Procédures modérées

338 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cœur est irradié à des doses faibles à modérées, puis leur fonction cardiaque est suivie par échographie, électrocardiogramme et stimulation transœsophagienne sous anesthésie, sur une durée pouvant atteindre quinze mois. Le projet cherche à comprendre les troubles du rythme observés après radiothérapie du sein droit chez les femmes. Le porteur affirme que l'irradiation à faibles doses n'entraîne ni douleur ni brûlure et fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids.

Objectifs

Après une exposition du cœur à des rayons X (comme dans le cas de la radiothérapie pour les cancers du sein), des problèmes cardiaques (troubles du rythme, insuffisance cardiaque) peuvent être observés. Notre hypothèse est que le développement de ces troubles cardiaques est lié à l’irradiation par des doses faibles à modérées de petites structures du cœur. L’objectif du projet est d’obtenir de nouvelles connaissances sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation et de constater de façons fonctionnelle, cellulaire et moléculaire les effets de cette irradiation sur le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite à long terme ; afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 2 EU différents. Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation du système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection et plus particulièrement chez des patientes cancer du sein : 1) Confirmer les données épidémiologiques de développement de trouble du rythme post-irradiation du sein droit. 2) Obtenir des données de caractérisation structurale, cellulaire, moléculaire ainsi que des mécanismes impliqués dans le remodelage du tissu cardiaque à des doses faibles à modérées d’irradiation pouvant conduire à des maladies cardiaques et surtout des problèmes de rythme cardiaque. 3) Définir un seuil dose/effets sur le développement d’un trouble du rythme dans ce modèle expérimental avec l'utilisation d'une gamme de doses allant de 250 à 2000 mGy, Tous ces résultats permettront d’améliorer, d’actualiser les connaissances sur les effets de la radiothérapie sur les femmes traitées pour un cancer du sein droit.

Procédures

Plusieurs interventions seront réalisées sur les souris notamment une irradiation localisée sous anesthésie. L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Les animaux seront suivis par échographie doppler sous anesthésie pour contrôler leur fonction cardiaque, leur rythme cardiaque (ECG) et enfin une mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine ni douleur ni brulure pour les animaux que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observée à long terme. Les anesthésies sont réalisées pour chaque intervention sous isoflurane, sauf la stimulation transoesophagienne qui nécessite une injection d’anesthésique. Les anesthésies sont répétées mais éloignées dans le temps évitant l’apparition d’effets secondaire indésirable chez les souris.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir réaliser des prélèvements sanguins et des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. L’évaluation de la fonction cardiaque par échodoppler, nécessite des modèles murins. De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus de développement de la maladie. En effet, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 338 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un logiciel « GPower » qui calcul le nombre d’animaux suffisant pour obtenir la meilleure puissance statistique avec le nombre minimum d’animaux. L’analyse indique que 8 animaux/groupe pour les mesures de stimulation électrique de la partie haute du cœur et l’étude de la fonction cardiaque par Echographie doppler pour observer les effets attendus. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 15 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 10 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques

Raffinement

Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.

Choix des espèces

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. Notamment l’évaluation de la fonction cardiaque par écho-doppler nécessite des modèles animaux. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Les animaux arriveront entre 4-6 semaines pour limiter les bagarres. Le sexe des animaux doit être justifié, en particulier si un seul des deux sexes est sélectionné. Des souris C57BL/6J femelle seront utilisées pour mimer les femmes traitées par radiothérapie dans les cas de cancer du sein.

1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.

Procédures

Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).

Impact sur les animaux

Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.

Réduction

6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.

Choix des espèces

Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est exposée aux fumées de cigarette deux heures par jour, cinq jours sur sept pendant quatre semaines, puis toutes subissent trois séances d'imagerie TEP sous anesthésie et l'injection d'un vaccin anti-tabac, pour mesurer les effets de quatre vaccins en développement. Les retombées annoncées se limitent à compléter une étude clinique en cours, l'objectif immédiat restant l'imagerie du métabolisme cérébral. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser ces mécanismes et conclut que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts dans le monde chaque année et est reconnu comme un fléau mondial. Il est la première cause évitable de mortalité en France. La lutte contre le tabagisme est une priorité de santé publique. A ce jour, les options pharmacologiques pour arrêter le tabac sont limitées. Un vaccin anti-tabac, qui permettrait de faciliter le sevrage tabagique, serait novateur dans la lutte contre le tabagisme. L’objectif de ce projet est de mesurer les effets de différents vaccins anti-tabac (4 au total) en cours de développement par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), qui offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral, notamment les modifications du métabolisme cérébral en présence et en absence d’une addiction au tabac (avec et sans vaccin anti-tabac). Cette étude sera menée chez un modèle murin : des animaux seront exposés deux heures par jour aux fumées de cigarette pendant 4 semaines puis la moitié recevra une dose de d’un vaccin anti-tabac.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude complèteront une étude clinique en cours et fourniront de nouvelles informations sur l'utilisation de certains vaccins anti-tabac pour faciliter le sevrage tabagique.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : Mise à jeun 6h avant l’imagerie • Réalisation 3 sessions d’imagerie (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 60 minutes au maximum) • Pour la moitié des animaux, exposition quotidienne aux fumées de cigarette (2 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 4 semaines). • Injection d’un vaccin anti-tabac (durée 10 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Mise à jeun 6h avant l’imagerie pouvant entrainer une perte de poids inférieure à 5%. • Exposition quotidienne aux fumées de cigarettes entrainant une perte d’appétit (ralentissement de la courbe de prise de poids) et une irritation des voies respiratoires. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en présence et en absence à une addiction au tabac en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc.., afin d’évaluer le métabolisme cérébral par le radiotraceur avec et sans vaccin anti-tabac n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier le métabolisme cérébral par le radiotraceur avant et après vaccin anti-tabac.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience ; chaque animal est son propre témoin, ce qui divise par 3 le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les rongeurs seront hébergés par groupes. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Cette espèce fait partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études sur le tabac. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser l’exposition au tabac ainsi que d'évaluer les différents effets des vaccins testés. Les animaux seront des adultes âgés de 10-11 semaines, étant donné que nous sommes intéressés aux effets cérébraux du tabac à l'âge adulte.

252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation gamma du corps entier, que le porteur décrit comme indolore, puis des échographies cardiaques sous anesthésie, des passages sur tapis de course, des mesures de pression à la queue sous contention et une stimulation transœsophagienne. Une perte de plus de 20 % du poids déclenche la mise à mort, et toutes sont tuées en fin d'étude pour prélever cœur et poumons. Le projet cherche à mimer l'exposition de populations vivant en zone contaminée après un accident nucléaire, afin d'alimenter les normes de radioprotection.

Objectifs

Actuellement, des résultats préliminaires de notre précédentes étude ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. Notre l'hypothèse est qu’il existe un seuil pour lequel nous avons le développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible à modérée et que cette pathologie cardiaque à long terme est due à un dysfonctionnement du système nerveux sympathique ou un remodelage vasculaire pulmonaire. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le cœur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection. Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 3 EU différents.

Procédures

Les animaux subiront une irradiation corps entier à des doses faibles n’entrainant ni douleur, ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après celle-ci. Des échographies seront réalisées sur les animaux sous anesthésie (1 fois par mois). Cette mesure sera prise 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies pour limiter le stress et biaiser la mesure de pression artérielle. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Certaines échographies seront précédées d’un temps limité sur un tapis de course (10 min sur le tapis roulant). La mesure de pression artérielle sera réalisée à la queue sur souris vigiles. Le ballonnet est gonflé puis dégonflé pour prendre la mesure, le tout pendant 2-3 min. Les mesures sont répétées 10 fois. Les souris sont d’abord habituées avec une série de 10 mesures par jour pendant 5 jours, avant la première prise de mesure qui sera prise en compte. Et enfin une seule mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée une semaine avant la fin de la procédure pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation et lors des mesures de pression artérielle même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui seront réalisés sous anesthésie générale, n’entrainant pas de douleur pour les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 252 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 15 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois et 9 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 18 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 15 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont pesés régulièrement. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.

Choix des espèces

Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.

Environ une souris sur cinq de la partie service, celles dont le sang compte moins de 25 % de globules blancs humains, est mise à mort dans les jours qui suivent le contrôle qualité, les autres étant expédiées à des laboratoires. 5 120 souris immunodéficientes de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le champ structuré en déclare 5 000 réutilisées, soit 120 seulement mises à mort. Elles reçoivent une molécule chimique deux jours de suite ou une irradiation de 218 secondes, puis une injection intraveineuse de cellules souches humaines sous anesthésie, et jusqu'à neuf prises de sang en 23 semaines pour les nouvelles lignées, dont les souris sont tuées à l'issue de 32 semaines. Six mois après la greffe, environ 5 % des souris maigrissent, blanchissent aux extrémités et perdent leur énergie. Le porteur décrit une production destinée à "un large panel d'utilisateurs finaux", académiques et industriels, et range le transport jusqu'à eux parmi les sources de stress.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Aucune procédure chirurgicale ne sera faite sur les animaux dans cette demande. Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >25% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux. Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. Le projet utilisera des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines) pour une meilleure prise de greffe.

Des candidats médicaments sont administrés à des macaques pour satisfaire une exigence réglementaire : un essai sur une espèce non-rongeur avant tout essai chez l'humain. 216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart porteurs d'un émetteur de télémétrie implanté par chirurgie, d'autres d'un gilet. Les produits passent par voie orale ou intraveineuse, mais aussi intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne, et les singes sont habitués à la contention en chaise. Le porteur affirme que la télémétrie enregistre leurs paramètres "sans induire de stress aux animaux", puis cite les contraintes du gilet, de la chirurgie et de la contention. Le champ structuré déclare 120 macaques réutilisés sur 216, et le porteur précise que ces singes sont mis à mort après plusieurs études, leurs émetteurs empêchant de les replacer ou de les faire adopter.

Objectifs

Le but de ce projet est de décrire les études permettant d’identifier les propriétés pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain conscient. Ces études de pharmacologie de sécurité permettent d’enregistrer les paramètres cardio-respiratoires vitaux tels que l’électrocardiogramme, les paramètres respiratoires ainsi que la température ou l’activité de l’animal par accéléromètre. Les animaux sont équipés d’émetteurs télémétriques implantés chirurgicalement (télémétrie interne) ou d’un gilet (télémétrie externe) permettant de transmettre en continu les signaux de respiration, de température et d’électrocardiogramme (ECG). En télémétrie interne ou externe, les paramètres sont enregistrés en continu sans induire de stress aux animaux. Les fonctions cardiaque, respiratoire et du système nerveux central sont ensuite évaluées après une ou plusieurs administrations d’un candidat médicament. Le présent projet comprend trois procédures de pharmacologie de sécurité chez le primate non humain (singe cynomolgus) conscient (procédures 1, 2 et 4) et une procédure de chirurgie (procédure 3). 1/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie interne (avec implantation d’un émetteur de télémétrie), 2/ Evaluation du système cardio-respiratoire par télémétrie externe (avec ou sans implantation d’un émetteur de télémétrie pour la pression artérielle), 3/ Implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie : Implants de télémétrie pour utilisation en procédure 1 et implants de mesure de pression artérielle pour utilisation en procédure 2, 4/ Evaluation du système nerveux central par batterie de tests fonctionnels.

Bénéfices attendus

Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif d’évaluer les effets pharmacodynamiques indésirables de candidats médicaments chez le primate non humain. Conformément aux lignes directrices éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH), l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'Homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, intra-articulaire, vaginale, rectale, sous-rétinienne ou intravitréenne), le plus souvent en dose unique, pour évaluer un potentiel effet pharmacodynamique indésirable d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins sont également possibles pour l’évaluation de l’exposition au produit et/ou bilan hémato-biochimique. Ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont rares et correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré [ex : action au niveau du système nerveux central, du système cardio-respiratoire (variation de fréquence cardiaque ou respiratoire ou du niveau de pression artérielle)] ou à des effets systémiques (ex : perte de poids, baisse de consommation alimentaire). Ces effets sont très rares en pratique compte tenu des faibles doses utilisées dans le cadre de ces études de pharmacologie de sécurité et qui sont le plus souvent déterminées en fonction des résultats des études de toxicologie réalisées auparavant. D’autres effets indésirables peuvent être associés aux procédures (contraintes liées au port du gilet de télémétrie, à l’implantation chirurgicale des émetteurs de télémétrie et à la contention lors des manipulations, prélèvements sanguins dans le but de vérifier l’exposition au candidat médicament, évaluation pharmacocinétique ou autres biomarqueurs sanguins).

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les animaux reçoivent des doses pharmacologiques supérieures ou égales aux doses thérapeutiques humaines et sont par conséquent, le plus souvent réutilisés. Ces animaux dont la majorité portent un émetteur de télémétrie ne peuvent pas être replacés ou adoptés. Après avoir participé à plusieurs études et en fonction des produits administrés et de leurs potentiel effet pharmacologique, les animaux sont sacrifiés suivant les procédures éthiques en vigueurs.

Remplacement

L'évaluation des effets pharmacodynamiques indésirables d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'Homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les interactions entre les différentes fonctions physiologiques et composantes de l’organisme qui participent aux réponses pharmacodynamiques d’un candidat médicament, ne peuvent pas être identifiées aujourd’hui par des procédures in vitro de types cellules ou organes isolés. Le choix du primate non-humain par rapport aux autres espèces non-rongeurs est justifié par la nature du candidat médicament (biologiques) et de l’homologie des voies métaboliques et relations pharmacodynamiques/pharmacocinétiques chez l’homme par rapport au primate non-humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est déterminé par la réglementation cadrant les études de pharmacologie de sécurité et est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. La méthode d’investigation en pharmacologie de sécurité implique le plus souvent un traitement croisé (cross-over design), permettant l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux (de 4 à 8 animaux par étude – le plus souvent d’un seul sexe), sans impacter la fiabilité des données, les résultats et les objectifs de l’étude. Dans le cas d’un candidat médicament du type biologique nécessitant un protocole d’étude en groupes parallèles avec un groupe véhicule et deux doses de produit (n=4 animaux par dose ou groupe et n=12 au total), le nombre total d’animaux peut être réduit à 8 au lieu de 12, en ré-utilisant le groupe véhicule pour évaluer une des doses du candidat médicament. Par ailleurs, l’analyse continue des données de télémétrie améliore considérablement la qualité et la fiabilité des données enregistrées avec un nombre réduit d’animaux. Pour éviter d’inclure systématiquement l’évaluation d’un produit de référence positif dans chaque étude portant sur les effets de candidat médicament sur le système cardiovasculaire et en accord avec les nouvelles recommandations ICH, les résultats des effets d’un produit de référence positif, évalué en cross-over à trois doses et un véhicule, peuvent être intégrés en annexe de chaque rapport évaluant les effets d’un nouveau candidat médicament. Si nécessaire et en fonction des changements de conditions expérimentales, les effets du produit de référence peuvent être réévalués séparément à un intervalle régulier de 3 et 6 années.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteurs, …) sont fournis aux animaux, leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les animaux sont habitués aux contraintes expérimentales telles que le port du gilet et la contention en chaise. En cas d’administration par perfusion intraveineuse, des friandises peuvent être proposées pendant la perfusion. Après les chirurgies pour implantation des émetteurs, les animaux sont suivis quotidiennement en période post-opératoire (suivi de la fréquence cardiaque, de la température corporelle sur 10 jours, voire plus si l’état de l’animal l’exige) et des actions post-chirurgie sont mises en place pour permettre une bonne récupération rapide de la chirurgie (distribution de rations additionnelles de fruits et de légumes pour favoriser la prise alimentaire et éviter la perte de poids, regroupement des animaux dès leur réveil complet pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation alimentaire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe social et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L’utilisation des non-rongeurs est une exigence réglementaire. Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'Homme, - la disponibilité d'études de toxicologie réglementaire dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique/pharmacodynamie. Le primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques de composés biologiques (ex : vaccins thérapeutiques anti-Alzheimer). Le choix de l’espèce de primate non humain (singe cynomolgus) est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’Homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’Homme. La pharmacocinétique du candidat médicament et les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique sont prises en compte. Les animaux intégrés dans ces études sont des animaux adultes ou jeunes adultes. L’âge minimal est d’au moins 24 mois. Pour les études de pharmacologie de sécurité, les animaux peuvent être utilisés dans le cadre de plusieurs études, par conséquent l’âge des animaux peut être plus important. Des individus matures ou jeunes adultes sont utilisés pour que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec les composés et ainsi garantir une évaluation adéquate des paramètres ciblés.

180 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec cinq aliments différents, la moitié reçoit ensuite une injection simulant une infection bactérienne qui déclenche une réponse inflammatoire et un comportement de fièvre. Huit heures plus tard, toutes sont anesthésiées puis tuées pour prélever foie, intestin, rate et sang. Le projet cherche à valider des aliments aquacoles entièrement végétaux, le porteur indiquant avoir réduit les conditions par des tests in vitro préalables mais jugeant l'étape sur poisson vivant nécessaire pour la filière.

Objectifs

Les farines et les huiles de poisson sont des ingrédients traditionnels utilisés dans les aliments aquacoles pour nourrir les espèces de poissons carnivores comme les salmonidés. Issus principalement de la pêche, les volumes de production de ces matières premières marines sont stables depuis les années 80 et la mise en place des quotas de pêche. Aussi, la disponibilité en farine et l’huile de poissons devient de plus en plus limitante vis-à-vis de la demande croissante émanant de l’aquaculture. Pour assurer le développement durable de l’aquaculture, la farine et l’huile de poissons doivent faire l’objet d’un remplacement par des sources végétales abordables, adaptées aux besoins nutritionnels des poissons et respectueuses de l’environnement. Cependant, l’utilisation de régimes à base de plantes dépourvus de farine et d’huile de poisson ne favorise pas une croissance optimale de la truite arc-en-ciel. En nutrition animale, les extraits de levures sont souvent utilisés pour améliorer la santé des animaux et leur croissance. Après avoir démontré les effets anti-inflammatoires de certains extraits de levures en utilisant des cultures de cellules d’intestin de truite, nous souhaitons maintenant confirmer ces effets chez de jeunes truites arc-en-ciel en tant que complément alimentaire. Des jeunes truites arc-en-ciel seront donc nourries avec des aliments 100% végétaux contenant des levures. Après 12 semaines d’alimentation, nous évaluerons si l’utilisation des levures dans l’alimentation favorise la croissance et augmente la résistance du poisson en cas d’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette expérience permettra d’améliorer l’efficience des aliments végétaux destinés aux jeunes truites arc-en-ciel. La filière pourra ainsi bénéficier d’aliments aquacoles 100% végétaux tout aussi performants que ceux contenant actuellement des huiles et farines de poissons et d’un moyen d’améliorer la robustesse des poissons.

Procédures

Dans cette expérimentation, 180 jeunes truites arc-en-ciel seront maintenues dans des conditions classiques d’élevage pendant 12 semaines et nourries avec 5 aliments différents répondant aux besoins alimentaires des poissons. A l’issue des 12 semaines, une moitié des poissons sera soumise à une injection de produit simulant une infection bactérienne (groupe traité) et l’autre moitié sera soumise à une injection de solution saline (groupe contrôle). La durée de l'injection dure en moyenne une dizaine de secondes. Huit heures après injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour observer une réponse inflammatoire. Les poissons seront également mesurés et pesés afin d’évaluer un potentiel effet des différents régimes alimentaires sur la croissance des poissons.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Les effets connus de l’injection que nous allons appliquer sont une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’un comportement de fièvre chez la truite arc-en-ciel. Ces injections ne sont pas létales mais nous ne sous-estimons pas l’impact de cette inflammation déclenchée chez le poisson. Ainsi nous avons sélectionné la plus petite dose ainsi que le temps le plus court possible afin d’observer une réponse inflammatoire. Afin de réduire le stress potentiel engendré par la manipulation puis l’injection, chaque poisson sera capturé avec une épuisette puis placé sous anesthésie générale afin de procéder à l’injection. Les manipulations des truites arc-en-ciel seront effectuées par des personnes expérimentées et familiarisées avec l'espèce.

Devenir

Huit heures après l’injection, la totalité des poissons seront anesthésiés puis euthanasiés afin de prélever des échantillons de foie, d’intestin, de rate et de sang.

Remplacement

Cette étude se propose d’étudier la robustesse de la truite arc-en-ciel nourrie avec des régimes 100% végétaux supplémentés avec des extraits de levures. En amont de cette expérience, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules d’intestin de truite afin de définir les doses d’extrait de levures potentiellement les plus efficaces pour induire une résistance à une inflammation cellulaire. Cette première étape in vitro nous a permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. Cependant, afin de valider les observations faites in vitro et envisager l’utilisation de ces produits en aquaculture, nous ne pouvons pas exclure cette étape d’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de poissons à utiliser pour cette expérience a été minimisé, en considérant les différences de réactions que chaque poisson peut avoir face à ce type d’injection. Pour ces calculs, nous avons utilisé un logiciel qui permet de s’assurer que le nombre de poissons sera tout de même suffisant pour que les résultats soient fiables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur les animaux utilisés au cours de l’expérience les différents points seront assurés : le volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, le rythme jour/nuit naturel, et le nombre de poissons par bassin pour exprimer un répertoire comportemental riche. Du début de l’élevage et jusqu’au grossissement des poissons la taille des bassins sera adaptée de façon à respecter une densité d’élevage appropriée à la truite arc-en-ciel. Tout au long de la croissance, le comportement et les mortalités seront contrôlés quotidiennement, lors de chaque repas. Ce suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Cette évaluation est basée sur deux grands critères : comportemental et physique. Dans les critères comportementaux, il sera évalué (scores allant de 1 à 3 suivant la sévérité) : la prostration et l’isolement prolongé de l’animal, la nage anormale, la prise alimentaire perturbée et la position inhabituelle dans la colonne d’eau. Concernant les critères physiques, il sera évalué le changement du volume anormal (ex : maigreur observé par la tête plus grosse que le corps), les lésions comportementales dues aux blessures ou maladies, l’apparition de malformations (scoliose, exophtalmie, tumeur) ainsi que l’aspect général de la peau et des nageoires. Si une note de 3, qui correspond au point limite ultime, est scorée sur un des points à évaluer, l’animal sera euthanasié aussitôt via les procédures réglementaires. La manipulation des truites-arc-en-ciel sera effectuée par des personnes expérimentées et familiarisées avec cette espèce. Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront qu’une dizaine de secondes par poisson. Le stress au réveil sera évalué selon les comportements décrits ci-dessus.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale. L’expérimentation sera réalisée sur des truites arc-en-ciel de 10 à 15g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons tissulaires dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.