Procédures modérées

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou un carcinogène associé à un produit inflammatoire dans l'eau de boisson pour déclencher un cancer du côlon, puis du tamoxifène, avant leur mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs. Le porteur indique que l'induction du cancer colorectal peut provoquer prolapsus et perte de poids, et affirme que seul l'animal permet une approche intégrée.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

1 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections quotidiennes de dérivés d'antidiabétiques et d'immunothérapies, puis des prélèvements de sang, pour évaluer l'effet de ces combinaisons sur le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas. Le porteur indique surveiller les tumeurs qui saignent ou suintent et mettre à mort en l'absence d'amélioration. Il affirme que le passage par l'animal est une "étape cruciale" avant l'humain.

Objectifs

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus dans le traitement du mélanome (cancer des mélanocytes qui sont les cellules de la peau responsables de la pigmentation), à l’aide de thérapies ciblées. Mais après une courte période de rémission, le mélanome acquiert, dans presque tous les cas, une résistance contre la drogue. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles molécules candidates pour la mise en place de thérapies spécifiques. Pour ce faire, nous avons fait synthétiser plusieurs dérivés d'anti-diabétiques (composés connus pour leurs propriétés anti- mélanome). Ces composés induisent la mort des cellules de mélanomes sans affecter la viabilité des cellules normales. De plus, certains de ces composés présentent des propriétés anti-invasives. Nos différentes molécules ont préalablement testé in vitro, seules les plus efficaces seront étudiées in vivo (dans un but de réduction du nombre d’animaux), afin de se placer dans un contexte plus physiologique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus avec l’inhibiteur d’une molécule retrouvée dans 50 % de mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées récemment. Mais elles ne donnent une réponse positive que dans 10 à 30% des cas. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies spécifiques et de combiner ces nouvelles molécules avec les immunothérapies déjà utilisées chez les patients, afin de voir si nos molécules sont capables d’augmenter leurs effets. Les cellules cancéreuses seront injectées en sous cutané dans des souris (souche C57B6J ou BalbC) pour observer l’effet des composés sur la croissance de tumeurs primaires (mélanome, cancer du pancréas et du côlon), en combinaison ou non avec les immunothérapies. Nous étudierons aussi la formation et le développement de métastases et micro- métastases pulmonaires sur les souris. Et nous pourrons observer l’effet des différents composés en combinaison ou non avec les immunothérapies sur la croissance de tumeurs non primaires. Nos composés étants des dérivés d’antidiabétiques, il serait intéressant de comparer les effets du composé antitumoral le plus efficace sur la résistance à l’insuline et sur l’intolérance au glucose avec ceux de la metformine (médicament de référence).

Procédures

1 seule Injection sous cutanée ou intraveineuse (environ 30 sec). Injection intrapéritonéale quotidienne (environ 10 sec) pendant maximum 4 s de traitement. Anesthésie gazeuse au vetflurane tous les 4 jours (environ 15 min). Prélèvement d'une goutte de sang à la queue, 7 fois sur une durée de 2 heures après une seule incision au début de l’expérience. Le prélèvement prend environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les Injections faites sur les animaux,les sites sont surveillés quotidiennement. Il peut y avoir une inflammation des sites, dans ce cas on traitera à la vétédine quotidiennement et si il n'y a pas d'amélioration au bout de 3 jours, la souris sera mise à mort. Concernant, l'aspect et la taille des tumeurs: il arrive qu'une tumeur saigne ou suinte, dans ce cas traitement à la vétédine quotidien et sans amélioration au bout de 3 jours, l'animal est mis à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale

Remplacement

Après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs composés antidiabétiques ayant des effets anti-tumoraux en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces drogues sont plus efficaces sur modèles de mélanome et de cancers colique et pancréatique chez la souris . Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Pour la procédure 1, seules 2 expériences ont suffit pour avoir des résultats statistiquement significatifs. celà nous permet de rajouter une procédure pour mieux caractériser notre dérivé antidiabétique sans avoir besoin de rajouter des animaux dans notre PEA.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Les points limites que nous avons définis sont prédidifs et suffisamment précoses pour éviter toute souffrance ou mal-être des animaux. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établie ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des molécules que nous voulons tester, un atout très important. Pour toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte (6 semaines). Elles seront commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

954 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de tumeur du péritoine puis des gavages et injections d'antibiotique et d'antiangiogénique, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour tester un traitement du pseudomyxome évitant une chirurgie lourde. Une partie des tumeurs est regreffée à d'autres souris pour entretenir le modèle. Le porteur affirme que cette tumeur, faite de gélatine, ne peut être étudiée in vitro.

Objectifs

Le but de ce nouveau projet est de tester l’effet combiné d’anti-angiogéniques et d’antibiotiques sur l’évolution du pseudomyxome et de ce fait pouvoir déterminer un traitement pour les patients qui ne peuvent supporter une chirurgie lourde.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir déterminer un traitement non invasif qui inhiberait l'évolution du pseudomyxome afin de traiter les patients qui ne peuvent pas supporter une chirurgie lourde et donc le traitement de référence.

Procédures

Les souris sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3%), après une injection sous cutanée locale de Lidocaïne (1mg/kg), seront soumis à une greffe intrapéritonéale d'une tumeur de pseudomyxome(1 fois 5-10min). Puis les animaux vigiles recevront en intrapéritonéale ou par gavage 2 fois par semaine pour l'anti-angiogénique (ou le solvant), et du lundi au vendredi pour le sorafenib et l'antibiotique (ou le solvant) (30secondes à chaque administration). A la fin de l'expérience, 4souris par groupe seront anesthésiées par un mélange dekétamine (80 mg/kg) et de xylazine (16 mg/kg) après une injection en sous-cutanée de buprénorphine 30 minutes avant (0,1mg/kg) (1fois 30secondes) pour l'examen de microangiographie (20- 25minutes). Enfin, les autres souris auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les antiangiogéniques car ils ont déjà été utilisés dans d'autres projets et sont utilisés à des doses non toxiques. Concernant les antibiotiques, nous n'attendons pas d'effets indésirables non plus mais comme chez l'homme, le risque d'effets notamment sur le système digestif n'est pas à écarté. Nous utiliserons les mêmes doses qui sont utilisées chez l'homme, rapporté au poids de la souris. Cependant, la surveillance quotidienne des animaux et plus précisément des points comme leur poids, leur apparence, leur comportement 2 fois par semaine notifiés dans un cahier de suivi des animaux nous permettront de déterminer si les traitements ont un effet néfaste sur la santé des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la 1ère procédure, par dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la deuxième procédure, dès que le poids aura atteint 33g. A la fin de la 1ère procédure, nous utiliserons le sang et la tumeur pour des analyses post-mortem; pour la 2ème procédure, une petite partie de la tumeur obtenue sera greffé à 3 autres souris pour maintenir le modèle.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin. En effet, cette tumeur est très peu cellulaire car essentiellement formée de gélatine, nous ne pouvons l’étudier in vitro. Il est nécessaire de reproduire la maladie par un modèle de greffe orthotopique par greffe de fragments de pseudomyxome en intrapéritonéal sur des souris nudes.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur les modèles de Pseudomyxomes (cancer rare du péritoine) et de la variabilité observée de ces derniers, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour tester une expérience. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Vu qu'il y a un risque de mortalité lié à l'intervention permettant la greffe de pseudomyxome, les groupes seront composés de 12 souris. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 2 à 3 groupes de traitement quand cela sera possible. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe Contrôle avec les groupes traités par les combinaisons.

Raffinement

Les souris auront une période d'acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux seront observés quotidiennement. Afin d'effectuer la greffe intrapéritonéale de pseudomyxome, les animaux recevront une injection d'analgésie locale et seront sous anesthésie générale gazeuse. Avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale. Concernant l'examen de microangiographie, les animaux seront aussi sous anesthésie générale. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Nous utilisons l’espèce souris pour notre projet car nous avons besoin d’animaux immunodéficients (cas des souris NOD ou nude). En effet, dans ce cas les tumeurs greffées ont la possibilité de se développer sans risquer un rejet. Aussi, les essais pré-cliniques sur la souris dans le cas du pseudomyxome permettent d’obtenir des informations satisfaisantes pour l’Homme. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.

68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une occlusion de l'artère cérébrale provoquant un accident vasculaire, suivie d'une IRM, pour tester une molécule ciblant un transporteur du folate. Le porteur indique que l'AVC entraîne perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de dix pour cent des opérées peuvent mourir d'œdème ou d'hémorragie. Il affirme que l'évaluation d'un traitement suppose un modèle reproduisant l'ischémie puis la reperfusion.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact d'une protéine de transport nommée RFC1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire. RFC1 (Reduced Folate Carrier 1) est un transporteur membranaire du folate, notamment au niveau de la barrière hématoencéphalique (BHE). Les variants génétiques (polymorphismes) de RFC1 jouent un rôle dans la survenue des AVCi chez l’Homme, ce qui suggère un rôle de RFC1 dans la pathogenèse de l’AVCi. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible suggèrent un effet délétère de RFC1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de RFC1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une mise sous silence transcriptionnelle de RFC1 par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. L’objectif spécifique de cette DAP est d’évaluer l’effet de l’administration intracérébrale d’une molécule thérapeutique ciblant RFC1 sur la taille de la lésion cérébrale et l’intégrité de la BHE. Le groupe contrôle recevra une molécule inactive. Notre hypothèse est que ce silençage génique de RFC1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la BHE.

Bénéfices attendus

Si l’effet neuroprotecteur du silençage de RFC1 est prouvé, cela validera RFC1 comme une nouvelle cible thérapeutique, et il sera possible de tester des molécules permettant d’inhiber RFC1 et de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVCi.

Procédures

L’injection d’un ARN interférent (siRNA) in situ nécessite une injection stéréotaxique, réalisée sous anesthésie générale (

Impact sur les animaux

Suite à l'accident vasculaire cérébrale, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (

Devenir

les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires post-mortem (imagerie ex vivo haute-résolution, immunohistochimie).

Remplacement

Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo (notamment sur microvaisseaux cérébraux isolés) et montrant le rôle de la protéine RFC-1 dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ dédié aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en per-occlusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (

Choix des espèces

Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de lésion du cerveau par injection d'une toxine et la pose d'un cadre métallique sur le crâne, puis des séances d'imagerie et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier la connectivité cérébrale dans deux modèles de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que la chirurgie de lésion réduit la motivation à se nourrir pendant une semaine environ. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la complexité du cerveau, ce qui rend selon lui le modèle animal "indispensable".

Objectifs

La maladie de Parkinson touche jusqu'à 4% des personnes âgées 65 ans ou plus et est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Elle est causée par une perte de neurones dopaminergiques entraînant des symptômes moteurs et non-moteurs. La reconstitution des niveaux normaux de dopamine via l’administration d'un médicament est le traitement le plus courant de la maladie de Parkinson. Le médicament atténue de nombreux symptômes, mais pas tous, induit des mouvements musculaires incontrôlables, avec un taux d'incidence rapporté de jusqu' à 80%, après 5 à 10 ans de traitement chronique. La physiopathologie de la maladie de Parkinson et de ces mouvements incontrôlables induits par le médicament n'est pas entièrement comprise, mais des dérèglements structurels et fonctionnels des réseaux neuronaux cortico-sous-corticaux et des modifications du réseau et de la connectivité du cerveau ont été observés. Les techniques de neuro-imagerie fournissent des informations importantes sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, les mécanismes compensatoires potentiels et les effets liés au traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, si la connectivité fonctionnelle des réseaux neuronaux est modifiée en fonction de l’état de dépletion de dopamine et de sa reconstitution. Nous utiliserons une technique d'imagerie de l'échographie rapide dans un modèle murin de lésion et un modèle murin génétique de maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier une modification de connectivité fonctionelle des réseaux neuronaux et des connectivité fonctionelles dans deux modèles différents de souris de la maladie de Parkinson. Cette technique sera hautement transposable puisqu'elle mésure le même paramètre physiologique, c'est-à-dire les changements de la perfusion cérébrale, que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle clinique et puisqu'elle produira des profils de réseau en corrélation avec la progression de la maladie et la réponse au traitement. Bien que le projet proposé soit une première étape pour déchiffrer les changements du connectome dans le cerveau de souris malades par rapport au cerveau de souris saines, nous envisageons que l'imagerie pourrait être utilisée dans le développement de médicaments, comme prédicteur de l'efficacité des médicaments et pour cribler de nouveaux candidats médicaments dans des modèles précliniques.

Procédures

Certaines souris subiront une chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue et de preparation pour imagerie. Une partie des animaux sera soumise à des études d'imagerie fonctionnelle après une injection aiguë ou chronique de médicaments dopaminergiques. D'autres animaux subiront une évaluation comportementale par plusieurs tests comportmentaux. En tout, 240 souris subiront une chirurgie d'une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

Certaines souris subiront une chirurgie : le montage d' un cadre metallique sur le crane, et d'autres subiront une opération supplémentaire : la chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue. La chirurgie des lésions rendra les animaux moins motivés de se nourrir pendant environ une semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mise à mort pour des analyses de tissus post mortem. Pour la fixation du cerveau, une perfusion intracardiaque avec une solution de paraformaldehyde sera utilisée et la procédure sera realisée sous une anesthésie générale profonde. Les tissus sont prélevés sur animaux morts.

Remplacement

Remplacement : A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet. L’analyse de la connectivité sur animal éveillé n’a été mise au point à ce jour que chez la souris.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Nous estimons que N=12 animaux sont suffisants par groupe. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Raffinement : Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesia générale. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal anesthesie et vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé ; des séances d'habituation seront effectuées au préalable. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur,souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Cette étude vise à étudier la connectivité cérébrale. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux. Notre choix s’est porté sur la souris car l’étude d’imagerie par ultrasons chez l’animal éveillé a été mise au point seulement dans cette espèce. Les animaux ayant atteint un poids corporel de 30 gr (âgés d'environ 4-6 mois) seront soumis à une chirurgie d'injection intracrânienne de 6-OHDA, les tests comportementaux auront lieu 3 semaines après, pour toutes les groupes expérimentaux.

2 030 poissons de rivière vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants dans leur habitat. Ils sont capturés par pêche à l'électricité puis marqués par une puce implantée sous anesthésie, pour mesurer si une rampe à macrorugosités leur permet de franchir un obstacle. Le porteur indique que la pêche électrique peut rarement provoquer des blessures et que le marquage laisse une petite plaie à cicatriser. Une partie des poissons peut être déplacée de l'amont vers l'aval pour les forcer à remonter le cours d'eau.

Objectifs

Suite à la Loi sur l’Eau et les Milieux Aquatiques de 2006, de nouveaux classements des cours d’eau, prenant en compte la restauration de la continuité écologique, sont parus en 2012-2013. Sur les cours d’eau classés en liste 2, les aménagements qui font obstacle à la continuité écologique doivent être équipés ou gérés de manière à rétablir le franchissement des poissons (par exemple par effacement de l’ouvrage ou construction d’une passe à poissons). Parmi les différents types de passes à poissons, les rampes à macrorugosités (rampe avec des plots verticaux, organisés en quinconce qui offrent une importante diversité écoulement) constituent une solution technique intéressante en termes de franchissabilité par toutes les espèces de poissons. Ces types de dispositifs sont régulièrement mises en œuvre en France depuis 2010. Des études hydrauliques en laboratoire ont permis d’établir les critères de conception de ces rampes mais les retours d’expérience in situ sur l’efficacité biologique de ces dispositifs sont encore peu nombreux. Une première étude a été conduite récemment sur une rampe avec une pente douce (4%). L’objectif de ce projet est de mener une deuxième étude pour quantifier l’efficacité d’une rampe à macrorugosités plus inclinée (5.5%), avec un focus sur les espèces encore peu étudiées jusqu’à présent, dont les capacités de nage sont plus réduites (goujon, spirlin, chevaine, etc.). L’étude permet également d’acquérir des connaissances sur les fractions d’individus migrant selon les espèces et sur leurs conditions de migration (période, débit, température, …). Le suivi des déplacements des poissons, en approche et sur la rampe à macrorugosité, se fera par le marquage des individus à l'aide des marques de type PIT (Passive Integrative Transponder) et leur détection aux antennes RFID (Radio Frequency Identification) installées sur le site. Les poissons seront capturés dans le cours d’eau par pêche à l'électricité. Deux stratégies de pêche/marquage sont prévues : 1/ les poissons seront prélevés tout d’abord dans le tronçon entre 300 et 900 m à l’aval de la rampe, marqués et relâchés au même endroit. 2/ en cas de besoin (si la stratégie 1 n’apporte pas de résultats recherchés suite à la première année d’étude), les poissons seront prélevés dans le tronçon à l’amont de la rampe à macrorugosités, marqués puis relâchés à l’aval de la rampe. Cette translocation force les poissons à remonter rapidement le cours d’eau pour retrouver leur habitat d’origine.

Bénéfices attendus

La construction de la passe à macrorugosités peut être préconisée par les autorités administratives de l’Etat aux maîtres d’ouvrages propriétaires des obstacles pour restaurer la continuité écologique. Ce projet, de portée nationale, s’inscrit dans une démarche de validation de l’efficacité de ces prescriptions techniques (type d’équipement et son dimensionnement).

Procédures

Le projet nécessite de capturer les poissons par pêche à l’électricité (jugée de sévérité légère, temps d'exposition est inférieur à 5 secondes) et de les marquer par PIT tags (Passive Integrative Transponder, procédure chirurgicale de sévérité modérée d'une durée inférieure à 15-20 secondes) sous anesthésie (d'une durée d'environ 10 minutes, de l'induction jusqu'au réveil complet), par des équipes formées et expérimentées.

Impact sur les animaux

1/ La pêche à l’électricité est la technique de capture la plus efficace pour obtenir rapidement le nombre de poissons nécessaire tout en réduisant au maximum les dommages sur les individus. L’immobilisation des individus est de très courte durée (quelques secondes). Les effets indésirables plus graves (blessures internes ou externe) peuvent subvenir mais sont rares, et tout est mis en œuvre pour les minimiser (réglage de l’engin de pêche, retrait rapide des individus hors champs d’action). 2/ Plusieurs études ont démontré que le marquage avec des marques PIT n’a pas d’effet sur la survie des poissons, pas ou peu d’effet sur leur croissance et pas d’effet sur leur capacité de nage. Les effets indésirables à court terme, suite au marquage, sont : le stress de la manipulation, la douleur de l’acte d’incision chirurgicale produisant une petite plaie (longue entre 2-5 mm) à cicatriser. Pour réduire ces nuisances du marquage, il sera effectué sous anesthésie générale de l’individu. La taille de la marque utilisée (12, 13, 23 ou 32mm) sera adaptée à la taille des poissons. Les poissons seront rapidement libérés en milieu naturel pour réduire le stress engendré par la captivité et les manipulations.

Devenir

L’étude est conduite en milieu naturel. Tous les animaux seront relâchés vivants dans leurs habitats d’origine, ceci étant un prérequis à l’étude.

Remplacement

Des études hydrauliques antérieures ont permis d’établir certains critères de conception des rampes à macrorugosités mais le comportement réel des poissons dans ces dispositifs ainsi que leur franchissement n’a encore pas été suffisamment étudié. Il est aujourd’hui nécessaire de mener plus de tests directement sur les poissons présents naturellement dans les cours d’eau concernés, afin de valider la performance de ces dispositifs pour rétablir la continuité piscicole.

Réduction

L’objectif, pour mener dans les bons termes l’évaluation de la rampe à macrorugosités, est de pouvoir détecter une centaine de tentatives de franchissement par espèce cible et individus de différentes tailles. 4 espèces seront étudiées en priorité (barbeau, chevaine, goujon et ablette). Pour calculer le nombre d’individus nécessaire à marquer en aval de l’ouvrage, nous avons utilisé leurs taux de migration observés au cours de l’étude précédente : -barbeaux (taux de migration env. 50%) : 200 individus seront marqués -chevaines (taux de migration env. 30%) : 330 ind. -goujons (taux de migration env. 20%) : 500 ind. -ablettes (taux de migration inconnu mais supposé à 25%) : 400 ind. seront marqués Compte tenu des atteintes aux animaux jugées faibles et sachant que l’information sur le franchissement des autres espèces (non prioritaires mais présentes sur le site d’étude) apporterait de nouvelles connaissances utiles, leur suivi n’est pas écarté d’office. Par expertise et extrapolation de l’information provenant des sites proches, on s’attend à contacter par pêche électrique les espèces telles que : gardon, vandoise, toxostome, perche fluviatile, truite fario, anguille, brêmes, loche, vairon, bouvière, rotengle, hotu, etc. Leur nombre maximal à marquer a été défini par expertise à 200 au total, sachant que dans l’étude précédente, leur nombre a été inférieur à cet objectif. En aval de l’ouvrage, il est donc prévu de marquer au maximum 1630 individus sur la durée du projet, appartenant à toutes les espèces présentes sur le secteur. Pour la translocation des individus, le même objectif de 100 individus par espèce cible transloquée de l’amont vers l’aval, a été retenu (4 espèces prioritaires * 50 ind. * deux occasions de translocation = 400 ind. au total). Il est à noter que la translocation est optionnelle, et sera utilisée au cours du projet uniquement si jugée nécessaire pour l’évaluation de la rampe.

Raffinement

Méthodes de raffinement utilisées : - Les poissons pêchés seront rapidement retirés du champ électrique et placés dans des seaux d’eau (équipés d’aérateur) pour leur récupération immédiate. Ils seront ensuite transportés et stockés dans plusieurs viviers (60x40x40 cm) perforés et immergés dans la rivière en attendant le marquage et la fin de la pêche. - L’implantation des transpondeurs et la biométrie se feront sous anesthésie générale, il n’y aura pas de manipulation à sec. - Surveillance régulière (visuelle et à l’aide d’une sonde multiparamétrique) et maintien de bonnes conditions d’anesthésie et de réveil (température proche du cours d’eau pêché, oxygénation de l’eau en continu avec aérateur, renouvellement d’eau fréquent) - Installation de caches (grands galets) dans les viviers de stabulation (eux-mêmes immergés dans la rivière) - Réduction du temps de captivité avec retour le plus rapide possible en milieu

Choix des espèces

Les rampes à macrorugosités sont des équipements multispécifiques, avec l’ambition de rétablir la continuité pour la grande majorité d’espèces des communautés piscicoles. Pour l’évaluation de leur efficacité, nous avons donc choisi d’utiliser les espèces de poissons de rivière, naturellement présentes à proximité de l’ouvrage étudié. Des poissons dès la taille 80-100mm (selon espèce) ont été détectés en migration lors de l’étude antérieure. De plus, des analyses statistiques ont mis en évidence l’influence de la taille sur le succès de franchissement de la rampe. Par conséquent, tous les stades marquables (tailles > 70 mm) sont visés par ce projet.

9 chiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à la colonie de l'établissement. Ils subissent trois prélèvements sanguins et une injection intraveineuse lente de fibroblastes gingivaux humains sous tranquillisation, pour vérifier l'innocuité de ce produit avant un futur essai visant le traitement de l'atopie du chien. Le porteur décrit une longue phase d'habituation avec caresses et croquettes pour réduire le stress. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne convient et que le chien, espèce cible de la mise sur le marché, ne peut être remplacé.

Objectifs

L’objectif de cette étude préclinique est d’évaluer l’innocuité (l'absence d'effets néfastes) d’une injection intraveineuse de fibroblastes (cellules jeunes, peu différenciées) gingivaux humains chez le chien, afin de tester par la suite, dans une étude clinique ultérieure faite sur chiens de propriétaires, leur efficacité dans le traitement de l’atopie (inflammation chronique de la peau). Les cellules mésenchymateuses, comme les fibroblastes gingivaux d’origine humaine ou animale, sont des produits d’origine biologique avec une très forte capacité de régénération. Des travaux expérimentaux (reconnus par des publications internationales et par l’obtention de brevets) ont montré qu’il était possible de transposer le pouvoir cicatrisant et anti-inflammatoire du fibroblaste gingival, cellule majoritaire de la gencive, à trois types de tissus très différents : les artères, la peau et l’appareil locomoteur (articulations, tendons). Ces cellules assurent la restauration de la fonctionnalité de l’organe lésé, notamment suite à une agression infectieuse, inflammatoire ou traumatique. L’utilisation des fibroblastes gingivaux humains est actuellement envisagée dans le traitement de l’atopie chez le chien. Cette maladie chronique de la peau, qui représente une des affections majeures rencontrées en dermatologie vétérinaire, résulte à la fois d'anomalies de la barrière cutanée, et d'une réaction de l'organisme à des allergènes de l'environnement (acariens de poussières de maison, pollens …), plus rarement alimentaires ou microbiens, conduisant à une inflammation chronique du tégument. L’utilisation des fibroblastes gingivaux se fera par administration intraveineuse chez le chien, et permettra de limiter voire même d’éviter une administration répétée, parfois quotidienne, de corticoïdes et d’immunosuppresseurs, habituellement utilisés dans le traitement de cette affection et ayant des effets néfastes à plus ou moins long terme. Les fibroblastes gingivaux sont déjà utilisés chez le chien et le cheval en administration intra-articulaire dans le traitement de l’arthrose chronique. Ils permettent de remplacer avantageusement la prise répétée d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, et donc d’éviter les effets secondaires associés. Cette thérapie cellulaire, utilisée en médecine régénérative, représente des options thérapeutiques innovantes et efficaces pour l’animal et pour l’Homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’innocuité (l'absence d'effets néfastes) de l’administration intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains chez le chien, pour ensuite proposer une étude clinique d’efficacité réalisée sur chiens de propriétaires atteints d’atopie. Cela permettra de construire le dossier d’autorisation de mise sur le marché de cette thérapie cellulaire chez le chien, qui sera une alternative innovante et intéressante à l’administration quotidienne de corticoïdes et/ou d’immunosuppresseurs, et donc un bénéfice pour les animaux atteints de cette pathologie chronique. Cette étude représentera en parallèle des données d’efficacité et d’innocuité dans un objectif translationnel à l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins. Il s'agit de gestes vétérinaires de routine qui se déroulent en quelques minutes. Ils recevront une injection intraveineuse lente (1 ml/kg) sur une durée de 20 minutes environ. Ils seront tranquillisés pour cette injection.

Impact sur les animaux

Les chiens pourront être stressés par le passage de leur lieu d’hébergement vers la salle d’examen où seront réalisés les examens cliniques, les prises de sang et l’injection intraveineuse. Des actions de renforcement positif seront mises en place au cours de la période d’acclimatation en amenant régulièrement chaque animal dans la salle, en le laissant au minimum 5 minutes sur la table d’examen, au cours desquelles il sera caressé par le manipulateur qui lui parlera, puis avant de quitter la salle, quelques croquettes lui seront données. Les prises de sang et la pose de la voie d’accès veineux (cathéter) seront réalisées par du personnel compétent, habilité et entrainé. Les personnes en charge des soins quotidiens des chiens, et donc connues par ces derniers réaliseront l’habituation pendant la période d’acclimatation, et seront également présentes lors des manipulations de chaque chien (prise de sang, pose de la voie veineuse, injection, …) afin de rassurer les animaux et donc de diminuer leur stress.

Devenir

A l'issue de la procédure, les chiens retourneront dans la colonie de l'établissement utilisateur.

Remplacement

L’administration intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains a été réalisée chez la souris dans une étude préalable, sans effet délétère observé. Le passage chez le chien est donc nécessaire en vue d’une obtention de mise sur le marché de cette thérapie pour cette espèce cible. L’objectif de cette thérapie cellulaire est de proposer les fibroblastes gingivaux comme traitement de l’atopie chez le chien après administration intraveineuse, aucune autre alternative n’est donc envisageable à ce stade.

Réduction

Les effets secondaires éventuels liés à une injection intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains chez le chien n’ont pas été rapportés. Ainsi nous nous sommes basés sur des études similaires disponibles dans la littérature afin de déterminer le nombre minimal et optimal d’animaux à utiliser dans cette étude. Après consultation des résultats de ces différentes équipes (utilisant des effectifs de 3 à 10 animaux par groupe, avec une moyenne de 4 à 5 chiens, groupes témoin et traité n’étant pas nécessairement équilibrés), un nombre minimum de 5 chiens pour le groupe traité et de 4 chiens pour le groupe témoin semble requis pour obtenir des données nécessaires et suffisantes pour la réalisation de tests statistiques adaptés et exploitables. Nous avons donc choisi d’utiliser 5 chiens dans le groupe traité, et 4 chiens dans le groupe témoin, afin d’inclure un nombre minimal d’animaux dans notre étude.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions de l’étude pour une durée minimale de 15 jours avant le jour d’administration de la suspension de fibroblastes gingivaux ou du soluté contrôle (J0). Les locaux d’hébergement climatisés toute l’année seront les mêmes que ceux de l'expérimentation, les animaux pourront simplement être changés de boxe pour faciliter le déroulé de l’étude. Au cours de cette période, des actions de renforcement positif seront mises en place en amenant régulièrement chaque animal dans la salle où seront réalisés les différents actes (examens cliniques, prises de sang, injection intraveineuse), en le laissant au minimum 5 minutes sur la table d’examen, au cours desquels il sera caressé par le manipulateur qui lui parlera, puis avant de quitter la salle, quelques croquettes lui seront données. Par ailleurs, cette salle est connue des chiens de l’EU, car ils y sont régulièrement manipulés pour des actes non invasifs : peignage, coupe de griffes ; il ne s’agira donc pas pour eux d’un lieu « nouveau ». Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude, et en cas d’observation anormale, le vétérinaire sanitaire de l’EU sera immédiatement averti. Les examens cliniques, les prises de sang et la pose de la voie veineuse seront réalisés par du personnel compétent et entrainé, permettant de réaliser ces actes très rapidement. Les personnes en charge des soins quotidiens des chiens, et donc connues par ces derniers réaliseront l’habituation pendant la période d’acclimatation, et la contention lors de chaque manipulation (prise de sang, pose de la voie veineuse, injection), afin de les rassurer et donc de diminuer leur stress. Une sédation légère sera réalisée, afin de diminuer le stress lié à l’injection intraveineuse lente, qui nécessitera un maintien de l’animal sur la table d’examen pour une durée de 20-25 min environ. Le cathéter sera placé une fois l’animal tranquillisé. Enfin, une surveillance clinique accrue (examen clinique complet, mesure de l’oxymétrie de pouls) sera mise en place au cours de l’administration intraveineuse de fibroblastes, puis à 1h, 2h, 3h, 6h, 24h et 48h après. Un nouvel examen clinique sera réalisé en fin d’étude à 7 jours (en plus des observations quotidiennes).

Choix des espèces

L’espèce utilisée pour cette étude est l’espèce cible de cette thérapie cellulaire, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de modèle animal actuellement pertinent ou disponible permettant une extrapolation de résultats obtenus et reproduisant la complexité d’un organisme de chien et qui pourrait être utilisés pour la demande de mise sur le marché. En outre, comme indiqué précédemment, il s’agit d’une étude préclinique règlementaire. Nous utiliserons des chiens adultes. L’atopie se déclare chez le chien adulte, généralement âgé de plus de 2 ans. Nous utiliserons donc des chiens de plus de 2 ans dans cette étude.

380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ils reçoivent de fortes doses de fentanyl ou d'autres opioïdes puis l'antidote, pour comparer les effets respiratoires et leur réversion. Le porteur indique attendre une sédation pouvant aller jusqu'au coma, une rigidité musculaire et, du fait des doses choisies, possiblement la mort. Il affirme que ces effets sur le système respiratoire ne peuvent s'étudier que sur un "animal entier".

Objectifs

Le fentanyl est un opioïde synthétique peropératoire dont l’efficacité analgésique en comparaison à l’intensité des effets secondaires est à l'origine de l'essor de son utilisation en particulier en anesthésie mais aussi dans la prise en charge de la douleur. L’utilisation du fentanyl exposerait néanmoins au risque de toxicité opioïde typique avec survenue d’un trouble de conscience et d’une dépression respiratoire ainsi qu’un risque de dépendance et d’abus. De plus, on observe une rigidité thoracique et diaphragmatique survenant très rapidement après injection, durant près de 15 min et pouvant conduire au décès rapide en l’absence de prise en charge immédiate et optimale. Il a par ailleurs été rapporté la nécessité de plus grandes doses de naloxone, l’antidote utilisé pour reverser les effets des opioïdes. Depuis récemment, le Center for Disease Control (CDC) américain considère que les opioïdes représentent désormais la première cause de mort toxique aux États-Unis, avec une contribution supérieure à 85% du fentanyl et de ses dérivés aux décès. Les effets neurorespiratoires délétères observés en clinique en cas de surdosage par les dérivvés du fentanyl ainsi que la particularité des décès qui leur sont attribués (survenue dans les minutes suivant l'injection d'une forte dose, rigidité musculaire entrainant la paralysie des muscles respiratoires), nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs d’abord, de caractériser de façon comparative, la réponse ventilatoire et diaphragmatique après administration d’une dose élevée de différentes molécules opioïdes. Ensuite, on étudiera l’efficacité de la réversion de leurs effets neurorespiratoires respectifs par l'antidote de référence.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes et les spécificités de la toxicité neuro-respiratoire à la suite d'overdose aux dérivés opioïdes et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour les animaux de la procédure 1 : Procédure chirurgicale (30 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes). Pour les animaux de la procédure 2 : Procédure chirurgicale (30 mins), injection de la substance étudée (1 injection; 5 secondes) et prélevements sur animaux vigiles (8 prélèvements; environ 1 min). Pour les animaux de la procédure 3 : Procédure chirurgicale (45 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes).

Impact sur les animaux

En raison du contexte d’exposition des animaux et des effets recherchés dans ce projet, on s’attend à plusieurs effets secondaires à l’utilisation des dérivés opioides y compris : Sédation allant d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma, myoclonies, rigidité musculaire, ou encore l'élévation non contrôlée de la queue. De part le choix de la dose, on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction de l’opioïde utilisé. De plus, les procédures 2 et 3 nécessiteront l'hébergement en cage individuelle des rats à la suite de leur chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire intégrée sur animal entier.

Réduction

Par nos expériences passées sur les mêmes modèles animaux, il est estimé qu’un groupe de 6 animaux exploitables est suffisant pour appliquer une analyse statistique et mettre en évidence des différences le cas échéant. Ce nombre est prédéterminé à l’aide du logiciel InVivoStat® (Essex, Royaume-Uni). Pour tous les tests, une valeur de p

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie péri-opératoire. Enfin, une ouate en silicone sera utilisée en post-opératoire pour permettre une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

La quasi-totalité des études expérimentales in vivo effectuées sur les dérivés opioïdes ainsi que sur la physiologie neurorespiratoire a été faite chez le rongeur, et principalement chez le rat. De plus, le rat est un bon modèle pour les études de pharmacocinétique ayant un métabolisme semblable à celui de l’Homme. De par sa taille, les prélèvements sanguins, ainsi que la pose des sondes de télémétrie sont plus aisés et donc plus reproductibles. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent se faire de manière repetée sur un même animal permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ces études. Nous utiliserons des rats Sprague-Dawley adultes, âgés de 8 à 9 semaines (jeunes adultes, poids : 250-350 g) au moment de l’expérimentation. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.

984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras, soumises à des cycles de perte et de reprise de poids, à des gavages de tamoxifène ou de doxycycline et à des prélèvements sanguins répétés, certaines isolées cinq jours en cage de calorimétrie, pour étudier les cellules progénitrices du tissu adipeux. Le porteur écrit que "chaque animal sera exploité afin d'apporter le maximum d'information". Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces fonctions et que seule une approche in vivo permet de les explorer.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'implication des progéniteurs du tissu adipeux dans les fonctions du tissu adipeux et les conséquences métaboliques à l'échelle des tissus adipeux et systémiques Nous chercherons (i) à identifier des acteurs moléculaires importants dans la fonction fibrotique et inflammatoires de progéniteurs et (ii) à savoir si moduler la fonction des progéniteurs suffit à améliorer en locale les fonctions du tissu adipeux et le métabolisme systémique dans le contexte de l’obésité et des variations pondérales.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'identifier les acteurs moléculaires critiques de la fonction des progéniteurs du tissu adipeux, ce qui permettra à terme de développer des stratégies innovantes pour permettre de limiter les désordres métaboliques qui sont associés à l'obésité. De plus, nos résultats permettront également de trouver des moyens d'optimiser la perte de poids et ses effets métaboliques.

Procédures

Les animaux seront rendus obèses à l’aide d’un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines. Chez les animaux anciennement obèses, la perte de poids) est permise soit par le remplacement du régime gras par du régime chow sans restriction calorique et donc disponible ad libitum ; soit par une restriction calorique modérée opérée alors que les animaux sont toujours sous régime gras. Dans ces 2 cas de figure, la perte de poids s’étend sur une période de 4 semaines. Pour le modèle yoyo, l’obésité est induite par un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines, ensuite une perte de poids est induite par le remplacement du régime gras par du régime chow (ad libitum) pendant 4 semaines. Puis une ré induction de l’obésité est opérée par une réexposition au régime gras pendant 4 semaines. Chez les souris minces, obèses, anciennement obèses ou yoyo, pour l'étude du contrôle de la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 4 heures et ils subiront des prises de petits volumes de sang (environ 150ul). Ainsi qu'un gavage ou une injection ip en début d'expérience. Le test de tolérance au glucose ou le test de sensibilité à l’insuline durent environ 2,5 heures. Chaque gavage ou injection dure moins de 20 secondes. Les prises de sang durent moins de 30 secondes. Pour les besoins de certains modèles OGM inductibles, les animaux se verront administrer du tamoxifène par gavage (5jours successifs, 150ul en moyenne, chaque gavage dure moins de 20 secondes) ou de la doxycycline (ajoutée au régime gras pendant 8 semaines ou ajoutée au régime chow pendant les 4 semaines de perte de poids). Afin d'étudier l'homéostasie énergétique, certains animaux seront analysés en cage de calorimétrie pendant 5 jours, ce qui nécessite l’isolement des animaux au cours de la période d’analyse. L’analyse de composition corporelle par RMN ne dure pas plus de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les différents tissus adipeux.

Remplacement

Dans le tissu adipeux, la fonction cellulaire des progéniteurs va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. De plus, nos données montrent que l’état d’activation des progéniteurs va en retour avoir des conséquences histologiques et fonctionnelles sur le tissu adipeux. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions des progéniteurs in situ. L’évaluation de l’activité des cellules progénitrices du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les modèles de souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. L’approche de croisement pour produire les animaux génétiquement modifiés est optimisée pour qu’une majorité des animaux produits soient utilisés. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. 984 animaux sont impliqués

Raffinement

Les animaux sont regroupés à 4-5 animaux par cage et le milieu est enrichi avec des bandes de papier et des abris en carton à usage unique. Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).

Choix des espèces

Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. La présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 8 semaines.