Procédures modérées

1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules cancéreuses de côlon sous la peau, administrent chaque jour un composé par gavage puis des anticorps par injection dans l'abdomen, et suivent la croissance de la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent se développer vite et générer inconfort, perte de mobilité, malnutrition ou déshydratation. Il indique réaliser des essais in vitro quand c'est possible mais conclut qu'étudier l'interaction entre les molécules et le système immunitaire dans son ensemble impose le recours à la souris.

Objectifs

Le carcinome colorectal est le deuxième type de cancer avec le plus haut taux de mortalité dans les pays développés. La résection chirurgicale est actuellement le traitement de choix. Cependant, environ 30 % des patients avec un envahissement ganglionnaire développent une récidive locale ou des métastases à distance dans les 5 ans suivant la chirurgie et meurent de la maladie. Les travaux des dernières années ont formellement établi le lien entre croissance tumorale et qualité de la réponse immunitaire. L’immunothérapie, par inhibiteurs de point de contrôle immunitaires (ICI), a révolutionné la prise en charge des patients atteints de certains cancers très avancés ou métastatiques. Au lieu de cibler directement les cellules cancéreuses comme c’est le cas de la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou de la radiothérapie, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires ciblent le système immunitaire du malade, dont ils lèvent les freins pour que certaines cellules du système immunitaire puissent détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement ces traitements ont des limites. Ainsi, face à la résistance des traitements actuels proposés, l’intérêt des inhibiteurs de l’enzyme NADPH Oxydase 1 (NOX1) pour ces types de cancers est une voie de traitement envisagé. En effet, l'expression de cette enzyme dans les cellules cancéreuses favorise la croissance tumorale et l'apparition des métastases dans plusieurs cancers, dont le cancer du colon. Il a été montré que l'inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 module la composition des cellules immunitaires associées aux tumeurs dans le cancer colorectal en favorisant le recrutement de cellules immunitaires/inflammatoires et ainsi la diminution de la croissance tumorale. L’inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 est donc une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour traiter le cancer du colon en particulier en association avec les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires tel que l’anti-PD1.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus dans ce modèle pourraient fournir une alternative de traitement chez les patients souffrant de cancers qui ne répondent aujourd'hui pas bien aux immunothérapies et dont les récidives sont importantes.

Procédures

Après une semaine d’acclimatation, l’injection des cellules cancéreuses de colon se fait en sous la peau (en bas du dos) sous anesthésie gazeuse (1 minute maximum). Le premier jour de traitement, les animaux sont pesés avant l’administration quotidienne de véhicule (contrôles) ou de composé par voie orale avec une sonde de gavage adaptée (10 secondes, 10 mL/kg maximum). Les animaux seront pesés deux fois par semaine pour que le volume administré soit représentatif de l’évolution de leur poids corporel. Le traitement par voie orale permettra de fortement contrôler la dose administrée aux souris en fonction de leur poids individuel. 4 jours après le début du traitement, les souris reçoivent une injection d’anticorps contrôles ou d'anticorps thérapeutique (10 secondes) en intra-péritonéal, puis deux fois tous les deux jours (3 doses au total) ou deux fois par semaine durant toute l’étude en fonction du composé testé. La croissance et la taille tumorale seront surveillées tout au long de l'expérience (mesures deux fois par semaine, 10 secondes) comparées entre les souris traitées et les témoins non traités, révélant un potentiel effet global du composé sur la prolifération des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les deux actes principaux effectués au cours de l’étude sur les animaux sont : - Le traitement par voie orale - Les injections : sous la peau de cellules cancéreuses et les intra-péritonéales pour les traitements avec anticorps et/ou le contrôle Des nuisances peuvent être induites par l’administration des produits pharmaceutiques et les effets potentiellement toxiques de ces composés. Les tumeurs sont généralement bien tolérées mais elles peuvent aussi se développer très vite et générer un inconfort ainsi qu'une perte de mobilité. Cette perturbation de la locomotion peut induire une malnutrition ou une déshydratation.

Devenir

Le prélèvement de la tumeur, des organes et la quantité de sang nécessaire aux analyses justifient la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les progrès de la technologie permettent en permanence le remplacement des animaux par d'autres modèles dans la science expérimentale. Ces évolutions sont évidemment souhaitables et, chaque fois que possible, nous réalisons des essais in vitro appropriés pour identifier les composés actifs présentant le plus grand potentiel d'application thérapeutique. Cependant, nous étudions les effets des molécules qui interagissent avec le stroma tumoral et l'effet que cela a sur différents axes du système immunitaire murin, en vue du traitement des maladies humaines. Ces interactions se produisent entre différents tissus et organes et sont également susceptibles d'être influencées par la présence de tumeurs en croissance et, en tant que telles, elles ne peuvent pas encore être reproduites in vitro nécessitant d'effectuer des recherches in vivo.

Réduction

Un composé de l’entreprise a déjà été testé dans ce modèle de cancer chez la souris. Nous ciblerons dans ce projet plus spécifiquement la NADPH Oxydase 1 (NOX1) avec des molécules adéquates issues de nouveaux projets, aux propriétés optimisées. Nous avons utilisé les données de croissance tumorale décrites dans la littérature avec ce modèle pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des différences significatives dans la croissance tumorale entre les groupes témoins et traités. Lorsque les tumeurs seront récoltées, l’échantillon sera optimisé pour répondre aux questions posées. Les tests statistiques qui seront utilisés nous permettront de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou encore un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est rapide et nécessite une contention courte. Un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement (tous les jours) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance. En fonction de leur évaluation, les mesures à prendre sont définies avec notre vétérinaire désigné. Le vétérinaire pourra être contacté en cas de besoin afin d'adapter au mieux les soins, par exemple si les observations ne correspondent pas à des signes attendus et que la procédure de soins n'est alors pas arrétée. La mort n'est pas une limite acceptable et tout signe clinique ou ensemble de signes grave et non soignable, tout signe de souffrance non supprimable, ou correspondant aux points limites définis, menera à l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus couramment utilisée comme modèle en oncologie est la souris. Sa petite taille, sa grande fécondité en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le développement de nombreuses souches a permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les modèles murins ont notamment permis de déterminer les grands principes de la chimiothérapie Nous utiliserons donc des souris de 8 à 10 semaines. Ces animaux ne nécessitent pas d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant 90 jours une eau chargée en nanoplastiques de polystyrène, la moitié recevant en plus une alimentation riche en sucre et en graisse, avec mises à jeun répétées, gavages et prises de sang à la queue. Le porteur signale le stress lié à la contention, au gavage et à l'isolement en cage individuelle pour recueillir les fèces. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la toxicité intestinale sous stress nutritionnel ni la communication entre intestin et foie, ce qui justifierait le recours à la souris.

Objectifs

Après une exposition orale, le tractus gastro-intestinal est la première barrière physique et biologique contre les contaminants environnementaux. Les nanoparticules de plastique (NPL) sont des polymères organiques synthétiques de taille inférieure à 1 micromètre. Ils peuvent être composés de polyéthylène (PE), polystyrène (PS), polypropylène (PP), polychlorure de vinyle (PVC), polyuréthane (PUR) et polyéthylène téréphtalate (PET). Les NPL auxquels nous sommes exposés via l'alimentation ou l’environnement ont été très peu étudiés dans un contexte toxicologique ciblant la sphère digestive. Les connaissances sur les interrelations entre l’ingestion de nanoplastiques et la modulation de la fonction barrière de l’intestin (épithélium/mucus/microbiote) sont peu nombreuses, l’essentiel des travaux décrits à ce jour ont été réalisé en utilisant des organismes marins comme modèle d’étude. Les seules études chez les mammifères ont très récemment été décrites chez la souris. Elles ont, par ailleurs, été réalisées avec des modèles NPL commerciaux dont le processus de synthèse et la présence d’additifs sont méconnues. Les résultats obtenus confortent toutefois l’hypothèse d’une altération des fonctions gastro-intestinales, avec une modulation de la sécrétion de mucus, des dommages sur la barrière épithéliale et l’établissement d’un déséquilibre de la flore intestinale sur ce modèle. En outre, la fonction barrière intestinale peut être fragilisée chez des sujets sains nourris avec un régime gras et sucré de type occidental qui présentent notamment une perméabilité intestinale accrue. En plus des effets connus de ce type d'alimentation, la fragilisation de la fonction barrière n’est malheureusement pas assez prise en compte dans les diverses études toxicologiques alors qu’une partie importante de la population consomme ce type d'alimentation. Ce projet a donc pour but d’étudier les effets d'une exposition orale à des NPL modèles traçables, synthétisés sans additifs et ayant une surface imitant chimiquement celle des débris ayant séjournés dans l’environnement (particules vieillies). L’objectif est de caractériser leur effet sur la sphère digestive et hépatique sur une barrière intacte ou fragilisée par l'alimentation pour détecter une potentialisation/synergie d’effets délétères.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette étude contribueront à l’évaluation de la toxicité intestinale des particules nanoplastiques présentes dans l’alimentation de la population. De plus, cette étude mimant l’exposition au plastique dans un contexte d’une alimentation « occidentale », permet également d’évaluer les conséquences des particules sur un système digestif fragilisé. Sur le long terme, cette étude participe à l’évaluation de la sécurité des aliments contenants de nanoparticules plastiques et aide les législateurs à faire évoluer l’utilisation du plastique dans le domaine de l’alimentation.

Procédures

Lors de l'exposition subchronique, tous les animaux de ce projet reçoivent le traitement à tester dans l’eau de boisson pendant 90 jours et la moitié des animaux reçoit une alimentation riche en sucre et en graisse. Les animaux sont mis à jeun pendant 4 à 6 h, gavés et du sang est prélevé à la queue pour effectuer les différentes mesures (glycémie et perméabilité intestinale) en début et en fin d'exposition. Chaque mise à jeun est séparée d’une semaine minimum de récupération. Le gavage sera fait d’un geste expert et très rapide (10 secondes) avec une sonde métallique à bout arrondi adaptée à la taille de la souris. Les animaux sont ensuite anesthésiés via une injection en intra-péritonéale qui est un geste maitrisé par les expérimentateurs et d'une durée de 10 secondes, et ensuite euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Le gavage lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress dû à la contention de l’animal et un inconfort dû à l’introduction de la sonde dans l’œsophage. La prise de sang au niveau de la queue lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress chez les animaux. La mise à jeun des animaux avant les mesures de perméabilité et des tests de tolérance au glucose peut engendrer un stress chez les animaux. Lors du prélèvement de fèces, un stress dû à la mise en cage individuelle des animaux peut également être engendré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour réaliser des prélèvements destinés à des dosages biochimiques et des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet nécessite des modèles impliquant la prise en compte de la barrière intestinale, la flore intestinale et de l’impact de l’alimentation dans toute sa diversité. Ainsi, seule une approche faisant appel à un modèle animal nous permettra d'explorer la complexité des interactions entre les nanoplastiques de polystyrène et les différents acteurs de la barrière intestinale (épithélium/mucus/microbiote) fragilisée ou non par une alimentation occidentale, et des conséquences/interrelations avec la fonction hépatique. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la toxicité sous stress nutritionnel. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la communication inter-organe (axe intestin-foie).

Réduction

La procédure 1 permet de choisir le modèle de nanoplastiques de polystyrène le plus pertinent en testant 2 modèles de nanoplastiques marqués différemment (marqueur fluorescent ou métallique). Cette étude pilote permettra de réduire le nombre d’animaux en choisissant le meilleur modèle de nanoplastique au préalable et de mettre au point les techniques de détection. Les expérimentations sont basées sur la comparaison de 4 groupes. Les effectifs seront déterminés et vos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés collectivement au calme dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger ainsi que de coton. Après une période 7 jours de repos pour qu’ils récupèrent du transport et s’habituent à leur nouvel environnement, ils seront manipulés régulièrement pour être habitués à la contention afin d’être pesés (1 fois par semaine), gavés et pour la prise de sang (4 fois sur la durée totale de l’exposition lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité). Le jour de l’expérimentation (10 à 15 jours après l’arrivée) les souris seront exposées aux particules via l’eau de boisson afin de limiter leur stress. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’acclimatation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Une période de récupération de minimum 1 semaine sera respectée entre la mesure de la perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose afin de minimiser le stress des animaux. L’état général des animaux et le comportement sera contrôlé quotidiennement et la prise de poids sera suivie afin de pouvoir déceler tous les signes anormaux de comportement, de souffrance et d’inconfort. Si une perte de poids supérieure à 10% de son poids initial, posture particulière dans la cage comme la prostration, les poils hérissés, la vocalisation sont observés alors l’animal sera retiré de l’étude et le cas échéant euthanasié si son état est jugé critique par la vétérinaire référente. Afin de suivre l'état général des animaux, des fiches d'observations seront mise en place pour uniformiser le suivi.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 J (mâle et femelle) est la souche pour laquelle les outils ont été développés et adaptés au laboratoire et représente un modèle pertinent pour étudier la physiopathologie digestive. Les souris mâles et femelles utilisées seront âgées de 6 semaines à la réception, afin d'une part de faire des observations sur des souris adultes, et d'autre part de pouvoir comparer notre étude à la littérature existante.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix servent à entraîner un geste d'injection, les autres reçoivent un virus porteur d'un gène puis subissent une batterie de huit tests, dont la suspension pour la force musculaire, le tapis roulant et la barre crantée pour la coordination, l'immersion de la queue en bain-marie et la plaque chauffante pour la sensibilité. Le porteur annonce une "preuve de concept thérapeutique" et une "étape essentielle vers les essais cliniques", bénéfices renvoyés à un stade ultérieur, pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il affirme qu'une étude sur cellules ne "pourrait pas se suffire à elle-même" car les effets sur l'organisme entier et la force musculaire y seraient impossibles à évaluer.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.

18 450 rongeurs, 17 200 souris et 1 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent l'implantation d'un transpondeur, des prélèvements sanguins répétés dont des ponctions cardiaques et des gavages, dans des modèles d'allergie cutanée, alimentaire et d'anaphylaxie pour tester des composés. Le porteur indique que la stimulation par l'allergène peut provoquer une hypothermie, des atteintes respiratoires et cardiaques et une anaphylaxie "pouvant être mortelle". Tous les animaux sont tués à l'issue, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas de modèles in silico ou in vitro" pour évaluer ces composés.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés dans des modèles d’allergie chez le rongeur. Les pathologies allergiques sont actuellement placées au 4ème rang mondial des maladies inflammatoires chroniques par l’OMS et selon les estimations statistiques réalisées la moitié de la population mondiale sera concernée d’ici à 2050. Il est donc primordial de poursuivre la recherche de nouvelle thérapies et l’évaluation de l’efficacité de ces traitements dans ce domaine. Ce projet visera particulièrement les allergies cutanées (urticaire, dermatite, …), alimentaires et généralisées telles que les anaphylaxies dont la prévalence a largement augmenté avec l’industrialisation mondiale. L’allergie est une pathologie complexe et multifactorielle, associée à un dérèglement du système immunitaire, nommée hyperréactivité, à l’égard de substances banales de l’environnement : les allergènes, conduisant à une perte de tolérance. L’allergie peut toucher de nombreux organes, néanmoins la peau et les muqueuses sont les tissus les plus souvent atteints de par leur interaction directe avec l’environnement. Elle se définit par une cascade d’événement qu'il est important d'identifier et de charactériser afin de développer des stratégies innovantes efficaces. Durant la première phase, dite de sensibilisation, l’individu est exposé pour la première fois à un allergène et va synthétiser des immunoglobulines E (IgE) spécifiques de cet allergène. La seconde phase, dite effectrice, induite lors de l’exposition secondaire ou chronique où l’individu pourra développer les symptômes d’une allergie (rougeurs, démangeaisons...). Des IgE seront produites et leurs interactions avec le récepteur FceRI permettront l’activation de cellules immunitaires innées telles que les mastocytes, basophiles, neutrophiles principalement retrouvées dans la peau, le tube digestif et les poumons. cette activation conduira à la libération très rapide de médiateurs pré-stockés tels que l’histamine, des leucotriènes ou des prostaglandines, responsables des symptômes engendrés dans les premières minutes de la réaction allergique : rougeurs, démangeaison, sécrétion et œdèmes. Puis la sécrétion de médiateurs lipidiques et protéiques permettra de soutenir cette inflammation locale qui peut à long terme être responsable d’altérations tissulaires et d’une anaphylaxie correspondant à une réaction allergique hyper-aiguë pouvant être mortelle.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels des pathologies allergiques ou anaphylactiques (utilisation d’anti-histaminiques, de bronchodilatateurs, injection intramusculaire d’adrénaline) réduisent les symptômes mais affectent peu la progression de la maladie. Les traitements biologiques récents sont plus efficaces mais très couteux et tous augmentent le risque d'infection. En outre ces traitements peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d'efficacité due à la production d'anticorps neutralisants par le patient. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies inflammatoires. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux :  Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études.   Mesure de la température corporelle : Durée 1 minute sur animal vigile ou sous anesthésie générale, par le biais d'un transpondeur implanté ou via une sonde rectale pour rongeur, pourraient être effectuées toutes les heures au cours des 24 heures ou sur une durée de 15 jours suivant le challenge avec les antigènes.   Implantation de transpondeur pour la mesure de la température : Durée 1 minute, sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Prélèvements de sang   par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Via la submandibulaire : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via ponction cardiaque : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Les volumes et la fréquence des prélèvements seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu'à une semaine. •    Administrations des composés à potentiel thérapeutiques   par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée, par application topique ou via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animaux vigiles.   Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement animal (inactivité, absence de réaction aux stimuli, des vocalisations), une hypothermie, des atteintes respiratoires (angio-œdème, baisse de la fréquence respiratoire, baisse du volume courant, hypoxie), cardiaques (hypotension, tachycardie, vasodilatation, diminution de la perméabilité vasculaire), cutanées (érythème, œdème, épaississement de la peau), intestinale (diarrhée), une perte de poids. Ces effets surviennent suite à la stimulation avec l’allergène et s’établissent très rapidement (en quelques minutes ou heures). Les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent constituer des nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des études. Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

A notre connaissance, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent d’évaluer une potentielle efficacité thérapeutique de composés dans des pathologies allergiques. Seul un modèle animal peut permettre de mimer de manière séquentielle le développement de la pathologie et contenir tous les acteurs cellulaires et moléculaires nécessaires à ces diverses étapes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles rongeurs de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles d’allergie chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (doses de l'agent allergènes, effets de molécules de références etc.) Adulte : Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine des pathologies allergiques

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la moelle épinière est induite chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivie d'injections quotidiennes pendant 10 à 30 jours, pour étudier la réparation de la myéline et une piste thérapeutique contre la sclérose en plaques. Le porteur indique des nuisances liées à la chirurgie, hypothermie, hémorragie et douleurs post-opératoires, avec un point limite à 20 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour des prélèvements post-mortem, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "indispensable" pour valider les résultats obtenus sur cellules.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’identifier et déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) et périphérique, en condition physiologique et pathologique. Ce projet vise à étudier le rôle d’un récepteur membranaire, impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires, dans le contrôle de la synthèse de la gaine de myéline du système nerveux central et périphérique au cours du développement et à l’âge adulte, chez la souris. Dans un second temps, ce projet nous permettra aussi de montrer que ce récepteur est une nouvelle cible thérapeutique favorisant la réparation des gaines de myéline du SNC, chez la souris. La validation de cette cible ainsi que des composés sélectionnés sont des études très prometteuses, qui pourraient permettre de repositionner ces molécules actuellement utilisées dans d’autres pathologies, pour le traitement de maladies de la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier de nouveaux mécanismes régulant la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses, lors du développement normal et dans des conditions pathologiques. Notre projet de sélection et de repositionnement de molécules thérapeutiques nous a permis de sélectionner 3 molécules avec un fort potentiel thérapeutique qui seront validées grâce à l’utilisation d’un modèle murin de lésions de la myéline, présentant des similitudes avec les lésions observées chez les patients. A terme, ces études permettront d'améliorer le traitement des lésions de la myéline chez les patients et de démontrer un rôle de ce récepteur dans les lésions de la sclérose en plaques.

Procédures

Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’un récepteur membranaire qui semble impliqué dans le processus de myélinisation du système nerveux. Dans l’objectif d’étudier son rôle, au cours du développement et au cours du processus de réparation de lésions de la myéline, nous induirons de petites lésions de la moelle épinière chez la souris (une lésion par animal, sous anesthésie générale). L’analyse de ces lésions à différents temps permettra d’analyser l’impact de la protéine étudiée sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions de la myéline. Nous utiliserons 560 animaux dans cette procédure expérimentale. La durée totale et maximale de cette procédure chirurgicale est de 30 minutes par animal et 30 jours post-chirurgie. Pour le groupe des souris inductibles, une injection d’un produit est nécessaire avant l’induction de la lésion (1X par jour pendant 5 jours par i.p. d’environ 5sec). Le groupe des souris sauvages recevra après la lésion une des molécules sélectionnées ou le véhicule seul (1X par jour par voie i.p, durée d’environ 5sec, ou par voie PO durée d’environ 5sec, pendant 10 à 30 jours). Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. Cela implique d’éviter et de prévenir toute dégradation post-mortem.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie : hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.

Devenir

Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Comprendre le rôle d’un récepteur, exprimé par la cellule responsable de la formation de la gaine de myéline, dans le système nerveux central, nécessite l’interaction de plusieurs types cellulaires et un environnement spécifique en fonction du stade du développement. Ainsi, le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de valider nos résultats déjà obtenus par des modèles cellulaires en dehors de l’organisme dans l’objectif de comprendre comment l’activité de ce récepteur impacte la myélinisation et la remyélinisation. Concernant la partie validation thérapeutique, une analyse bio-informatique et l’utilisation de lignées de cellules, nous ont permis de réduire notre liste de composés à tester et par conséquent le nombre d’animaux à inclure dans notre étude. Nos résultats préliminaires suggèrent un fort potentiel de remyélinisation des 3 molécules sélectionnées, actuellement en phase clinique dans d’autres pathologies.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous prévoyons l’utilisation de 560 souris qui vont subir une procédure expérimentale modérée : - 280 pour notre procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer l’effet régénératif dans les souris transgéniques. - 280 pour notre procédure de de démyélinisation focale afin d’évaluer la régénération de la myéline après traitement par des molécules pharmacologiques sélectionnées. Certaines variations expérimentales pouvant être observées dans ces deux modèles, le nombre d’animaux de chaque groupe est le minimum requis pour obtenir des données statistiquement significatives.

Raffinement

Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront parfaitement contrôlées (directive européenne 2010/63/UE). Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (soit 22°C +/-2° pour la température et entre 45 et 65% d’hygrométrie). De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi : animaux hébergés en groupe, nid en coton. Une alimentation adaptée est proposée aux animaux en croisement pour couvrir les besoins de la gestation et de l’allaitement. -Une période minimale de 7 jours d'acclimatation est respectée. - Plusieurs points limites visant à réduire la souffrance et/ou la détresse de l'animal sont respectés : - Apparence et position anormale : dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie au cours de la chirurgie (la température de l’animal étant monitorée durant l’acte) - Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, réduction de la mobilité - Perte de poids rapide ou progressive de 20 % (poids de référence pris le jour de la chirurgie) réalisée par pesée tous les jours pendant 5 jours puis 2 fois par semaine avant l'euthanasie - État de choc, léthargie, immobilité - Difficultés respiratoires. L'euthanasie de l'animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères. Le vétérinaire désigné sera consulté en cas de complications ou effets indésirables constatés lors des procédures ou après celles-ci : présence de signes cliniques d’infection (ex: prostration, suppuration) afin de mettre en place les actions nécessaires.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’homme. Afin de comprendre le rôle d’un récepteur membranaire du facteur de croissance vasculaire dans la régulation de la myélinisation en condition physiologique et pathologique, il est nécessaire de réaliser des études in vivo, intégrant l’ensemble des interactions entre les différents types cellulaires et leurs environnements. Chez l’homme adulte, quand la gaine de myéline est endommagée ou détruite, un mécanisme de réparation se met en place afin de régénérer une nouvelle gaine de myéline afin de protéger les neurones de la dégénérescence. L’utilisation de modèles animaux, au stade équivalent (souris adulte), reproduisant certains aspects des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, est indispensable pour évaluer la fonction de ce récepteur membranaire en contexte pathologique. Il existe aussi un ensemble d’outils (anticorps, lignées transgéniques permettant de tracer le devenir des cellules gliales) qui ont été développés principalement chez la souris. L’utilisation de la souris pour l’étude de ce récepteur au cours du développement du système nerveux et dans des conditions pathologiques est donc indispensable pour étudier le rôle de ce récepteur et identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies de la myéline. Nous utiliserons des animaux des deux sexes afin d’éviter tout biais potentiellement lié au sexe dans notre étude.

340 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie transférée vivante vers un autre site pour expérimentation. Le projet déclare la création et l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable qui développe spontanément des polypes intestinaux, pour étudier le cancer colorectal. Le porteur indique que les individus présentent après cinq mois des signes d'anémie, une perte de poids et des prolapsus, et qu'ils sont utilisés avant cet âge. Sur les 340 souris, 220 sont dédiées à l'élevage et à la maintenance de la lignée et 120 forment des cohortes transférées vers un autre site dans le cadre d'une "utilisation continue", le porteur affirmant qu'il n'existe "aucun modèle de substitution".

Objectifs

Nous souhaitons comprendre la séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale, impliquant l’utilisation de souris développant des lésions adénomateuses précoces de l'intestin. Cette saisine vise uniquement à déclarer la création et l'élevage de cette lignée. Cette lignée de souris combinera 3 modifications génétiques, permettant de comprendre comment l'inactivation d'un gène requis pour l'activation du système immunitaire peut diminuer le développement de polypes intestinaux.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet la génération de modèles d'études inédits, permettant de comprendre comment certaines cellules épithéliales peuvent participer à la mise en place d'un environnement propice à la tumorigenèse intestinale, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Aucune intervention invasive hors des actes à des fins d'élevages ainsi que dans le cadre de la prise en charge d'un phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les animaux possédant l'un des 3 gènes modifiés vont développer, au cours de leur vie, des polypes intestinaux de manière spontanée. L'expérience acquise sur cette lignée montre que les individus ne présentent que peu ou pas de d'effets indésirables durant les 4 premiers mois de leur vie. A termes, à partir de 5 mois d'âge, les nuisances peuvent être les suivantes: signe d'anémie, perte de poids, et, de manière plus tardive, apparition de prolapsus.

Devenir

Les individus seront utilisés uniquement à des fins d'élevages avant 5 mois (220 au total), afin de générer des cohortes qui seront utilisées sur un autre site (120). Les animaux générés dans le cadre de cet élévage seront par la suite transférés sur un autre site pour expérimentation (cadre d'une utilisation continue).

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. Il est en effet crucial pour nous de comprendre quelles sont les interactions entre les différentes populations cellulaires, les différents compartiments tissulaires ainsi que le microbiote intestinal. Il n’existe à ce jour aucun modèle de substitution, et l’utilisation de souris reste la seule alternative à notre problématique.

Réduction

Sur la base de nos données acquises lors d'un précédent projet, des cohortes expérimetales de 20 souris contrôle et 20 souris test seront requises pour réaliser 3 expériences indépendantes, portant le nombre d'animaux à produire à des fins expérimentales à 120 (40 x 3). Il faut ajouter à ce nombre les individus nécessaires pour la création de la lignée et son maintien (110), et anticiper d'éventuels croisements requis pour la suite de nos projets (110) . Ainsi, nous déclarons un total de 340 souris a utiliser dans le cadre de ce projet.

Raffinement

La principale stratégie de raffinement consistera à utiliser les animaux le plus précocement possible, jusqu'à 5 mois maximum, phase durant laquelle les individus ne présentent pas d'effets délétères majeurs. Des critères d'évaluations et des points limites visant à détecter les premiers signes avant-coureurs de l'évolution de l'état des souris seront mis en place lors de l’élevage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un appareil digestif et d'un système immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. L'un des gènes modifié utilisé dans ce projet mime la perte de fonction du gène le plus fréquemment muté dans le cancer colorectal humain. Ce modèle de souris transgéniques sera donc utilisé pour nous permettre de tester au mieux nos hypothèses. Les animaux dédiés à la maintenance et l’amplification des colonies seront utilisés entre 8 et 22 semaines, âge auquel les souris ne présentent pas d'effets indésirables drastiques.

40 microcèbes, un petit primate, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 24 tués à l'issue et 16 réutilisés. Les animaux portent un gilet d'ECG, subissent des échographies sous anesthésie et cinq injections de molécules, et quatre d'entre eux une restriction calorique de 30 % avec abaissement de la température à 15 °C. Le porteur indique que les individus dont l'état se dégrade sont euthanasiés pour prélever les organes, ceux de 6 à 12 ans étant tous tués au cours du projet, le prélèvement de sang intracardiaque étant terminal. Il décrit le microcèbe comme un "meilleur modèle" du vieillissement cardiaque que les rongeurs et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale.

Objectifs

Avec le vieillissement de la population, 75% des personnes de plus de 65 ans souffriront de déficiences cardio- vasculaires, limitant leur autonomie physique et cognitive et pouvant dégénérer en maladies potentiellement mortelles. Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies. La fréquence cardiaque maximale diminue chez les personnes âgées, indépendamment du mode de vie. Chez ces personnes, le remodelage fonctionnel du nœud sinusal qui est le stimulateur naturel du cœur, et sa modulation anormale par le système nerveux autonome pourraient être à l'origine de la diminution de fréquence cardiaque. Les statistiques nous indiquent que 1 personne âgée sur 600 développera des brady-arythmies directement liées à la défaillance du nœud sinusal, appelées syndrome du sinus malade. Ce syndrome pourrait aussi être une des causes de la fibrillation auriculaire, l’arythmie la plus courante chez les personnes âgées, qui se vérifie dans 5 à 10 % de ces personnes. Pour clarifier la façon dont le remodelage du nœud sinusal et le tonus autonome anormal diminuent la fréquence cardiaque dans le vieillissement, nous allons étudier l'activité cardiaque chez un modèle de petit primate, le microcèbe. Les données seront comparées aux études déjà réalisées chez la souris et pourront, à plus long terme, permettre le développement de traitements visant à réduire la déficience cardiaque chez les personnes âgées.

Bénéfices attendus

Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies, ainsi que la morbidité et mortalité associés à ces maladies. Pour clarifier la façon dont le remodelage du nœud sinusal et le tonus autonome diminuent la fréquence cardiaque dans le vieillissement, nous avons choisi un modèle de petit primate qui présente de plus grandes similitudes avec l’homme comparé à la souris. En effet, bien que de taille similaire aux petits rongeurs, le microcèbe à une espérance de vie (12 ans) bien plus longue que celles des souris (3 ans). Par conséquent, le nombre de battements cardiaques générés dans une vie chez le microcèbe est de 3 milliards, similaire au nombre qui peut attendre le cœur humain au long d’une vie alors que la majorité des autres mammifères génèrent un maximum de 1 million de battements cardiaques dans une vie. Ces comparaisons montrent la similarité entre homme et microcèbe et justifient l'utilité de cette espèce comme meilleur modèle pour des études sur le vieillissement cardiaque. A plus long terme, cela permettrait d'envisager des thérapies visant à réduire la déficience cardiaque au cours du vieillissement

Procédures

Contention pour rasage et pose du gilet incluant un dispositif d’ECG (5 minutes), enregistrement ECG dans lieu de vie (6h30) pendant 3 jours, anesthésie gazeuse (30 minutes), épilation à la crème dépilatoire (2 minutes), échographie photoacoustique (30 minutes), injection intrapéritonéale de molécules (durée 1 minute) avec un intervalle de 3 ou 4 jours, 5 injections au total suivi d'un ECG (1h) sur une durée de 2 semaines. Pour 4 animaux, restriction calorique de 30% et diminution de la température de la pièce à 15°. La durée totale du suivi est de 9 semaines pour chaque animal. En fin de procédure, lors de l'euthanasie le prélèvement de sang intracardiaque est fait sous analgésie et anesthésie profonde .

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à la pose du gilet pour enregistrer les ECGs peut provoquer un léger stress. Les injections intrapéritonéales des molécules ou des anesthésiques entrainent aussi un stress de très courte durée. Les analyses de photoacoustique seront faites après anesthésie gazeuse de l’animal, ce qui permet ensuite un réveil très rapide. Les animaux en fin de vie seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie pour permettre les prélèvements d'organes pour des études post mortem au niveau tissulaire et cellulaire.

Devenir

Tous les animaux dont l'état de santé se dégrade seront euthanasiés pour récupérer les organes d'intérêt et étudier l'effet du vieillissement sur ces organes. Donc on estime que tous les individus de la classe 6-12 ans seront euthanasiés au cours du projet et certains individus les plus âgés de la classe 1-5 ans pourraient présenter une dégradation de leur état de santé compte tenu de la durée du projet.

Remplacement

Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des dysfonction cardiaques dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. Par ailleurs, la variabilité individuelle chez les primates mime la variabilité chez l'homme. Ainsi,cette forte similitude entre la physiologie des microcèbes et humaine, comparée aux rongeurs, permet d’obtenir des données plus fiables qui auront une meilleure applicabilité pour le développement de traitement clinique.

Réduction

Nos procédures sont planifiées de façon à réutiliser les mêmes animaux dans plusieurs tests non invasifs. Les expériences précédentes sur d'autres animaux de laboratoire, suggèrent que 10 animaux par groupe seraient suffisants pour appliquer des tests et mettre en évidence des différences statistiquement significatives. Nos protocoles prévoient un suivi individuel (avant et après traitement). Ainsi chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de réduire le nombre d'individus dans les groupes, sans compromettre les objectifs du projet. Pour ce qui concerne les analyses statistiques, tous les tests seront faits de façon telle à comparer les groupes sur la base de l'âge et du sexe des animaux . Pour les données post mortem, les analyses sont faites sur le cœur isolé à partir des animaux dont l'euthanasie est décidée car en fin de vie ou présentant une altération forte de leur bien-être (blessure, pathologie) et pour lesquels les points limites de bien-être animal sont atteints. Tous les organes seront prélevés et conservés pour partage éventuel de tissus à la communauté scientifique, ce qui réduit le besoin d’animaux à plus large échelle.

Raffinement

Les microcèbes en élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. Les animaux sont groupés par 4 ou 5 individus de même sexe. L’observation quotidienne des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux est réalisée. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux sont enregistrés par des dispositifs externes (holter), posés sous des gilets, ce qui évite l’installation d’implants télémétriques. Les enregistrements sont réalisés sur des animaux qui continuent à avoir une vie normale en élevage et qui portent le gilet seulement durant 6h30, et pas sur une durée de plusieurs mois comme c'est le cas pour des animaux implantés. De plus la technique de tomographie photoacoustique sous anesthésie gazeuse permet d’obtenir des informations structurales sur le cœur et le cerveau des animaux in vivo, sans intervention invasive. En cas d'atteinte des points limites, les animaux sont retirés de l'étude voire euthanasiés. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement d'organes, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Le nombre de battements cardiaques dans une vie est commun à plusieurs espèces de primates et trois fois plus élevé que dans les espèces de rongeurs (souris et rat) communément utilisées en recherche. Le microcèbe possède l'avantage, par sa petite taille, d'être facile à maintenir en élevage. De plus, au cours de leur vie (espérance de vie de 12 ans), ces lémuriens génèrent autant de battements cardiaques qu’une personne âgées, soit environ 3 milliards. Cela indique que les cœurs des microcèbes, des humains et d’autres primates doivent avoir des adaptations qui leur permettent de soutenir dans une vie, une activité cardiaque trois fois plus longue que les autres mammifères. De ce fait, le microcèbe est un meilleur modèle pour étudier les effets du vieillissement au niveau cardiaque . Le microcèbe est considéré comme âgé à partir de 5 ans donc nous comparerons les fréquences cardiaques des animaux âgés (plus de 5 ans) à celles d'animaux adultes (moins de 5 ans) . Notre étude sera donc réalisée sur des animaux , entre 1 et 5 ans pour les adultes et entre 6 et 12 ans pour les individus âgés.