Procédures modérées

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des immunisations uniques ou répétées par diverses voies, jusqu'à trois sites par jour, avec prélèvements sanguins et anesthésies multiples, avant euthanasie pour prélever leurs organes. L'objet est de vérifier que des candidats vaccins déclenchent une réaction immunitaire avant des essais d'efficacité ultérieurs. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'immunogénicité d'un produit dans un organisme entier vivant.

Objectifs

Selon l'OMS, en 2017, les maladies infectieuses sont responsables dans le monde de 17 millions de décès par an, soit un tiers de la mortalité et 43 % des décès dans les pays en voie de développement (contre 1 % dans les pays industrialisés). Les maladies infectieuses recouvrent un large spectre de pathologies bénignes comme le rhume ou l’angine, mais également très graves comme l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine, les hépatites, le paludisme, la tuberculose, etc. Si la recherche a permis l’éradication de certaines d’entre elles grâce à la mise au point de vaccins spécifiques et des antibiotiques, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir pour que toutes ces pathologies soient traitées. Dans le cas du développement d'un vaccin anti-infectieux, il convient de s'assurer que le candidat vaccinal permet d'induire une réaction immunitaire spécifique chez l'animal sain après injection, permettant le développement d'anticorps spécifiques contre la pathologie visée, avant la réalisation d'études d'efficacité (challenge vaccinal). Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de modéliser de manière fiable l'immunogénicité d'un produit injecté dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet. Ce projet a pour objectif de caractériser l'immunogénicité de candidats vaccins après administration chez la souris. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner de nouveaux candidats vaccins à visée anti-infectieuse pour les phases d'efficacité, et à terme, pour la mise sur le marché de nouveaux vaccins.

Procédures

Les animaux seront immunisés par injection unique ou répétée (maximum 1 fois par semaine) du produit à tester par voie per-os (vigiles), sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale (vigiles ou anesthésiés) ou intratrachéale (anesthésiés). Sur animaux vigiles, l’immunisation est de l’ordre de la minute, en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Au maximum, 3 sites/souris par jour pourront être utilisés en respectant les volumes d’injections recommandés et un espacement de 7 jours. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine (et avant euthanasie) jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions immunitaires différentes selon les produits testés. Il est possible que leur système immunitaire soit affaibli entrainant l’apparition de signes cliniques. Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, administration des produits, prélèvements de sang) et pourront subir plusieurs anesthésies au cours des études susceptibles d’induire un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole afin de prélever les organes pertinents nécessaires aux mesures et analyses menées pour déterminer l’immunogénicité des produits testés.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser l'immunogénicité d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la réaction immunitaire induite d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur un réel pouvoir immunogène du traitement testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure), avec des enrichissements appropriés (abris, matériel de nidation, bois à ronger…). En cas d’hébergement individuel (pour cause de bagarre entre congénère par exemple), les cages seront réorganisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux adjacents. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et ainsi vérifier leur état général. Les injections pourront se faire sur animaux vigiles ou sous anesthésie (anesthésie systématique pour les voies d’injection intramusculaire et intratrachéale) en fonction de la voie d’injection et du protocole. Une attention particulière pourra être apportée au site d’injection durant les jours post-injection afin de détecter d’éventuels signes locaux ou d’irritation cutanée. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Des critères d’interruption ou points limites seront appliqués tout au long de ces études (basés sur la perte de poids, l’état de santé général et d’éventuelles lésions au site d’injection de l’animal). Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n'influent pas sur l'immunogénicité des produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Différentes espèces animales sont nécessaires pour tester l'immunogénicité de candidats vaccins car les pathologies infectieuses présentent des tropismes particuliers vis à vis de certaines espèces animales dans lesquelles ces pathologies infectieuses se développent ou non. Dans ce projet, des souris seront utilisées car il s’agit d’une espèce cible judicieuse qui est sensible aux modèles de pathologies comme la grippe, les rotavirus, la coqueluche, le tétanos, etc. (liste non exhaustive) et qui va donc induire une réaction immunitaire spécifique pour ensuite pouvoir réaliser des tests de challenge vaccinaux. La première injection se fera sur des animaux âgés de 7 à 13 semaines (stade jeune adulte). Ce stade de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude.

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sur leur dos sous anesthésie, puis irradiée par lumière visible chaque jour jusqu'à cicatrisation, l'appareil étant maintenu par un harnais qui impose un hébergement individuel. Le porteur reconnaît que l'isolement peut être source de stress, atténué selon lui par des cages transparentes laissant un contact visuel. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet un suivi prolongé du processus de cicatrisation.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. Les objectifs de ce projet sont, à la suite des essais préliminaires effectués in vivo chez le rat, d’évaluer l’efficacité du traitement de plaies cutanées à l’aide du nouveau dispositif expérimental utilisant les effets thérapeutiques de la lumière visible conçu pour le traitement de celles-ci. Les essais effectués chez le rat sans induction d’une plaie cutanée ont permis de s’assurer du maintien de la partie du dispositif expérimental appliquée sous anesthésie directement sur le dos, laissé en place pendant 5 heures sur le rat sans anesthésie à l’aide d’un harnais conçu spécifiquement et sur mesure. Ces essais ont également permis de d’assurer du maintien de la connexion avec le module de contrôle placé en dehors de la cage d’habitation, du contrôle en continu de la température corporelle au niveau de la zone d’application du dispositif expérimental et de celle du dispositif expérimental, ainsi que de la tolérance locale au niveau de la peau saine suite à l’irradiation lumineuse à l’aide de ce dispositif expérimental et sur 48 heures par la suite. Le dispositif expérimental va donc être utilisé pour traiter des plaies cutanées induites chez le rat. Des irradiations longues pendant 5 heures, ou séquentielles pendant 7 minutes 30 toutes les 15 minutes sur 5 heures, vont être utilisées pour le traitement des plaies cutanées, quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ces durées d’irradiations ont été déterminées suite à la réalisation d’études menées chez le rat dans le cadre d'un projet européen. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ce projet constituera la toute première évaluation de ce nouveau dispositif médical pour le traitement de plaies cutanées chez le rat.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales,les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité d’un nouveau dispositif expérimental tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ce dispositif expérimental pourrait ainis à terme, être utilisé chez l’Homme, pour le traitement de plaies chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 50 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 5 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis 6 heures après celle-ci, et si nécessaire 12 voire 24 heures après. Les plaies cutanées seront traitées quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète, pendant 7 minutes 30 sous anesthésie gazeuse, ou 5 heures en fractionné ou en continu sans anesthésie. Les plaies cutanées, protégées par un pansement et un harnais, seront observées et photographiées 3 fois par semaine lors du renouvellement du pansement, effectué en 10 minutes environ. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. En cas d’inflammation sévère du tissu cutané au niveau de la plaie cutanée traitée par irradiation lumineuse, le protocole d’irradiation serait systématiquement arrêté. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent le harnais, le pansement et surtout le dispositif expérimental de traitement des plaies cutanées placé dans le harnais, mais avec des briques d’Aspen placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. Les changes de pansement, effectués également sous anesthésie générale gazeuse de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais, le pansement et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’une surdose d'euthanasiquel effectuée sous anesthésie gazeuse profonde, et un prélèvement de peau correspondant à la zone traitée par la lumière sera effectué pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs quant aux objectifs envisagés selon notre expérience et les résultats obtenus d’études précédentes sur ce modèle de plaie cutanée. S’agissant en effet de la toute première étude menée chez l’animal avec ce dispositif expérimental, il ne nous est pas possible de définir un effectif minimal nécessaire à l’aide d’un test de puissance statistique. Les résultats qui seront obtenus, et le traitement statistique des données générées en analyse non paramétrique, le permettront pour les études suivantes.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de la réalisation de chaque irradiation lumineuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque change de pansement et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques de bois seront placées dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle du dispositif expérimental qui va être utilisé (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau), et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat nécessaire afin d’avoir une surface corporelle suffisante pour mettre en place le harnais et le dispositif expérimental d’irradiation lumineuse (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau).

6 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un candidat vaccin et trois prélèvements de sang à l'oreille en cage de contention, puis une ponction intracardiaque terminale de 30 mL sous anesthésie qui se termine par leur mise à mort. L'objet est de produire des anticorps anti-Klebsiella destinés à une vaccination testée ensuite chez des souris dans un autre projet. Le porteur indique qu'il faut exsanguiner les animaux pour récupérer assez d'anticorps et qu'on ne peut pas se passer du modèle animal.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae (OMPs), a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. L’objectif du projet est de déterminer si ce vaccin entraine une production d’anticorps fonctionnels chez une autre espèce. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la lapine dans le but d’obtenir une quantité importante d’anticorps. Ces anticorps seront utilisés par la suite (dans un autre projet) pour réaliser une vaccination passive chez la souris et ainsi évaluer leur efficacité face à une infection à K. pneumoniae.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, ce projet vise à déterminer s’il est capable d’entrainer la production d’anticorps chez la lapine. Si c’est bien le cas, ces anticorps serviront à mettre au point une vaccination passive chez la souris. L’efficacité de cette vaccination passive permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin.

Procédures

Les animaux vont être soumis à 6 interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 sur animal vigile : 3 secondes - 3 injections du candidat vaccin (0.5mL) par voie intramusculaire à J0, J12 et J28 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) : 3 secondes par injection - 3 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J7 et J21 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention : 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xylazine (3 secondes) - directement suivit d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) - qui se terminera par une injection intracardiaque d’euthasol (3 secondes) pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en de la puce. - 3 injections du candidat vaccin (0.5mL) par voie intramusculaire à J0, J12 et J28 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testé chez la sourie et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 3 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J7 et J21 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention : Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisés avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xylazine directement suivit d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui (si elle n’a pas entrainé la mort de l’animal) se terminera par une injection intracardiaque d’euthasol pour la mise à mort. La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière

Devenir

Les 6 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 42 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Afin de récupérer un quantité suffisante d’anticorps, il est nécessaire d’exsanguiner les animaux et donc de les euthanasier.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seuls deux groupes seront comparés et ces groupes ne contiendront que 3 animaux chacun. Ces 3 animaux par groupe seront suffisants pour permettre une première évaluation de la différence interindividuelle de réponse au candidat vaccin et permettre également de récupérer suffisamment d’anticorps pour de futures expériences d’immunisation passive.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante, capable de produire une réponse IgG.

Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses cellulaires et moléculaires, 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir si des lymphocytes T régulateurs contrôlent la douleur par les enképhalines qu'ils produisent. Chacune reçoit cinq injections de tamoxifène dans l'abdomen et passe huit mesures de sensibilité à la pression aux filaments de Von Frey. Selon les groupes, s'y ajoutent sous anesthésie une injection dans le coussinet de la patte, une greffe de tumeur sous la peau ou, pour 126 d'entre elles, une constriction chronique du nerf sciatique. Le porteur écrit qu'"Une douleur modérée sera induite" dans toutes les procédures et exclut tout analgésique opioïde, qui pourrait interférer avec la lecture des résultats. Il prévoit du méloxicam, de la lidocaïne et de la bupivacaïne autour de la chirurgie du nerf, et affirme ailleurs que "L'administration d'analgésique est impossible ici".

Objectifs

Le projet vise à établir le rôle des peptides opiodes générés à partir de la proenképhaline produites par les lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. La signalisation par le TNFR2 pourrait être un facteur clé dans l'expression des enképhalines dans les Treg. Dans un travail publié récemment, le TNFR2 exprimé par les Treg est associé à la perception de la douleur dans le modèle de constriction du nerf sciatique, communément utilisé dans la recherche sur la douleur. Dans ce travail, les auteurs montrent notamment qu'un agoniste du TNFR2 est capable de réduire la sensibilité de la patte lésée mais seulement si les Treg sont présents. L'hypothèse de travail du projet est que le TNFR2 pourrait jouer son rôle sur la douleur par l'intermédiaire des enképhalines.

Bénéfices attendus

En l'absence de production d'enképhalines par les Treg, une douleur exacerbée dans au moins 2 des 3 procédures indiquerait un rôle important des Treg dans le contrôle de la douleur chez la souris. En l'absence du TNFR2 dans les Treg, nous vérifierons que le TNFR2 exerce son action sur la douleur via les Treg dans un modèle sans équivoque. Nous démontrerons alors que l'action du TNFR2 sur la douleur s'exerce via la régulation de la production des enképhalines. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de la douleur chez les patients via une action sur le TNFR2.

Procédures

- Injections intrapéritonéales de Tamoxifène (270 animaux vigiles): cinq injections à un jour d'intervalle. - Injections dans le coussinet plantaire (54 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection. - Injections de tumeurs sous cutanées (90 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection .-Constriction chronique du nerf sciatique ischio-jambier (126 animaux sous anesthésie générale avec Ketamine/Xylazine): chirurgie unique. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une injection intrapéritonéale de Meloxicam. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une seule injection locale de Lidocaïne et de Bupivicaïne. - Traitement analgésique post opératoire (126 animaux vigiles): deux injections intrapéritonéales de Meloxicam 24 heures et 48 heurs après la première injection. - Sensibilité à la pression avec les filaments Von Frey (270 animaux vigiles): 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles. - Injection d'un agoniste de TNFR2 par voie intrapéritonéale (54 animaux vigiles): une seule injection

Impact sur les animaux

Une douleur modérée sera induite chez les animaux dans toutes les procédures. La douleur liée à la chrirugie du nerf sciatique sera prise en charge avec les analgésiques adaptés (Molixicam, Lidocaïne et Bupivicaïne) selon une posologie établie. Aucun analgésique opioide ne sera utilisée, ceux ci pouvant interférer avec la lecture des résultats et compromettre les objectifs du projet.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Nous utiliserons 6 animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 3 fois. Nous utiliserons le test statistique Mann- Whitney de type non paramétrique pour comparer les medianes entre groupes, ou d'analyse de pente par regréssion linéaire pour la croissance des tumeurs. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Une grille de scores cliniques sera remplie journellement pour déceler les animaux en souffrance qui seront immédiatement euthanasiés. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. L'administration d'analgésique est impossible ici, celle ci pouvant avoir des effets sur la lecture des résultats. Une grille de score clinique sera remplie journellement pour chaque animal pour évaluer l'évolution de la santé des animaux des procédures et engager l'euthanaise en cas d'atteinte d'un score définissant le point limite.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude (1). La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires (1). La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. 1 Larson CM, Wilcox GL, Fairbanks CA. The Study of Pain in Rats and Mice. Comp Med 2019; 69: 555–570. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature comportant des niveaux stables de Treg. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles. Les souris mutantes sont génotypés par PCR par prélèvement d'un morceau de tissu caudal au moment du sevrage. Les animaux entrant dans les différents groupes sont identifiés par marquaes aux oreilles avec un poinçon dédié (ref: Fine Science Tools 24212-01 ) et désinfecté avec de l'éthanol 70% selon un code interne à l'expérience (absence de marquage, un ou deux marquages de 1mm aux oreilles droites ou gauches) permettant d'identifier les 6 animaux de chaque cage.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déficientes en anticorps IgA ou en leur récepteur, elles reçoivent des gavages quotidiens pendant dix-huit jours et deux prélèvements de sang, avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. L'objet est d'étudier l'effet de ces déficiences sur le microbiote intestinal et de tester un apport oral d'anticorps. Le porteur affirme que les interactions hôte-microbiote ne sont pas reproductibles in vitro et indique qu'aucune alternative n'existe pour ce projet.

Objectifs

Les immunoglobulines A (IgA) et M (IgM) sont abondamment produites dans le chorion de la muqueuse intestinale, avant d'être sécrétées dans la lumière intestinale. Les Immunoglobuline sécrétées (SIg) comprennent donc les SIgA et les SIgM, et façonnent le microbiote intestinal, notamment en offrant une protection contre les pathogènes, en permettant l'implantation de certaines souches bactériennes, et en favorisant l'échantillonnage des bactéries commensales au niveau des plaques de Peyer ; des organes lymphoides secondaires impliqués dans la réponse immunitaire mucosale. Ainsi, la déficience en IgA chez les humains est associée à une baisse de la diversité microbienne dans les fèces, et ce malgré la compensation de cette déficience par une sécretion augmentée de SIgM. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de la déficience en SIgA seules ou en SIgA et SIgM, sur la composition du microbiote intestinal de souris. De plus, la possibilité del'administration passive d'IgA par voie orale Pour cela, nous disposons au laboratoire de deux modèles différents : - Des souris IGHA-/-, de fond génétique BALB/C, qui ne produisent pas d'IgA que ce soit en périphérie ou dans la muqueuse intestinale. De façon similaire à la déficience en IgA chez l'homme, qui est l'immunodéficience humaine la plus commune, les SIgM seront toujours présentes dans la lumière intestinale, mais les SIgA en seront absentes. - Des souris pIgR-/- de fond génétique C57bl/6, qui sont déficientes pour le récepteur pIgR, nécessaire au transport des immunoglobulines vers la lumière intestinale, et donc à la production de SIg. Ces souris n'ont ni SIgA ni SIgM dans la lumière intestinale. Ce modèle reflète plutôt les immunodéficiences transitoires chez l'homme, notamment celles induites par l'utilisation d'immunosuppresseurs. Ces souris transgéniques sont déjà présentes dans l'animalerie du laboratoire. Ces souris sont de fond génétique différent, et il est préférable de comparer chacun des modèle à des souris sauvages du même fond génétique. En effet, des différences basales du système immunitaire pourraient expliquer des variations du microbiote intestinal, qui seraient alors indépendantes de la présence ou non de SIg. Des souris contrôles différentes seront donc utilisées pour chaque modèle. Afin de limiter les différences de microbiote entre les souris, ces dernières seront traitées par antibiotiques puis traitées par transplantation fécale (FMT) à partir de fèces de souris, ou de fèces humaines.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est double : -D'un point de vue fondamental, il permettra de mieux comprendre l'impact de la compensation de la perte des SIgA par les SIgM, en comparant la dysbiose (ou déséquilibre de la flore intestinale) entre les souris pIgR-/- déficientes en SIgM et SIgA et IGHA-/-, uniquement déficientes en SIgA. De plus l'utilisation de modèles murins permet d'étudier la composition du microbiote intestinal dans les fèces, mais aussi directement dans l'intestin, ce qui permet une analyse plus précise que ce qui a déjà était fait chez l'homme. Ces résultats seront complétés par l'étude des métabolites dérivés du microbiote dans les fèces de ces souris. En effet, ces métabolites jouent un rôle important dans le métabolisme de l'hôte et dans la stimulation de son système immunitaire. - Cette étude apporte également un intérêt pour les applications cliniques d'administration orale d'IgA. La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par un transfert passif d'IgA par voie orale a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en IgA ou sous immunosuppresseurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale réguliers (1 fois par jour pendant 18 jours). La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. En début et fin d'expérimentation, du sang sera prélevé de chaque animal au niveau de la veine saphène (2 prélèvements à J4 et J18).

Impact sur les animaux

Les mutations portées par les modèles transgéniques pIgR-/- et IGHA-/- n'entachent pas la qualité de vie des animaux. Les gavages oraux réalisés fréquemment seront réalisés par un personnel particulièrement habitué au geste, de façon à ne créer aucune lésion et à diminuer la durée du geste.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal. Ce dernier est composé d'une grande quantité de taxons différents, qui peuvent être aérobie ou anaérobie, et qui varient le long du tube digestif. Leur implantation dépend de nombreux facteurs parmi lesquel l'alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire, la sécrétion de mucus, la compétition inter-espèces etc. Ces facteurs ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Les effectifs de 6 souris par groupe représentent la quantité minimale de souris nécessaire pour avoir assez de puissance pour conclure.

Raffinement

Les souris sont suivies attentivement par un personnel qualifié. Leur douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont. Les animaux sont hebergés en groupes harmonieux (par 2) et dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée pour couvrir les bruits parasites.

Choix des espèces

La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des IgA à la structure proche des IgA2 humaines (la sous classe majoritairement retrouvée dans les sécrétions mucosales), ce qui n'est par exemple pas le cas des modèles invertébrés. De plus, la grande majorité des travaux effectués sur les SIgA est conduite chez la souris, et notre travail pourra être analysé plus finement grâce à la vaste littérature qui existe sur ce sujet et avec ce modèle. Enfin, Les modèles IGHA-/- et PIGR-/- sont déjà présents dans notre animalerie, et permettront d'observer l'effet des IgA administrées oralement. Les souris auront entre 5 semaines et 6 mois, car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.

Devenir

A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules souches humaines, elles reçoivent des injections répétées à doses croissantes d'un traitement anticancéreux, des prélèvements sanguins et une imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine, avant euthanasie. L'objet est le développement préclinique d'une immunothérapie contre des cancers du sang avant un essai clinique, les retombées pour les patients restant renvoyées à ce projet futur. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut se modéliser in vitro et invoque l'effet de l'organisme entier.

Objectifs

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR in vivo (stratégie d’immunothérapie cellulaire) ciblant un marqueur tumoral que nous souhaitons mener jusqu’à la démonstration de sa sécurité et de son efficacité thérapeutique dans des indications de cancers du sang. Ces résultats sont un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2022. Il s’agit d’évaluer l’efficacité anti-tumorale lorsque notre CAR in vivo est injecté et distribué entre les différents compartiments de l'organisme dans un modèle murin humanisé. Ce projet nous permettra également de démontrer chez l’animal que la modification des cellules sanguines est bien spécifique des lymphocytes T (globules blancs du système immunitaire) ciblés et que notre CAR in vivo est bien toléré lors d’administrations répétées à des doses croissantes. Ces problématiques ne peuvent être abordées que via l’expérimentation animale. Aussi nous explorerons l’efficacité anti-cancéreuse, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines. Le choix de la souris NSG-hCD34+ est justifié car c’est un modèle de référence en oncologie très largement caractérisé́ et dont la prédictibilité a été démontrée dans de nombreuses études en immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR T-cell in vivo dirigé contre le marqueur tumoral CD19 qui doit nous permettre de démontrer sa sécurité et son efficacité thérapeutique dans des modèles de cancers hématologiques. Cette preuve de concept d’efficacité anti-cancéreuse est un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2023 chez les patients atteints de cancers hématologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à 5 temps différents (J-7, J+3, J+10, J+17, fin de projet). Ils seront aussi soumis à des injections par perfusions ou injections, ces perfusions/injections seront au nombre de 3 à 5 d'affilé. Ils passeront ensuite des examens d'imagerie par bioluminescence 1 à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isolflurane

Remplacement

La biodistribution d'un composé implique une interaction forte entre les différents compartiments de l'organisme, c'est à dire un échange entre le sang et les organes. Actuellement, il n'est pas possible de modéliser cette répartition tissulaire in vitro. Par ailleurs, même si l'innocuité des composantes de notre produit (lentivecteur + polymère + agent de ciblage anti-CD3) a déjà été vérifiée dans nos tests cellulaires et in vivo (par d’autres groupes), l'effet de l'organisme entier sur le lentivecteur associé au polymère ne peut être complétement évalué. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l’efficacité, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris NSG (NOD scid gamma) immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines. L’expérimentation chez la souris est nécessaire pour démontrer que la transduction des cellules cibles est toujours efficace quand notre produit injecté en systémique et distribué entre les différents compartiments de l'organisme.

Réduction

Afin de minimiser la consommation inutile des 105 souris qui pourraient être exposées à des doses dépassant la dose maximale tolérée, nous avons prévu 3 procédures qui seront lancées de manière séquentielle après avoir vérifié que les doses et protocoles d’injections de la procédure précédente ne présentent pas de toxicité macroscopique particulière. Le nombre de souris par groupe nécessaire et suffisant pour pallier à la forte variabilité interindividuelle observée en imagerie de bioluminescence et en cytométrie de flux a été défini. De plus il permet de démontrer l’efficacité du traitement par rapport aux groupes contrôles grâce à l’analyse statistique des résultats (tests one-way ANOVA et Kaplan-Meier) avec une signification suffisante (valeur p

Raffinement

Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement est aussi quotidiennement contrôlé et l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose)

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. La multitude de références bibliographiques en fait donc un modèle de choix. Par ailleurs, de nombreuses études en immunothérapie ont montré de bons résultats dans le modèle murin NSG-hCD34+. Ces animaux sont greffés avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines et se caractérisent par une excellente maturation des cellules T et la présence de cellules CD4+ et CD8+ dans la circulation et autres tissus. Cette souche constitue un modèle idéal pour vérifier in vivo la spécificité pour les lymphocytes T des promoteurs humains et des aptamères anti-CD3 développés en interne. Enfin le modèle de lymphome choisi et basé sur l’injection systémique de cellules Ramos humaines exprimant la Luciférase est également un modèle reconnu qui a été utilisé pour l’évaluation préclinique de différents agents anti-cancéreux. Les animaux utilisés seront adultes. Ce choix est nécessaire pour pouvoir injecter des volumes d’au moins 250 µL en iv ou 450 µL en perfusion contrôlée et lente (22,5 µL/min) étant contraints par les titres (nombre de particules virales infectieuses) de nos préparations de lentivecteurs. Après réception dans l’animalerie et observation de la quarantaine, une période supplémentaire de 2 semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et régime alimentaire sera respecté afin de réduire autant que possible l’état de stress des individus et ainsi avoir des animaux dans un état général optimal pour supporter des anesthésies générales répétées.