Procédures modérées

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules de mélanome humain sous la peau ou dans le sang, puis on les traite par des oligonucléotides et un gavage quotidien jusqu'à une tumeur de deux centimètres cubes. Le porteur prévoit la mise à mort dès ce point limite ou à la fin, puis des analyses moléculaires. Il présente le projet comme une preuve de concept ouvrant une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et écarte les cultures cellulaires, jugées insuffisantes pour reproduire la tumorigenèse.

Objectifs

Ce projet vise à démontrer que l'inhibition de longs ARNs non codants in vivo altère la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ce projet est destiné à prouver que certains longs ARNs non codants sont de potentielles cibles thérapeutiques Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques

Bénéfices attendus

Cette expérimentation doit permettre de caractériser les changements dans la formation et la croissance tumorales suite à l'inhibition d'un ARN longs non codant associée ou non à un traitement complémentaire déjà utilisé et ceci dans un contexte physiologique que ne permettent pas les cultures cellulaires in vitro. Ce projet devrait permettre la validation d'une nouvelle cible thérapeutique pour le mélanome cutané. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d'inhibition des ARNs longs non codants, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections de cellules par voie sous-cutanée ou intraveineuse rétroorbitale sont réalisées sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections sous-cutanée d'ASO (ASO : "Anti-Sense Oligonucleotides" : petites molécules d'ADN simple brin) (tous les deux jours, 100 microlitres) ou intrapéritonéales de luciférine (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparaitre à partir de 5 jours suivant l'injection et croitre assez rapidement. La durée totale de l'expérimentation sera de trois semaines. Les souris seront sacrifiées en cas d'atteinte du point limite du volume tumoral de 2cm3. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont dû être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases. Les cellules tumorales injectées par voie intraveineuse devraient se fixer sur les organes de préférence métastatique, à savoir les poumons en premier. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Le suivi des cellules du fait de leur luminescence permettra de suivre la croissance tumorale pour les deux voies d'injection. Les traitements subséquents devraient réduire la formation et la croissance des tumeurs.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Après euthanasie, des prélèvements seront effectués pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par des oligonucléotides antisens (ASO) sur la croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 180 réparti comme suit : 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie intraveineuse (IV) rétroorbitale avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 2 cohortes de 60 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 2 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec les ASOs en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Le paramètre étudié sera la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance pour les souris injectées par SC et le développement des métastases pulmonaires pour les souris injectées par IV. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes et leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique, il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires dans les deux voies d'injection. Pour l'analyse statistique, nous utiliserons le logiciel GraphPad Prism. Pour comparer deux groupes, un test t de Fisher à deux intervalles sera appliqué. Pour plus de deux groupes, une analyse de la variance à sens unique (ANOVA) sera suivie d'une analyse post hoc de Tukey pour comparer les moyennes entre deux groupes.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les femelles et les mâles répondent de la même manière aux traitements, il ne devrait donc pas y avoir de biais expérimental du au sexe. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d'imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine. En plus du suivi de la taille de la tumeur primaire, la "painscore sheet" servira à l'évaluation de la douleur des animaux. Ce suivi permettra la mise en place d'une éventuelle analgésie (niveau 2) qui pourra être suivie de l'euthanasie si le score de douleur augmente encore (niveau 3).

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétroorbitale.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur ouvre le crâne pour y déposer un implant en céramique, puis on répète l'imagerie au micro-scanner et on injecte un agent pour visualiser les vaisseaux, avant la mise à mort pour analyse. Le porteur décrit des douleurs post-chirurgicales et un protocole d'analgésie sur trois jours, pour comparer des géométries d'implants destinés à combler des pertes osseuses. Il écarte les modèles in vitro et in silico, jugés incapables de reproduire la complexité de la réparation osseuse et sa vascularisation.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure toujours un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement osseux du patient sur un autre site) reste la référence, il a cependant des inconvénients (quantité disponible, morbidité..). Les céramiques à base de phosphates de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car elles possèdent une composition chimique similaire à la phase minérale de l’os, les rendant biocompatibles et ostéoconductrices (favorisant la repousse osseuse à la surface du matériau) . Cependant, la faible vascularisation et pénétration des tissus néoformés dans les céramiques poreuses en CaP n’en font une solution satisfaisante que pour des défauts de petite taille. L'augmentation de leur efficacité clinique implique une amélioration de leurs propriétés angio- et ostéo conductrices (favoriser l’invasion vasculaire et la formation osseuse). Ces propriétés peuvent être obtenues en modulant les caractéristiques chimiques et architecturales de la céramique. L’architecture des céramiques (comprenant la forme, la porosité, la taille des pores, leur interconnectivité et la surface interne) conditionne le transport de nutriments, la migration cellulaire et tissulaire et la distribution des contraintes de cisaillement. Les techniques récentes de fabrication additive associées à celles de conceptions assistées par ordinateur permettent dorénavant de produire des implants avec des formes externes personnalisées (épousant parfaitement le défaut osseux) ainsi qu'une macro-architecture interne optimisée et reproductible. Ce présent projet fait suite à un précédent projet récemment terminé qui a consisté à évaluer le potentiel de réparation de défauts osseux au niveau du crâne de rat avec des implants à base de céramiques de phosphates de calcium et 2 géométries différentes. Nos résultats, obtenus sur des défauts de taille non critique (5 mm de diamètre) ont montré que les paramètres porosité / taille des pores étaient critiques par rapport à la surface interne. Ce projet a pour objectif de valider ces premiers résultats sur un défaut de taille critique (8 mm de diamètre) et de mieux discriminer l’impact des paramètres (i) porosité, (ii) taille de pores et (iii) surface interne sur la cinétique de l’invasion osseuse. Par ailleurs, nous évaluerons la relation entre formation osseuse, vascularisation et impact de la géométrie des implants.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux issus de la littérature ont tenté de déterminer l’impact de certains paramètres géométriques d’implants substitut osseux sur l’invasion osseuse, mais la plupart des études ne tiennent compte que d’un seul paramètre (généralement la taille des pores) ; cette étude permettra de discriminer l’impact de la porosité globale, de la taille des pores et de la surface interne sur l’invasion osseuse et l’invasion vasculaire. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la fabrication des implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

1-Craniotomies latérales et dépôt d’un implant ( 1X ; durée ~40 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (Max 7X; durée 15 min) 3- Injection de fluorochromes (2X, durée 5 min) 4- Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant; Injection en sous cutané ; Injection en intrapéritonéal (sous anesthésié gazeuse) ; Chirurgie au niveau du crâne (sous analgésie et anesthésie) ; thoratocomie. Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au scanner à haute résolution de la formation osseuse et du réseau vasculaire pénétré dans le matériau macroporeux + histologie des cranes réparés)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules osseuses / cellules immunitaires par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le suivi de la formation osseuse seront réalisées sur les mêmes animaux par imagerie in vivo. Le suivi de la vascularisation aux temps précoces ne se fera qu’à 2 et 4 semaines et que sur 2 groupes (1 seule géométrie et défaut vide). Ces études nécessiteront 10 animaux par groupe compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo, de cassures de l’implant, et de l’étape de perfusion vasculaire qui, parfois faillit en ne remplissant pas parfaitement le réseau vasculaire, notamment les capillaires. Pour les analyses statistiques, nous effectuerons les tests adéquats après test de normalité.

Raffinement

Les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. Un analgésique leur sera administré avant chaque intervention chirurgicale laquelle sera faite sous anesthésie générale. Des injections bi quotidiennes d’analgésique en sous cutanée seront aussi pratiquées pendant les 3 jours post opératoires. Pour chaque analyse en imagerie, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse. L’acte terminal nécessitera des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le rat male WISTAR (non-syngénique). Le rat est un bon compromis entre la souris (trop petite pour obtenir un défaut de taille suffisante pour l’évaluation d’implants massifs) et le lapin (couteux et trop gros pour permettre un suivi en imagerie micro-scanner in vivo). De plus, le modèle de défaut au niveau de la calvaria est bien décrit dans la littérature et autorise la réalisation de défauts reproductibles et contrôlés. Jeunes adultes (3 mois) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

120 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une IRM puis une chirurgie du cerveau par stéréotaxie de deux à quatre heures pour implanter des électrodes de stimulation profonde ou injecter des vecteurs viraux, avant d'être mis à mort pour des analyses. Le porteur justifie le recours au porc en invoquant l'"éthique spéciste actuelle" qui interdit ces approches invasives chez l'humain, et conclut à la nécessité de l'animal. Il retient le porc pour la proximité de son cerveau avec celui de l'humain en taille et en structure.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde est une procédure neurochirurgicale souvent pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement. La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans la structure cible (dont le mécanisme n'est pas entièrement compris) pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la maladie et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Toutefois le développement de nouvelles sondes de stimulation cérébrale capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs viraux tout comme la stimulation cérébrale reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Des études précliniques sont nécessaires pour valider ces outils (sondes de stimulation ou vecteurs viraux) avant de puvoir les utiliser chez les patients. Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs viraux dans le cadre de la thérapie génique et d’autre part de nouvelles sondes de stimulation cérébrale chez le porc. Les deux approches pouvant être combinées en conditions proches de la clinique avant leur utilisation chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un médicament ou d’un nouveau dispositif médical, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles techniques sur les animaux visant à améliorer l’impact de la stimulation cérébrale dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, épilepsie...).

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : examens d’imagerie non-invasifs par IRM (durée 2-4 heures), une chirurgie stéréotaxique (identique à celle réalisée chez le patient) pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration de vecteurs viraus de thérapie génique sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). Des prélèvements pourront être réalisés (sang) lors de l'opération sous anesthésie générale (30 secondes). En fonction du test réaliser, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’une à deux semaines après la chirurgie, de l’imagerie et d'enregistrements electrophysiologiques afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. L’ensemble de ces complications sera pris en charge par une prophylaxie adaptée. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Bien que les vesteurs viraux pour la thérapie génique soient connus pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter d'éventuels effets inattendus.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet concerne exclusivement une utilisation du porc. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le porc (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale) apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 6 animaux par étude en moyenne, soit un total de 120 animaux sur 5 ans maximum. Les vecteurs viraux pour la thérapie génique auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical, la chirurgie implantatoire ne concerne qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des mâles comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors de l'opération, l'hydratation ou la fourniture d'antiarythmiques est assurée en permanence. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le porc a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du porc est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Le stade de développement de l'animal est Porc, jeune de 35-40kg environ (environ de 3-4 mois). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant cinq à quinze semaines à une alimentation riche en graisses et en sucre, avec des prélèvements de sang à la queue, des injections de glucose et d'insuline et une échocardiographie sous anesthésie. Le porteur décrit une obésité et un prédiabète induits, puis la mise à mort pour prélever le cœur et le foie et constituer une biobanque. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour ce projet de physiologie intégrée et retient des souris de cinq mois pour majorer l'atteinte cardiaque.

Objectifs

Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Le projet consiste à analyser un modèle de cardiomyopathie diabétique chez la souris induit par une alimentation riche en graisse et en sucre, afin d’en comprendre les mécanismes et d’identifier de nouvelles potentielles pistes thérapeutiques. Plus particulièrement, cette étude vise à : 1) étudier l’impact de l’âge et du sexe sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie de la cellule, dans le développement du diabète au niveau du foie et du cœur et 2/ identifier les acteurs au niveau moléculaire en réalisant une analyse comparative entre 6 laboratoires européens pour identifier l’impact des conditions d’élevage dans les laboratoires.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de préciser les altérations de la communication entre réticulum et mitochondries au cours du diabète de type 2 et de la cardiopathie diabétique selon l’âge et le sexe, afin d’établir son rôle comme cible thérapeutique pour tous les patients ou seulement des sous-groupes, en vue d’une médecine personnalisée. Ce projet permettra également d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de la cardiomyopathie diabétique car indépendantes des conditions d’élevage ou du technicage des échantillons, dans le cadre d’un projet multi-établissements et via des analyses comparatives à large échelle des mécanismes moléculaires. A plus long terme, nos résultats permettront d’envisager de nouveaux traitements pour les patients

Procédures

Les souris recevront une alimentation riche en lipides et en sucrose pendant 5 ou 15 semaines qui va induire une prise de poids sans altérer leur mobilité sur la durée de l’étude. Une fois par mois et lors des test métaboliques, les souris sont mises à jeun 6 heures et soumises à des prélèvements sanguins de petits volumes au niveau de la queue pour les mesures de glycémie sous analgésie. Ces prélèvements sont au nombre maximum de 15 répartis sur 15 semaines, selon les durées de régime et leur durée n’excèdera pas 30 secondes chaque fois. Lors de chaque test métabolique, les souris sont soumises à une injection (glucose ou insuline) au niveau de l’abdomen (

Impact sur les animaux

Suite à l’alimentation riche en lipides, les souris vont développer une obésité et un prédiabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder à la mangeoire et que leur prédiabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner. Au cours du test de tolérance au glucose, une hyperglycémie transitoire est induite. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors du test de tolérance au glucose revient à la normale au bout de 90 minutes. Au cours du test de tolérance à l’insuline, certaines souris sont susceptibles de présenter une hypoglycémie transitoire qui revient à la normale lorsqu’on redonne accès à la nourriture aux souris. Les injections intrapéritonéales associées à ces différents tests peuvent entrainer, de même que les prélèvements sanguins, une douleur transitoire, prise en charge par ailleurs.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes d’intérêt. Ces prélèvements d’organes sont nécessaires pour constituer une biobanque et analyser les mécanismes moléculaires à l’origine du développement de la pathologie. Pour accroitre notre compréhension de ces mécanismes et tirer le plus d’information de ce modèle, nous allons réaliser des analyses à large échelle sur plusieurs organes afin de mieux comprendre l’influence du métabolisme à l’échelle de différents organes sur la cardiomyopathie.

Remplacement

Il s’agit d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si la cardiomyopathie diabétique induite par une alimentation obésogène est dépendante ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en mutualisant les prélèvements des différents organes, soit 160 animaux sur 2 ans.

Raffinement

L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Le nombre d’animaux par cage est donc réduit par rapport aux conditions standard d’hébergement pour que chacune ait suffisamment de place. Les animaux sont suivis quotidiennement et la mise en place de points limites pertinents permet d'intervenir au plus tôt en cas de difficulté. Le temps de jeûne pour les mesures de glycémie et les tests métabolique est réduit au minimum nécessaire (6 heures) et est mis en place dans le début de la phase diurne, soit en période de faible activité des souris. Pour les mesures de glycémie et les tests métaboliques, les souris sont mises à jeun pendant 6 heures, puis une crème analgésiante est appliquée à l’extrémité de la queue 30 minutes avant de réaliser une incision fine à l’aide d’un scalpel pour prélever une goutte de sang (5µl). Pour les mesures successives lors des tests, la queue n’est pas retaillée mais le coagulum est ôté par un léger frottement avec une compresse stérile, qui provoque à nouveau le saignement de la queue. Une hyperglycémie transitoire est attendue lors du test de tolérance au glucose qui devrait se restaurer au bout de 90 minutes. De même une hypoglycémie transitoire est attendue lors du test de tolérance à l’insuline. Après les examens échographiques réalisés sous anesthésie générale, les souris sont placées dans une couveuse à 37°C pendant 30 minutes pour éviter toute hypothermie et leur permettre de récupérer plus facilement.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme en termes de contrôle de la glycémie et le fonctionnement cardiaque. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte (âgées de 5 mois), âge auquel le développement cardiaque est terminé. Cet âge « avancé » permet de majorer les atteintes cardiaques induite par l’alimentation et de reproduire la pathologie de cardiomyopathie diabétique chez l’Homme (intervenant généralement chez le sujet adulte).

5 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort à l'issue. Ils reçoivent trois prises orales de calcium, quinze prises de sang à la jugulaire sur animal vigile et six prélèvements d'urine, pour adapter au chien un test de charge calcique existant chez l'humain. Deux chiens reproducteurs sont conservés à ce titre et les trois autres pourront être proposés à l'adoption, après réutilisation dans d'autres études. Le porteur décrit une surveillance du calcium sanguin et des félicitations après chaque geste, et présente le test comme un outil de prévention des calculs urinaires.

Objectifs

Les calculs urinaires sont fréquents chez le chien et le chat. Parmi les différents types de cristaux, ceux d’oxalate de calcium sont très fréquents (47% chez le chien, 38 % chez le chat). Ces cristaux ou calculs peuvent être consécutifs à une augmentation de la concentration en oxalate et/ou en calcium dans les urines, dont la cause est peu recherchée en médecine vétérinaire. Pourtant, les affections liées à ces cristaux ne sont pas traitables médicalement et la mise en place de mesures préventives par la prise en charge de facteurs favorisants aurait une place essentielle dans leur gestion médicale. Parmi les facteurs favorisants, figure l’augmentation de l’activité de la glande parathyroïde, qui sécrète alors trop de parathormone, une hormone qui augmente la quantité de calcium dans le sang, et par conséquent dans les urines. Le test de charge calcique, aussi dénommé test de Pak, a été développé chez l’Homme pour explorer l’origine de cette trop grande quantité de calcium dans les urines, en observant la réponse métabolique face à un apport de calcium. Ce projet vise à adapter ce test au chien. Cela permettra ensuite d’étudier sa potentielle contribution à l’exploration des mécanismes sous-jacents à une augmentation de la quantité de calcium dans les urines. Il pourrait également se révéler intéressant lors de l’exploration d’une augmentation de la concentration sanguine de calcium de manière générale, notamment lors de valeurs sanguines de parathormone équivoques.

Bénéfices attendus

Explorer plus précisément le métabolisme calcique d’animaux ayant présenté des calculs d’oxalate de calcium permettrait de trouver des stratégies préventives adaptées à l’animal en fonction de l’origine de ces calculs, pour limiter le risque de récidive.

Procédures

Les procédures réalisées sur 5 animaux seront : - Trois prises orales de 10 mL - Quinze prises de sang de 5ml par prélèvement seront réalisées à la veine jugulaire sur chiens vigiles. - Six prélèvements d’urine seront réalisés sur chien vigile (par sondage et/ou cystocentèse) selon la faisabilité - Une mise sous perfusion suite à la procédure, si nécessaire selon les résultats biologiques

Impact sur les animaux

Nuisance médicale de l’administration de calcium par voie orale: risque modéré. Nuisance médicale des prélèvements sanguins et urinaires : risque faible. Nuisance stress physique : risque faible. Nuisance faim et soif : risque faible.

Devenir

Certains animaux utilisés dans cette procédure sont des chiens reproducteurs qui seront donc conservés pour cette raison. Les autres chiens pourront être proposés à l'adoption.

Remplacement

Ce projet vise à appliquer un test de charge calcique connu chez l’Homme à l’espèce canine. Il doit donc nécessairement impliquer des chiens vivants.

Réduction

Les chiens participant à ce projet seront réutilisés après d’autres études expérimentales avant d’être proposés à l’adoption ou réutilisés comme reproducteurs. Le nombre de 5 chiens a été déteriminé comme nécessaire et suffisant pour permettre d’objectiver un effondrement de la parathormone après administration de calcium.

Raffinement

Les gestes techniques seront effectués par des personnels formés et pratiquant couramment ce type de geste. Pour chacun des gestes pratiqués, une attention particulière sera portée au confort de l'animal, et le temps nécessaire sera pris pour rassurer le chien. Après chaque geste technique, le chien sera félicité par la voix et des caresses. A la fin de chacun des protocoles, une friandise sera donnée à chacun des chiens. La concentration sanguine en calcium sera étroitement surveillée et si celle-ci dépasse la valeur de 1.40 nmol/l ou augmente de plus de 20% par rapport à la valeur initiale, une perfusion sera mise en place. Les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'interactions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.

Choix des espèces

S'agissant de mettre au point un test diagnostique pour des chiens, le projet sera mené dans cette espèce. Les chiens utilisés seront des chiens adultes, car ce test s’adressera à des chiens adultes, et afin d’éviter le biais de la croissance sur le métabolisme du calcium et du phosphore. Un bilan de santé sera effectué sur chacun des chiens avant son inclusion dans le protocole.

99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous la peau et dans le derme de composés myorelaxants candidats, puis sont mis à mort pour l'analyse histologique des sites d'injection. Le porteur qualifie ces injections de "brèves, indolores et peu stressantes" alors qu'il déclare par ailleurs une douleur liée à l'injection et une gêne en cas d'inflammation. Il justifie l'usage du rat par la continuité avec ses études de toxicité antérieures et écarte les modèles cellulaires, jugés inadaptés à son développement.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de déterminer la bonne tolérance de nos composés après injections sous-cutanées ou intradermiques. Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, sous la peau (injection sous-cutanée) et dans les couches supérieures du derme (injection intradermique). L'observation est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (molécule la plus active et la plus intéréssante) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes :

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection s.c. / i.d. = 6 injections, durée 1 min / animal. - Pesée des animaux = maximum 5 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 2.5 minutes / animal. - Observation des réactions = 1 fois / jour => 30 sec / animal.

Impact sur les animaux

Ces molécules ont déjà été injectées en intramusculaire, sans avoir provoqué le moindre signe clinique (macroscopique ou en analyse histopathologique). Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des molécules ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection ; une douleur liée à l’injection sous-cutanée ou intradermique ; une gêne si inflammation des tissus.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les sites d’injections seront prélevés pour des analyses histopathologiques.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Des modèles in vitro d'irritation locales existent bien mais ne sont pas adaptés dans notre developpement, en effet, la production d'anticorps anti-drug necessite et impliquent le système immunitaire de complet de l’hôte, ainsi aucun modèle in vitro ne peut remplacer ce système.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis). Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 3 animaux / doses / type d’injection. De plus, les 2 flancs des animaux étant utilisés , ceci nous permet de réduire le nombre d’animaux en maximisant le nombre de site/composé (n=6/dose)

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les injections intradermiques et sous cutanée dans la peau du flanc, sont réalisés sous contention par un expérimentateur entraîné, et les observations sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux.

Choix des espèces

Nos études précédentes (preuve de l’efficacité de nos molécules et étude de toxicité GLP) ont été réalisées chez le rat. Ainsi, par continuité avec ces études, notamment sur les analyses histologiques, il nous semble important de continuer sur ce modèle. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis par continuité avec nos études précédentes fonctionnel et notre étude GLP de toxicité

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection du produit dans le cerveau ou la moelle épinière, par voie intracrânienne, intrathécale ou intraveineuse, puis sont mises à mort au plus tard soixante jours après pour prélever leurs tissus. Le porteur indique des douleurs post-opératoires possibles, un saignement lors de la descente de l'aiguille, une perte de poids ou un décès sous anesthésie, et décrit un protocole d'analgésie. Il conclut à l'irremplaçabilité de la souris, aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau, pour optimiser une thérapie génique visant les maladies neurodégénératives.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles stratégies sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches se trouve la thérapie génique. Elle utilise la génétique pour soigner ou prévenir la maladie. L’objectif est de délivrer aux cellules malades un gène à action thérapeutique (transgène) qui permet de remplacer la protéine défectueuse à l’origine de la maladie. Ce gène médicament est transporté dans les cellules grâce à un virus modifié (vecteur viral) dont les caractéristiques peuvent permettre de cibler plus ou moins spécifiquement les cellules malades. Le projet « Optimisation de l’expression d’un transgène sur modèle murin par modulation du sérotype du vecteur thérapeutique et du site d’injection en vue d’une application en thérapie génique pour les maladies neurodégénérative » a pour but de déterminer les conditions optimales d’administration (site d’injection et spécificité du vecteur médicament) pour permettre d’augmenter l’efficacité du traitement de thérapie génique en vue d’une application à l’homme. Nous testerons différents vecteurs médicaments ainsi que différents sites d’injection et testerons leur efficacité. Cette optimisation permettra d’ajuster au mieux la thérapie aux patients en ciblant de manière plus spécifique les cellules malades et en déterminant la meilleure voie. Les deux approches combinées (ciblage des cellules malades et choix de la voie d’administration) permettront d’améliorer considérablement l’efficacité de la thérapie tout en réduisant de manière significative les risques liés à l’utilisation de virus en diminuant la dose utilisée.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de : - déterminer la meilleure voie d'administration pour le traitement de maladie neurodégénérative, - déterminer la dose de virus utile pour un traitement avec pour objectif de réduire cette dose au maximum, - déterminer une stratégie thérapeutique qui réduirait le délai pour envisager une application à l’homme.

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Deux interventions seront effectuées sur chaque animal, l’une au moment de l’injection (IC - Intra cranienne, injection dans le cerveau), ICM - Intra Cisterna Magna, injection dans la grande citerne, cavité à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre, IT - Intrathécale, injection au niveau de la moelle épinière par injection entre les vertèbres, ICV - IntraCérébroVentriculaire, injection dans les ventricules du cerveau, IV - Intraveineuse, injection dans le système veineux), l’autre au moment de l’euthanasie au maximum 60j post-injection. Pour les injections IC, ICM, IT, ICV une intervention inférieure à 30 minutes animal endormi, avec prise en charge analgésique 30 minutes avant la chirurgie sera effectuée. Afin d’éviter la douleur, post-chirurgie, les animaux reçoivent l’administration d’analgésique dans les 48 heures suivant la chirurgie. Pour l’injection IV une intervention de moins de 5 minutes par animal sera réalisée (5 minutes pour anesthésie et injection avec un temps d’injection de 20 secondes maximum). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les tissus pour analyses.

Impact sur les animaux

Cette étude ne devrait pas engendrer de nuisance ou d’effet indésirable pour les animaux (surexpression modérée des différentes protéines et un temps d’expression suffisamment court pour ne pas engendrer de toxicité à long terme). L'utilisation d'antalgique (buprénorphine) permettra de minorer les éventuelles douleurs post opératoire liées : (1) à la manipulation des animaux (placement sur appareil de stéréotaxie), (2) à l’injection (réalisation de trepan pour l'Intra Cranienne et l'Intra Cérébroventriculaire, chirurgie pour injection dans la Cisterna Magna et en Intra Thécale), (3) à un saignement suite à une lésion d’une artère ou d’une veine lors de la descente de l’aiguille au site d’injection, (4) à une perte de poids liée à l’intervention et/ou chirurgie ou un décès dû à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin procédure expérimentale pour les prélèvements et leurs analyses afin de pouvoir répondre a la question scientifique de ce projet.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles.

Réduction

Des résultats précédents nous ont permis d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités. Le nombre d’animaux utilisés est donc optimisé pour obtenir des résultats statistiques. La composition des groupes d’étude a été faite pour utiliser un nombre minimal d’animaux (6 animaux, un seul sexe étudié car aucune variabilité liée au sexe n’est attendue permettant ainsi de ne pas injecter d’animaux supplémentaires pour homogénéiser le ratio sexe F/M). Leur nombre (338) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. Un groupe contrôle de 12 animaux servira pour l’ensemble de l’expérience. En cas de problème pour l’un des groupes injectés (tel qu’un décès lors de l’anesthésie par exemple), un animal du groupe contrôle sera utilisé en remplacement, ainsi aucun animal supplémentaire ne devrait être ajouté à celui indiqué précedemment pour finaliser le projet. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Un plan statistique complet a été rédigé et validé. L’analyse statistique sera réalisé à l’aide du logiciel statistique informatique.

Raffinement

Les animaux seront regroupés par groupes de 6. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection de lidocaïne (anesthésique local) et par protocole analgésique ratifié par le vétérinaire du service pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Toute manipulation de vecteurs thérapeutiques se fait dans les conditions optimales. Les animaux seront hébergés en zone confinée du moment de l’injection des vecteurs thérapeutiques jusqu’à leur euthanasie. Un environnement enrichi sera garanti aux animaux, : carré de coton ou des lamelles de kraft pour la nidification. Un igloo sera ajouté dans chaque cage. Tout au long de la vie des animaux un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris. Notre étude a pour but d’étudier la biodistribution, un modèle « complet » animal est donc indispensable. Le modèle murin est le modèle de référence pour des études préliminaires. Les animaux utilisés seront injectés à P50 et mis à mort 2 mois après injection. Ce projet a pour objectif de déterminer la voie d’administration optimale en fonction du sérotype et du transgène choisi. Il servira de référence en vue d’une application de cette stratégie sur l’humain adulte. Des animaux adultes sont donc utilisés. L’expression de nos vecteurs est optimale 4 à 6 semaines post injection, nous avons choisi de conserver les animaux 8 semaines post injection pour que chacun des animaux injectés exprime la protéine d’intérêt de manière optimale.

24 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la gastro-entérite transmissible au moyen d'une inoculation oro-nasale, puis subissent écouvillonnages et prises de sang quotidiens, et sont mis à mort dès l'apparition de la diarrhée et des vomissements pour prélever leurs tissus. Le projet affirme vouloir évaluer si des organoïdes porcins peuvent remplacer l'expérimentation animale, tout en présentant le recours aux porcs comme "indispensable" pour cette validation. Le porteur retient des porcelets de plus de trois semaines parce que l'infection y provoque des symptômes moins sévères que chez les plus jeunes.

Objectifs

Ce projet d’expérimentation animale rentre dans le cadre d’une thèse dont le but est d’analyser l’apport des organoïdes porcins dans l’étude des interactions hôtes-pathogènes. En effet, les organoïdes sont des cellules qui s’auto organisent en 3 dimensions et qui reflètent la diversité cellulaire que l’on retrouve au sein d’un organe. Ces organoïdes grâce à leur structure et leur composition cellulaire pourraient être des méthodes alternatives à l’expérimentation animale. Ils permettraient de réduire l’utilisation des animaux placés en expérimentation et répondre à la règle des 3R qui est Réduction, Remplacement et Raffinement. Le virus de la gastro entérite transmissible (GET) a été choisi comme modèle de pathogène dans notre étude. L’expérimentation animale, qui utilisera 24 animaux, a donc pour but d’avoir des résultats concernant l’expression des gènes mais aussi de la réponse immunitaire et antivirale que l’on retrouve In Vivo, c’est-à-dire chez l’animal. Ces résultats nous permettront de comparer avec ceux retrouvés dans les organoïdes et dans les modèles cellulaires. Ainsi, nous pourrons évaluer si les organoïdes sont de bons modèles alternatifs à l’expérimentation animale, pour l’étude des interactions entre l’hôte et le vGET dans un premier temps et aux différents coronaviroses dans un second temps.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à partir de l’expérimentation animale au niveau de l'expression des gènes et des réponses immunitaires et antivirale seront comparés aux résultats acquis sur organoïdes et culture cellulaire pour connaître l’apport des organoïdes porcins dans l’étude des interactions hôte pathogène et envisager la possibilité d’une réduction de l’utilisation d’animaux.

Procédures

Les animaux subiront une inoculation par voie oro-nasale. Des prélèvements nasaux, salivaires et de fèces se feront par écouvillonnage et prises de sang seront réalisés une fois par jour pendant quatre jours au maximum.

Impact sur les animaux

Lors des inoculations intranasale et orale, l'animal pourra ressentir une gêne. Lors des prélèvements nasaux et des prises de sang, les animaux devraient ressentir une légère douleur. Les écouvillonages salivaires et de fécès provoqueront une légère gêne chez l'animal. L’infection pourrait engendrer dès le premier jour des symptômes de diarrhées et vomissement. Cependant dès le début des symptômes les animaux seront mis à morts.

Devenir

Les porcs seront mis à morts afin de prélever les tissus.

Remplacement

Le but du projet est d'évaluer si les organoïdes sont de bons modèles expérimentaux pour étudier les interactions moléculaires hôtes pathogènes. Pour cela notre étude comparative doit prendre en compte également le contexte naturel d'infection, le porc, qui représente l'environnement physiologique complet . C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est ici indispensable pour déterminer si les organoïdes sont de potentielles méthodes alternatives à l’expérimentation dans le cadre de l’étude des interaction hôte-pathogène.

Réduction

Chaque groupe de porcs est constitué de 4 individus ce qui nous permettra d'identifier des gènes qui sont fortement modifiés après infection (la puissance statistique devrait nous permettre de valider ces gènes).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes stables à partir du sevrage et tout au long d’un essai avec enrichissement du milieu. Ils auront accès à volonté à de l’eau et à de la nourriture. Une lampe chauffante et une plaque de couchage seront mis à leur disposition. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de déceler la survenue de points limites et d’y remédier.

Choix des espèces

Etant donné que seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la GET et que nous voulons démontrer l’apport des organoïdes porcins, l’utilisation des porcs est indispensable. Utilisation de porcelets de 4 à 6 semaines d’âge pour que les porcelets soient sevrés. De plus, en comparaison avec les porcelets de moins de 2 semaines dont l'infection provoque des symptômes sévères, les porcelets de plus de 3 semaines d'âge bien qu'ils soient toujours sensibles à l'infection au virus de la GET, possèdent une probabilité d'apparition et d'intensité des symptômes (vomissement, diarrhée) plus faibles.