Procédures modérées

1 895 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée, d'autres gardés pour l'élevage ou adoptés. Des lapines reçoivent des injections hormonales et des transferts d'embryons sous anesthésie, des mâles sont vasectomisés, pour renouveler des lignées transgéniques produisant des protéines thérapeutiques humaines dans leur lait. Le porteur indique que les lapines donneuses de gamètes sont tuées, leurs voies génitales devant être prélevées entières, et affirme que les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype anormal. Le lait des lapines modifiées sert à produire des médicaments.

Objectifs

L’Homme peut être atteint de maladies génétiques, affectant la synthèse par notre corps, de protéines indispensables à la vie. Selon le gène et les modifications de l’ADN, la protéine qui aurait dû être produite peut être absente, ou présente mais non fonctionnelle. L’administration de la protéine manquante sous forme de médicament est alors la meilleure thérapie. Nous avons choisi de produire des protéines recombinantes (car produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) à partir de la glande mammaire de lapines génétiquement modifiées, pour les récupérer dans le lait lors de la lactation. Les protéines recombinantes seront ensuite purifiées et deviendront des médicaments. Ce dossier présente nos activités de recherche : 1. l'optimisation de la production de protéines recombinantes. En effet, nous voulons améliorer la qualité et l’efficacité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques, en modifiant leur génome par transgénèse, dans des embryons au stade une cellule. 2. notre société avait créé des lapines transgéniques produisant dans leur lait, l’inhibiteur C1 estérase recombinant (InhC1), utilisé comme médicament pour soigner les patients souffrant d’angioœdème héréditaire (AOH). Cette maladie génétique rare, causée par le déficit de production de la protéine inhibiteur C1 estérase, se caractérise par la survenue d'œdèmes sous-cutanés et/ou sous-muqueux, entrainant un gonflement localisé des tissus, de fortes douleurs abdominales et des décès (25% des cas) sans traitement approprié. Du fait de l’augmentation de la demande de l’InhC1 pour traiter l’AOH, les tests précliniques en cours pour d’autres pathologies (Covid-19) et pour renouveler les lapines transgéniques de 4ème génération produisant l’InhC1 dans notre animalerie de production, nous avons besoin de régénérer des lapins transgéniques de 2èmes et 3èmes générations à partir de semence transgénique de mâles des 1ères et 2èmes générations. Leur sperme avait été congelé il y a plus de 20 ans et ne parvient plus à féconder des lapines lors d’inséminations artificielles. Pour pallier ce problème, nous devons utiliser l’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, plus efficace que la fécondation in vitro) qui permet d’introduire un spermatozoïde dans l’ovule pour le féconder, puis le transférer dans l’utérus de lapines receveuses, pour régénérer des animaux transgéniques InhC1 de 2ème et 3èmes générations.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques pour l'Homme en utilisant des lapines trangéniques, ce qui nous a permis de commercialiser en 2014 un médicament plus efficace que les autres médicaments autorisés pour traiter les crises d’angioedème héréditaire (AOH) : notre protéine recombinante est identique à la protéine humaine et hautement purifiée alors que les produits concurrents sont eux isolés à partir de plasma humain, ne sont pas aussi bien purifiés et ne garantissent pas un médicament aussi sûr . Aujourd'hui, nous souhaitons améliorer la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques en augmentant le niveau et l'efficacité de la production de la protéine d’intérêt, grâce à des outils de modifications du génome plus efficaces. Cela aura pour effet d’augmenter la durée de vie de la protéine recombinante dans l’organisme du patient et ainsi diminuer le nombre d’injections et la dose à injecter. Ces bénéfices pour l’Homme auront des avantages pour l’animal car produire des protéines recombinantes de meilleure qualité nous permettra de diminuer le nombre d'animaux dont nous aurions eu besoin pour produire ce médicament. Le deuxième bénéfice attendu de ce projet est de régénérer les lignées d'animaux transgéniques produisant notre médicament commercialisé afin de pouvoir soigner le plus de patients possibles, de réaliser de nouvelles études pré-cliniques et cliniques car cette protéine a un grand potentiel thérapeutique pour d'autres maladies comme le Covid-19.

Procédures

Les animaux vigiles recevront des injections sous-cutanées, intra-musculaires et des injections intraveineuses mais dans ce cas, sous anesthésie locale. Pour la procédure 1, obtention de gamètes femelles, les lapines vigiles reçoivent 2 injections sous-cutanées par jour pendant 2,5 jours, 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale. Cette procédure est prévue pour 1006 femelles. Pour la procédure n°2, vasectomie, 10 mâles subiront une seule chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Pour la procédure n°3, transfert d’embryons chez une lapine receveuse, les lapines vigiles reçoivent 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale, 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées (liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires) et une chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Cette procédure est prévue pour 440 femelles. - Pour la procédure n°4, Césarienne, les lapines ont une chirurgie sous anesthésie générale (30 min) et reçoivent 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées, liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires. Cette procédure est estimée pour 22 femelles - Pour la procédure n°5, prélèvements de sang, 212 lapins vigiles auront au maximum 2 prélèvements de sang (< 2 min) au cours de leur vie. - Pour la procédure n°6, prélèvement de lait, 205 lapines recevront une injection en intra-veineuse sous anesthésie locale, 1 fois par jour pendant la durée de la lactation, de J3 à J30 après la mise-bas, et ce uniquement les jours de semaine. Elles sont donc traites une fois par jour (10 min) pendant 20 jours environ. Concernant l’euthanasie des animaux, elle se fait majoritairement en intraveineuse mais il peut arriver qu’elle soit réalisée en intracardiaque sur des animaux précédemment anesthésiés (par une injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xilazyne).

Impact sur les animaux

Les lignées d'animaux transgéniques créées et renouvellées ne subiront aucune nuisance ou effet indésirable car les outils de biologie moléculaire que nous utilisons sont de classe 1, c'est à dire, sans effet sur l'Homme, les animaux et l'environnement. Les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype différent des animaux de génotype sauvage, seule la composition du lait produit lors de la lactation de la lapine transgénique est légèrement différente, et n'entraine d'ailleurs aucun trouble de croissance des lapereaux.

Devenir

La procédure obtention de gamètes femelles, est classé légère mais suivie d'une euthanasie car nous ne pouvons pas récupérer les gamètes sans récupérer les tractus génitaux. Cela implique de devoir euthanasier la lapine donneuse de gamètes. Concernant la procédure 2, vasectomie, nous avons besoin des mâles pour qu’ils stimulent l’ovulation des lapines donneuses d’ovocytes, mais sans les féconder, c’est pourquoi les animaux seront gardés en vie après avoir été opérés. Le transfert d’embryon dans une lapine receveuse a pour but de placer des embryons dans l’utérus d’une femelle pour qu’ils puissent se développer et devenir des lapereaux. Les lapines opérées dans le cadre de cette procédure seront gardées en vie pendant quelques mois et nous les utiliserons ensuite soit pour un nouveau transfert soit pour la procédure « obtention de gamètes femelles ». La césarienne, qui ne sera réalisée qu’en cas de difficulté de la lapine à mettre bas, a le même but : nous permettre d’obtenir des lapereaux vivants, qui auront besoin de leur mère pour être nourris et élevés. Les procédures qui consistent à prélever du sang et du lait sur les lapins, ont pour but de nous permettre de déterminer si nous avons atteints nos objectifs. Ces animaux seront laissés en vie après la procédure et remis dans l’élevage.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. Concernant le projet de renouvellement, nous avons essayé d’inséminer des lapines avec de la semence décongelée de mâles transgéniques InhC1 de 1ères et 2èmes générations mais avec un succès très limité. Le stock de paillettes de semence s’épuisant, il est nécessaire de trouver une alternative : l’ICSI (injection intracytoplasmique de sperme) .

Réduction

Pour l'optimisation de la production des protéines, nous mettons au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous souhaitons à terme, pouvoir tester tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir pré-sélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet. Pendant cette mise au point, nous testons l’efficacité de nouveaux outils d’ingéniérie génétique en laissant en culture des embryons micro-injectés, jusqu’à ce qu’ils aient 5 jours (stable morulae/blastocyste) et nous réalisons ensuite leur génotypage pour vérifier l’efficacité des outils choisis . Cela nous permet de diminuer le nombre d’animaux utilisées pour un transfert d’embryon, de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Une fois les nouveaux outils validés, nous réitérons l’expérience en transférant cette fois les embryons micro-injectés dans des lapines dites receveuses. Les cibles génétiques sélectionnées concernent soit la production des protéines récombinantes soit l’amelioration de glycosylation de ces protéines récombinants. Les lapines reçoivent un traitement de super-ovulation qui, en moyenne, double le nombre d’ovocytes émis lors de l’ovulation (passe de 15 à 30, en moyenne), ce qui permet de diminuer par deux le nombre de lapines à utiliser. Après transfert, gestation et/ou lactation, les femelles receveuses d’embryons sont ré-utilisées en tant que femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons. L’optimisation de l’utilisation des lapines nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés réaliser la procédure « obtention de gamètes femelles ».

Raffinement

Les lapins reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de mettre en œuvre leur comportement naturel de se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux. Les gestes invasifs associés aux procédures sont faits sous anesthésie locale et/ou générale et les animaux recoivent des anti-inflammatoires locaux et généraux après chaque intervention. Notre protocole post-opératoire est mis en œuvre pour assurer le plus de confort et le moins de douleur à l’animal par l’application de produits cicatrisants et désinfectants en spray (pour ne pas toucher la zone potentiellement douloureuse), par l'injection d’anti-inflammatoire les 3 jours suivants l’opération, par la pose d’une collerette pour éviter que l’animal ne mange ses points de suture, pendant 10 jours environ après l’opération. La quantité d'aliment est augmentée pour que la lapine puisse accéder à sa nourriture facilement.

Choix des espèces

Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (32-33 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapines sont utilisées dès qu'elles ont atteint la maturité sexuelle, à 4 mois : Elles peuvent être utilisées comme receveuse d'embryons, par réimplantation chirurgicale d'embryons. Elles peuvent être super-ovulées et accouplées (ou non) avec des mâles pour être fécondées et être donneuses de gamètes. Les mâles sont utilisés comme reproducteurs à partir de 5 mois, lorsqu’ils ont atteint la maturité sexuelle, pour générer une descendance.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrose du genou leur est provoquée par injection d'une substance, la MIA, sous anesthésie, pour tester un gel de chitosan censé limiter les lésions. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de soulager la douleur par des antalgiques, ceux-ci fausseraient l'inflammation et les lésions recherchées, et décrit une douleur modérée liée au développement de la pathologie. Les rats sont tués quatorze jours après l'injection pour prélever et analyser les genoux.

Objectifs

L’arthrose du genou est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30 % de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. Des études récentes ont montré que la progression de l'arthrose pouvait significativement être liée au stress oxydatif et aux radicaux libres. En effet, la production de radicaux libres a été trouvée élevée chez les patients atteints d'arthrose. Notre étude vise à cibler la voie de signalisation du stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose en évaluant l’effet d'une viscosupplémentation par un gel chélateur à base de chitosan (production d’un composé non toxique à partir des radicaux libres) sur le développement de la pathologie arthrosique. Le modèle d’arthrose utilisé est un modèle expérimental d’arthrose chez le rat par injection intra-articulaire de mono-iodoacétate de sodium (MIA). L’injection intra-articulaire de MIA entraine l’apparition rapide en 14 jours de lésions articulaires similaires aux lésions arthrosiques.

Bénéfices attendus

En ciblant la voie de signalisation de ce stress oxydatif impliquée dans la pathologie de l'arthrose, la viscosupplémentation par injection intra-articulaire locale à l'aide d'un gel chélateur de chitosan (permettant la production d’un composé non toxique) pourrait donc permettre de soulager les patients et de retarder voir de supprimer l'apparition des lésions arthrosiques, évitant ou retardant ainsi la mise en place d'une prothèse (seule technique efficace pour le moment).

Procédures

Tous les animaux subiront 2 injections intra-articulaires à J0 et à J3 (d'une durée de moins d'une minute chacune), qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. La première injection de MIA va permettre d'induire l'arthrose expérimentale. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans ce modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. L'accès à la nourriture et à l'eau n'est pas impacté et les animaux conservent une mobilité et un comportement social normal. La deuxième injection intra-articulaire de gel à base de chitosan n'induit pas de douleur "post-injection". La formulation du gel de chitosan n'est pas toxique pour l'animal et n'induit aucun signe de douleur.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosupplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale, ce qui permettra de supprimer la douleur de l'injection. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu en termes de douleur. Il n’est cependant pas possible de diminuer la douleur par l’administration d’antalgiques, car ces molécules auraient une influence sur l’inflammation et l’apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Il pourra y avoir également un handicap moteur d'ordre modéré.

Devenir

A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort 14 jours après l'injection de MIA. Chaque genou (droit et gauche) sera ensuite prélevé pour des analyses histologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuses à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlatéral. Le liquide synovial sera récupéré pour la réalisation des dosages des médiateurs de l'inflammation. La synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation via un score de Rooney.

Remplacement

Afin de développer de nouveaux produits dans le traitement des symptômes de l'arthrose (douleur et inflammation), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer leur efficacité avant de les tester chez l'Homme. Il n'y a pas de méthode «in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l’intérêt d’une viscosuplémentation dans un modèle d’arthrose expérimentale sur les lésions arthrosiques.

Réduction

Dans un souci d’éthique, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera injecté de façon à conserver le genou gauche comme témoin. Pour le traitement de nos données, le test ANOVA est la méthode de référence pour l'analyse statistique. Tous les scores histologiques (MANKIN pour les lésions du cartilage et ROONEY pour l'inflammation de la membrane synoviale) seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales (type miels pops). Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par injection de MIA est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure à 20% sur 3 jours après injection de MIA étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

Le rat est courament utilisé dans l'arthrose et ce modèle mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux utilisés seront livrés à l'âge de 5 semaines (150 - 175 g) et auront une semaine d'acclimatation. L'arthrose sera induite sur des animaux agés de 6 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 14 jours après l'induction de l'arthrose pour réaliser des explorations histologiques et immunohistologiques des lésions arthrosiques et pour évaluer le degré d'inflammation.

Porteuses d'une mutation d'un canal calcique décrite dans une maladie du cervelet de l'enfant, les souris de ce projet peuvent développer une atrophie du cervelet, une ataxie et des crises d'épilepsie de type absence. 438 souris vont être utilisées, 357 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 81 un niveau modéré. 294 passent pendant environ un mois des tests moteurs et cognitifs dits "standards" que le résumé ne nomme pas, dont 70 après une chirurgie stéréotaxique pour injecter un adénovirus qui déclenche l'expression du canal muté, 81 reçoivent des électrodes implantées dans le crâne pour un EEG de six heures par semaine pendant un mois, et 63 des séances d'échographie photoacoustique sous anesthésie. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et leur cervelet.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.

Procédures

Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.

Remplacement

Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.

750 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des tumeurs de glioblastome ou pancréatiques leur sont implantées, suivies d'injections de nanoparticules et de prélèvements sanguins répétés, pour tester la distribution de ces nanoparticules et leur accumulation dans les tumeurs en vue d'améliorer la radiothérapie. Le porteur cite comme effets attendus l'immunodéficience des souris, les douleurs des injections et le stress des contentions et anesthésies. Les animaux sont ensuite tués sous anesthésie pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le but de ce projet est d’améliorer l’efficacité de la radiothérapie en utillisant des nanoparticules scintillatrices. L'objectif de l'étude proposée ici est de tester la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique, leur potentiel à s'accumuler dans les tumeurs, ainsi que le délai d'injection qui permet une accumulation optimale des composés dans les tumeurs. Les nanoparticules utilisées seront fluorescentes (fluorescence intrinsèque ou nanoparticules marquées avec un fluorophore). Dans ce cadre, nous prévoyons l'étude in vivo de 10 nanoparticules (5 nanoparticules pour des modèles de glioblastome et 5 nanoparticules pour des modèles pancréatiques). Nous étudierons deux modèles de glioblastomes (un modèle sous cutané implanté chez la souris et un modèle orthotopique implanté chez le rat) et deux modèles pancréatiques (un modèle sous cutané et un modèle orthotopique implanté chez la souris).

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer le bénéfice d'un nouveau mode de radiothérapie, basé sur des nanoparticules qui boostent l'effet de la radiothérapie, dans des modèles particulièrement agressifs et pour lesquels trop peu de solutions thérapeutiques existent. En cas de succès, ce type de traitement pourrait être proposé pour un grand nombre de pathologies tumorales.

Procédures

Pour l'étude 1: Du sang sera prélevé à différents temps après injection ( 30 minutes / 7 Jours / 14 Jours ) pour analyses ex vivo. Les prélèvement seront de 200μL pour les souris et 500μL pour les rats. Pour l'étude 2: Les prélèvements seront effectués 15 min après l'injection, puis à 1h, 2h, 3h, 5h et 7 heures post-injection. La quantité totale de sang prélevé sera d'environ 180μL soit moins de 1% du poids total de nos souris et moins de 1 millième du poids de nos rats. La mesure de 24h sera réalisée avec le sang récupéré lors du sacrifice. Pour l'étude 4: 500uL de sang seront prélevés dans la veine caudale des rats 5 heures et 24 heures après l’injection de nanoparticules. Ce volume total représente moins de 10% du volume de sang de nos rats et ne devrait ainsi pas entraîner de contraintes pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.

Devenir

Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des souris avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang. L'euthanasie des rats sera effectuée par injection intra-cardiale de barbituriques (Exagon 1ml/kg) sous anesthésie gazeuse, avant le prélèvement de pièces anatomiques.

Remplacement

Ce projet a été initié depuis 2017. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les caractéristiques des nanoparticules ont été réalisés en solution. L’ensemble des nanoparticules testées in vivo aura été préalablement testé et validé in vitro sur des cultures de cellules tumorales (2D / 3D). Seules les molécules les plus performantes seront testées chez l’animal. Cette étape d’expérimentation animale permet de progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.

Réduction

La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 6 animaux par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables (ANOVA). Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la soufrance et l'angoisse notament en mettant en place des points limites. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuze, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation.

Choix des espèces

Les souris Nudes permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les rats sont intéressants dans notre cas du fait de leur taille plus importante ; les injection intracérébrales sont plus faciles à mettre en œuvre de façon fiable et reproductible. Souris nudes de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines. Rats Fischer mâles de 6-8 semaines. Les rats mâles sont utilisés entre 6 à 8 semaines après la naissance, ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficiles à gérer en animalerie.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique puis des prélèvements de sang répétés sous anesthésie, certaines souris modèles de la maladie de Pompe développant une faiblesse musculaire évaluée par un test de force, pour optimiser le ciblage tissulaire de ces vecteurs. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et un risque de cannibalisme chez les nouveau-nées. Toutes les souris sont tuées par dislocation cervicale pour analyser la distribution des vecteurs dans les organes.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de développer des outils de thérapie génique pour améliorer les traitements de maladies rares. La thérapie génique est un outil de plus en plus utilisé pour le traitement d’un grand panel de pathologies génétiques (maladies hépatiques, musculaires, neurologiques, etc.), il est donc important de cibler spécifiquement les tissus touchés par telles ou telles pathologies. Néanmoins, certaines difficultés restent à être surmontées et d’autres points peuvent être améliorés. L'objectif de ce projet est d'optimiser un vecteur de thérapie génique, l'AAV (virus adéno-associé), afin de le rendre plus efficace et plus spécifique pour l'organe à traiter dans le cadre de la maladie. Pour cela, nous allons travailler sur deux éléments du vecteur : la capside, la partie externe du vecteur responsable du ciblage des organes, et le promoteur, un élément qui permet l'expression du gène thérapeutique (le transgène) dans l'organe à traiter. Ce projet utilisera des souris saines pour sélectionner les meilleures capsides et promoteurs, qui seront ensuite validés sur des souris adultes et juvéniles atteintes de la maladie de Pompe pour tester leur efficacité thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les meilleurs vecteurs AAV pour cibler de manière spécifique les organes couramment touchés par les maladies génétiques : le foie, les muscles et le système nerveux central. Le développement de vecteurs optimisés pour le(s) organe(s) cible(s) permettra de réduire la dose de vecteur nécessaire pour atteindre l'effet thérapeutique et ainsi diminuer le risque d'effets indésirables du traitement (e.g. la réponse immunitaire contre le vecteur).

Procédures

L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale pour les souris adulte ou dans la veine temporale pour les souris juvénile sera effectuée une seule fois au début de l'étude. Le prélèvement de sang sur les souris adultes sera réalisé sous anesthésie au niveau de la veine faciale à 1, 4, 7, 15, 30, 45 et 60 jours post-injection et après une fois par mois. Les souris juvéniles seront prélevées une fois par mois. Un test d’évaluation fonctionnel (grip test) sera réalisé sur les souris atteintes de la maladie de Pompe à 3 mois et 6 mois post-injection afin de vérifier l'efficacité du vecteur.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur instantanée due à l'injection du vecteur. Le stress de la manipulation peut durer jusqu'à 30 secondes. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie, la souris ne ressentira donc aucune douleur, mais la manipulation (environ 1 minute) pourra être un facteur de stress. Les souris modèle de la pathologie de Pompe pouvaient développer le phénotype pathologique progressive (faiblesse musculaire) au cours des derniers mois de l'étude. Un risque de cannibalisme pourrait être observé chez les souris nouveau-nées.

Devenir

Tous les animaux sains utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Toutes les souris atteintes de la maladie de Pompe utilisées pour tester l'efficacité thérapeutique des meilleures combinaisons capside-promoteur seront euthanasiées par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Une procédure d'élevage de souris atteintes de la maladie de la Pompe est prévue dans cette étude, les souris de cette procédure seront utilisées dans les procédures expérimentales.

Remplacement

Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste des capsides et des promoteurs grâce à l'utilisation de culture cellulaire. Ces premiers tests nous ont permis de mettre en évidence 80 capsides et 50 promoteurs intéressants. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (réponse immunitaire) et également mesurer sont efficacité de traitement d'une maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons établi une approche statistique autour du paramètre d’intérêt commun mesurable dans toutes les procédures : l’expression de notre transgène. Nous utiliserons 6 souris/groupe pour nous donner la possibilité de détecter une augmentation significative du transgène. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (798 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats. Les souris souffrant de la maladie de Pompe seront utilisées en dernier recours, afin de valider nos meilleurs candidats (252 souris).

Raffinement

Nous allons tout mettre en œuvre pour maximiser le bien-être des animaux (limitation du nombre de souris par cage, enrichissement des cages, limiter le stress lors de la manipulation des animaux, etc.). Chaque geste expérimental réalisé sur les animaux (injections et prise de sang) sera réalisé par du personnel formé, la mise en place d'anesthésies et des mesures de récupération (surveillance accrue des souris, utilisation de plaque chauffante jusqu'au réveil, etc.) seront utilisées lors de des prises de sang. Le prélèvement de sang sera réalisé au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées afin de diminuer leur stress. L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale sera réalisée après avoir favorisé la dilatation des veines (sous une source de chaleur) pour un maximum d’efficacité et de rapidité d’intervention sur l’animal, pour limiter le temps de passage en boîte de contention nécessaire à l’injection dans la queue.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux disponibles pour la maladie de Pompe (bovins, chats, moutons et caille), la souris Gaa-/- [B6;129-Gaatm1Rabn/J] est l'espèce animale la plus facile à produire. Elle reproduit la maladie de Pompe, car elle ne montre aucune activité enzymatique de GAA (dans le sang et dans les tissus), elle présente une accumulation de glycogène dans tous les tissus et l'activité locomotrice des souris est altérée. De plus, nous disposons déjà de ce modèle dans notre animalerie et nous disposons de toutes les techniques pour mesurer la réversion du phénotype liée à la pathologie. La maladie de Pompe est une maladie liée à une accumulation de glycogène dans différents tissus (foie, muscles, système nerveux central, etc.). Les outils développés ont pour but d’augmenter l’efficacité du traitement déjà disponible afin de réduire la dose de vecteur injecté. 1) Certaines souris seront injectées à l’âge adulte (4 mois) ; âge où les premiers symptômes de la maladie de Pompe apparaissent pour la colonie de souris Gaa-/-. Cette approche permettra de tester si notre stratégie permet de traiter la pathologie sur les organes matures. 2) D’autres souris seront injectées à la naissance (0-2 jours). Cette approche permettra de déterminer si notre stratégie perdure dans le temps malgré la croissance des souris et des différents tissus, notamment le foie. Les souris saines utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront injectées à 6 semaines, âge pour lequel la souris est considérée comme adulte.