois moindre lors de locomotions plus dynamiques. Il a été récemment démontré chez le xénope et la souris l’existence lors de la locomotion d’un signal nerveux provenant de la moelle épinière (copie efférente spinale), générée par des neurones spinaux générateurs de rythme, qui participe au contrôle du regard. Le but de ce projet est de caractériser comment ce signal interagit avec les réflexes responsables du contrôle du regard qui dépendent des entrées vestibulaires et visuelles : les réflexes vestibulo-oculaires et optocinétiques. Nous évaluerons également dans quelle mesure ce signal participe à la substitution sensorielle lors de pertes vestibulaires plus ou moins marquées. À l'aide de techniques comportementales, pharmacologiques et électrophysiologiques, l’influence des paramètres locomoteurs sur l’intégration des signaux visuels, vestibulaires et spinaux sera étudiée, en particulier au niveau des neurones vestibulaires centraux. Ce projet utilisera un maximum de 480 souris.

Bénéfices attendus

Le projet constitue un projet de recherche fondamental qui vise à une meilleure compréhension des signaux sensoriels et nerveux qui permettent le sens de l’équilibre et de l’orientation, par l’étude d’une voie nerveuse non encore décrite, potentiellement importante lors de situation pathologiques conduisant à des substitutions sensorielles. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation motrice chez des patients atteints de pertes des fonctions sensorielles et de fonctions locomotrices.

Procédures

-Les animaux seront tous soumis à une chirurgie unique permettant l'implantation de dispositifs sur la tête d'une durée comprise entre 20 minutes, ou d'une craniotomie d'une durée de 60 minutes. -Certains animaux seront utilisés lors de tests comportementaux de type course sur tapis motorisé (durée 45min), à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines. D'autres seront utilisés pendant des tests comportementaux de type course sur roue non motorisée (durée 30min) pendant 2 seaines et des tests sensorimoteurs visuo-vestibulaires (durée 45min) pendant 2 semaines. -Une partie des animaux recevra une injection unique (durée

Impact sur les animaux

Des chirurgies potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Le protocole d’apprentissage de la tâche de locomotion sur roue nécessite une restriction hydrique afin de motiver les souris à la course. Une fois la tâche acquise, son maintien pourra être le cas échéant effectué à l’aide de récompense (eau sucrée) permettant de lever la restriction. Lors de ces apprentissages et lors des tests, les souris sont maintenues tête fixe pendant le temps expérimental qui n’excède jamais 60min. Les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiées à la fin des procédures. Les cerveaux feront l'objet de prélèvements post-mortem et seront utilisés pour préciser la neuroanatomie des voies spino-oculaires étudiées ainsi que la localisation des neurones enregistrés au cours du projet.

Remplacement

L’intégration des signaux sensorimoteurs issus de l’oreille interne et de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient échouer à atteindre la vitesse minimale de 25cm/s lors de la tâche comportementale. Le nombre de souris pourra être diminué si cette estimation est supérieure à la réalité. L'électrophysiologie ne sera effectuée que sur souris contrôles et sur 1 unique groupe de souris, déterminé en fonction des résultats obtenus. Cette approche séquentielle permet de réduire de 120 le nombre de souris demandées.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnemnt du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 12 semaines (3 mois) pour les plus âgées.

Transgéniques et "de mauvais génotype", ces souris sont tuées de toute façon hors de ce projet, selon le porteur, faute d'utilité dans les protocoles de l'établissement : 480 d'entre elles sont exploitées pour former le personnel aux injections et aux prises de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Après un entraînement sur simulateur, sur cadavre ou sur souris anesthésiée, les participants pratiquent sur des souris éveillées et immobilisées des injections sous la peau, dans le péritoine ou jusqu'à huit fois dans la veine de la queue, des gavages d'eau et des prises de sang à la joue ou à la patte. Une sonde de gavage mal placée peut provoquer une détresse respiratoire, et le tuteur tue sur-le-champ la souris qui s'étouffe. Chaque souris est tuée après son geste pour une autopsie qui valide la formation. Le porteur fixe un maximum de trois souris vivantes par geste et par participant, sans dire combien de participants expliquent les 480 souris.

Objectifs

Ce projet concerne la mise en place d’un tutorat permettant le contrôle de compétences ou la formation du personnel/utilisateurs de l’établissement, selon une méthodologie définie et finalisée par une validation de la maitrise du geste technique. Il concerne les techniques d’administration par injections sous-cutanées, dans le péritoine, dans la veine de la queue, ou par gavage, et de prélèvements sanguins dans la veine de la patte ou en veine submandibulaire, chez la souris. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’administration de substances, peut se réaliser selon différentes voies choisies selon les volumes et le produit à administrer. Les prélèvements sanguins permettent de suivre différents paramètres physiologiques. Afin de limiter son impact sur l’animal, des recommandations quant au volume à prélever et la fréquence de ces prélèvements doivent être suivies. Ces techniques doivent être maitrisées pour être correctement réalisées, en respectant le bien-être des animaux, et limiter le stress de l’animal et de l’expérimentateur. Conformément à la règlementation, les personnes amenées à expérimenter sur des animaux doivent justifier de la maitrise des gestes techniques qu’ils doivent réaliser dans le cadre d’un projet. Ainsi, ce tutorat sera destiné uniquement aux personnes sélectionnées selon leur besoin de maîtriser un de ces techniques requis spécifiquement dans le cadre d’un projet ayant obtenu une autorisation. La formation sera adaptée à chaque participant et ne concerna que les gestes techniques requis et non réalisables systématiquement par un autre personnel de l’établissement. La supervision par le tuteur se fera jusqu’à l’autonomie de l’expérimentateur en formation et observation du geste sur les premiers animaux du projet. La formation devra être réalisée juste en amont du démarrage du projet. Ces formations seront progressives et encadrées par du personnel qualifié référent identifié au sein de l’établissement. Les compétences validées lors de cette formation répondent à un certain nombre de critères définis à chaque étape de la formation. Si les gestes ne sont pas acquis à une étape, le tuteur peut exiger la reprise du geste dès la première étape sur animal simulateur ou sur un animal mort. Après validation, la formation sera inscrite dans leur livret de compétences. Ainsi, les participants pourront réaliser leurs travaux de recherche selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale et en accord avec la règlementation.

Bénéfices attendus

Cette formation s’adresse aux personnels sélectionnés selon leur besoin de maîtriser une ou plusieurs gestes techniques dans le cadre de la réalisation de projets ayant obtenu une autorisation. Elle permettra de s’assurer de la bonne réalisation de gestes techniques fréquemment utilisés en expérimentation animale pour l’administration de substances/cellules et les prélèvements sanguins, selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale (raffinement), afin d’assurer le bien-être des animaux et de répondre aux exigences réglementaires. De plus, les souris de réforme, qui sont des souris systématiquement mises à mort car elles sont non utilisables dans les projets et non re-plaçables (souris transgéniques), seront utilisées dans le cadre éducatif, permettant la réduction du nombre d’animaux à produire pour l’apprentissage de ces gestes.

Procédures

Une souris sera soumise à un seul des gestes techniques enseigné, c’est-à-dire soit des injections sous la peau, soit dans le péritoine, soit dans la circulation sanguine via la veine de la queue, soit une administration d’eau par gavage, soit des prélèvements de sang (en veine submandibulaire ou en saphène au niveau de la patte postérieure). Toutes les injections se feront avec des solutions injectables type sérum physiologique stérile avec des volumes bien inférieurs aux recommandations et aux lignes directives en vigueur. Les administrations réalisées qu’une seule fois, à l’exception des injections dans la veine de la queue. En effet, cette technique nécessite un apprentissage plus long, et le geste sera répété au maximum 8 fois espacés d’une semaine, sur une durée totale de 1 mois. Les volumes de prélèvement de sang seront adaptés en fonction du poids de l'animal, en respectant la physiologie de la souris mais aussi les recommandations. Le prélèvement sanguin sera effectué une seule fois pour chaque animal. L’apprentissage se fera sur animal simulateur et sur cadavre quand c’est possible ou sinon si ça n’est pas possible sur animal anesthésié ; puis, une fois les gestes maitrisés, ils seront effectués sur des animaux vigiles, immobilisés par une contention ou dans un tube à contention adapté à la taille de la souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis selon le geste étudié au stress de l’anesthésie ou de l’immobilisation par contention. L’injection d’une solution de sérum physiologique par voie sous-cutanée, ou dans le péritoine ou intraveineuse ne devrait induire qu’une légère douleur due à la piqure. Le gavage de la souris pourra induire un inconfort, voire une irritation due à la sonde. Si la sonde n’a pas été introduite correctement, l’animal peut montrer des signes de détresse respiratoire ; dans ce cas, elle sera ressortie très délicatement et l’animal sera surveillé jusqu’à un retour à un état normal ou mis à mort immédiatement par le tuteur si l’animal s’étouffe. En effet, si un animal montre des signes de souffrance, présente des difficultés respiratoires ou une modification motrice/de posture qui perdure lors de la procédure, il sera mis à mort. Le prélèvement sanguin en veine submandibulaire pourra induire une douleur légère lors de la piqure si la zone est mal anesthésiée. Il est possible d’observer un saignement à l’oreille ou au nez si la piqure est mal réalisée. Le prélèvement sanguin en veine saphène ou l’injection en intraveineuse entrainera en plus de la douleur légère induite par la piqure, un inconfort de la souris quand le geste technique sera réalisé sur la souris vigile et immobilisée dans un tube de contention.

Devenir

Les animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de mauvais génotype, sans pathologie, non utilisables en protocole et non replaçables, et qui sont systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. Chaque animal est mis à mort après chaque apprentissage d’un geste pour réaliser ensuite une autopsie afin de valider la formation du geste et vérifier que la souris n’a subi aucune autre atteinte non souhaitée.

Remplacement

La formation des expérimentateurs sert à valider sur animaux vigiles la réalisation de gestes techniques de prélèvement et d’injection afin de les réaliser ensuite de façon autonome et en respectant les bonnes pratiques et le bien-être animal. Même si une partie de l’apprentissage sera d’abord réalisée sur des modèles d’imitation de la souris (Simulateur Mimicky souris) et des cadavres (pour l’administration par voie sous cutanée et intrapéritonéale), il est nécessaire de valider l’ensemble de ces gestes techniques sur des souris vigiles, avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des groupes plus importants d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé pour permettre aux expérimentateurs de maitriser le geste dans le respect des volumes prélevés et du nombre d’administrations toléré. Les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris ou sur une souris décédée quand c’est possible ou quand sinon si ça n’est pas possible sur animal anesthésié et enfin sur animal vigile, afin d’utiliser le moins possible d’animaux. De plus, un geste maitrisé par un utilisateur représente un raffinement pour la réalisation des projets, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux analysés par groupe. Il est aussi important de préciser que la totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de mauvais génotype non utilisables en protocole et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour l’apprentissage des gestes techniques. Ainsi, le nombre d’animaux vivants a été limité à 3 souris maximum par geste technique par participant.

Raffinement

Les animaux seront manipulés régulièrement par des personnes compétentes avant le début du projet afin qu’ils soient habitués avant leur premier contact avec les participants de la formation. Une attention particulière sera portée à l’apprentissage initial la préhension et contntion de l’animal avant l’apprentissage et la réalisation de tous les gestes enseignés. La présence du tuteur lors de la réalisation du geste garantira la qualité de l’apprentissage de manière individuelle pour chaque participant. Les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris et sur une souris mises à mort, avant de valider le geste sur un animal vigile, afin de générer le moins de stress possible. Enfin, un seul geste technique ne sera réalisé par animal, ce qui justifie le nombre de procédures.

Choix des espèces

Lorsqu’il n’y a pas de méthodes de remplacement permettant de répondre à une question scientifique sans recours à l’animal, notre établissement utilise principalement des souris transgéniques pour ses projets scientifiques. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en reproduisant la physiologie de l’homme, et en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyses disponibles. Les souris seront âgées au minimum de 8 semaines pour afin d’assurer l’apprentissage sur des animaux de taille adulte, avec un poids minimal de 25g.

298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de pose d'une broche puis une découpe du fémur pour simuler une fracture, suivie de radiographies répétées sous anesthésie et d'injections sous-cutanées quotidiennes, avant sa mise à mort pour prélever les os. Le porteur reconnaît que la fracture provoquée est douloureuse à court terme et met en avant l'analgésie mise en place. Il justifie le rat par l'absence de modèle in vitro reproduisant une fracture et par la possibilité d'y poser des broches de chirurgie humaine.

Objectifs

La réparation des fractures a fait l’objet d’études antérieures et certaines molécules ont été développées et approuvées pour traiter les complications osseuses associées aux fractures (retard de consolidation, non consolidation, etc…). Cependant, l’utilisation de ces molécules est associée à de fortes contraintes ou effets secondaires indésirables (implantation locale via un dispositif médical nécessitant une chirurgie correctrice, augmentation localisée de la résorption osseuse, formation osseuse anarchique et anormale et quelques fois un œdème) avec en plus un fort coût économique qui ne semble pas justifié par rapport aux bénéfices apportés aux patients. Aujourd’hui, il n’y a pas de molécule, administrable par injection, permettant de faciliter la réparation des fractures et de réduire le risque de complications et de chirurgies correctrices. La consolidation des fractures osseuses nécessite une activation contrôlée des voies de la formation osseuse. La différentiation des cellules impliquées dans la réparation osseuse est conditionnée par la qualité du matériau osseux sur lequel ces cellules reposent et un changement de dureté/raideur du matériau osseux est suffisant pour activer le programme de différentiation de ces cellules. Cependant, aujourd’hui, aucune donnée sur la qualité du matériau osseux au site de fracture ou adjacent au site de fracture n’est disponible. Récemment, de nouvelles molécules ont été développés et leurs mécanismes d’action suggèrent une augmentation de la résistance osseuse dans les semaines qui suivent l’initiation du traitement. In vitro, ces composés stimulent la formation osseuse et augmente la qualité du matériau osseux déposé, résultant in fine en une meilleure résistance osseuse. Ces composés sont administrables par voie sous-cutanée et l’hypothèse de travail est qu’ils pourraient améliorer la réparation et consolidation des fractures osseuses réduisant ainsi les complications associées. Les objectifs de ce projet sont : (1) de générer un modèle animal de fracture fémorale afin d’évaluer la qualité du matériau osseux au site de fracture et juste à côté ; et (2) d’investiguer si les nouvelles molécules pourraient représenter une solution thérapeutique innovante dans la prévention des complications osseuses associées aux fractures.

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la qualité du matériau osseux afin de comprendre la contribution dans la différentiation cellulaire. Le second bénéfice est représenté par l’évaluation de nouvelles molécules qui a terme peuvent apporter un réel plus dans la prise en charge des patients avec fractures osseuses.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale afin de réaliser l'implantation d'une broche osseuse pour stabiliser la fracture et une découpe du fémur afin de simuler une fracture osseuse. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et une administration de médicaments anti-douleur sera réalisée avant incision de la peau. De même, un antibiotique sera administré aux animaux avant la procédure chirurgicale afin de réduire le risque d'infection. Un suivi longitudinal des animaux sera réalisé par radiographie (3 radiographies pour les temps court et 8 radiographies pour le temps long) après anesthésie gazeuse. Des traceurs fluorescents non toxiques seront injectés aux animauxpar voie sous-cutanée afin de standardiser les mesures avant mise à mort. Les nouvelles molécules seront administrées quotidiennement par voie sous-cutanée. Les injections sous cutanée seront réalisées sur animaux vigiles avec une contention adaptée.

Impact sur les animaux

La réalisation chirurgicale de la fracture osseuse et de l’ostéosynthèse pourra être perçue comme une procédure douloureuse à court terme. Cependant, il est à noter ici que la séquence utilisée, pose d’une broche pour stabiliser le fémur avant fracture, a été choisi afin de ne pas engendrer de lésions des tissus entourant le fémur et de ne pas entrainer de mouvements des fragments osseux. Ceci dans un but de réduire la douleur ressentie par les animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale et des médicaments anti-douleur seront administrés au moment du geste (analgésie péri et post-opératoire immédiate) et maintenu sur une période de 48h. Les animaux recevront également une dose cumulative de rayons x estimé au maximum à 0.020 mSv, équivalente à 60h d’irradiation naturelle. Enfin une grille de points limites adaptés a été mise en place et sera utilisée pour évaluer l’inconfort/souffrance des animaux. Le cas échéant, une administration de médicament anti-douleur pourra être réalisée. Les administrations de traceurs fluorescents et de nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées par voie sous-cutanée.

Devenir

Le but de l'étude étant d'étudier le retentissement d'une fracture osseuse, avec ou sans traitement, sur la qualité de la matrice osseuse, nous devons collecter des pièces osseuses à des temps bien précis. Les animaux de l'ensemble des procédures expérimentales seront mis à mort à la fin des 4 procédures de ce projet.

Remplacement

Malheureusement, à ce jour, aucune donnée de la littérature n’est disponible et ne permet pas de développer un modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les conséquences moléculaires, cellulaires et tissulaires d’une fracture osseuse. Le recours à l’emploi d’un modèle de petit animal est requis pour évaluer ces questions. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La physiologie de réparation des fractures chez cet animal est également transposable à l’homme. De plus, la taille des os longs et notamment du fémur, rend possible l’utilisation de broches osseuses utilisées en chirurgie osseuse humaine pour la stabilisation des fractures de phalanges.

Réduction

Le modèle de fracture osseuse proposé dans ce programme (stabilisation par broche osseuse et découpe du fémur pour simuler la fracture) est maitrisé dans notre laboratoire. Les investigations osseuses sont également toutes maitrisées. Les données de la littérature permettent d’établir un échec de la procédure (non-récupération de l’anesthésie, infection osseuse, mauvaise pose de la broche osseuse, points limites) d’environ 18%. Nos études antérieures de qualité osseuse dans des modèles animaux précliniques nous ont permis de réaliser un calcul d’échantillonnage (test d’inférence statistique) afin de déterminer le nombre minimum d’animaux à inclure par groupe pour observer une différence significative de la résistance osseuse et donc in fine de la vitesse de réparation osseuse. En tenant compte de l'ensemble des paramètres, un nombre de 13 animaux par groupe devraient nous permettre d’atteindre la significativité des résultats obtenus. Des tests statistiques seront utilisés et une valeur de p

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions d’hébergements au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages normalisées, dans une pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées. Les animaux auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à la disposition des animaux un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Des frisottis de cartons et/ou des petits morceaux de bois à ronger seront mis à disposition. La fracture (stabilisation et découpe osseuse) sera réalisée sous anesthésie générale. Des médicaments anti-douleur seront administrés avant ouverture de la peau et renouvelés pendant les premières 48h post-opératoires. Un antibiotique sera injecté avant ouverture de la peau pour réduire les risques d’infection. Une grille de points limites, adaptée au modèle, sera mise en place et comportera les items suivants : expression faciale, activité, posture, respiration, automutilation, aspect des matières fécales et déshydratation. Le cas échéant une palpation de la zone opérée pourra être effectuée afin de s’assurer que celle-ci n’est pas douloureuse et ne présente pas de signe d’infection osseuse.

Choix des espèces

Une étude préliminaire préclinique sur un modèle rongeur est un prérequis des agences de régulation du médicament pour le développement d’une thérapie osseuse. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La taille des pièces osseuses rend l’utilisation des dispositifs biomédicaux humains possible pour la stabilisation des fractures. La réparation des fractures chez le rat présente également des mécanismes physiopathologiques similaires à ceux observés chez l’homme. De plus, notre équipe a depuis maintenant 10 ans développés et validés des outils d’analyse de la qualité osseuse directement applicable aux modèles de rongeurs. Les animaux seront utilisés à un âge d’environ 10 semaines +/- 1 semaine. Ce stade correspond à l’entrée dans le plateau de croissance des animaux et le tissu osseux est considéré comme significativement mature à partir de cet âge. De plus, cet âge est couramment employé pour ce modèle, ce qui permettra de faire une comparaison des données obtenues avec les données de la littérature obtenus avec d’autres agents thérapeutiques.

2 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales, parfois après une irradiation du corps entier, puis des produits anticancéreux par diverses voies et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant leur mise à mort pour prélever organes et tumeurs. Le porteur reconnaît que les tumeurs et les métastases peuvent provoquer une perte de poids traduisant une souffrance de l'animal. Il décrit un modèle de service destiné à des sponsors et conclut que la phase in vivo reste "indispensable", aucun modèle ne reproduisant selon lui un organisme greffé.

Objectifs

Ce projet comporte plusieurs objectifs : 1) Caractériser des modèles murins tumoraux en évaluant le développement de différentes lignées cellulaires tumorales injectées chez la souris en sous-cutanée, par voie intraveineuse ou en intrapéritonéale. Ces lignées cellulaires pourront être rendues bioluminescentes ou fluorescentes afin de suivre leur évolution par imagerie optique. 2) Evaluer l’efficacité et la biodistribution de différents produits anti-cancéreux (qui peuvent être fluorescents) au niveau de la tumeur ou de différents organes dans les modèles murins tumoraux déjà développés ou développés au cours de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à développer des modèles tumoraux murins qui permettront d’étudier l’efficacité et la biodistribution de produits anti-cancéreux innovants et ainsi contribuer à de nouvelles études cliniques voire à la mise sur le marché de nouveaux traitements anti-cancéreux.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales soit par voie sous-cutanée (sur le ou les flancs de l’animal) après une anesthésie volatile ou fixe, soit par voie intrapéritonéale ou intraveineuse sur animal vigile. Les souris vigiles pourront être irradiées par des rayons X sur le corps entier, dans les 24 heures qui précèdent l’injection des cellules tumorales humaines afin de faciliter la prise de greffe. La dose utilisée est une dose minimale pour avoir la meilleure prise tumorale sans effet délétère à long terme (dose validée en interne depuis plusieurs années). L’injection des produits anti-cancéreux se fera sur animal anesthésié pour les injections intratumorales ou péritumorales et sur animal vigile pour les injections intrapéritonéale, intraveineuse ou per os. Le ou les produits anti-cancéreux seront administrés par injection intratumorale ou en péritumoral, par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse (bolus ou injection lente) . Des acquisitions d’imagerie pourront être réalisées afin de suivre l’évolution de la tumeur mais également la biodistribution des produits anti-cancéreux injectés. Pour cela, les animaux seront anesthésiés. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours des études sur animal anesthésié . Dans le cas de prélèvements sanguins avec réveil, un fluide de remplacement pourra être injecté pour éviter la déshydratation. Des prélèvements sanguins terminaux, comme le prélèvement intracardiaque, pourront être réalisés mais ces actes doivent se faire sous anesthésie pour une procédure sans réveil. Des prélèvements d’organes pourront être réalisés après euthanasie des animaux pour différentes analyses. Tous les organes pourront être prélevés et pesés, ainsi que la tumeur et la carcasse.

Impact sur les animaux

Avant chaque nouvelle étude, lorsqu’un nouveau produit à tester va être utilisé, une fiche dans laquelle les caractéristiques des éléments d’essai (dont la toxicité, si le produit a déjà été injecté in vivo et les effets indésirables déjà observés tels qu’une perte de poids, des inflammations légères et locales, …) sont renseignées par le sponsor. Néanmoins, la manipulation régulière des animaux pour différents actes (administration des cellules tumorales, administration de produits anti-cancéreux, pesées, observations cliniques, prélèvements de sang, acquisitions d’imagerie) est susceptible d’induire un stress sur les animaux. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies). L’injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale peut induire la formation d’une tumeur et/ou potentiellement de métastases ce qui peut engendrer une perte de poids démontrant une souffrance de l’animal. L’injection par voie sous-cutanée de cellules tumorales possède un risque faible de nuisance pour l’animal puisque la tumeur sera mieux visible et régulièrement mesurée. Les injections sur animaux vigiles ou anesthésiés ainsi que les acquisitions d’imagerie sur animaux anesthésiés peuvent engendrer un stress lié à la manipulation ou lié à l’anesthésie. Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress produit par l’anesthésie ainsi qu’un risque de déshydratation. L’irradiation ne provoque pas d’effet indésirable important. En effet, l’irradiation qui pourrait être réalisée serait faite à une dose minimale sans effet délétère à long terme.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes mais aussi parce que ce sont des modèles tumoraux (animaux présentant une pathologie, ne pouvant pas être réutilisés ou adoptés).

Remplacement

Des tests in vitro sur les lignées cellulaires tumorales en culture pourront être réalisées en amont de la phase in vivo afin de valider l’efficacité des traitements anti-cancéreux sur les cellules tumorales cibles. Cependant, la phase in vivo est à ce jour indispensable car il n’existe pas de modèle de remplacement permettant de mimer de manière fiable un organisme vivant ayant été greffé avec des cellules tumorales. De plus, l’utilisation de souris greffées avec des cellules tumorales humaines ou murines est un modèle de référence pour l’évaluation de l’efficacité et de la biodistribution de traitements anti-cancéreux.

Réduction

Pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité du traitement testé, des groupes de 6 animaux seront utilisés. Une approche statistique est prévue. Le cours à l’imagerie médicale (bioluminescence ou fluorescence) dans ce projet permet de suivre directement au cours du temps le développement des tumeurs et/ou de suivre l’évolution de produits anticancéreux dans l’organisme. Ces techniques ne nécessitent pas de mise à mort d’animaux au cours de l’étude puisque les mêmes animaux sont suivis au cours du temps. Cela a pour avantage de réduire l’impact de la variabilité individuelle mais aussi de diminuer le nombre d’animaux nécessaire par étude.

Raffinement

Une période d’acclimatation de minimum 6 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoins. Les injections de cellules tumorales et/ou de produits anti-cancéreux, les acquisitions d’imagerie et l’euthanasie seront réalisées sous anesthésie. Tout au long du projet, l’état général de l’animal sera surveillé quotidiennement et l’évaluation de l’état clinique des animaux réalisée régulièrement. Des pesées régulières seront également réalisées afin de suivre les éventuelles pertes de poids. Des mesures de soutien nécessaires en fonction des signes cliniques observés (injection de fluides ou d’analgésiques, isolement, réchauffement, etc.) seront mise en œuvre, si possible. Tout observation clinique anormale nécessitant un examen plus spécifique et/ou régulier seront réalisés. Le vétérinaire sera consulté pour réaliser un examen clinique complet si nécessaire. De plus, si besoin, le vétérinaire pourra prescrire un traitement approprié compatible avec le projet. Une analgésie pourra être mise en place si une forme de douleur ou de souffrance est observée. L’utilisation d’un analgésique sera discutée entre le directeur d’étude, le sponsor et le vétérinaire afin de s’assurer que son utilisation (produit, délai, fréquence) soulage l’animal sans impacter l’étude en cours. Dans le cas de prélèvements sanguins avec réveil, un fluide de remplacement pourra être injecté pour éviter la déshydratation. Des points limites ont été définis. La décision de mise à mort pourra être évaluée au cas par cas, en concertation avec le responsable de l’étude en cours et/ou par le vétérinaire si besoin en cas de dégradation générale de l’animal sans atteinte des points limites pour éviter toutes souffrances supplémentaires. Dans ce projet, le recours à l’imagerie médicale (bioluminescence ou fluorescence) présente l’avantage d’être non invasive mais nécessite une anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un modèle standard polyvalent qui est régulièrement utilisé dans les modèles d’oncologie. De plus, l’utilisation de souris greffées avec des tumeurs humaines ou murines est un modèle de référence pour l’évaluation de l’efficacité de traitement anti-cancéreux. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte âgés de 5 à 9 semaines au début de l’étude. Ce stage de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude.