Procédures modérées

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie sous anesthésie, puis ils reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'IRM et de scanner, pour optimiser la dose permettant de visualiser la tumeur et de renforcer l'effet de la radiothérapie. Le porteur qualifie de légère la douleur liée à l'incision du crâne et prévoit une mise à mort si un point limite est atteint, le cerveau étant prélevé pour analyse. Il affirme que la complexité des tumeurs cérébrales et la distribution des nanoparticules ne peuvent être appréhendées qu'in vivo.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

51 brebis gestantes vont être utilisées, gardées vivantes puis réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie par cœlioscopie d'une heure au maximum permettant au moins trois biopsies du placenta, pour chercher des marqueurs sanguins de bonne santé placentaire et réduire la mortalité des agneaux nouveau-nés. Le porteur indique que la biopsie présente un risque de perte fœtale et une douleur pendant deux à trois jours après l'opération. Il affirme que le recours à la brebis est "indispensable" puisqu'il s'agit de collecter des placentas et du sang au cours de la gestation.

Objectifs

Dans l'espèce ovine, la mortalité néonatale affecte près de 15 à 20% des jeunes et reste un enjeu important tant du point de vue du bien-être animal qu’économique. Les causes de cette mortalité sont nombreuses, néanmoins elle résulte principalement de mort-nés et/ou d’un retard de croissance d'origine gestationnelle. Le placenta, organe transitoire à l’interface entre la mère et le foetus, joue un rôle primordial dans la communication entre la mère et le foetus et dans la mise en place de phénomènes adaptatifs. Il apparaît donc crucial d’étudier les mécanismes d’adaptations placentaires mis en place au cours de la gestation chez la brebis afin de pouvoir identifier des marqueurs de la bonne santé placentaire dans le sang maternel et de les utiliser ultérieurement dans le suivi de complications gestationnelles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont ciblés pour la filière ovine et visent à identifier des marqueurs de la bonne santé placentaire permettant de développer des stratégies de correction au cours de la gestation limitant la mortalité néonatale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de type célioscopie d'une durée maximale d'une heure, qui permettra de réaliser au moins trois biopsies placentaires.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la procédure chirurgicale. Cela inclut un risque de perte fœtale en raison de la biopsie placentaire et le suivi post-opératoire (risque de douleur) pendant 2 à 3 jours qui suivent le prélèvement.

Devenir

- Quelle que soit la procédure, les brebis seront utilisées dans d'autres projets.

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit de collecter des placentas au cours de la gestation et du sang .

Réduction

Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant à la mise en place de nos protocoles, en nous basant sur une publication scientifique en lien avec la gestation chez la brebis. Pour la mise au point du protocole chirurgical à 3 stades de gestation, nous avons prévu un maximum de 10 brebis gestantes par stades comme dans la publication. Nous arrêterons cette procédure dès qu'elle sera mise au point. Pour définir des marqueurs de bonne santé placentaire, 7 brebis par stade sont prévues, ce nombre est suffisant pour obtenir des résultats suffisamment fiables et robustes.

Raffinement

-Les brebis seront toujours manipulées par lot. -15 jours avant la procédure chirurgicale, les brebis auront une phase d’acclimation avec leur environnement. -Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale précédée d'une analgésie adaptée et d'une antalgie post-opératoire. Les prélèvements seront réalisés sous coelioscopie pour limiter la taille des incisions et le nombre de points de suture. -Après la chirurgie, les brebis, placées en logette d’isolement, seront suivies pendant toute la phase de réveil. Ces logettes permettent aux animaux de toujours maintenir un lien visuel, sonore et olfactif. Elles auront aussi un ballon et une brosse comme enrichissement. -Un traitement antalgique et/ou antibiotique sera réalisé durant les cinq jours qui suivent la chirurgie, en évaluant les signes de douleurs selon une grille définie dans une publication scientifique (signes de prostration, perte d’appétit, mimiques faciales …) -Le suivi post-opératoire inclura aussi une vérification par échographie du maintien de la gestation, 5 jours post-opératoire puis une fois par semaine pendant 3 semaines. -De plus, les animaux bénéficieront de conditions d’hébergement en troupeau/lot pour favoriser les relations sociales et leur bien-être mais aussi d'enrichissements (ballon, brosse). Ils seront placées le plus possible en situation d'éco-paturage en extérieur (pâture sécurisée dans l'enceinte du centre de recherche) dans la mesure où leur état de santé le permettra (en dehors des périodes de surveillance post-opératoire).

Choix des espèces

Ce projet vise la filière ovine pour limiter la mortalité néonatale, par conséquent l'espèce animale ne peut-être que la brebis.Les brebis adultes seront âgées de 1 à 4 ans. Nous avons prévu des mises au point chirurgicales à différents temps de gestation (60, 80 et 120 jours de gestation). A 60 et 80 jours, le placenta est en croissance et à 120 jours, il est mature. L'objectif est de maîtriser la procédure chirurgicale puis de collecter le tissu placentaire afin de pouvoir identifier les marqueurs de la bonne santé placentaires le plus tôt possible.

4980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome puis un ou deux traitements, avant d'être tuées pour prélever la tumeur et les organes du système immunitaire, afin de tester un composé naturel censé activer l'immunité contre la tumeur, seul ou associé à des immunothérapies. Le porteur indique que les injections et la croissance tumorale peuvent provoquer des douleurs. Parmi les bénéfices attendus, il cite l'amélioration de la prise en charge des patients mais aussi la publication de ses travaux.

Objectifs

Nous avons montré qu’un composé naturel (CN) inhibe la progression des tumeurs de la peau (mélanomes) et qu’il stimule l’infiltration des cellules immunes dans les tumeurs. Les expériences réalisées sur des cellules de tumeur en culture montrent que le CN induit la libération de petites vésicules extracellulaires (pVE) et la mort des cellules cancéreuses qui vont libérer des signaux (lysats cellulaires). Nous avons montré que les pVE et les lysats cellulaires induits par le CN stimulent l’activation de certaines cellules immunes mises en culture. Les objectifs du projet sont d’étudier sur différents cancers de la peau (mélanome) implantés chez la souris, si le CN active le système immunitaire contre la tumeur et de caractériser si les pVE ou les lysats cellulaires participent aux effets du CN. Il sera également étudié si l’activation du système immunitaire et l’inhibition de la progression de la tumeur par le CN peut augmenter l’efficacité d'autres immunothérapies déjà utilisées en clinique en testant leur association.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra de compléter les études réalisées in vitro sur des cellules en culture et montrera l'impact du CN et des mécanismes qu'il active sur la réponse immune contre la tumeur et déterminera si l’association du CN avec d’autres immunothérapies utilisées en clinique peut augmenter leur efficacité. Ce projet aura pour bénéfice de pouvoir étudier dans un système intégré l'action de nouvelles thérapies qui stimulent le système immunitaire contre la tumeur dans le but d’améliorer la prise en charge des patients ayant un mélanome et qui ne répondent pas aux immunothérapies proposées en clinique et et permettra de publier nos travaux.

Procédures

L'animal sera soumis à un ou deux traitements avec une durée inférieure à 1 minute par traitement. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vigiles et aucune procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur l'animal seront dues aux injections des cellules tumorales et des traitements qui entrainent des douleurs sur le site de l'injection ainsi que la croissance des tumeurs qui peut entrainer des douleurs. Le CN a déjà été testé in vivo sur plusieurs modèles de tumeurs et aucun effet indésirable, ni perte de poids n'ont été observés. Les immunothérapies ont déjà été utilisés chez la souris (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Par contre, les combinaisons du CN avec les immunothérapies n'ont pas été testées. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les traitements ou combinaisons n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance, et de même nous surveillerons si la croissance des tumeurs induit des douleurs. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Devenir

Procédure 1: Les souris seront gardées en vie après la formation des tumeurs car elles seront soumises à des traitements pendant une durée déterminée. Procédure 2: A la fin du temps des traitements, les souris seront mises à mort car la tumeur et les organes du système immunitaire seront récupérés afin d'isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui sont activées ou inhibées par les traitements.

Remplacement

Le CN a été montré comme activant l'infiltration des cellules immunes dans les tumeurs mammaires et de mélanomes implantées chez la souris immunocompétente par des études d'immunohistochimie. Des expériences in vitro sur des cellules immunes ont été préalablement réalisées et ont montré les effets du CN et des mécanismes activés (sécrétion des pVE ou mort des cellules tumorales) sur la réponse immune. Nous nous sommes ainsi assurés de la pertinence d'étudier la réponse immune anti-tumorale chez la souris.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera le nombre minimal d’animaux qui permettra d’avoir des résultats significativement exploitables compte tenu de la grande variabilité des réponses immunitaires anti-tumorales des souris et pour répondre aux objectifs du projet qui sont d’évaluer la réponse immune anti-tumorale de plusieurs traitements et d’isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui ont infiltrées les tumeurs et qui sont minoritaires comparé aux cellules tumorales. Les lignées choisies sont des lignées utilisées dans la littérature et en immunothérapie..

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour étudier cette espèce. Le système immunitaire est un système complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires et plusieurs organes immuns qui communiquent entre eux. Ainsi, l'utilisation des souris immunocompétentes ou immunodéficientes pour montrer l'implication du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale du CN, des pVE et des lysats cellulaires est essentielle pour cette étude qui nécessite un système intégré.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit une injection de la bactérie de la syphilis directement dans les testicules sous anesthésie générale, puis des prises de sang à l'oreille deux fois par semaine pendant six semaines, jusqu'au développement d'une orchite. Les animaux sont ensuite tués pour prélever les tréponèmes présents dans le tissu testiculaire. Le porteur présente le lapin comme le seul modèle connu et affirme qu'une fois la culture en milieu axénique maîtrisée, il s'abstiendra du recours à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre projet a pour but l'obtention de suffisamment de matière infectieuse prélevée sur des lésions de syphilis primaire induites chez le lapin au niveau des testicules inoculé à partir de souche établit ou de prélèvements cliniques. Ce broyat testiculaire de lapin sera mis en culture dans les différents milieux mis au point par notre équipe. L’infectiosité sera suivie au cours du temps par PCR mais aussi par inoculation à d’autres lapins. Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable. Ainsi nous nous abstiendrons du recourt à l’expérimentation animale quand cette technique sera maîtrisée.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable pour l'isolement de nouvelles souches cliniques ainsi que pour leur production. L'étape d'injection des testicules de lapin est primordiale pour la mise au point de milieu de culture optimum afin de s'abstenir à terme de l'utlisation d'animaux ou d'en réduire au maximum son utilisation.

Procédures

Inoculation par injection intra testiculaire sous anesthésie générale pour une durée prévue entre 15 à 20 minutes maximum. Le prélèvement sanguin auriculaire sera effectué sur des animaux vigiles après application de crème anesthésiante locale de type EMLA 5%. Les animaux sont placés dans des boites de contention le temps du prélèvement pour une durée prévue entre 10 à 15 minutes, 2 fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le suivi des lapins se fera pendant les six semaines qui suivront l’inoculation. Le développement d’une orchite est attendu. D’après la littérature, les lapins sont sacrifiés dès l'apparition de l'orchite afin de prélever les treponema présents dans le tissus testiculaire. Des prises de sang auront lieu 1 fois par semaine (suivi PCR et sérologie). A l’issu, ils seront euthanasiés et prélevés.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure. En effet, les individus infectés ne peuvent pas être utilisés dans une nouvelle procédure ni proposé à l'adoption.

Remplacement

La syphilis est due à Treponema pallidium, bactérie spirochète, observée au microscope au début du siècle dernier, mais qui n’a jamais été mise en culture axénique. Depuis un an, notre équipe tente la culture ultrapure de l’agent de la syphilis (T. pallidium) dans un milieu axénique (en absence de tout autre organisme, dans un milieu stérile, exempt de tout autre agent biologique). Les résultats obtenus, s’ils montrent que des cultures restent positives au test moléculaire (détection de l’ADN) de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ne peuvent pas objectiver la viabilité des éventuelles bactéries cultivées. Le passage à l’essai in vivo chez le lapin (seul connu pour être un bon modèle) devient une étape obligatoire d’une recherche scientifique, qui une fois que la culture axénique de T. pallidum sera maîtrisée, s’abstiendra d’avoir recours à l’expérimentation animale. Des animaux destinés à la recherche seront donc utilisés, de manière ponctuelle, dans ce projet.

Réduction

Afin d'estimer au mieux le nombre d'animaux pour l’isolement de souche clinique et leur production, nous avons utilisé le concept de l'effet de taille (effect size). On s'attend à ce que plus l'effet soit fort (donc la différence est grande), plus la taille de l’échantillon nécessaire sera petite. Pour se faire, deux moyennes ont été comparées, une moyenne théorique (mt) de 25% a été choisie en se référant aux données bibliographiques, et la comparaison a été faite pour un effet fort (80%), qui représente ici le taux d’infections réussies avec une puissance de 0,9 et un risque (alpha) de 0,05. Le nombre de lapins nécessaires pour la production est fixé à 2 lapins pour chaque inoculum bactérien, si 10 souches par an, nous aurons besoin de 20 lapins par an, soit 100 lapins sur 5 ans. En ce qui concerne l’isolement d’une souche clinique, la faible quantité et concentration de départ nous oblige à ne prévoir qu’un seul lapin par souche, ce qui correspond à 10 lapins par souche clinique par an, soit sur 5 ans: 50 lapins. Au total, sur 5 ans, nous pensons avoir recours à 150 lapins.

Raffinement

Par ailleurs, les animaux bénéficient d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin de leur assurer un bien-être optimal tout au long des études. Ce suivie est réalisé par du personnel habilité. Des éléments à ronger, de la paille à ronger et d'autres enrichissement seront fournis aux lapins afin qu’ils puissent se divertir. Les lapins seront hébergés dans des cages individuelles munies d’une plateforme non métallique répondant aux normes. Les manifestations de la douleur seront suivies rigoureusement grâce à une grille d’évaluation (voir annexe) (adaptée de celle de Morton et Griffiths 1985) et tout signe de douleur sera tout de même soulagé par une pommade anti-inflammatoire (Betneval® 0,1 %). De plus, une anesthésie profonde est préconisée avant l’euthanasie des lapins de laboratoire afin de réduire le plus possible la douleur et la détresse de l’animal. Cela est préconisé dans la directive du Parlement Européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques : (https://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=COM:2008:0135:FIN:FR:PDF ). La voie IM est la voie préconisée pour l’administration de la combinaison kétamine/xylazine chez le lapin, car elle est non douloureuse. Cela a été décrit par Lipman et al. (Lab Anim Sci. 1990, 40(4):395-8).

Choix des espèces

Le choix du lapin est basé sur les informations bibliographiques dans le domaine de laproduction et isolement d'agent de la syphilis. Le modèle lapin a déjà été prouvé et validé pour l'infection par Treponema pallidum. Nous allons utiliser des sujets adultes dont le volume des organes cibles de cette infection (testicule de lapin) est suffisant et capable de contenir l’infection sans induire de choc infectieux(septicémie) fatal.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, l'injection d'un candidat-médicament marqué à un isotope radioactif puis jusqu'à dix prélèvements sanguins, certaines étant isolées jusqu'à 96 heures en cage à métabolisme, pour suivre la distribution du produit dans les organes. Le porteur précise que ces études sont commandées par des entreprises clientes, selon un schéma répétitif de sélection de candidats-médicaments. Il indique que la tumeur peut atteindre 1500 mm3 ou se nécroser et que la toxicité peut entraîner une perte de poids supérieure à 20 pour cent, et affirme qu'aucun modèle ex vivo ou sur organoïdes ne reproduit la complexité physiologique de l'animal.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour unique objectif l’étude pharmacologique de sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif de faible énergie afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et fluides biologiques d’intérêt. La radioactivité est administrée à des doses ne présentant aucun effet nocif pour la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont que la molécule testée soit spécifique du tissu tumoral ciblé afin dans un second temps de développer des candidats-médicaments spécifiques de ces tumeurs à but diagnostique et/ou thérapeutique.

Procédures

Toutes les souris sont injectées en sous-cutanée avec des cellules cancéreuses ; fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec. Les souris recevront toutes une injection d'un candidat-médicament ; voies possibles : IV, SC, IM, IP, voie orale et intravésicale fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec à 3 min. A l'exception des souris en cage à métabolisme, toutes les souris seront prélevées en sang : - Cas du microsampling : fréquence max 3 fois sur 24 heures puis 1 fois par 24 heures pendant 7 jours = 10 prélèments durée/prélèvement : 1 min - Cas des autres techniques de prélèvements: fréquence max 2 fois avec un intervale minimum de 1 heure et maximum de 5 jours durée/prélèvement : 1 min Les souris en cage à métabolisme sont isolées pendant 96 heures au maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables inattendus sont: - tumeur aggressive dépassant les 1500 mm3 et/ou nécrosante entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés. - toxicité de la molécue testée se traduisant par une perte de poids >20% et/ou un état général dégradé ( poils piqués, réduction de la motricité , perte d'appétit...) entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés.

Devenir

Tous les organes d'intéret doivent être prélevés d'où l'impossibilité de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Ces étude ne peuvent pas être remplaceées étant donné que le système d'intéraction tumeur et molécule à tester est complexe et qu'à l'heure actuelle ex-vivo, sur organoides ou modélisation ne permet de reproduire la complexité physiologique de l'animal.

Réduction

Un groupe composé de 6 individus au maximum est nécessaire et suffisant à la détermination d'un coefficient de variation prenant en compte la variabilité interindividuelle. La mesure radioactive est très précise et répétable ne nécessitant pas l'intégration d'animaux supplémentaires. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place: Une une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant l'entrée dans le protocole ; Des conditions d'hébergement adéquates incluant un enrichissement avec du papier accordéon et des tunnels teintées un suivi quotidien des animaux ; la mise en place de méthodes d'anesthésie et d'euthanasie reconnues et validées ; l'instauration de points limites pertinents et précoces le respect des volumes d'injection , de la fréquence et des volumes de prélèvements sanguinss

Choix des espèces

Les souris sont des animaux préférentiellement utilisés dans les phases précoces de recherche de biodistribution tissulaire. Le choix de la souche et du sexe dépendra ensuite des résultats antérieurs de la Société cliente. Les animaux sont utilisés à l'âge de jeune adulte (environ 6-8 semaines). Le système immunitaire à cet âge est mature.

199 animaux non-humains, 162 souris et 37 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des matrices implantées sous la peau, les rats une ostéotomie du fémur avec injection d'un gel puis une thoracotomie terminale, pour tester des matériaux à base d'ARNm censés induire la réparation osseuse. Le porteur indique un risque de boiterie après la chirurgie osseuse et décrit la thoracotomie comme une procédure douloureuse réalisée sous fortes doses d'anesthésie en condition péri-mortem. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la réparation osseuse et conclut au recours "nécessaire" à l'animal.

Objectifs

Le processus spontané et naturel de réparation du tissu osseux est pris en défaut lors d’un traumatisme trop étendu, d’une non-consolidation, d’une résection osseuse de grande taille. Dans ces situations, l’autogreffe osseuse est le traitement de référence mais présente des inconvénients de morbidité et de quantité disponible. L’utilisation de biomatériaux est l’alternative usuelle pour la chirurgie orthopédique; néanmoins, ces matériaux inertes sont dépourvus de propriété biologique induisant la formation osseuse (dit ostéo-inductrice) limitant leur efficacité à la réparation de défaut de petite taille. Une approche en médecine régénérative osseuse consiste à rendre ces matériaux implantables biologiquement actifs, en leur associant des molécules induisant la formation osseuse. Les molécules les plus connues pour induire de l’os sont les protéines de la morphogénèse osseuse ou Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). La BMP2 délivrée sous forme de protéine est/a été utilisée en clinique dans certaines pathologies mais se heurte à des effets secondaires importants en raison des fortes doses utilisées ; elle a d’ailleurs été retirée du marché dans de nombreux pays. Il est nécessaire d’évaluer de nouvelles alternatives à l’utilisation de BMP-2 sous forme protéique. Le projet propose d’évaluer le potentiel d’induction de formation osseuse de matériaux chargés non pas de protéines mais d’ARNm codant pour les protéines de BMPs (les ARNm sont des molécules, en principe produites dans les cellules, qui permettent de transformer l’information génétique situé dans l’ADN (dans le noyau) en protéines (cf https://www.afm-telethon.fr/glossaire/arn-messager-2717)); dans ce projet, nous synthétiserons l’ARNm codant pour différentes types de BMP et l’associerons à un gel ; l’utilisation d’ARNm présente de nombreux avantages tels que de délivrer des doses infiniment plus faibles qu'en utilisant des protéines de BMP. Une première étape consistera à évaluer le potentiel de différentes types de BMP (sous forme ARNm) à induire du tissu osseux en site sous cutané chez la souris (potentiel ostéoinducteur) ; cette évaluation se fera sur des animaux mâles et femelles pour évaluer l’impact du sexe de l’animal hôte sur la réponse biologique des BMPs. La seconde étape consistera à valider le potentiel de réparation d’u gel chargé d’ARNm codant pour la BMP la plus efficace dans un grand défaut osseux chez le rat.

Bénéfices attendus

D’un point de vue technologique, notre projet donnera des données quant à l’intérêt de cette technologie à base d’ARNm pour une application d’ingénierie tissulaire. Pour la première fois, nous connaitrons le potentiel ostéoinducteur de différents homo- et hétérodimères de BMP (ces protéines sont composées de 2 sous-unités identiques (homodimère) ou différentes (hétérodimère)) délivrés sous forme d'ARNm en comparaison avec la stratégie actuelle en clinique, mais néanmoins controversée, consistant à utiliser la protéine recombinante rhBMP2. Nous obtiendrons aussi des véritables données sur l'influence du sexe de l’animal receveur (et donc présence ou non d’œstrogènes, hormones qui modulent la signalisation des BMP dans les cellules ostéoprogénitrices) sur la réponse des BMPs. Enfin, d’un point de vue médical, ce projet permettra d’évaluer une nouvelle stratégie pour la réparation de grands défauts osseux.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (4X; durée 15 min) 3- Imagerie en bioluminescence in vivo (8X; durée 40 min) Pour les rats : 1- Osteotectomie diaphysaire fémorale avec injection d’un gel ostéoinducteur (1X, durée 60 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) ; 3- Thoracotomie suivie d'une perfusion intracardiaque d'un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Les implantations sous-cutanées sont généralement bien tolérées chez la souris; il sera en éponge de collagène qui s’écrase. Un effet indésirable est l’élimination des points de suture trop rapidement (le lendemain) ; si la cicatrice est belle, rien ne sera fait ; si la cicatrice est mal fermée (> 2 mm), l’animal sera anesthésié sous isoflurane, et les bords seront recoupés et resuturés. Pour les implantations intra-osseuses, un risque est l’apparition d’une boiterie de l’animal post-chirurgie ; les animaux seront étroitement surveillés durant les 3 jours post-chirurgie. Il peut aussi arriver une faillite de l’ostéosynthèse (vis se dévissant); tous les animaux seront scannés toutes les 2 semaines, permettant de contrôler l’ostéosynthèse ; en cas de faillite, nous surveillerons étroitement la démarche de l’animal ; si une persistance de boiterie apparait, il sera mis à mort. Ce projet comprend aussi une thoracotomie en point terminal (ouverture de la cage thoracique pour accéder au coeur). La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des explants ou analyses de l'expression génique)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Les études quantitatives nécessiteront 8 animaux pour obtenir un pouvoir statistique suffisant, compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo. Pour les études en site ectopique 4 implants ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. Pour les études en site ectopique 4 ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. L’imagerie noninvasive pour petits animaux (suivi de l’expression d’une protéine modèle luciférase par bioluminescence (phénomène d’émission de lumière telle qu’observée chez les vers luisants) et de la formation osseuse par microscanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et permet ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant les 3 premiers jours. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement (2X/j pendant 3 jours, puis 1X/j pendant 3 jours puis finalement 2 X/semaine jusqu'à la fin de l'expérimentation). Pour chaque analyse (micro-scanner ou bio-imageur) les souris seront anesthésiées par inhalation à l’Isoflurane dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris et rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, scorés et reportés sur une feuille de score permettant d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté, boiterie) et en cas d'atteinte des points limites sont listées sur cette feuille de score.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris Swiss. Le modèle souris permet d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants chargés d’un facteur de croissance induisant la formation osseuse (en particulier la Bone Morphogenetic Protein 2/ BMP2), aussi bien que le rat ; la souris a l’avantage d’être plus petite et moins chère. La souche SWISS est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin et donc diminuant le biais d’utiliser une population trop homogène ; par ailleurs, son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin. Pour les souris, jeunes adultes de 8 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont le potentiel de réparation osseux est optimal. Pour les rats, jeunes adultes (12 semaines) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain sous les flancs et de l'estradiol dans l'eau de boisson, puis des antiestrogènes, pour étudier une protéine liée à la résistance à l'hormonothérapie chez les patientes. Le porteur indique que la tumeur constitue le point limite, son volume au-delà de 500 mm3 déclenchant l'arrêt du protocole et le prélèvement. Il affirme que les travaux in vitro ne reproduisent pas l'activité de cette protéine et présente la xénogreffe comme "nécessaire".

Objectifs

Les patientes atteintes de cancer du sein présentent une tumeur exprimant le récepteur aux estrogènes ERalpha et sont traitées par hormonothérapie. En clinique les traitements de ces patientes par les antiestrogènes (Tamoxifen et Fulvestrant) diminuent le taux de rechute et améliorent la survie des patientes. Le Tamoxifen est administré chez les patientes pré-ménopausées et en seconde ligne, le Fulvestrant est utilisé dans le traitement du cancer du sein lorsqu'il est localement avancé. L’efficacité de ces thérapies est limitée par la résistance à ces traitements, car jusqu’à 40% de ces tumeurs rechutent après les traitements. Ceci rend nécessaire les études cliniques qui évaluent les bénéfices des traitements sur les rechutes tardives. Nous avons montré qu’une protéine fortement présente dans les tumeurs mammaires module l’activité du récepteur ERalpha dans ces tumeurs et affecte ainsi la réponse des patientes aux traitements. Le traitement par les antiestrogènes induirait l’activité bénéfique de cette protéine chez les patientes sensibles mais pas chez les patientes résistantes. Le modèle murin reproduit la réponse tumorale observée chez les patientes sensibles aux traitements. Ceci permet l’étude des mécanismes de la sensibilité aux antiestrogènes après prélèvement de la tumeur murine. L’objectif du projet est de comprendre le rôle de cette protéine dans la réponse des patientes aux antiestrogènes.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle murin de xénogreffes qui mime la tumeur des patientes hormonosensibles permettra de mieux comprendre la résistance au traitement par le Tamoxifen et par le Fulvestrant et donc d'identifier des biomarqueurs de la sensibilité des patientes à l’hormonothérapie, d’adapter les traitements des patientes ayant un cancer du sein hormonosensible et donc d'entrevoir de nouvelles thérapies.

Procédures

Les animaux sont inoculés avec des cellules tumorales sous la peau des flancs en début des études et sont supplémentés par de l’estradiol dans l’eau de boisson, pour la durée de l'étude. L'injection des cellules tumorales sur les 2 flancs de la souris nécessite 1 minute d'endormissement de l'animal, placé sous anesthésie gazeuse (isoflurane/air). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. En fin de protocole, après sédation de la souris et dislocation cervicale, les tumeurs seront prélevées post-mortem. Le temps d'endormissement pour la sédation des souris par anesthésie chimique (Kétamine/)Rompun) est de 5 à 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les souris sont ceux dus à l’inoculation de cellules tumorales chez des animaux immunodéficients. Le volume tumoral est un point limite (>500 mm3 ) déterminant l’arrêt du protocole et le prélèvement des tumeurs. Les souris sont également supplémentées par des antiestrogènes et par des inhibiteurs de leur activité. Les traitements par les antiestrogènes sont donnés dans l’eau de boisson des souris ou par une injection hebdomadaire sous la peau de l’animal, ce qui limite les interventions par injection.

Devenir

Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. En fin de protocole, après sédation de la souris, les tumeurs seront prélevées post-mortem après dislocation cervicale, afin d'étudier les modifications induites dans les tumeurs des souris recevant les traitements comparativement aux souris non traitées.

Remplacement

Nos travaux menés in vitro dans des cellules de cancer du sein suggèrent l’activité bénéfique d’une protéine dans la réponse aux antiestrogènes chez les patientes atteintes d'un cancer du sein hormonosensible. Ces travaux in vitro ne permettant pas de reproduire l'activité de la protéine telle qu'elle est observée dans les tumeurs chez les patientes, des études in vivo seront faites grâce à un modèle de greffe de cellules humaines de cancer du sein, chez la souris. Ce modèle murin dit de "xénogreffe" mime ainsi la tumeur mammaire humaine et est nécessaire à l’observation des caractères de la tumeur chez les patientes.

Réduction

Les études menées au préalable dans des lignées de cellules de cancer du sein ont permis d'étudier l’effet antitumoral des antiestrogènes. Cependant, ces travaux in vitro n'ont pas reproduit l'activité de la protéine telle qu'elle a été observée dans les tumeurs des patientes. Le recours au modèle de xénogreffe de cellules de cancer du sein chez la souris est nécessaire. La formation de tumeur chez les souris est d’environ 80% dans ce modèle de xénogreffe murin de cellules de cancer du sein hormonosensible. Nous étudierons l'inhibition de la croissance tumorale chez les souris par les traitements aux antiestrogènes et comparerons cette croissance entre les souris traitées et non traitées. Pour mesurer une différence significative des traitements sur la croissance des tumeurs, entre les groupes de souris traitées et celles ne recevant pas le traitement, il faut 10 souris Balbc/Nude par groupe. L'étude comporte 12 groupes et nécessite donc 120 souris.

Raffinement

Les souris cohabitent dans des cages à couvercle filtrant, dans des conditions d’humidité, de lumière et de ventilation adéquates avec un environnement enrichi par les petites cabanes-niches et du coton. sous surveillance journalière. Tout élément rentrant en contact avec la souris est stérile. Le change de la litière et de la cage s’effectue une fois par semaine par le personnel compétent de l’animalerie. Lors de l’injection des cellules tumorales, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Les traitements par les inhibiteurs des antiestrogènes sont adaptés d'après des études de la littérature scientifique qui préconisent l'inoculation de ces inhibiteurs dans l'huile de maïs stérile pour limiter les effets irritants et allergisants. L’observation de signes de douleur ou de mal être (prostration, perte de poids, morsure) entraînera la sortie du protocole de l’animal. En cas de signes de stress associés à un des points limites, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale avec une sédation préalable.

Choix des espèces

La souris Balbc/Nude est couramment utilisée en oncologie car l’inoculation de cellules tumorales humaines n’induit pas le rejet de la xénogreffe dans cette espèce. Les études seront réalisées avec des souris femelles car elles portent sur le cancer du sein et chez des animaux de 8 semaines, car à cet âge, l’ensemble des fonctions est mature.

800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des composés sont injectés dans le derme puis stimulés par voie électrique ou lumineuse pendant jusqu'à soixante jours, pour poser les bases d'une interface sensorielle destinée à des prothèses humaines. Le porteur indique des nuisances possibles comme une inflammation, des lésions aux sites de stimulation, une modification de la démarche et des signes d'automutilation des doigts, et précise qu'aucun antidouleur ne sera administré car il fausserait la réponse des nerfs mesurée. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour ce projet mené pour un client.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle interface sensorielle, c.a.d., étudier la capacité de nouveaux composés à transmettre/moduler localement un signal provenant de l’extérieur, envoyé au système nerveux périphérique sensoriel, lorsqu’ils sont placés au niveau du derme de l’animal (comme un tatouage) et exposés à une stimulation physique en surface de la peau (une stimulation électrique ou lumineuse).

Bénéfices attendus

La vision, l'ouïe, le toucher, l'odorat et la perception gustative nous relient au monde extérieur. La perte de perception sensorielle affecte notre qualité de vie à des degrés divers. Les dispositifs de restauration ou de substitution sensorielle apportent l'espoir de rétablir totalement les fonctions sensorielles déficientes humaine. Par exemple, des personnes ayant perdu l’usage d’un membre et portant une prothèse ont l’espoir de retrouver le sens du toucher. Dans ce contexte, les interfaces nerveuses périphériques sensorielles doivent pouvoir activer chaque fibre nerveuse pour tenter de reproduire le sens du toucher tel qu’il serait ressenti si le membre était intact. Concernant la substitution sensorielle (i.e., l’utilisation d’un sens tel que le toucher ou l’ouïe pour assister ou pour remplacer un autre sens tel que la vision, comme l’écriture braille qui utilise le sens du toucher pour l’écriture et la lecture), l’interface doit être adapté à la quantité d’information à transmettre. Ce projet vise à placer les bases pour la conception d’une nouvelle interface sensorielle en étudiant la possibilité de connecter les composés d’intérêts aux fibres sensorielles situées dans le derme (ce qui permettra d’anticiper la résolution spatiale de l’interface, liée à la densité de connexion) et la vitesse de propagation du signal lorsque ces connexions seront stimulées (ce qui permettra d’anticiper la résolution temporelle de l’interface).

Procédures

L'ensemble des animaux subiront une injection intradermique ou sous-cutanée (1 à 5 sites) sous anesthésie gazeuse. Chaque injection dure environ 2 minutes. Un test pour mesurer la conductivité nerveuse dure au maximum 5 minutes et il est réalisé sous anesthésie gazeuse. 3 stimulations la première semaine (une à J0 (baseline) et deux supplémentaires), et 1 stimulation par semaine pour les semaines suivantes. La durée maximale de l’étude est établie à 60 jours.

Impact sur les animaux

Au vu des interventions subits par les animaux des nuisances peuvent apparaitre comme : une inflammation au niveau du site d’injection, des lésions au niveau de sites de stimulation, une modification de la démarche ainsi hypoactivité. Les animaux pourraient également présenter des signes de mutilation des doigts ainsi qu'une perte de masse qui feront donc l'objet d'un suivi.

Devenir

Tous les animaux sont tous euthanasiés à la fin de la procédure soit parce qu’ils subissent des prélèvements de sang ou de tissus soit en raison du fait qu’ils ont été traités aux composés de recherche dont l’inoccuité à long terme reste inconnu.

Remplacement

Aucune méthode de remplacement n’est disponibleà l’heure actuelle pour étudier la problématique du présent projet, car la réponse du système nerveux périphérique sensoriel à sa stimulation met en jeu des interactions complexes in vivo.Toute fois si des informations supplémentaires nous sont apportés par le client, elles seront intégrées et prises en compte.

Réduction

Nous cherchons toujours un compromis expérimental qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisé. Par exemple, nous favorisons le test de plusieurs conditions expérimentales en parallèle (typiquement différents composés sont testés à un ou plusieurs sites d’injection dans une étude pour réduire le nombre d’animaux contrôles). En règle générale, chaque groupe expérimental d’un plan d’étude se compose de 8 animaux afin d’obtenir un résultat statistiquement satisfaisant. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous envisageons également de retirer le groupe contrôle si les différentes études sont basées sur le même véhicule et de prendre les données historiques pour réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (2-5 individus). Les manipulations sont faites par du personnel compétent pour détecter les potentielles points limites ou points d’arrêts, l’objectif étant de soustraire l’animal aux souffrances inutiles. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. L’injection des composés et des véhicules mais également les mesures sont réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter que l’animal ne bouge pendant le traitement. L’administration d’agents anti-douleur ou anti-inflammatoire n’est pas envisagée lors des études car la prise de ces médicaments pourrait compromettre les résultats de l’étude en modulant eux-mêmes la réponse des nerfs sensoriels par rapport aux valeurs de référence lors des expériences de stimulation.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Nous utilisons généralement des femelles car celles--ci présentent un déclin moins prononcé de la fonction du nerf périphérique sensoriel lors du vieillissement comparativement aux mâles. Elles prendront moins de poids que des mâles de la même espèce durant la période du projet (60 jours). En effet, il est connu comme chez l’homme que l‘index de masse corporelle influence la conduction nerveuse.

572 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent une chirurgie d'injection intracérébrale, 180 reçoivent une canule fixée au crâne reliée à une source lumineuse, et 540 sont soumis à une restriction alimentaire jusqu'à douze semaines pour les maintenir à 90 à 95 % de leur poids, afin d'étudier comment le cerveau calcule la valeur d'une décision. Le porteur indique que la chirurgie présente des risques d'infection, d'hypothermie et de douleur. Il affirme que ces fonctions cognitives ne peuvent s'étudier que sur des "organismes entiers" et retient le rat pour ses capacités jugées "plus évoluées que la souris".

Objectifs

Chaque jour, nous prenons des décisions pour maximiser la récompense. Pour y parvenir, nous et les autres animaux devons déterminer la valeur des différentes options. Les preuves suggèrent que cette évaluation n'est pas nécessairement guidée par la valeur absolue ou attendue d'une option, mais au contraire, les valeurs de décision sont souvent relatives et dépendent du contexte dans lequel elles sont présentées. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment la valeur est calculée dans le cerveau des mammifères pour guider la prise de décision en s'appuyant sur l'existence de processus cognitifs de base similaires chez les rongeurs et les humains.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira une compréhension importante de la façon dont la valeur est calculée dans le cerveau pour guider la prise de décision. Un certain nombre de troubles neuropsychiatriques sont caractérisés par des déficits cognitifs, y compris de faibles capacités de prise de décision. Cette recherche nous permet d'examiner comment le cerveau prend des décisions et comment la communication entre les régions corticales oriente nos décisions. Par conséquent, ce projet améliorera non seulement notre compréhension fondamentale des processus cognitifs complexes, mais il pourrait également nous aider à mieux comprendre les troubles neuropsychiatriques impliquant des déficits dans la prise de décision.

Procédures

Dans ce projet, tous les rats subiront une intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et 180 rats seront également implantés avec une petite canule fixée au crâne. Pour ces 180 rats, une source lumineuse sera connectée à la canule pendant la tâche comportementale. Tous les rats seront mis à mort pour des analyses post-mortem. La majorité des rats (540/572) recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire pour une durée maximale de 12 semaines.

Impact sur les animaux

Tous les rats subiront une intervention chirurgicale qui présente des risques potentiels d'infection, d'hypothermie, et de douleur. Les tâches cognitives nécessitent une restriction alimentaire légère pendant 12 semaines. Chaque jour, les rats sont pesés et reçoivent une quantité de nourriture allouée pour les maintenir à 90-95% de leur poids normal (~ 12-15 grammes de nourriture par jour).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche in silico faisant appel à la modélisation informatique est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe (15 rats/groupe) pour obtenir des résultats significatifs et exploitable. Donc le nombre total d'animaux requis pour ce projet est de 512 rats sur 5 ans. Le recours à des méthodes réversibles permet de limiter fortement le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière (vérifié chaque jour). Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés (ex. critères de perte de poids, comportement anormal) pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont en effet largement conservés à travers les espèces de mammifères. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car ils sont grégaires, intelligents et présentent de nombreuses capacités comportementales similaires aux sujets humains. Les analyses anatomiques et fonctionnelles détaillées utilisées dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de deux mois environ au début des expériences. Le projet consiste à identifier les principes de fonctionnement des circuits neuronaux sous-tendant la prise de décision. Les animaux utilisés seront donc tous adultes âgés de deux mois environ au début des expériences.