Procédures modérées

186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, laissent croître une tumeur intracérébrale suivie jusqu'à quatre mois, passent des IRM sous anesthésie et reçoivent des médicaments, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet étudie la communication entre cellules cancéreuses et cellules vasculaires dans le glioblastome, une tumeur que le porteur décrit comme incurable chez l'humain, avec une survie médiane de quinze mois. Il affirme n'avoir trouvé aucune méthode in vitro reproduisant ces interactions.

Objectifs

L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend d'une part de l’expression de facteurs d’adhésion et d'autre part de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences des voies de signalisation identifiées in vitro (adhésion et signal calcique). Dans un second temps, nous souhaitons évaluer une stratégie thérapeutique anti-tumorale s'appuyant sur ces mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'Homme (survie médiane actuelle de 15 mois).

Procédures

- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2) .

Impact sur les animaux

- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée. - La procédure expérimentale d'IRM, utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. - La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - La croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particuliers.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, à la fin du suivi de croissance tumorale (maximum 4 mois). Les tissus (organes et sang) seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15%), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20%, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (http://www.gpower.hhu.de/) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12*1.15*1.2*1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et insulinorésistantes par un régime riche en graisses, elles reçoivent dix injections dont un agent mimant l'exposition au froid, subissent sept prélèvements de sang à la queue et des pesées hebdomadaires pendant dix-huit semaines, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à savoir si une protéine, PIEZO1, joue un rôle dans l'apparition de l'obésité, retombée que le porteur formule au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude sur un "organisme entier".

Objectifs

L’obésité et ses complications métaboliques comme l’insulinorésistance et le diabète de type 2 (DT2) sont des problèmes de santé majeurs. L’obésité résulte principalement d’un déséquilibre entre apport et dépense énergétique. Les adipocytes blancs dans le tissu adipeux blanc sont impliqués dans le stockage du surplus énergétique sous forme de graisse. Les adipocytes bruns présents dans le tissu adipeux brun sont des cellules impliquées dans la dissipation de l’énergie sous forme de chaleur, processus appelé thermogenèse non frissonante. Au sein du tissu adipeux blanc sous-cutané coexistent, avec les adipocytes blancs, des adipocytes beiges qui comme les bruns, sont capables de dissiper de l’énergie sous forme de chaleur et dont le nombre augmente en cas de besoin thermogénique. L’obésité entraine des anomalies de fonctions des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et la réactivation de ces adipocytes et/ou l’augmentation de leur nombre permet de corriger les anomalies métaboliques associées à l’obésité. Il existe cependant des lacunes importantes dans la compréhension des mécanismes et dans l’identité des facteurs qui régulent l’activité et/ou la formation des adipocytes thermogéniques bruns et beiges. Il a été récemment montré que ces adipocytes thermogéniques sont des cellules mécanosensibles suggérant que des protéines activées par des stimulations mécaniques puissent contribuer au contrôle des fonctions biologiques de ces cellules. Nous avons récemment découvert que les adipocytes bruns expriment en grande quantité un canal ionique mécanosensible fonctionnel. L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle de ce canal ionique mécanosensible dans la fonction et le développement des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et d'évaluer si son absence dans ces adipocytes thermogéniques conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques. Pour cela nous générerons des souris n'exprimant plus ce canal ionique mécanosensible dans les adipocytes bruns et beiges. Nous étudierons l’impact de l’absence de cette protéine dans ces adipocytes sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en lipides et sur le développement de l'insulinorésistance et du diabète. Nous déterminerons si cette protéine contrôle, in vivo, le développement et/ou la fonction de ces adipocytes thermogéniques.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce programme, nous espérons comprendre si la protéine PIEZO1 joue un rôle dans l’apparition de l’obésité. Si cette hypothèse est vérifiée, ces connaissances pourraient servir à développer des méthodes de prévention et de lutte contre le surpoids et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Tous les animaux (vigiles) sont soumis à : 1) une injection de glucose, une injection d’insuline, 7 injections d’un agent mimant l’exposition au froid, une injection d'anesthésique. Au total 10 injections sur les 18 semaines de la procédure. Chaque injection dure quelques secondes ; 2) sept prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la queue (une quinzaine de secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : 1) obésité et insulinorésistance 2) contraintes des pesées hebdomadaires 3) contention et douleur lors des injections et des prélèvements

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure . Ceci est nécessaire pour prélever les différents tissus et les analyser.

Remplacement

Le diabète et l’obésité sont des maladies d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Ces pathologies affectent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et lipidique. De plus, elles s’expriment àl’échelle d’un organisme et font donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose et des lipides. Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici.

Réduction

Réduction: Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre d’animaux minimum, grâce à l’utilisation d’outils statistiques et de l’expérience d’études précédentes menées dans notre équipe. Nous constituerons des groupes de 10 souris (contrôles et mutées). Le nombre total de souris nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées.

Raffinement

Raffinement : Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : hébergement à 30°C correspondant à leur température de confort (thermoneutralité) ; enrichissement de l’environnement (maisonnettes, buchettes, tiges papier), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur ; surveillance régulière suivie selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris . Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus cette souche est connue pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 18 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 30 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes. Ces durées de régime et stades de développement ont déjà été utilisés dans notre équipe pour étudier l’obésité induite par le régime. Ceci nous permettra de comparer nos résultats aux études précédentes.

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'un produit de santé sous la peau ou dans l'os, avec prélèvements sanguins et injections, sur une période pouvant aller jusqu'à vingt-quatre mois, puis sont mis à mort pour analyse des organes et des tissus. Le porteur décrit comme nuisances attendues une perte de poids, des douleurs ostéo-articulaires, des complications de la plaie chirurgicale et l'hébergement individuel d'une espèce sociale. Il présente ces essais réglementaires comme "obligatoires" faute de test in vitro validé, et choisit le lapin pour la taille du dispositif à implanter.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires recommandées avant utilisation d’un produit de santé chez l’homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Dans ce projet, il s’agit plus précisément d’évaluer la toxicité systémique (c’est-à-dire la toxicité non limitée aux effets défavorables au niveau du contact entre le corps et le dispositif) et éventuellement locale d’un produit fini ou de ses différents constituants, après implantation/injection chez le lapin sur une période allant de 14 jours à 24 mois. Le lapin est privilégié du fait de la taille du dispositif à implanter. Toute étude de toxicité systémique peut, par ailleurs, être couplée à une évaluation des effets locaux (= toxicité locale). Dans ce cas, les réactions locales à étudier dépendent directement des caractéristiques du produit à tester (ex : étude de la tolérance locale après implantation/injection dont la localisation est proche de l'utilisation clinique chez l'homme).

Bénéfices attendus

S’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Implantation chirurgicale sous-cutanée sous anesthésie : 1 environ 40 minutes maximum en fonction du nombre de sites et de l'implant Implantation chirurgicale intraosseuse sous anesthésie : 1 environ 60 minutes maximum Prélèvement sanguin sur animaux vigiles : 2 (1 en début et 1 en fin d’étude) environ 5 minutes chacun (total de maximum 10 minutes) Injection intramusculaire : 1 environ 1 minute Injection intraartérielle : 1 environ 1 minute par molécule (total de maximum 4 minutes) Anesthésie volatile : 1 environ 10 minutes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suivant nos procédures expérimentales sont les suivantes : perte de poids, baisse d’activité, baisse d’appétit, comportements atypiques pour l’espèce, vocalises, hébergement individuel pour les espèces sociales, douleurs myo-arthro-squelettiques, complications post-chirurgie (inflammation de la plaie chirurgicale).

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou la tolérance locale au niveau de la zone d'implantation du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire post-chirurgicale et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux* (nombre minimal d'animaux/sites requis par les textes de références, lots témoins communs entre différents essais si possible, engagement du donneur d'orde de non duplication des essais, évaluation de la toxicité systémique couplée à une évaluation de la tolérance locale si possible), l'espèce et la durée de l'essai sont alors définis. * Dans le cadre d'essai de toxicité systémique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (e.g. toxicité subaiguë: minimum 4/sexe/groupe; toxicité subchronique: minimum 5/sexe/groupe; toxicité chronique: minimum 7/sexe/groupe. Dans le cadre de l'évaluation des effets locaux, minimum 10 sites sur minimum 3 animaux différent sont nécessaires)

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux et repose sur l’acclimatation des animaux pendant laquelle les animaux ne subissent aucune manipulation non indispensable ; la présence d’enrichissements du milieu systématique ; l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques ; un suivi sanitaire et clinique quotidien et renforcé en phase post-opératoire avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place (suivi de l'alimentation, du comportement et de la lomotion)

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence. En général, les animaux sont utilisés au stade jeune adulte (lapins de minimum 2,5 kg) ; lorsque la procédure le nécessite (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante, implantation intra-osseuse), des animaux plus "âgés" (donc d’un poids plus important) peuvent être utilisés. L'implantation intra-osseuse nécessite des animaux plus gros d'au moins 26 semaines.

4 575 animaux non-humains, 1 525 souris, 1 525 rats et 1 525 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après retrait des couches superficielles de la cornée sous anesthésie, un agent pro-inflammatoire est appliqué sur un œil, suivi de traitements en gouttes ou en injections oculaires, les animaux ressentant une douleur et une inflammation de la surface de l'œil pendant toute l'étude. Le projet vise à identifier des traitements de l'inflammation et de la douleur oculaires. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer un traitement dans un modèle d'inflammation cornéenne et choisit le lapin pour la taille de son œil.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place, dans le plus grand respect du bien-être animal, un modèle expérimental induisant une inflammation et douleur modérée chez l’animal afin de pouvoir identifier et évaluer des traitements susceptibles de les réduire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de futurs traitements pouvant améliorer le bien-être des patients atteints de signes d'inflammations et de douleur au niveau de la surface oculaire.

Procédures

Au premier jour de la procédure, quinze minutes après avoir enlevé sous anesthésie les couches superficielles de la cornée, une goutte d’un agent pro-inflammatoire va être appliquée sur un œil. Au troisième jour, d’une procédure qui en durera cinq, l’application sera renouvelée. Une série de traitements est ensuite administrée suivant les groupes soit sous formes de gouttes soit sous formes d’injections oculaires en fonction du type de produit et de son mode d’action. Ces administrations par gouttes sont quotidiennes et sont répétés une à quatre fois par jour. Les injections oculaires se font moins fréquemment, généralement pas plus de cinq administrations sur la durée de la procédure. Ces administrations peuvent se faire chez l’homme sous anesthésie locale. Ici, l’animal est endormi à l’aide d’une anesthésie générale légère afin de l’immobiliser, de faciliter l’injection et de réduire un stress éventuel. Une série d’observations est ensuite réalisée quotidiennement afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur l’inflammation et la douleur oculaire. Tous les examens réalisés durant ces cinq jours de procédure sont des examens réalisés chez l’homme en cabinet d’ophtalmologie ou en clinique vétérinaire. Ils sont de plus totalement indolores et ne durent que quelques minutes (cinq minutes tout au plus). Ils seront éventuellement réalisés sous anesthésie générale légère afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver des traitements à l'inflammation et à la douleur oculaire. Les animaux vont sur la durée de l'étude ressentir une douleur légère à modérée et une inflammation de la surface oculaire (cornée, conjonctives).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité…), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Contrairement aux tests d’irritation oculaire (test d’irritation oculaire de Draize par exemple) où plusieurs méthodes alternatives permettant de s’affranchir d’essais sur l’animal ont été validées, il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation cornéenne. Les mécanismes impliqués dans les phénomènes inflammatoires et neuro-inflammatoires associés à des douleurs cornéennes sont nombreux et font intervenir différents acteurs (cellules immunes, cellules nerveuses, médiateurs pro-inflammatoires, facteurs de croissances…) présents bien sûr au niveau de l’œil mais aussi au niveau d’autres organes voisins (ganglions, noyaux sensitifs, système nociceptif présent dans le cerveau…). C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet, les modèles alternatifs ne pouvant pas prendre en compte ou faire intervenir à ce jour, toutes les interactions et tous les acteurs impliqués dans ces phénomènes neuro-inflammatoires.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'efficacité d'un traitement sera évaluée à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. De plus, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et en l’atténuant après l’intervention. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilitées. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8 à 12 semaines. Ces âges correspondent à la maturité visuelle chez ces animaux.

3 433 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent pendant leurs cinq premiers jours de vie des injections d'une cytokine inflammatoire qui provoquent déshydratation, retard de croissance et, dans cinq à dix pour cent des cas, la mort, puis subissent une série de tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature. Le projet étudie le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux liés à l'inflammation périnatale, chez les mâles et les femelles. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés que sur l'animal vivant et fixe pour objectif le transfert des résultats à l'humain.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la vie périnatale et une augmentation du risque de développer des troubles neurodéveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation périnatale. L’objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle sur modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible, mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par l'utilisation d'une drogue permettant la recolonisation microgliale permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.

Procédures

Tests comportementaux à la période juvénile et à l'âge adulte (6 tests en juvénile et 5 à l'âge adulte) – quelques minutes par test. Injections intrapérionéales pendant les premiers jours de vie - quelques secondes

Impact sur les animaux

Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cytokine inflammatoire induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent montrer des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris injectées avec une solution neutre. Ces effets perdurent environ jusqu’au quinzième jour de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des microglies (cellules immunitaires du cerveau) au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des microglies humaines et des souris permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons choisi un nombre minimal permettant d'observer des différences menant à des conclusions statistiques. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile (P3-P16) et à l'âge adulte (après P60) pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues neutropéniques par un immunosuppresseur, elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des antibiotiques toutes les deux heures, avant une mise à mort vingt-six heures après l'infection pour dénombrer les bactéries dans les poumons et la rate. Le porteur indique qu'un animal atteignant un score de souffrance extrême est mis à mort par anticipation. Il décrit de nouvelles options thérapeutiques comme "indispensables" et présente le recours aux souris comme une étape "obligatoire et réglementaire" du développement des médicaments.

Objectifs

Ce projet vise à tester l’efficacité in vivo du céfépime (antibiotique), couplé à l’enmétazobactam (inhibiteur de β-Lactamases à Spectre Etendu - BLSE) dans un modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae productrice d’OXA-48 (mécanisme de résistance aux bêta-lactamines) chez la souris neutropénique. Ce projet fait suite à une autre étude qui a donné des résultats satisfaisant mais nécessitant de nouvelles investigations.

Bénéfices attendus

Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi résistantes comme K. pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé. En effet, ces pathogènes bactériens deviennent de plus en plus difficiles à traiter en raison de leur capacité à produire des β-lactamases, en particulier les carbapénèmases telles que l’OXA-48. Les entérobactéries productrices d’ OXA-48 sont de plus en plus communes dans les systèmes de santé nord-américains et européens et de nouvelles options thérapeutiques sont indispensables pour traiter ces infections. L’évaluation de l’efficacité du céfépime couplé à l’enmétazobactam pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique pour lutter contre ces infections.

Procédures

Les souris recevront deux injections intrapéritonéales d’immunosuppresseur à J-4 et J-1 avant infection afin d’obtenir une neutropénie significative mais non létale. L’infection se fera par voie intranasale à l’aide d’une pipette et sous une courte anesthésie volatile. L’administration des antibiotiques se fera par voie sous cutanée ou intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées avec un protocole bien défini. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et les animaux seront placés sous anesthésie volatile. Les concentrations d’antibiotiques utilisées seront en accord avec les données de la littérature sur ce sujet. Aucune toxicité n’est rapportée. Du fait des temps d’administration des antibiotiques (toutes les 2h pendant 24h), la surveillance de l’évolution de l’infection sera quasi continue sur la totalité de l’étude (26h) et si un animal présente des signes de souffrances extrêmes, correspondant à un score de 8 (cf tableau des scores cliniques), alors une mise à mort prématurée sera mise en place. Tableau score clinique en annexe

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 26h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.

Remplacement

Le céfépime est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines, du groupe des céphalosporines de 4e génération. Cependant, le céfépime peut être hydrolysé par des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases telle que l’OXA-48. La principale stratégie pour restaurer l'efficacité des β-lactamines est l'utilisation d'inhibiteurs de β-lactamase. Le but est de trouver la meilleure combinaison capable d’avoir une activité antibactérienne efficace contre ces BLSE. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez des Entérobactéries multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison (céfépime + enmétazobactam) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement et que les aspects liés à la pharmacocinétique de ces nouvelles molécules ne peuvent être évalués autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (7 animaux pour la phase d’efficacité), ce qui permettra de répondre aux hypothèses énoncées et d’effectuer une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons)

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, ce qui risquerait même de faire flamber l’infection. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 7 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire. Pour cela, une surveillance quasi continue sur 26h du fait du rythme d’administration des antibiotiques (toutes les 2h) sera réalisée tout au long de l’étude et si un animal présente des signes de souffrances extrêmes correspondant à un score de 8 (cf tableau des scores cliniques), alors une mise à mort prématurée sera mise en place.

Choix des espèces

Les souris CD1 représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée dans d’autres modèles d’infection pulmonaire développés au laboratoire. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 28-32g (même poids que pour les précédentes études).

98 rats Wistar vieillissants, 49 mâles et 49 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils suivent un entraînement d'endurance sur tapis roulant, des tests sensorimoteurs et cognitifs de force de préhension et de mémoire, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sur huit semaines, avant d'être tués pour prélever cerveau et muscles. Les retombées annoncées, transposer à l'humain les effets de l'entraînement sur le cerveau vieillissant, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire l'interaction muscle-cerveau sur une telle durée.

Objectifs

Dans ce projet, l’efficacité de programmes d'intensité modérée (Moderate intensity continuous training ou MICT) et de haute intensité (High-intensity interval training ou HIIT) est évaluée sur l’évolution des paramètres physiologiques de la performance d’endurance et de la performance sensorimotrice/cognitive ainsi que sur la plasticité musculaire et cérébrale sur 98 rats Wistar mâles (n=49) et femelles (n=49) adultes vieillissants (12-15 mois). Ce projet implique donc des tests sensorimoteurs/cognitifs, de performance d’endurance sur tapis roulant, 2 prélèvements de sang seront réalisés avant et après les 2e séances des semaines 2, 4 et 8 (après désinfection à l’alcool à 70°) au niveau de la veine caudale latérale de la queue. Ces échantillons seront ensuite conservés pour des analyses moléculaires ultérieures. Cela implique aussi des mesures moléculaires musculaires et cérébrales (hippocampe et cortex) à la fin du protocole après prélèvement des tissus pour quantifier les protéines clefs impliquées dans la neuroplasticité et l’activité métabolique.

Bénéfices attendus

Le projet peut révéler la spécificité de chaque méthode d'entraînement en endurance sur les fonctions cérébrales ainsi que les fonctions cognitives et sensorimotrices chez les individus âgés où des troubles moteurs et cognitifs apparaissent fréquemment. Les protocoles d'endurance seront individualisés à partir de repères physiologiques (voir procédure 1 pour la méthodologie utilisée) afin d'être facilement transférables à l'humain comme cela sera dans ce projet de recherche.

Procédures

Pas de chirurgie avec réveil dans ce projet. 1) Les intensités d'effort sont individualisées pour limiter les vitesses de course excessives et stressantes pour les animaux. 2) Pour le prélèvement du cerveau et muscles, ils subiront d'abord une anesthésie profonde. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier par un surdosage d'anesthésique. 3) Prélèvement de sang à la base de la queue sous anesthésie pour réduire le stress et les mouvements de l'animal (maximum 4 prélèvements de sang sur 8 semaines). Le volume prélevé sera inférieur au 20% du volume sanguin total dans la période de 7 jours, soit 2 ml maximum de sang prélevé pour des rats de 400-550g sur 1 semaine incluant le prélèvement PRE et POST séance (séance 2 des semaines 2, 4 et 8).

Impact sur les animaux

Globalement, le protocole n'induit pas d'effets indésirables importants. De légères blessures possibles peuvent subvenir aux niveaus des pattes. les autres procédures sont réalisés sous anesthésie n'induisant pas d'effets indésirables.

Devenir

Ils seront euthanasiés pour prélever les organes afin de les utiliser pour des analyses moléculaires ultérieures (Western blot et ELISA).

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. L’utilisation de culture de neurones (in vitro) ne peut pas remplacer l’utilisation des animaux dans ce projet car il n’est pas possible de mimer précisément l’entraînement physique de manière chimique. De plus, la durée de l’entraînement prévue est trop longue (8 semaines) pour pouvoir réaliser la même expérience in vitro. Les neurones en culture primaire ne restent pas exploitables sur cette durée. Il est également nécessaire de tenir compte des contraintes mécaniques imposées aux muscles actifs lors de la course. Ces contraintes contribueraient à la plasticité cérébrale mais le modèle in vitro ne peut pas reproduire ces phénomènes physiologiques d’interaction muscle-cerveau.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique, soit un total de 98 rats Wistar, mâles et femelles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés respiratoires, s’il est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d’assurer le bien-être de l'animal. Ce qui est prévu : L’environnement des cages sera enrichi et renouvelé toutes les semaines par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux (igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier). Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux. Les animaux sont familiarisés avec les dispositifs expérimentaux avant le début du protocole pour réduire le stress éventuel. Pour le protocole de la ponction de la veine caudale latérale (gauche ou droite) est réalisé sous anesthésie générale (gazeuse). Pour le prélèvement du cerveau et muscles, les rats reçoivent un antalgique 30 min avant la procédure et sont ensuite anesthésiés profondément. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier avec un surdosage d’anesthésique. Cette procédure n'induira pas de perte de poids de plus de 20%. Ils devraient même en prendre régulièrement. Dans le cas contraire, ils seront euthanasiés. le porteur du projet prendra cette décision.

Choix des espèces

Les répercussions musculaires et métaboliques à l'exercice montrent des similitudes entre un rat et un homme (par exemple, présence d'un seuil lactique, biogenèse mitochondriale, gains de masse musculaire) comme en témoignent de nombreuses publications. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux (sensibilité mécanique, force de préhension, mémorisation à court terme…) et immunohistologique, de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies d'entrainement. Les rats sains vieillissants seront inclus à partir de 12 mois (12-15 mois). Le taux de survie est plus important comparé aux rats âgés de 20 mois. De plus, ces animaux sont davantage susceptibles de courir sur le tapis roulant que des rats plus lourds. Ce modèle de rats vieillissants est fréquemment utilisé dans la littérature pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une greffe de l'un des six modèles de cancer du sein triple négatif, puis des injections de molécules et un suivi de la tumeur, avec mise à mort au plus tard soixante jours après le début. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont présentées comme "nécessaires" à de futurs essais cliniques. Le porteur affirme que la sensibilité des tumeurs aux traitements dépend du microenvironnement et impose de travailler sur un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet vise à étudier 6 nouveaux modèles de cancers du sein triple négatif (catégorie de cancer à mauvais pronostic). Le cancer du sein désigne un ensemble de tumeurs malades. En l’absence de traitements cette catégorie de cancer présente une forte agressivité et a de mauvais pronostics. Ce cancer représente environ 15% de l’ensemble des cancers du sein et touche préférentiellement les femmes jeunes, entre les âges de 40 et 50 ans. L’incidence annuelle est de l’ordre de 14/100 000 femmes, soit environ 40 000 nouveaux cas par an en France. Que ce soit dans les formes localisées ou déjà propagées le pronostic est significativement plus sévère que dans les autres formes de cancers du sein. Il s’agit donc d’un véritable problème de santé publique pour lequel de nouveaux traitements sont nécessaires. Le présent projet vise à évaluer de nouvelles thérapies dans des modèles. Il se déroulera en deux temps. Tout d’abord seront établies les conditions optimales de prise tumorale des 6 lignées cellulaires sur une souche de souris dépourvue de système immunitaire, puis souhaitera évaluer l’efficacité de nouvelles molécules .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouveaux principes thérapeutiques soient actifs dans le traitement du cancer du sein triple négatif. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’homme.

Procédures

Implantation de tumeur en sous-cutané ou orthotopique mammaire (ressemble à de la sous cutanée) (une fois au début de l'expérimentation, quelques minutes) - injection intraveineux de composés thérapeutiques non toxiques (quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours - mesures tumorales au pieds à coulisse 3x/semaine (quelques secondes)

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales en sous cutané entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - injection de cellules tumorales en orthotopique mammaire ressemble à de la sous cutanée) entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne et éventuellement douleur au niveau de la tumeur - pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention (quelques minutes) il n'y a aucun effet secondaire attendu pour les traitements.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Nous devrons récupérer les tumeurs pour analyses.

Remplacement

La sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris. In vitro au préalable, les molécules ont été testé sur ces mêmes lignées pour connaitre et valider la dose optimale. La voie d’administration de chaque drogue a fait l’objet d’une étude de toxicité et pharmacocinétique afin de déterminer la meilleure méthode d’injection de chaque composé.

Réduction

Les expériences seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable, i.e. 8 animaux par groupe. Le nombre de souris a été défini et établi via des outils statistiques. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Avant la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif. En effet la souris immunodéprimée est reconnue pour l’implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale

96 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants et réintégrés au circuit d'élevage au sevrage. Âgés de trois à six jours, ils sont castrés après injection d'un anesthésique local et d'un anti-inflammatoire, l'étude comparant deux doses d'un produit associant procaïne et adrénaline censé mieux contrôler la douleur et limiter les saignements. Le porteur classe le projet en "bien-être animal" tout en pratiquant la castration sur des porcelets qui rejoindront ensuite la production. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'est possible puisque l'étude porte sur la douleur ressentie.

Objectifs

Quand elle est pratiquée en élevage, la castration doit être réalisée par un éleveur formé, avec anesthésie locale et analgésie. Des études ont montré un léger bénéfice de la lidocaïne comparativement à la procaïne comme anesthésique local lors de la castration. Pour cette raison, le protocole actuellement utilisé par les éleveurs associe la lidocaïne comme anesthésique local pour la douleur au moment de la castration, et un anti inflamatoire non stéroïdien pour la douleur post opératoire. Cependant la lidocaïne a des propriétés vasodilatatrices et on constate des saignements parfois importants lors de la castration. Le médicament utilisé pour notre essai associe procaïne et adrénaline. Sa concentration deux fois plus élevée permet de réduire le volume à injecter; la présence d'adrénaline par ses propriétés de vasoconstriction, pourrait permettre d'une part d'améliorer l'efficacité et la durée de l'anesthésie en limitant la diffusion de l'anesthésique et d'autre part de limiter les saignements liés à l'intervention. Les quantités à administrer restent à préciser pour permettre une bonne prise en charge de la douleur lors de l'anesthésie. L'objectif est de tester l'injection de deux quantités différentes du médicament pour réduire la douleur lors de la castration.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu est d'identifier un protocole qui soit au moins aussi efficace que le protocole actuel utilisant la lidocaïne pour réduire la douleur lors de la castration des porcelets, et qui permette de limiter les saignements consécutifs à la castration des animaux.

Procédures

Les porcelets seront tous castrés. Ils recevront tous préalablement une injection d'anesthésique local et d'anti inflammatoire non stéroidien pour prendre en charge la douleur . Toutes ces interventions sont courtes, inférieures à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les piqures d’injections vont entrainer une douleur légère et du stress, la castration une douleur modérée du fait de l'anesthésie et de l'utilisation d'anti inflamatoire pour calmer la douleur post opératoire.

Devenir

Tous les porcs seront gardés en vie à la fin des procédures. Ils intègreront le cycle habituel de production de l'élevage au moment du sevrage.

Remplacement

Sachant que le projet porte sur l’évaluation de la douleur ressentie par les animaux, il n’est pas possible de mettre en place de méthode de substitution qui évite l’emploi d’animaux vivants.

Réduction

Un maximum de 96 porcelets seront intégrés à ce projet. Cet effectif a été calculé sur la base d’études similaires, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant un effectif suffisant d’animaux pour pouvoir tirer des conclusions sur l’efficacité des anesthésiques utilisés. Tous les porcelets recevront une analgésie pour prendre en charge la douleur pos opératoire

Raffinement

Les animaux sont logés conformément aux règlementations définissant les conditions de vie des porcs d’élevage. Lors des interventions, les animaux ne sont jamais isolés de leurs congénères : les animaux de la portée auxquels sont administrés les traitements sont placés ensemble dans une caisse puis remis directement dans la loge avec leur mère une fois l’intervention réalisée. Les procédures utilisées sont des pratiques habituelles d’élevage (castration). Les castrations seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles d’hygiène et de sécurité.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des traitements qui seront testés. Les animaux seront utilisés entre 3 et 6 jours d’âge, ce qui correspond à l’âge habituel de cette intervention en élevage de porcs. La variabilité des âges dépend de la date de naissance des porcelets, les mises bas s'étalant sur une période de quelques jours dans une bande de truies. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’à leur sevrage vers 28 jours d’âge, date à laquelle ils sont habituellement pesés avant leur passage en salle de post sevrage.