Procédures modérées

78 960 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections d'une suspension de cellules pour l'immuniser, puis subit deux ponctions d'environ soixante millilitres de sang à l'artère de l'oreille à deux jours d'intervalle, avant une ponction cardiaque terminale qui le tue. Ce prélèvement en série produit un médicament anti-rejet de greffe commercialisé, que le porteur présente comme un "life saving drug". Il affirme qu'aucune méthode ne permet de produire ce sérum in vitro et que le lapin est la seule espèce autorisée.

Objectifs

Le projet est la production d'un médicament à usage humain, la THYMOGLOBULINE, visant à lutter contre le risque de rejet de greffe et à améliorer la prise en charge des affections sanguines.

Bénéfices attendus

La production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Ce médicament est en effet un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire, ainsi que pour traiter l'aplasie médullaire.

Procédures

La procédure se résume à une phase d'immunisation comprenant deux injections et une phase de prélèvement comprenant trois opérations. Les immunisations et les prélèvements à l'oreille sont réalisés sur animal vigile, seul le dernier prélèvement est effectué sous anesthésie générale. L'immunisation à J0 consiste en l'injection par voie sous-cutanée de suspension cellulaire avec du sérum physiologique utilisé comme adjuvant. Elle se fait au niveau de 4 points d'injection : 2 lombaires et 2 scapulaires (0,5 mL à chaque point d'injection). L'immunisation à J14 consiste en l'injection par voie intraveineuse au niveau de la veine marginale de l'oreille de 3 mL de suspension cellulaire avec du sérum physiologique utilisé comme adjuvant. Le premier prélèvement sanguin est réalisé 20 jours±1 après la première immunisation, et consiste en la ponction de 60mL de sang environ au niveau de l'artère médiane de l'oreille du lapin. Le second prélèvement, identique au premier, se fait deux jours plus tard sur l'autre oreille du lapin, soit à J22±1. Le dernier prélèvement est réalisé 2 à 4 jours après le second prélèvement à l'oreille (à J25±1). Il est réalisé en intracardiaque et prend fin à la mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux inclus dans le projet ; tout d'abord une phase d'immunisation : injection d'une suspension de cellules thymocytaires par voie sous-cutanée puis intraveineuse sur animal vigile puis une phase de prélèvements : deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile et un prélèvement terminal en intracardiaque sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux élevés dans la procédure n°2 sont destinés à être inclus dans le protocole expérimental de la procédure n°1, et un petit nombre de lapins servira au renouvellement du cheptel de reproducteurs. Les animaux intégrés à la procédure n°1 sont mis à mort à la fin du protocole lors du prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous anesthésie générale.

Remplacement

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final THYMOGLOBULINE. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde.

Réduction

La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité totale de sérum prélevée sur chaque lapin en prélèvement intracardiaque, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger). Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement. Une prise en compte et une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance dépassée. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale en remplacement de pansement papier lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.

Choix des espèces

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire la THYMOGLOBULINE in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication de la THYMOGLOBULINE, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements répétés notamment).

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en DDC leur provoque une cholestase du foie, puis elles reçoivent sept injections intra-péritonéales hebdomadaires et subissent sept prélèvements sanguins par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, avant un prélèvement terminal par ponction cardiaque. Le projet teste un anticorps pour élargir les indications d'un traitement déjà en développement clinique. Le porteur affirme qu'aucun test sur cellules ne reproduit la fibrose du foie et que les maladies hépatiques "ne sont pas douloureuses".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique d'un anticorps monoclonal ciblant la protéine de jonctions serrées Claudine-1 pour le traitement des cholestases hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre de démontrer l'eeficacité de notre anticorps anti-Claudine 1 dans les cas de fibrose induits suite au développement d'une cholestase hépatique. Cet anticorps étant déja en développement clinique pour le traitement de la fibrose dans les cas de stéato-hépatite non alcoolique et pour le traitement du carcinome hépatocellulaire, cette étude nous permettrait d'envisager une extension des indications thérapeutiques afin de faire bénificier un maximum de patients de cette option de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection IP hebdomadaire sur animal vigile pendant 7 semaines, soit 7 injections. Les animaux subiront un prélèvement sanguin hebdomadaire, sur animal anesthésié à l'isoflurane et ayant reçu une analgésie locale à la tétracaïne 1% en collyrepar, voie rétro-orbitaire pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole, sur animal anesthésié à l'isoflurane, par ponction intracardiaque trans-thoracique.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront sous nourriture + DDC pendant 8 semaines, vont développer une cholestase hépatique rapide en 2 à 4 semaines. Les maladies hépatiques ne sont pas douloureuses est sont compatibles avec une vie normale, sauf en cas extrême de décompensation des fonctions hépatiques, ce qui ne sera pas le cas avec le protocole adopté dans ce projet. Les animaux recevront un total de 7 injections IP d'anticorps ou de véhicule, soit 1 par semaine pendant 7 semaines, ce qui ne devrait engendrer aucune douleur ni souffrance sur la durée du protocole.

Devenir

Afin d'analyser l'effet thérapeutique de notre anticorps sur la fibrose hépatique, tous les animaux de chaque groupe devront être sacrifié afin de procéder à la collecte du foie et à un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvement nous permettront d'analyser les fonction hépatiques (sérum) et le niveu de fibrose hépatique suite au traitement (marquage histochimique du foie).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucun test in vitro capable de récapituler la complexité du développement de la fibrose hépatique, notamment dans les cas de cholestases hépatiques qui impliquent l’obstruction des voies biliaires. Ainsi l’évaluation thérapeutique de nouvelles approches pour ces maladies hépatiques ne peut se passer de l’utilisation d’animaux.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’activité anti fibrotique de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. Nous utiliserons un total de 60 animaux répartis en 3 groupes, traité anticorps spécifique, anticorps isotypique et non traité.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi (souris + nourriture 0,1% DDC) permet de récapituler au plus proche les caractéristiques histologiques des cholestases hépatiques humaines en 4 à 8 semaines. Hormis le modèle de ligature du canal biliaire, beaucoup plus invasif, c’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une cholestase hépatique. Les animaux seront utilisés à un âge de 8 semaines afin d’induire une cholestase hépatique adulte.

30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des cathéters dans les veines fémorales sous anesthésie, on administre par voie orale ou intraveineuse un candidat médicament anti-inflammatoire, puis on réalise cinq prélèvements sanguins sur douze heures et un placement en cage à métabolisme pendant vingt-quatre heures. Le projet mesure le devenir de la molécule dans l'organisme en vue d'un futur dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur affirme que la pharmacocinétique n'est "pas prévisible" par des études sur cellules et qu'elle doit être fournie in vivo pour ce dossier.

Objectifs

L'IMD-036B est un candidat médicament qui présente des caractéristiques intéressantes pour lutter contre les processus inflmmatoires à l'origine de maladies chroniques inflammatoires comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques ou encore l'hyper-inflammation responsable des orages cytokiniques comme dans le cas des formes graves de COVID19. Afin de compléter les données obtenues sur ce candidat médicament avant de pouvoir mener des essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de connaître son devenir dans l'organisme et de déterminer si la molécule est bien absorbée et comment elle est éliminée (élimination rénale ou métabolisme hépatique). Notre projet a donc pour but de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et la clairance rénale de l'IMD-036B après administration par voie orale (la voie préconisée pour l'administration future chez l'Homme) et par voie intraveineuse (la voie de référence permettant de déterminer la biodisponibilité de la molécule).

Bénéfices attendus

Ce projet est une première étape pour pouvoir déposer un dossier d'AMM pour un nouveau candidat médicament. Les premières données obtenues sur ce candidat médicament laissent fortement penser qu'il permettrait de traiter efficacement les processus inflammatoires dans un certains nombres de maladies chez l'Homme qui n'ont pour le moment peu ou pas de traitement (par exemple, sclérose en plaques ou COVID19). Dans un deuxième temps, son utilisation pourrait également bénéficier aux vétérinaires pour le traitement de dermatites atopiques chez le chien par exemple.

Procédures

1. Pose d'un ou deux cathéters au niveau des veines fémorales sous anesthésie générale + analgésie: une seule chirurgie de maximum 30 minutes avec un réveil rapide, 2. Administration par voie orale ou par voie intraveineuse d'IMD-036B: une seule administration de quelques secondes à une minute max à chaque fois, 3. Cinq prélèvements sanguins sur environ 12h (1 de 100 µL et 4 de 250 µL) via cathéter sur animal vigile: quelques secondes à 1 minute max à chaque fois, 4. Placement en cage à métabolisme pour recueil des urines sur 24h, 5. Prélèvement de sang sous anesthésie via cathéter ou par ponction intracardique suivi de la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

La toxicité de cette molécule a déjà été testée sur rongeurs après des administrations répétées et à des doses bien plus importantes que celle utilisée dans notre projet. Aucun effet indésirable n'est attendu lors de l'administration unique par voie orale ou intraveineuse d'IMD-036B à la dose de 10 mg/kg à des rats. Les nuisances qui pourraient être observées sont plutôt inhérentes à la chirurgie effectuée sur les animaux, mais il s'agit d'une procédure largement maitrisée par le personnel en charge du projet et avec une analgésie très efficace.

Devenir

Les animaux ayant subi une chirurgie et l'administration d'une molécule qui n'est pas encore disponible sur la marché dont nous ne pouvons donc pas connaître les effets à long terme seront euthanasiés. Les animaux avec des cathéters non fonctionnels qui n'auraient pas reçu la molécule seront euthanasiés pour obtenir des matrices blanches permettant de réaliser gammes et QC pour le dosage de la molécule dans la plasma.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...). De plus, lors du dépôt de dossier d'AMM pour ce nouveau candidat médicament, il sera nécessaire de fournir des données de pharmacocinétique in vivo.

Réduction

Le projet sera découpé en deux parties: une première partie consistant à administrer la molécule à 15 rats par voie intraveineuse, la seconde partie consistant à administrer la molécule à 15 autres rats par voie orale. L'utilisation du second lot de 15 rats pour l'administration par voie orale ne sera faite que si les études menées in vitro sur Caco2, en parallèle de la première partie de notre étude, montrent que la molécule présente un bon passage au niveau intestinal. De plus, grâce à des techniques de modélisation des données, il est possible de réduire le nombre de prélèvements sanguins effectués sur les rats en ne réalisant pas tous les prélèvements sanguins à tous les temps sur tous les rats. Enfin, le fait de poser deux cathéters lors d'une seule chirurgie pour l'administration par voie intraveineuse et la réalisation des prélèvements sériés permet de réduire le nombre d'anesthésies pour ces animaux.

Raffinement

La réalisation du projet en deux parties permet de ne pas utiliser inutilement des animaux pour l'administration par voie orale alors que, si la molécule est mal absorbée, les résultats seront inexploitables. Les rats seront hébergés en groupe dans des milieux enrichis (papier pour faire des nids, rouleaux en carton en guise de tunnels et pour ronger), sauf juste après la pose des cathéters (au moins jusqu'au réveil de l'animal) et lors des 24h en cage à métabolisme. Les cages à métabolisme permettront tout de même aux animaux de se voir et se sentir.

Choix des espèces

Les études précliniques qui doivent être effectuées avant les essais cliniques chez l'Homme doivent l'être sur une espèce de référence comme le rat ou la souris. Le choix du rat a été fait car cette espèce permet, contrairement à la souris, de faire des prélèvements sanguins sériés. Animaux adultes. Dans un premier temps, on évitera les animaux trop jeunes ou senescents qui pourraient avoir un métabolisme différent car nous n'avons pas encore connaissance de la cinétique de la molécule et de la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques et urinaires.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales puis une instillation de bléomycine dans le nez, une substance qui déclenche l'inflammation puis la fibrose du poumon, avant d'être mises à mort le jour même de l'administration. Le projet cherche à montrer qu'un récepteur qu'elles expriment, une fois activé, réduit la fibrose pulmonaire, dans l'espoir lointain d'une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les cultures de cellules ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo et juge "nécessaire" le recours à la souris.

Objectifs

De nombreuses maladies pulmonaires interstitielles pouvant évoluer vers la fibrose pulmonaire existe chez l’homme et actuellement il n’existe pas de traitement permettant de guérir la fibrose ; Seuls 2 traitements sont utilisés et ils permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie. Nous avons identifié un récepteur exprimé par toutes les cellules dont l'activation permet la mise en place de réponses immunitaires anti inflammatoires et développé une molécule qui active ce récepteur. L'objectif de ce projet est de démontrer que c'est bien l'activation de notre récepteur d'intérêt qui conduit à la diminution de la fibrose pulmonaire chez la souris. Ceci permettrait à terme de développer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les fibroses pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet amènera une preuve importante certifiant que l’activation de notre récepteur dans des pathologies inflammatoires et fibrotiques peut être bénéfique, contrairement à ce qui est connu à ce jour. La mise au point de cette nouvelle technique d’étude de l’activation de notre récepteur pourrait être utilisée dans plusieurs autres pathologies pulmonaires, mais aussi être adaptée à d’autres organes. Cette technique permettrait de détecter réellement et efficacement l’activation de notre récepteur in vivo. En effet, aujourd’hui seules les voies de signalisation en aval du récepteur d’intérêt sont étudiées, or ces voies sont communes à l’activation de nombreux récepteurs cellulaires.

Procédures

Les animaux anesthésiés (diminution du stress) seront soumis à une injection par voie intranasale de petits volumes de solution. Ces solutions sont indolores pour l'animal et le geste ne dure pas plus d'une minute. 192 animaux recevront 2 injections intrapéritonéales (ip) à 30 minutes d’intervalle (1 ip flanc droit, 1 ip flanc gauche) suivi d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). 256 animaux recevront 1 injection intrapéritonéale suivie d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). Ces injections et instillations sont très bien supportées par les animaux et le geste technique dure une dizaine de seconde à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration par voie intranasale de petits volumes (25ul par narine) de liquide est certainement désagréable, mais non létale. La littérature montre que l’administration de bléomycine induit une inflammation marquée du poumon qui précède la fibrose (visible à partir du 14ème jour) et que cette dernière est associée à une mortalité de l’ordre de 30% (Jiang D, 2005 PMID 16244651). Néanmoins, malgré ce taux de mortalité élevé, ce modèle reste le modèle de choix pour étudier l’incidence de l’intensité inflammatoire sur l’apparition des fibroses pulmonaires. Dans ce projet, les souris seront mises à mort le même jour que l’administration de la bléomycine, s’affranchissant ainsi des effets létaux et sévères de la bléomycine sur le bien-être animal.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des deux procédures

Remplacement

Nous avons utilisé des cellules en culture pour définir les concentrations actives de nos molécules. Néanmoins l'utilisation de cellules en culture ne permet pas de mimer la complexité des interactions cellulaires et moléculaires nécessaire à la caractérisation de l'activation de notre récepteur.

Réduction

Une étude de la littérature a été menée pour s'assurer de la non-reproduction de résultats. L’étude statistique prévisionnelle nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous utilisons une technique basée sur l’instillation de bléomycine par voie intranasale, cette technique évite une chirurgie. L’instillation est réalisée sur des souris anesthésiées pour diminuer leur stress et nous utilisons un tapis chauffant pour reverser l’hypothermie associée à l’anesthésie. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une grille d’observation qui liste les mesures prises pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites à partir desquels les mesures sont prises pour limiter la souffrance de l’animal ou arrêter l’expérience.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris car l’instillation de la bléomycine chez la souris mime l’état inflammatoire et fibrotique des patients atteints de fibrose pulmonaire. Ayant montré dans le cadre d'un projet antérieur que les modulateurs positifs de notre récepteur d'interet inhibent la fibrose pulmonaire, il est important de démontrer son activation dans les mêmes conditions. Les souris mâles seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature et les souris développent une inflammation et une fibrose pulmonaire après l’exposition à la bléomycine .

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour surexprimer la télomérase et développer une maladie rénale, elles reçoivent de la doxycycline dans l'eau de boisson puis des injections intra-péritonéales quotidiennes d'un inhibiteur pendant sept à vingt et un jours, avant mise à mort pour prélever les reins. Le projet cherche à savoir si une protéine, le TGF-b, intervient dans l'effet d'une autre cible sur la progression de la maladie, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que la complexité de la maladie interdit une étude sur cellules et conclut que l'objectif "nécessite le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale chronique très agressive, de progression rapide et associée à un mauvais pronostique. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique pour cette pathologie rénale, et les patients souffrant de HSF suivent par défaut les mêmes protocoles thérapeutiques que ceux utilisés pour traiter les autres maladies rénales chroniques. Toutefois, les patients atteints de HSF présentent une faible réponse à ces traitements, leur fonction rénale ne s’améliore pas, et la grande majorité d’entre eux développent une insuffisance rénale terminale les obligeant à subir des dialyses puis des greffes de rein pour pouvoir survivre. Les causes de la HSF sont inconnues, mais des facteurs génétiques et cliniques sont associés au développement de cette maladie, tels qu’une inflammation anormalement maintenue, la consommation de médicaments, et un large spectre d’infections virales incluant le VIH. Aussi, les évènements moléculaires associés à l’initiation et à la progression de cette maladie restent méconnus. Toutefois, des études précédentes ont montré qu’une voie de signalisation importante pour la physiopathologie de la HSF impliquait la télomérase. En effet, l’augmentation anormale de l’expression de la télomérase chez la souris provoque un dysfonctionnement de la fonction de filtration rein qui montre alors les caractéristiques histologiques de la HSF. Ces souris permettant de surexprimer la télomérase représentent donc un modèle robuste de la HSF. Aussi, l’étude de ces souris a montré que le ciblage pharmaceutique de la protéine X (pX) permet de limiter les effets néfastes de la télomérase sur le rein. Cet effet bénéfique de la modulation de pX sur la progression de la HSF apparaît être associée à une stimulation du processus de sénescence dans le rein et à une augmentation du facteur de croissance transformant-b (TGF-b). TGF-b est une molécule décrite comme une cible de pX qui augmente la sénescence dans différents organes. Dans ce projet, nous allons déterminer si l’augmentation de TGF-b est nécessaire pour l’effet thérapeutique observé lors de la diminution de pX chez les souris surexprimant la télomérase. Pour ce faire, nous allons tester l’effet de deux inhibiteurs de TGF-b sur la progression de la HSF chez des souris invalidées pour pX et surexprimant la télomérase. Ce travail permettra de mettre en évidence de nouvelles stratégies pour le traitement des patients atteints de HSF.

Bénéfices attendus

La télomérase est surexprimée dans le rein des patients souffrant de la hyalinose segmentaire et focale, une pathologie rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale, et caractérisée par la reprogrammation des cellules rénales responsables de la filtration du sang, les podocytes, en cellules dédifférenciées et prolifératives. Nos résultats montrent que l’invalidation ou l’inhibition pharmaceutique de pX permet de restreindre les fonctions non-canoniques de la télomérase et ainsi d’empêcher la dérégulation des podocytes induite par la surexpression de la télomérase chez la souris adulte. Le projet présenté dans ce PEA permettra de déterminer si la modulation de pX réfrène la progression de la hyalinose segmentaire et focale via une stimulation de TGF-b dans ce contexte. Ce travail permettra d'ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber l'activité́ pro-proliférative de la télomérase dans une pathologie rénale associée à la prolifération des podocytes.

Procédures

Les animaux vont être taités à la doxycycline dans l’eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d'atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l’hydratation des animaux. Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale d’inibiteur de TGF-b toutes les 24h dès le début du traitement à la doxycycline. Les injections seront effectuées alternativement à droite et à gauche de la ligne médiane abdominale. Les animaux seront injectés avec l’inhibiteur pendant 7 jours, 14 jours ou 21 jours. A l’issue de ces injections, les animaux seront sacrifiés et les reins seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

La protéine pX est exprimée dans toutes les cellules du corps, mais avec des niveaux différents en fonction des organes ainsi qu’en fonction des types cellulaires au sein d’un même organe. L’organe montrant la plus forte expression de pX est le testicule. Ainsi, les souris mâles qui n’ont plus de protéine pX montrent des performances de reproduction amoindris. Cependant, aucun phénotype dommageable n’est observé chez ces animaux qui n’ont plus de protéine pX (femelles et mâles). Deux caractéristiques physiologiques observables sont associées à l’augmentation de l’expression de la télomérase chez la souris adulte : 1) La pousse accélérée des poils, suivi par leur perte. Ce phénotype n’a aucun impact sur le bien-être des animaux, et l’hébergement des animaux en groupes de 2 à 4 souris par cages favorise le maintien de la température corporelle des souris malgré la diminution de la densité des poils. Aussi, l’ajout systématique de carrés de coton dans les cages permet aux animaux de faire un nid, et ainsi favorise le maintien de la température corporelle. 2) La perturbation des cellules du rein, associée à un dysfonctionnement de la filtration rénale et au développement de la HSF.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de cette procédure expérimentale afin de permettre l'analyse histologique et moléculaire de leurs reins.

Remplacement

Ce projet d’expérimentation animale s’appuie sur des études préalables réalisées in vitro décrivant les processus moléculaires associant pX, TGF-b et le processus de sénescence cellulaire. Cependant, la HSF est un processus pathologique complexe, et l’étude du rôle de TGF-b sur la progression de cette maladie ne peut pas être réalisé sur des cellules en culture. Ainsi, par définition, cet objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Deux groupes de souris témoins (génotype sauvage et génotype i-TERTci) sont prévus afin d’évaluer les potentiels effets secondaires des inhibiteurs utilisés. Nous commencerons par réaliser le protocole sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Le protocole expérimental ne sera réalisé sur ces groupes que si nous notons un effet significatif des inhibiteurs employés sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un minimum de 90 animaux, et un maximum de 270 animaux.

Raffinement

L’évolution de la pathologie rénale sera surveillée étroitement dès le début des procédures. Aussi, dans le but de limiter l'impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par les procédures expérimentales décrites dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grilles de score. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

Le modèle murin i-TERTci utilisé dans ce projet, est un modèle de souris génétiquement modifiées déjà disponible au sein de notre animalerie qui présente les caractéristiques de la hyalinose segmentaire et focale (HSF) décrite chez l’Homme. Ce modèle est croisé avec des souris invalidée pour pX, et nos résultats montrent que cette invalidation restreint l’initiation et la progression de la HSF chez les souris i-TERTci. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires mondiaux permettant de répondre aux questions scientifiques posées dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la pénétrance du phénotype chez les souris i-TERTci est la plus élevée.

2 556 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des mycobactéries, Mycobacterium avium ou abscessus, par voie intranasale ou intratrachéale, puis traitées jusqu'à deux mois par de nouveaux antibiotiques, avant d'être tuées à différents temps. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant 20 % déclenche la mise à mort, tout en présentant une perte de poids continue comme "non préjudiciable" en deçà de ce seuil. Il qualifie le modèle murin d'"indispensable" et de préalable à un essai chez l'humain "incluant le moins de patients possible".

Objectifs

Mycobacterium abscessus (Mabs) et Mycobacterium avium (Mavi) sont des mycobactéries pathogènes opportunistes responsables d'infections pulmonaires chroniques. La physiopathologie et le terrain prédisposant ces infections ne sont pas bien connus. Pour mieux comprendre l'impact de l'hôte, des modèles précliniques sont indispensables. Actuellement, une infection par voie intraveinseuse de souris immunodéprimées est la seule méthode permettant d'évaluer de nouveaux traitements antibiotiques car il existe une clairance spontanée de l'infection chez les animaux immunocompétents. Cette clairance, qui est aussi retrouvée dans d'autres modèles murins d'infection bactérienne (par exemple Pseudomonas aeruginosa), a été contournée par l'infection des animaux par des bactéries encapsulées dans des billes d'alginate. Cet artifice va permettre de créer une infection chronique ressemblant à celle observée chez les patients. Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente. Pour ce faire nous effectuerons une infection des souris par des Mabs et Mavi encapsulées dans des billes d'alginate via deux voies d'infection différentes: intranasale et intratrachéale.

Bénéfices attendus

Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente.

Procédures

Les animaux seront infectées par voie intranasale ou intratrachéale par Mycobacterium avium ou Mycobacterium abscessus (n=2376) puis traités par voie orale ou sous cutanée pendant un maximum de 2 mois par de nouvelles molécules afin d'évaluer l'efficacité des traitements (n=1800). Un prélèvement sanguin à la veine mandibullaire sur 24 animaux par molécule sera réalisé; seules les 4 molécules les plus actives seront testées soit un maximum de 96 animaux prélevés. Les animaux ne seront prélevés qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

L'infection chronique par Mabs ou Mavi peut entrainer une perte de poids modérée mais sans mortalité. Le poids sera donc surveillé de manière hebdomadaire. En cas de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera euthanasié par élongation cervicale.La valeur de référence sera le poids initial des souris le jour de l’inoculation. Le point limite est fixé à une perte de poids de 20% ; cette perte n’interviendra pas du jour au lendemain mais pourra effectivement être continue pour les animaux concernés. Si aucun autre signe évoquant la souffrance n’est associé (animal prostré, poil piqué, animal ne se nourrissant plus), une perte de poids continue n’est pas préjudiciable aux animaux dans la limite du point limite fixé.

Devenir

Fin de procédure 1: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 2: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 3: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet. Fin de procédure 4: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet.

Remplacement

Les études dans le modèle murin sont un prérequis indispensable à la compréhension de la maladie humaine. Il s'agit d'une étape indispensable pour pouvoir affiner au mieux les stratégies thérapeutiques qui seront évaluées chez l'homme dans un essai incluant le moins de patients possible. Notre projet s'inscrit en amont des études d'activités d'antibiotiques chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour que les résultats soient interprétables ; si notre mise au point de modèle n'était pas concluante, la deuxième partie du modèle ne serait pas mise en oeuvre et une partie des souris prévue ne serait pas utilisée.

Raffinement

Il sera assuré par l'utilisation d'anesthésiques adéquates ainsi que par l'enrichissement mis à disposition des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par des personnes compétentes, permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. L’infection par Mycobacterium avium ou abscessus est susceptible d’engendrer une perte de poids chez l’animal. En cas d’atteinte des points limites fixés préalablement (perte de poids supérieur à 20%) l’animal sera euthanasié par une personne compétente. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle utilisé pour l'évaluation des antibiotiques dans les infections à mycobactéries avant évaluation chez l'homme. Il est nécessaire de garder le même modèle pour obtenir des résultats reproductibles. Les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure à 5 semaines après avoir observés une semaine d'acclimatation. Dans la littérature, les animaux utilisés dans d’autres infections mycobactériennes ont habituellement 4 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature et d’être reproductibles.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre à sept injections intrapéritonéales d'un inhibiteur d'enzyme (BAPN) ou d'un placebo, avant d'être tuées pour prélever la cornée sur tissu frais. Le porteur précise que cette expérience répond à une demande d'examinateurs pour finaliser la publication de travaux déjà réalisés. Il n'anticipe "pas de souffrance ou de douleur" sur la courte durée des injections et présente la souris comme "essentielle" pour étudier le devenir des cellules souches in vivo.

Objectifs

Le but de ce projet est de mesurer l’impact de la rigidité matricielle de la niche du limbe de la cornée sur le destin des cellules souches. L’expérience proposée ici est une demande d'examinateurs afin de finaliser la publication de nos travaux . L’effet fonctionnel a déjà été évalué sur des limbes de cornée prélevés sur souris wild type. Il faut maintenant évaluer la rigidité du tissu en question (mesure par microscopie à force atomique). Pour cela, il s’agit de répéter la modulation de la rigidité du limbe par injection intrapéritonéale d’un inhibiteur d'une enzyme de modification de la matrice extracellulaire (lysyl oxidase LOX) et d'effectuer un prélèvement d’organe après sacrifice. La mesure AFM doit effectivement etre realisé sur tissu frais.

Bénéfices attendus

Le destin des cellules souches de s'autorenouveler ou de se différencier dépend en grande partie de l'environnement extracellulaire, en particulier de l'élasticité de leur niche. Néanmoins, le rôle de la rigidité de la matrice dans la formation de cette niche et dans les fonctions souches in vivo est mal connu. Nos données montrent que la rigidité matricielle du stroma module ce destin en générant des compartiments fonctionnels différents. Ce projet vise à mesurer la rigidité de la matrice du stroma du limbe par microscopie à force atomique AFM, comme demandé par les examinateurs. En effet, nous avons montré, dans ce manuscrit, de manière fonctionnelle que c’est en compartimentalisant l’environnement que la matrice contrôle le destin souche.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à 4 traitements par injection intrapéritonéale (lot 1 BAPN et lot 2 PBS ) soit à 7 traitements par injection intrapéritonéale (lot 3 BAPN et lot 4 PBS). Une injection intrapéritonéale prend environ 2 minutes par souris à réaliser (soit un total de 2minutes x 4= 8 minutes maximum réparti sur 5 jours pour les lots 1 et 2, et 2minutes x 7= 14 minutes maximum réparti sur 7 jours pour les lots 3 et 4).

Impact sur les animaux

Sur la base de l'expérience antérieure de nos collaborateurs avec les injections de BAPN ou le gavage oral, nous n'anticipons pas de souffrance ou de douleur chez les animaux. Le BAPN est un inhibiteur des enzymes LOX et devrait atténuer la rigidité tissulaire. Ce n'est qu'après des traitements plus longs (comme un mois, i.e. beaucoup plus long que les 4 ou 7 jours max. d'injection proposé ici) que des phénotypes dommageables peuvent apparaitre.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de l'unique procédure expérimentale de ce projet. En effet, la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement d'organes prévu pour répondre à la question scientifique posée.

Remplacement

Une importante partie de ces travaux a été réalisée in vitro sur cellules en culture, en particulier l’aspect des mécanismes moléculaires impliqués. Cependant, l’étude de l’impact de l’environnement matriciel sur le destin fonctionnel des cellules souches n'est que limitée sur des cellules en culture, et c’est pour cela qu’il est essentiel de réaliser cette expérimentation sur la souris.

Réduction

Chaque souris ayant deux yeux, le nombre de prélèvements pourra être légèrement réduit. De même, les mâles et les femelles seront utilisés limitant donc le nombre de portée et d’animaux générés (début procédure à P13). Néanmoins, afin de préserver la qualité statistique des données, 12 souris par groupe et par traitement sont prévues.

Raffinement

Afin de reduire le risque potentiel de perforation des organes fixes ou de consistance plus dure (estomac, cæcum, foie...) par l'injection intrapéritopneale, le site d'injection choisi est le quadrant abdominal inférieur droit de la cavité péritonéale de l’animal en regard de la cuisse (c'est à dire autour des anses intestinales, organes lâches, qui se rétractent sous l’injection). De même, afin de réduire la douleur, l'aiguille utilisée est de très petit diamètre et le volume injecté de moins de 50 microlitres. Bien entendu, une fiche de score avec point limite bien défini (site d'injection, état général et comportement de l'animal) sera utilisée.

Choix des espèces

La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur les processus biologiques régulant le devenir des cellules souches in vivo. La souris apparaît comme un excellent modèle pour étudier ces mécanismes car le modèle est parfaitement décrit et déjà utilisé et le traitement BAPN a déjà été testé, validé et partiellement publié par un membre de la collaboration. De plus, nous proposons ce projet dans le cadre du manuscrit en cours de révision pour lequel notre collaborateur a utilisé un modèle de souris génétiquement modifiées (LOXOE, enzyme LOX OverExpressed). Ainsi, en utilisant des souris, nous pourrons comparer nos données sur souris wild type injectées au BAPN et les données sur souris transgéniques. Ce projet sera développé dans le cadre de réponse aux reviewers sur des expériences déjà réalisées. Ainsi, la procédure sera réalisée sur des souris jeunes P13 uniquement.