Procédures modérées

2 524 animaux non-humains, 2 164 hamsters dorés et 360 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, suivis cliniquement puis soumis à des tests de comportement dont le détail n'est pas précisé, pour étudier l'atteinte du système nerveux par le virus et tester des molécules. Le porteur indique une perte de poids et une perte possible du goût et de l'odorat dans les cinq jours suivant l'infection, les animaux atteignant les points limites étant mis à mort. Il affirme que l'infection du cerveau ne peut être démontrée in vitro et présente ces expériences comme une "étape incontournable".

Objectifs

Il s’agit d’étudier la capacité du SARS-CoV-2 à infecter le système nerveux et d’analyser l’efficacité de nouvelles approches préventives ou curatives pour lutter contre l’infection et ses conséquences.

Bénéfices attendus

Afin d’étudier la colonisation du système nerveux central par le SARS-CoV-2, le laboratoire utilisera des modèles rongeurs reconnus dans le domaine de la physiopathologie de l’infection (hamster doré syrien adulte et souris génétiquement modifiées). L’état de santé de ces animaux, et notamment tout ce qui signe une atteinte du système nerveux, sera suivis. Enfin l’activité potentielle de molécules limitant l’entrée du virus et sa propagation dans l’organisme seront analysés. Ce projet devrait permettre à terme de mieux comprendre les mécanismes d’atteintes du virus sur le système nerveux et de développer et valider des approches préventives ou curatives dans les modèles animaux.

Procédures

Intervention 1 : Inoculation intranasale sur animaux anesthésies. 360 souris et 2164 hamsters. Durée de l’intervention : moins d’une heure/animal Intervention 2 : Suivi clinique sur des animaux vigiles (pesée et observation de l’état de santé). 360 souris et 2164 hamsters. Durée de l’intervention : environ 5 minutes/animal, répétition quotidienne selon la durée de l’expérimentation (4 jours pour la phase aiguë, 14 à 30 jours pour la phase chronique) Intervention 3 : Tests de comportement sur des animaux vigiles. 150 souris et 934 hamsters. Durée de l’intervention : moins de 20 minutes/test, maximum 3 tests/animal (1 test/jour pendant 3 jours).

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter la douleur, la souffrance des animaux (anesthésie,...) et l’angoisse (plusieurs souris ou hamster par cage, mise en place d’enrichissement sous la forme d’igloo, de coton,...). Enfin, des points limites sont clairement définis et permettent d’éliminer toute souffrance inutile. Si des animaux deviennent malades et atteignent les points critiques, ils seront mis à mort. Les animaux infectés présentent une perte de poids dans les 5 jours post-infection, avec ensuite une reprise de poids. Les animaux peuvent être présenter une perte du goût et de l’odorat également dans les premiers 5 jours post-infection. Pas de problèmes liés à la locomotion ni à la douleur sont prévus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Après leur infection dans un niveau de confinement de niveau 3, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Ces expériences viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture de neurones humains et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. En effet, l’infection de neurones in vitro ne nous permet pas de prouver si le cerveau est infecté lors d’une infection intranasale ni d’évaluer les conséquences encéphaliques lors de l’infection par le SARS-CoV-2. Il est aussi important de pouvoir tester et valider in vivo les résultats obtenus in vitro concernant le rôle du récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAChR) dans l’infection.

Réduction

L'analyse des résultats utilise des tests statistiques permettant de comparer dans les règles de l'art les données qualitatives ou quantitatives obtenues et limitant le nombre d'animaux au strict nécessaire d’après notre expérience. 2164 hamsters et 360 souris seront utilisés.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter la douleur, la souffrance des animaux (anesthésie,...) et l’angoisse (plusieurs souris ou hamster par cage, mise en place d’enrichissement sous la forme d’igloo, de coton,...). Enfin, des points limites sont clairement définis et permettent d’éliminer toute souffrance inutile. Si des animaux deviennent malades et atteignent les points critiques, ils seront mis à mort.

Choix des espèces

Le hamster doré syrien (Mesocricetus auratus) semble être le meilleur modèle animal pour l’étude d’une infection par le SARS-COV-2 en raison de la capacité de son récepteur ACE2 à se lier au domaine de liaison au récepteur de la protéine spike du SARS-COV-2 avec une affinité de liaison élevée. De plus, ce modèle animal présente une longue période d’infection avec un faible taux de mortalité. Des souris génétiquement modifiées exprimant le récepteur ACE2 humain seront également utilisées dans ce projet comme substitut d’une infection humaine. Les modifications génétiques de ces souris n’induisent pas de modifications dommageables du phénotype de ces souris, mais les rendent sensibles à l’infection par SARS-CoV-2. Ce projet utilise des souris et hamsters adultes. Nous utiliserons des animaux adultes car ces animaux présentent des signes d’infection plus proche de ce qui est observé chez l’homme (ce sont aussi les classes d’âge les plus élevés qui sont les plus touchés chez l’homme.

475 animaux non-humains, dont 310 souris et 155 rats tués et 10 porcs réutilisés ensuite dans un autre projet, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Souris et rats subissent gavages, injections et prélèvements dont des ponctions rétro-orbitaires, les porcs une anesthésie et une intubation, non pour produire des connaissances mais pour entraîner aux gestes des personnels d'expérimentation. Le porteur indique qu'il arrive "relativement fréquemment" qu'un ou plusieurs rongeurs meurent d'un accident anesthésique, ce qui explique le nombre d'animaux prévu. Il affirme que les animaux vivants ne peuvent être "remplacés intégralement" par des modèles inertes, tout en indiquant que les participants s'exercent d'abord sur mannequins.

Objectifs

La protection des animaux utilisés à des fins scientifiques repose en Europe sur 4 points : l'agrément des établissements, le contrôle de leur origine, l'autorisation des projets et la qualification des personnels. Notre établissement assure ce type de formations pour les concepteurs depuis les années 1990 et depuis 2014 nous organisons cette formation réglementaire concepteurs-réalisateurs sous la forme de 4 modules thématiques en accord avec la réglementation actuelle. Une session annuelle a lieu avec un module général et trois modules spécialisés : un consacré aux rongeurs et au lapin, un consacré aux carnivores et au porc et un consacré aux ruminants, au cheval et au porc. Une formation est complète pour un groupe d’espèces lorsqu’un participant a suivi et validé (présence + examen) le module général et un module spécifique. L'un des facteurs de qualité de ces formations est constitué par leur partie pratique sur des modèles inertes et des animaux. En dehors de l'apprentissage indispensable des gestes techniques et de leur bonne réalisation, le fait d'être confronté à des animaux vivants au cours de la formation permet aux participants de se trouver en situation de ce type d'utilisation des animaux et alimente les débats autour des aspects éthiques d'utilisation des animaux en recherche, ce d'autant plus que de nombreux participants de ces formations sont au tout début de leur parcours professionnel. Nous garantissons un parcours pédagogique le plus didactique et éthique possible pour l’apprentissage des gestes techniques peu invasifs (contention, administrations, prélèvements), avec la réalisation des enseignements par des intervenants qualifiés et pédagogues, selon la séquence suivante : 1. Un cours théorique complet détaillant les éléments techniques et scientifiques et les points limites associés à ces gestes 2. Une séance de travaux pratiques (TP) sur modèles inertes permettant l’acquisition de ces gestes (nombreux ateliers mis à disposition des participants et animés par plusieurs intervenants qualifiés), 3. Des visites ou des TP avec des animaux vivants dans les meilleures conditions possibles pour les participants et les animaux. Notre objectif est qu’à l’issue de cette formation, les participants aient une bonne maitrise des principaux gestes techniques autorisés par une telle formation et soient en mesure de les appliquer dans les meilleures conditions possibles de respect des animaux et avec la plus grande pertinence scientifique possible.

Bénéfices attendus

Dans le cadre des formations obligatoires des personnes appelées à intervenir dans des projets de recherche impliquant des animaux, nous estimons indispensable que les apprenants pratiquent sur des animaux vivants les actes techniques autorisés par cette formation les plus courants. Depuis le début de 2016, une séance de travaux pratiques sur modèles inertes (mannequins de rats, modèles d'oreilles de lapins, mannequins de cheval ou de vache permettant les ponctions de la veine jugulaire, mannequin de porc pour la contention...) est organisée préalablement aux séances de travaux pratiques sur animaux vivants objets de la présente demande d'autorisation de projet. Cette séance permet d’acquérir la maitrise technique des gestes avant de les pratiquer sur des animaux vivants et de réduire ainsi le risque d’infliger une douleur, un stress ou une lésion à un animal (Raffinement). Il demeure que la réalisation ou l'observation d'actes pratiqués sur l'animal vivant est une partie essentielle à la qualité de la formation des personnels ayant à les réaliser dans leur activité professionnelle, garantissant ainsi des gestes en conditions réelles techniquement mieux réalisés, plus sereinement, cela au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. Ces séances sont animées par un nombre conséquent d’encadrants très expérimentés, motivés par la transmission de leurs savoir-faire et très attentifs au bien-être des animaux.

Procédures

Souris et rats : sur animaux vigiles : gavage et pour la souris, un prélèvement à la veine mandibulaire ; sur animaux anesthésiés : plusieurs injections intra-musculaires, sous-cutanées, intradermiques, intraveineuses), et prélèvements intraveineux et rétro-orbitaires Porc : anesthésie et intubation La séance de travaux pratiques dure 2h pour chaque espèce. Chaque geste est réalisé sur quelques secondes ou minutes.

Impact sur les animaux

La contention des animaux et la réalisation des premiers gestes avant anesthésie impliquent un stress des animaux. Celui-ci est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement une semaine avant la séance de travaux pratiques, l’apprentissage préalable des gestes par les participants sur modèles inertes et un encadrement au plus près des participants, centré sur le respect des animaux. L’effet indésirable le plus fréquent est un accident anesthésique chez un rat ou une souris (pas d’événement rencontré chez le porc en 8 ans). En cas d’apnée ou d’arrêt cardiaque, une réanimation vigoureuse est pratiquée par un encadrant. Il arrive néanmoins relativement fréquemment qu’un ou plusieurs animaux meurent, ce qui explique le nombre d’animaux prévu pour chaque session. La maitrise par les encadrants du mélange anesthésique, des stratégies de réanimation et des erreurs des participants les plus fréquentes permettent de réduire année après année ces accidents anesthésiques.

Devenir

Les rongeurs (procédure 1 et 2) sont euthanasiés et les porcs (procédure 3) sont maintenus en vie et réutilisés dans un autre projet après évaluation par le vétérinaire désigné. Les souris et les rats sont euthanasiés à l’issue de la séance car aucune utilisation ni aucun replacement ne peut être envisagé pour ce nombre d’animaux, après réalisation de plusieurs gestes dont des prélèvements rétro-orbitaires et après rupture de leur statut sanitaire « Specificic pathogen free » lors de cette séance. Les cadavres des rats sont utilisés pour une séance de dissection en anatomie.

Remplacement

Les mesures prises pour le respect des 3R sont les suivantes : en premier lieu, nous estimons qu'il en va du bien-être des animaux ultérieurement manipulés par nos participants dans leur exercice professionnel qu'ils aient pratiqué ou au minimum vu pratiquer la plupart des gestes courants et peu invasifs pouvant être utiles à la réalisation de projets de recherche. Pour cette raison, nous estimons que les animaux vivants ne peuvent être remplacés intégralement par des modèles inertes. Toutefois, nos participants commencent toujours par pratiquer les mêmes gestes sur ces modèles.

Réduction

Ce projet nécessite pour 5 ans l’utilisation d’un total de 310 souris, 155 rats et 10 porcs au maximum. Le nombre d'animaux utilisés correspond à une souris par participant, un rat pour 2 participants et un porc pour 10 participants, ce qui semble le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Par ailleurs, les rats euthanasiés lors des travaux pratiques d’administrations et prélèvements sont ensuite utilisés lors de la séance de dissection pour l’anatomie. Enfin, les porcs sont ensuite ré-utilisés par une équipe de recherche. Ces réutilisations permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire.

Raffinement

La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce un entrainement des participants sur modèles inertes, à un encadrement nombreux et de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes les plus douloureux ou stressants sont réalisés sous anesthésie générale. Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long des travaux pratiques sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces travaux pratiques doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal et la pertinence des résultats scientifiques.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les modèles les plus pertinents pour le module rongeurs-lapin, de par la fréquence de leur utilisation et leur différence de taille qui permet d’appréhender la variation des gestes techniques. Le porc est le modèle le plus pertinent pour le module carnivores-porc car la majorité des participants à ce module travaillent avec des porcs, que le porc présente un niveau de difficulté important pour l’intubation, qui justifie la confrontation à ce geste lors de la formation, et enfin parce que notre établissement utilisateur permet la réutilisation des porcs pour une autre équipe. Adultes pour les souris (16 semaines), jeunes adultes pour les rats (6-7 semaines), jeunes porcs (environ 1 à 3 mois). Les animaux sont ainsi de taille suffisante sans être trop gras (ce qui rendrait l’anesthésie plus difficile et donc dangereuse), avec une bonne homogénéité des lots pour faciliter la gestion anesthésique.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, et certaines souris jeunes sont irradiées puis reconstituées avec les cellules de souris âgées, pour étudier le rôle du vieillissement immunitaire dans l'atteinte rénale. Le porteur indique un risque de mortalité de 20 à 30 % lié à l'induction de la maladie et décrit un stress transitoire lié aux chirurgies et injections. Il affirme que la maladie est trop complexe pour des modèles in vitro et présente la souris comme l'espèce "la moins susceptible de ressentir" douleur et souffrance.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier l'impact du vieillissement sur l'infiltrat immunitaire durant l'Insuffisance Rénale Aigue (IRA) et de tenter de trouver de nouvelles interventions ciblant les cellules immunitaires pour prévenir 'lInsuffisance Rénale Aigue (IRA) et sa transition vers l'Insuffisance Rénale Chronique (IRC) chez les sujets âgés.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes immunitaireset physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue chez des souris agées et recheche de traitements pharmacologiques potentiels

Procédures

1/ groupe IRA : L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ) sur des souris males et femelles de 2 et 18 mois anesthésiées. 2/ groupe inhibiteur pharmacologique : Après IRA, des souris seront exposées ou non à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. 3/ groupe chimère hématopoiétique : Des souris jeunes seront irradiées puis le compartiment hématopoiétique sera reconstitué par des cellules provenant de souris agées. Par la suite une IRA sera induite >>Avant sacrifice, tous les groupes d'animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale : diurèse en cage metabolique (1 fois), débit de filtration glomérulaire (2 fois : J0 et avant sacrifice), prise de sang (3 fois : J0, H6, J2) au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50μl) pour mesurer l'urée plasmatique.

Impact sur les animaux

Protocole #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Protocole #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Protocole #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes pour des analyses post sacrifice.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).

Réduction

Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Pour ce projet portant sur l’immunosénescence, nous avons besoin de comparer des animaux jeunes à des animaux vieux. Pour cela, nous utiliserons des souris de 2 mois (jeunes) et de 18 mois (vieux).

428 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des plaques sous régime gras, elles reçoivent une injection de lipoprotéines marquées et, pour une partie, un agent inflammatoire, afin de tester une imagerie de l'athérosclérose. Le porteur indique mettre à mort 328 animaux pour prélever leurs tissus et transférer les 100 autres vers un autre établissement pour une imagerie sur corps entier. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de suivre ces composés injectés dans l'organisme.

Objectifs

L’athérosclérose se caractérise par l’accumulation progressive de lipides dans la paroi des artères, conduisant à la formation de plaques d’athérome pouvant obstruer partiellement la lumière artérielle. Cette maladie peut rester longtemps silencieuse avant de provoquer un accident vasculaire provoqué par la rupture soudaine de la plaque, devenue instable car fragilisée par des phénomènes inflammatoires. La cause initiale de la formation des plaques d’athérome est le captage anormal de lipoprotéines, complexes transportant le cholestérol dans la circulation. On distingue ainsi des lipoprotéines de type LDL (« mauvais cholestérol ») ou HDL (« bon cholestérol »). LDL est HDL peuvent toutes deux être captées par les cellules présentes dans la paroi artérielle. Dans un projet précédent, nous avons développé un système de marquage bimodal permettant de suivre une molécule d’intérêt au niveau du corps entier (imagerie PET) et dans des biopsies de tissus (microscopie en fluorescence). L’objectif de ce projet est d’appliquer ce système de marquage aux lipoprotéines afin d’utiliser ces dernières comme nouveaux agents d’imagerie de l’athérosclérose sur corps entier et sur biopsies de plaques. Nous testerons nos lipoprotéines marquées sur deux modèles de souris génétiquement modifiées connus pour développer, sous régime riche en cholestérol, des plaques d’athérome d’étendue modérée (souris LDLRKO) ou importante (souris ApoEKO). Nous testerons également la capacité de nos lipoprotéines marquées à discriminer des plaques d’athérome stables (souris ApoEKO sans inflammation) ou instables (souris ApoEKO avec inflammation induite par injection de LPS).

Bénéfices attendus

L’athérosclérose est une des premières causes de mortalité dans les pays développés. Les techniques d’imagerie actuelle permettent de détecter des rétrécissements artériels ou des lésions artérielles avancées, mais sont limitées à des explorations dans des régions corporelles très restreintes et ne permettent pas de discriminer des plaques stables de plaques instables. Si nos lipoprotéines marquées s’avèrent efficaces elles permettraient, après transposition à l’humain, de détecter les plaques d’athérome de manière exhaustive et de prédire leur propension à se rompre. Cette nouvelle stratégie d’imagerie permettrait ainsi d’orienter de manière plus précise la prise en charge des patients tant au niveau des interventions chirurgicales que des traitements médicamenteux. A long terme, ces nouveaux traceurs permettraient notamment de diminuer le résiduel et les récidives d’accidents vasculaires qui persistent chez les patients à risque.

Procédures

Injection intraveineuse de traceur d’imagerie sur souris vigiles. Une seule fois, sur tous les animaux. Régime riche en graisse sous forme de croquettes fournies ad libitum durant 12 semaines pour 232 souris au total. Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin terminal avant mise à mort sur 328 souris au total. Injection intrapéritonéale de sérum physiologique (« placebo ») ou d’un agent inflammatoire sur souris vigiles : 1 par jour pendant 5 jours. 40 souris placebo et 40 souris avec inflammation. Transport vers l’autre EU : stress lié au transport (5minutes). 100 souris au total.

Impact sur les animaux

Injection intraveineuse de lipoprotéines. Les composés injectés sont naturellement présents dans la circulation chez les vertébrés, donc leur injection ne devrait pas provoquer d’effet néfaste. Seule la contention liée à la procédure d’injection est susceptible de provoquer un inconfort chez les animaux. Régime riche en graisses. D’après nos expériences passées, le régime riche en graisse (croquettes ad libitum) donné aux souris durant les 12 semaines n’a pas d’effet indésirable sur les animaux, qui ont néanmoins un pelage d’aspect « gras ». L’athérosclérose induite après 12 semaines de régime est complètement asymptomatique et ne provoque aucune nuisance à l’animal. Injection d’un composé pro-inflammatoire. L’injection en elle-même est associée à un inconfort léger le temps de la contention. L’inflammation induite par ce composé est susceptible de générer une douleur modérée mais réversible au bout de 5 jours.

Devenir

Pour chacune des trois procédures, les prélèvements sanguins et de tissus (foie, intestin, rate, plaques d’athérome) impliquent la mise à mort des animaux sous anesthésie : 96 pour la procédure 1 ; 192 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3. Les autres animaux sont transférés vers un autre EU à des fins d’imagerie sur corps entier : 20 pour la procédure 1 ; 40 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce projet visant à étudier le trajet dans l’organisme de composés administrés par voie veineuse et destinés à des applications d’imagerie sur corps entier et sur biopsies de tissus.

Réduction

Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature en termes de pharmacocinétique. Nos précédents projets de cinétiques utilisant des molécules portant des marqueurs bimodaux nous ont permis de connaitre les doses optimales à utiliser.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (minimum 3 ou 4 par cage), dans des conditions standard avec enrichissement du milieu. Ils seront contrôlés quotidiennement. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel familiarisé aux souris, formé aux gestes techniques et au bien-être animal, en utilisant un appareillage de contention spécialement dédié. Elles seront effectuées hors des pièces d’hébergement pour ne pas générer un stress supplémentaire. Pour la plupart des animaux utilisés dans ce projet, l’intervention se limitera à une injection intraveineuse suivie d’une mise à mort sous anesthésie générale. Un petit nombre d’animaux recevra 5 injections intrapéritonéales visant à induire une inflammation modérée et feront l’objet d’un suivi particulier avec traitement de la douleur en cas d’apparition de signes de détresse. Tous les animaux seront surveillés après injection et ceux présentant des signes de détresse persistant au-delà de 24 heures (posture prostrée, contractions abdominales, masque de douleur, grognements) ou d’atteinte neurologique ou respiratoire (paralysie, suffocation) seront mis à mort sous anesthésie générale. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale avant mise à mort.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car ses grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’homme (fonction rénale, hépatique). Le rat ne développe pas de plaque d’athérome, même sous régime riche en graisses. Les lignées de souris génétiquement modifiées LDLRKO et ApoEKO sont les deux modèles de référence pour l’étude de cette pathologie avec deux degrés différents de sévérité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les composés d’intérêt étudiés ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de la plaque d’athérome. Du fait de la pathologie intervenant chez l’adulte, il est justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt-quatre reçoivent un régime alcoolisé pendant onze jours et des gavages répétés d'une bactérie productrice de toxine, pour mettre au point un modèle d'hépatite alcoolique jugé plus proche de la maladie humaine. Le porteur indique une perte de poids servant de point limite et une agressivité possible provoquant morsures et dépilations. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour cette maladie et que l'animal est "indispensable".

Objectifs

L'hépatite aiguë alcoolique apparaît chez des patients consommant de l'alcool de manière chronique et excessive. La mortalité atteint 30 à 40% à 28 jours d'évolution. La cortisone, un anti-inflammatoire est le seul traitement validé mais son utilisation est limitée par l'absence de réponse au traitement dans 40% des cas, des potentiels effets secondaires et l'absence de bénéfice sur la mortalité au-delà de 28 jours. Ainsi, un nombre significatif de patients se retrouve sans alternatives thérapeutiques. A ce jour, les modèles murins disponibles sont imparfaits en raison d'une faible inflammation et d'une fibrose légère. Ces données sont ainsi très loin de la physiopathologie observée chez les patients atteints d'hépatite aiguë alcoolique. La bactérie Entéroccocus faecalis est présente dans le tractus gastro-intestinal des humains et chez certains animaux. Chez des patients atteints d'hépatite alcoolique aiguë, elle est notamment responsable de la production d'une toxine appelé cytolysine. Récemment, il a été démontré que cette toxine est responsable de la mort des cellules du foie, les hépatocytes et ainsi aggraverait le pronostic vital du patient. Le lien étroit entre cette maladie et le microbiote intestinal est due à l'induction d'une perméabilité intestinale accrue causée par une consommation aiguë et chronique d’éthanol. L'objectif du projet est d'utiliser un modèle murin d'alcoolisation chronique connu en ajoutant des gavages intragastriques à des temps précis de la souche bactérienne productrice de la toxine, la cytolysine. Cela permettra d'obtenir un modèle murin représentatif de la réalité médicale et permettra par la suite de valider des médicaments soignant la pathologie.

Bénéfices attendus

Aucun modèle actuel ne synthétise parfaitement les caractéristiques de l'hépatite aiguë alcoolique limitant la compréhension des mécanismes permettant le développement d'étude chez l'Homme. Le modèle que nous proposons de mettre au point se veut rapide (16 jours), reproductible (souches bien identifiées et purifiées de la bactérie) et transposable à l'homme. Par ailleurs ce modèle nous permettra de tester nos molécules d'intérêts que nous avions à ce jour testé sur les modèles connus mais imparfaits. Avec ce modèle plus pertinent, les résultats de cette étude pourront conduire au développement rapide d'études chez l'Homme.

Procédures

Toutes les souris (n=48) du protocoles vont bénéficier d'un régime alimentaire semi liquide pendant 16 jours. Ce régime sera alcoolisé ou non (11 jours sur 16) ce qui est une variation par rapport à leur standard d'alimentation lorsqu'il y a de l'alcool. Cette intervention à base d'alcool concernera 24 souris. L'appétence pour la texture semi liquide est très importante pour les souris qui l'apprécient. 24 animaux seront soumis à des gavages intragastriques à J6, J9, J12 et J15 de la souche E. faecalis pour les groupes 2 et 4. Les gavages intragastriques en termes de temps sont très court pour l'animal et ne représentent pas de douleurs. Les 24 autres souris ne subiront pas cette intervention.

Impact sur les animaux

Nous possédons une expertise du protocole murin d'alcoolisation. Les effets indésirables observables pour ce protocole sont la perte de poids qui représente le point limite. Une procédure de raffinement spécifique est mise en place pour permettre d'endiguer la perte de poids trop importante. Le gavage intragastrique par une souche bactérienne est une inconnue cependant nous nous sommes entourés d'un laboratoire de bactériologie. De plus, la concentration administrée à chaque gavage correspond à 10g de selles humaines soit des concentrations réalistes et acceptables. Le gavage de bactéries prévu est en quantité modeste et doit être répété car en quantité insuffisante pour coloniser la flore digestive des souris et induire une intoxication aiguë. Néanmoins, pour prévenir toute incertitude liée à la tolérance des ingestions répétées de bactéries par gavage, nous avons développé un score clinique de surveillance détaillé dans la partie raffinement et constituant un point limite. Les gavages intragastriques itératifs peuvent stresser l'animal, une procédure de raffinement est prévue. L'alcoolisation chronique peut entrainer une agressivité chez certaines souris dominatrices. Cette aggressivité n'est pas constante et ni spécifique de ce protocole. L'aggréssivité se manifeste en premier lieu par des lésons de dépilation ou de morsures qui restent modestes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les souris agressives ou à l'inverse blessées seront isolées et soignées par soins locaux de bétadine. Cela ne constitue pas un point limite et la souris aggressive peut rester dans le protocole d'étude bien qu'elle soit isolée. Les maladies du foie comportent un large spectre allant de la stéatose jusqu'au cancer du foie. Des complications graves comme la jaunisse ou de l'accumulation de liquide dans l'abdomen (ascite) sont observées chez les patients malades. Ces stades ne sont pas retrouvés chez les modèles murins et ainsi ne représentent pas une nuisance potentielle.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour des analyses post mortem de différents organes (foie, rate, intestin).

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucune approche in vitro pour étudier l'évolution d'une pathologie inflammatoire multifactorielle comme l'hépatite alcoolique et notamment le lien avec le microbiote intestinal en corrélant la présence de la cytolysine, la toxine produite par la bactérie Entéroccocus faecalis avec la mort des cellules du foie, les hépatocytes. Une étude chez un organisme vivant telle que la souris est indispensable pour pouvoir valider par la suite des études de phase 2 chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera menée avec un nombre total de 48 jeunes souris adultes mâles pesant 18 à 20g, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle sur l'évolution de la pathologie hépatique. Ce nombre correspond au nombre de souris mâle permettant de former chaque groupe (n=12) au sein de l’étude statistiquement significatif.

Raffinement

Dès la réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l'air, ...) à leur bien-être. Une procédure d'estimation (avec des paramètres définis) et suppression de la souffrance sera mise en place. Les points limites de ce protocole concerne 1) la perte de poids de l'animal. Ainsi, une surveillance pondérale régulière (J0, J6, J8, J10, J15) et un protocole de raffinement spécifique est prévu (augmentation de la stimulation les conduisant à mieux s’alimenter, renutrition par des croquettes riches en protides). Dans les cas éventuellement graves, les animaux seront mis à mort selon le protocole en vigueur à l'animalerie. 2) Nous prévoyons d'utiliser un score de surveillance prenant en compte l'apparence, la mobilité, la réponse aux stimuli, l'ouverture des yeux, la froideur au toucher et la fréquence respiratoire. Un score élevé constitue un point limite. 3) En cas d'aggréssivité persistantes des animaux attesté par des morsures et lésions de dépilation, la souris dominante sera isolée pour prévenir toute éventualité d'aggravation des lésions. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des prélèvements d'organes seront effectués pour permettre de réaliser les analyses biochimiques et immuno-pathologiques.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris C57BL/6. Ce choix a été motivé par l'expertise de l'équipe pour cet animal et cette souche pour la mise en place de modèle murin dans le cadre des maladies du foie. Ce choix nous permettra des comparaisons entre nos modèles et au niveau international avec les modèles en vigueur. De plus nous prévoyons l’utilisation future d’inhibiteurs de TREM-1 sur ce modèle s’il est probant. Le choix de l’espèce est ainsi étayé par l’existence d’un modèle transgénique KO-TREM-1. L’étude sera réalisée sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début du projet. Ce choix est motivé par l’analyse de travaux publiés dans des journaux scientifiques internationaux portant sur l’étude de l'hépatite aiguë alcoolique.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux cent quarante subissent une chirurgie créant deux plaies sur le dos, jusqu'au muscle, pour tester si un régime cétogène ou un composé favorise la cicatrisation. Le porteur écrit que l'étude vise à apporter la preuve exigée pour déposer un brevet. Il indique traiter la douleur par de la buprénorphine et affirme que seul un modèle in vivo garantit des conditions proches de la clinique.

Objectifs

Le composé X est produit naturallemnt par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Le composé X a montré sur les cellules immunitaires des propriétés benefiques lors de leurs infiltration des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire ou l’application topique de ce composé X lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire (brûlures, plaies…) peut être bénéfique au patient. Ce composé peut être délivré par injection ou en application topique. Ce projet a été évalué par cellule de valorisation de brevets et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce régime chez la souris est demandée.

Bénéfices attendus

Au-delà des informations fondamentales qui permettront de caractériser les cellules de l'immunité, les macrophages , les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. A titre d’exemple, nous pouvons citer les lésions post-ischémiques ou la cicatrisation de grandes zones cutanées (grands brulés). De plus, le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses : régime cétogène. Ce composé a montré des propriétés benefiques sur les cellules immunitaires dans un contexte de réparation tissulaire. Ce projet a été évalué par Ouest Valorisation et afin de déposer un brevet, une preuve des bienfaits de ce composé chez la souris est demandée.

Procédures

L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 2 procédures du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Elle concerne tous les animaux, soit 340 au total. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. Le paracetamol sera contenu dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle et jusqu’à la fin de la procédure 2. Pour la chirurgie induisant les lesions cutanées, les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine. Le maintien de l’anesthésie durant la procedure chirurgicale se fera par isofluorane. La chirurgie durera environs trente minutes et sera effectuée sur 240 souris. La buprénorphine sera administrée régulièrement en sous cutanée ) avant le réveil, 1h et 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la buprénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel sera mise à disposition des souris pour la nuit.

Impact sur les animaux

Les animaux seront utilisés une semaine après leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ils subiront ensuite une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure. Les animaux ne sont pas réveillés car nous allons prélever le sang et différents organes pour des évaluations biochimiques et histologique.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (340 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle de cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en suivant le test de Wilcoxon-Mann Whitney.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience . Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques, seront donnés. La douleur des animaux sera gérée en pré-opératoire par l’adjonction de paracétamol (1mg/ml) dans l’eau de boisson 24h avant la mise en place du modèle de cicatrisation. Les souris seront anesthésiées par l’injection de kétamine et xylazine (100microg de kétamine et 10 microg de xylazine par gramme de souris). Le maintien de l’anesthésie se fera par isofluorane 2%. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de l’opération et jusqu’à leur réveil. Des doses de buprénorphine seront administrées régulièrement (0,1mg/kg) en sous cutanée (sous 100 microL) avant le réveil, une seconde 1h après (100 microL) puis 5h après. Ensuite les souris seront visitées 4 fois par jour et suivant les signes cliniques observés, la burénorphine sera injectée. De plus chaque soir à la visite de 18h, de la buprénorphine en gel (15μg/ml) sera mise à disposition des souris pour la nuit. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de cicatrisation chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester le composé X afin de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.