Procédures modérées

L'évaluation réglementaire de dispositifs oculaires implantables mobilise 40 chiens et 200 cochons, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Les animaux reçoivent des prélèvements sanguins hebdomadaires, sont anesthésiés pour l'imagerie et l'implantation chirurgicale, une lésion oculaire pouvant être provoquée avant la pose du dispositif. La mise à mort sert à l'examen nécropsique et histopathologique des tissus, censé établir la tolérance locale et la durabilité de l'implant. Le RNT présente ces atteintes comme identiques à celles d'un futur patient humain, cadrage qui déplace la finalité vers la validation industrielle du produit.

Objectifs

Les dispositifs implantables chirurgicalement sont des dispositifs médicaux conçus pour être insérés en totalité ou partiellement dans le corps humain, ou à remplacer une surface épithéliale, grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer après l'intervention de façon temporaire ou définitive, pour soutenir les fonctions d'organes ou de tissus spécifiques, surveiller les activités physiologiques ou administrer des médicaments. Les pathologies oculaires entrainent des lésions qui peuvent affecter gravement la vision de manière irréversible. Ces pathologies sont multiples et peuvent atteindre les différents segments de l’œil, comme par exemple: la dégénérescence maculaire liée à l’âge, l'hyperpigmentation focale, la rétinopathie chronique, le décollement de rétine, la néovascularisation, la cataracte, la glaucome, les pathologies de la cornée… Plusieurs pathologies de cécité résultent aussi de la perte des récepteurs ou des cellules de la rétine qui communiquent l’information visuelle au cerveau via le nerf optique. Différentes stratégies thérapeutiques avec dispositifs sont à l’étude comme par exemple des approches pharmacologiques, les thérapies génique ou cellulaire, ou les prothèses rétiniennes qui permettent de proposer une solution aux patients ayant perdu la vision en réactivant les cellules rétiniennes résiduelles par stimulations électriques par dispositif électronique. Ce projet de recherche se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2) s’intéresse aux nouvelles approches thérapeutiques pour traiter les pathologies oculaires. L’objectif est de conduire des études permettant d’évaluer de nouveaux dispositifs médicaux implantables, de nouvelles approches chirurgicales visant à restaurer la vision et les fonctions altérées de l’œil. Les différentes itérations de prototypes des dispositifs doivent être confrontées au modèle animal de grande taille qui permet de respecter les contraintes anatomiques trouvées chez l’homme en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie pré, per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens ophtalmologiques ou d'imagerie par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Les yeux des porcins et des canins sont en fonction de leurs structures anatomiques les plus semblables à ceux de l'Homme, - Les processus de réparation tissulaire et de cicatrisation est similaire à celui observé chez l'homme, - La taille relative de ces modèles animaux et des organes visés dans ce projet sont compatibles avec l'utilisation d'équipements de chirurgie ophtalmologique, de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Une tumeur est implantée sous la peau, puis jusqu'à cinq injections d'anticorps dans la veine de la queue : 48 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La croissance tumorale peut gêner leurs déplacements et les injections répétées risquent d'irriter ou de nécroser la veine. Le projet cherche une dose d'immunothérapie volontairement sous-optimale, à combiner ensuite avec des ultrasons. Les tumeurs sont prélevées après la mise à mort.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude globale qui vise à potentialiser l’effet de l’immunothérapie par les ultrasons par recrutement du système immunitaire et par action sur le microenvironnement tumorale. Les modèles de cancers choisis sont le mélanome car il est sensible à l’immunothérapie et le cancer du sein triple négatif car il est peu sensible à l’immunothérapie. Le mélanome est un cancer de la peau agressif qui touche environ 330 000 nouvelles personnes chaque année dans le monde, avec une incidence en hausse constante. Le cancer du sein triple négatif, une forme particulièrement agressive et difficile à traiter, représente environ 10 à 15 % des cancers du sein, soit environ 225 000 nouveaux cas par an dans le monde. Nous allons viser un dosage de l’immunothérapie pour obtenir un effet partiel à optimiser avec un traitement complémentaire, représenté dans notre étude globale par les ultrasons. Le but de ce projet est de déterminer une dose d’immunothérapie sous-optimale pour le mélanome et le cancer du sein, permettant d’observer une réponse immunitaire partielle dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite d'utiliser ces modèles pour tester des combinaisons d'immunothérapie et d'ultrasons. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de mélanome, et de cancer du sein triple négatif. Ce projet permettra de mettre au point des modèles qui pourront être utilisés pour d’autres projets. La combinaison des traitements en clinique permettra de réduire les effets secondaires engendrés par l’immunothérapie et pourrait être appliquée dans d’autres types de cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour une injection sous la peau de cellules tumorales (3 minutes). Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour les peser et pour observer la pousse tumorale et ils recevront jusqu’à 5 injections intraveineuses.

Impact sur les animaux

Une injection de cellules en sous cutané entraînant une croissance de tumeur peut entraîner une gêne à la locomotion. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les injections intraveineuses répétées d’anticorps via la veine caudale, associées à des contentions successives, peuvent également induire du stress, des douleurs locales au point d’injection ainsi qu’un risque d’irritation ou de nécrose de la veine. Avec l’injection d’anticorps, un risque de GVHD est possible (réaction immunitaire), pouvant entraîner des douleurs ou crampes abdominales, et diarrhées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car les mesures réalisées pour ce projet seront faites sur les tumeurs prélevés après la mise à mort de l’animal pour vérifier que l’immunothérapie génère une réponse immunitaire.

Remplacement

Afin d’établir et d’affiner toute l’étude globale, nous nous sommes basés sur plusieurs informations qui ont été données via des études sur des cultures de cellules 3D. En effet dans le but d’avoir des paramètres optimaux pour la finalité de notre étude, c’est-à-dire, combiner nos traitements, il est intéressant de savoir que l’élasticité est augmentée après traitement par ultrasons. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de l’immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Les effectifs des groupes ont été calculés avec des outils statistiques.

Raffinement

Une anesthésie sera mise en œuvre lors de la procédure qui le nécessite. Un traitement anti-douleur sera administré si nécessaire. Les animaux seront placés sur litière en cellulose afin de limiter les risques d’ulcération, d’irritation ou de nécrose tumorale. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont définis afin de permettre un arrêt précoce de la procédure en cas d’atteinte au bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 8-9 semaines, 8 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.

Pour suivre où se répartissent deux candidats médicaments contre la mucoviscidose, 1 562 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une ou plusieurs administrations sous anesthésie, par voie intraveineuse, nasale, trachéale ou sous la peau, avant d'être tuée entre un et sept jours plus tard pour prélever ses organes. Le projet vise à choisir la dose et la voie d'administration avant d'éventuels essais chez l'humain. Le résumé ne détaille pas comment l'effectif de 1 562 a été fixé.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique rare. Elle apparaît lorsqu’un gène chargé de garder le mucus fluide ne fonctionne pas correctement. Le mucus devient alors épais et collant, surtout dans les poumons et le système digestif, ce qui favorise les infections et abîme progressivement les organes. Aujourd’hui, les personnes atteintes vivent en moyenne 40 à 50 ans. Un traitement existe et aide beaucoup de patients, mais il n’est pas parfait : il peut provoquer des effets secondaires et il est très coûteux. C’est pourquoi il est important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous cherchons à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette optique, nous cherchons à comprendre comment administrer au mieux deux nouveaux candidats médicaments afin d’étudier leurs répartitions dans le corps de la souris. En même temps, nous pourrions également montrer que les doses administrées ne provoquent pas d’effets indésirables. Cela nous permettra de choisir la bonne dose, la meilleure manière de les administrer et de préparer les étapes suivantes, comme les tests de sécurité, avant de pouvoir envisager des essais chez l’humain.

Bénéfices attendus

Cette étude va aider les chercheurs à mieux comprendre comment les nouvelles molécules thérapeutiques se répartissent dans les organes chez la souris, selon la manière dont elles sont administrées, la dose utilisée ou leur composition. L’objectif est de trouver la meilleure combinaison pour que ces molécules restent actives pendant une semaine dans les poumons et le système digestif. Si cela fonctionne, cela permettra de réduire la fréquence des traitements : les patients pourraient recevoir ces médicaments une à deux fois par semaine, au lieu de tous les jours comme c’est le cas avec le traitement actuel.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour recevoir une dose unique ou des doses multiples (tous les 2 jours) administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intranasale ou intratrachéale. Puis, à la fin du protocole, les animaux seront mis à mort à J+1, J+2, J+3, J+4 ou J+7.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur légère et passagère, un stress transitoire, une gêne locale ou respiratoire selon la voie d’administration, sans effet durable.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de nos traitements, notamment leur devenir dans l’organisme, nous devons récupérer en fin d’expérience les organes des animaux traités et non traités. Cela nécessite l’euthanasie de l’ensemble des animaux du projet. L’étude du devenir des traitements dans les organes est indispensable pour évaluer leur accumulation et pour définir les doses et le nombre d’administrations. La collecte du sang total sera également effectuée afin d’obtenir plus d’informations sur le traitement utilisé (selon les 3R) et d’analyser en parallèle si le traitement active les cytokines (réponse inflammatoire).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire de façon fiable la complexité d’un organisme entier pour étudier la distribution d’un médicament dans les organes. Les modèles cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques ne permettent ni d’évaluer la circulation systémique, ni de mesurer la répartition précise d’une molécule dans les tissus, ni d’anticiper son élimination. L’utilisation de l’animal est donc indispensable pour obtenir des données biologiquement pertinentes. Avant d’en arriver à cette étape, toutes les alternatives non animales ont été exploitées, notamment des études in vitro et des analyses prédictives, afin de réduire au maximum le recours aux animaux.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, chaque souris sera exploitée au maximum en réalisant plusieurs mesures sur les mêmes individus (analyses de sang, imagerie, prélèvements d’organes). Les groupes expérimentaux sont volontairement restreints au strict minimum permettant d’obtenir des résultats fiables grâce à un calcul préalable de puissance statistique. L’utilisation d’un seul groupe contrôle par procédure, rendu possible par la stabilité de la fluorescence basale quel que soit le mode d’administration ou le temps post‑traitement, évite la création de contrôles supplémentaires. Enfin, l’ensemble du protocole a été conçu pour réduire toute redondance expérimentale, en regroupant les analyses et en évitant tout doublon inutile.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. Les souris sont hébergées dans un environnement contrôlé et enrichi (matériaux à ronger, abris, papier), favorisant l’expression de comportements naturels. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en douceur et avec le moins de contention possible. Lors des procédures, une anesthésie adaptée est systématiquement utilisée, et un analgésique est administré si un signe de douleur apparaît. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l’aide de grilles d’évaluation permettant de repérer rapidement tout signe de détresse. Si un seuil critique est atteint, des critères d’arrêt humanitaires sont appliqués pour éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit de l’espèce la plus couramment utilisée et la mieux adaptée pour étudier la répartition d’un médicament dans l’organisme. Son métabolisme, la structure de ses organes et sa réponse aux traitements sont bien connus, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables à d’autres études précliniques. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (environ 8 semaines), un stade auquel leurs organes et systèmes physiologiques sont pleinement développés et fonctionnels. Ce choix garantit que la distribution du médicament reflète correctement celle observée dans un organisme mature, tout en évitant les variations importantes liées à la croissance ou au vieillissement. Les souris seront utilisées après une semaine d’acclimatation pour réduire le stress et assurer des conditions expérimentales stables.

Injectées d'un composé bactérien qui provoque une inflammation généralisée, puis soumises à des tests de mesure du seuil de douleur, 440 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'inflammation induit fièvre, perte de poids et sensibilité accrue à la douleur. Le projet étudie comment cette inflammation dégrade la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau. Le liquide céphalorachidien et les tissus cérébraux sont prélevés sous anesthésie, suivis d'une injection qui tue l'animal.

Objectifs

Le sepsis, résultant d’une inflammation généralisée induite par un pathogène, est à l'origine de 20% des décès mondiaux (11 millions en 2020 selon l’Organisation Mondial de la Santé). Dans 70% des cas cette pathologie entraine de nombreux problèmes neurologiques potentiellement associé à une forte dégradation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau. Lors d’un sepsis, l’organisme réagit en augmentant l’expression des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs (qui subissent une dégradation similaire à la morphine). Notre but est d’étudier la dégradation des neurotransmetteurs et de la morphine (qui représente un traceur de la dégradation) dans un modèle d’inflammation généralisée chez la souris. Nous voulons également déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire peut restaurer des niveaux normaux de neurotransmetteurs et ainsi faciliter la guérison. MODIFICATION- Nous avons montré qu’un inhibiteur d’une voie intracellulaire diminue de 90% la dégradation de la morphine dans un modèle de culture cellulaire. Cependant, le produit de dégradation de la morphine se retrouve piégée dans les cellules. Chez la souris, l’administration de cet inhibiteur améliore considérablement l’effet analgésique d’une faible dose de morphine dans un modèle d’inflammation généralisée induit par un composé pathogène bactérien. Un de nos buts est d’étudier la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le liquide céphalorachidien dans notre modèle inflammatoire traité ou non avec l’inhibiteur de la dégradation.

Bénéfices attendus

Notre but est de définir si une inflammation généralisée induite par un composé pathogène bactérien provoque une dégradation accrue de la morphine et donc une diminution de ses effets antidouleurs. Par ailleurs, nous voulons identifier les neurotransmetteurs également dégradées et déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire spécifique ou une délétion génétique peut être bénéfique lors d’une inflammation généralisée. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre les conséquences de la neuroinflammation induite par le sepsis. Ces travaux détermineront quels neurotransmetteurs sont plus dégradées et si l’utilisation d’un inhibiteur de la dégradation peut normaliser leurs taux et une favoriser une guérison. -MODIFICATION- Ce projet a aussi pour but de vérifier que le l’inhibiteur provoque une séquestration des molécules dégradées dans les cellules empêchant son élimination du cerveau. Les prélèvements de liquide céphalorachidien permettront d’étudier l’effet de l’inhibiteur sur la dégradation de morphine et de neurotransmetteur ainsi que leur élimination cérébrale.

Procédures

16 groupes de souris subiront des injections de substances sur animal vigile (30sec) et 8 groupes auront des tests de mesure du seuil de douleur (25sec) et 4 groupes d’animaux auront un test de comportement locomoteur (10min). Les 16 groupes auront une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min). Modification : un prélèvement sur animal anesthésié d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Notre modèle d’’injection de composé pathogène bactérien chez la souris induit une inflammation aiguë (protocole d'une durée de 48h). Elle peut être associée à une fièvre et une perte de poids transitoires chez les animaux. Par ailleurs, ce composé pathogène ne provoque pas de douleur mais induit une sensibilité accrue à la douleur. Il peut également induire une diminution de l'activité locomotrice et des diarrhées. - MODIFICATION - Les injections induiront un stress léger lié à la contention, ainsi qu'une douleur aigue liée à la piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour obtenir des fluides biologiques et des tissues cérébraux à analyser en spectrométrie de masse .

Remplacement

Nos études utilisant des cultures cellulaires ont montré qu’une stimulation avec un composé pathogène bactérien augmentait la dégradation de la morphine et qu’un inhibiteur spécifique abolissait cette augmentation. Cependant, les cultures cellulaires ne reflètent pas la complexité du cerveau qui comporte de nombreux types cellulaires qui interagissent. Il en est de même pour les cultures organotypiques. Chez la souris, l’injection d’un composé pathogène bactérien induit une neuroinflammation ponctuelle qui provoque une diminution de l’activité motrice, ainsi qu’une sensibilité plus forte au stimulation thermiques, deux paramètres qui ne peuvent pas se mesurer sur des cellules en culture ou des cultures organotypiques. Le but du projet est de montrer que, chez la souris, l’augmentation des enzymes de dégradation diminue les quantités de morphine et de certains neurotransmetteurs en conditions inflammatoires. Ainsi, nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ou organotypiques ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur et/ou la locomotion. (2) les cultures cellulaires et organotypiques ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau entier.

Réduction

440 animaux (160 souris mâles et 160 souris femelles C57BL/6J + 60 souris mâles et 60 souris femelles mutantes) sont nécessaires aux études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer l’effet d’un traitement analgésique. De plus, un effectif de 10 nous permet d’écarter un animal en cours de procédure (suite à des blessures consécutives à des bagarres ou d’un problème technique) sans impacter la robustesse de l’étude. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle étude avec tous les groupes contrôles devra être rajoutés ce qui va à l’encontre du principe de réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions. MODIFICATION- un groupe de 80 animaux a été rajouter pour réaliser les études sur le liquide céphalorachidien.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des objets (tunnel transparent pour la manipulation, frisure et carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation, bâtons de bois à ronger) pour réduire leur stress et stimuler leur interaction sociale. Avant chaque procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au test (i.e., pièce et ambiance sonore du test, matériel utilisé lors du test) est réalisée durant 14 jours. Par ailleurs, des indicateurs du bien-être des animaux ont été établies pour chacune des procédures réalisées et des points limites ont ete etablis pour soustraire l'animal a la souffrance. MODIFICATION - Les prélèvements de liquide cephalorachidien seront effectuées sous anesthésie générale. Les souris recevront, en fin de prélèvement, une injection entrainant leur mort. Tout au long de l’étude, une formation continue en expérimentation animale ainsi que le suivi constant de la littérature permettent d'intégrer tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés et les modèles inflammatoires induit par le LPS sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de la souris est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur neuropathique. Nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voies métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études précliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du SNC et du système opioïde est uniquement mature chez l’adulte.

Pour étudier le rôle d'un type de cellules dans le passage d'un adénome au cancer du côlon, 300 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles développent des polypes intestinaux dont la multiplication peut provoquer perte de poids et déshydratation, suivis par échographie sous sédation. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce un bénéfice thérapeutique "à long terme" pour le traitement du cancer du côlon, sans échéance.

Objectifs

Nous souhaitons comprendre le rôle des différents types de cellules dans la progression du cancer du côlon. Nous savons qu'un facteur est détectable dans un type de cellule spécialisé dans les tumeurs bénignes du côlon, mais pas dans les tissus sains. La présente étude vise à étudier la fonction de ce facteur dans ces cellules lors de la transition entre tissu normal et cancer. À cette fin, nous utiliserons des souris qui développent des tumeurs du côlon et chez lesquelles nous pouvons éliminer ce facteur. Ces études nous permettront de caractériser les fonctions de notre facteur d'intérêt dans ce type de cellules spécialisées de l'intestin, de clarifier son rôle dans la croissance du cancer du côlon et d'identifier de nouveaux mécanismes dans la tumorigenèse du côlon.

Bénéfices attendus

Dans l'ensemble, ces expériences permettront de déterminer les mécanismes dépendants du gène d'intérêt dans la progression du cancer de l'intestin. À long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement du cancer du côlon.

Procédures

Injection intrapéritonéale =6 (quelques secondes), injection sous-cutanée = 20 (quelques secondes), Mesures par ultrasons (30 minutes, réalisées sous sédation)

Impact sur les animaux

Les nuisances seront les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (quelques secondes, douleur légère), les mesures échographiques (30 minutes), réalisées sous sédation (nuisances mineures) et, potentiellement, le développement tumoral. En effet, la prolifération des polypes (augmentation de leur nombre et de leur taille) peut entraîner l'apparition de symptômes cliniques (perte de poids et déshydratation) chez les animaux. Pour éviter cela, nous surveillons de près leur état clinique, leur administrons un régime alimentaire adapté et procédons à leur euthanasie avant que les symptômes cliniques ne s'aggravent.

Devenir

À la fin de l'examen final, les souris sont mises à mort, leurs intestins sont prélevés puis conservés en vue d'analyses (immuno)histochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

L'homéostasie et le remodelage au cours du développement du cancer sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles de culture cellulaire in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Notre stratégie est bien conçue pour prendre en compte les objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des cultures cellulaires ou des systèmes purement biochimiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire pour valider un effet significatif. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, et dans la mesure du possible, les échantillons prélevés sur les mêmes souris seront utilisés dans différents types d'analyses.

Raffinement

L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées comme méthodes principales afin de minimiser autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Les animaux seront élevés sans isolement, en groupes du même sexe, dans des conditions d'hébergement conformes aux exigences réglementaires (densité) et bénéficiant d'un enrichissement environnemental (abri, matériel de nidification) tout au long de la procédure. Un score clinique sera évalué chaque semaine et chaque jour dès que les premiers adénomes seront visibles à l'échographie. Une liste de points limites est établie. Lorsque ceux-ci sont atteints, les animaux seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

L'homéostasie et le remodelage au cours de la tumorigenèse intestinale sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Après avoir déclenché la formation d'une tumeur du côlon, il est important de surveiller la transformation maligne d'un adénome dans son environnement. L'utilisation d'un modèle animal tel que la souris est donc essentielle en raison de ses similitudes génétiques et physiologiques avec l'être humain. Le choix d'animaux adultes se justifie par le fait que les adénomes et les cancers du côlon touchent principalement les adultes.

Gavées par une sonde pendant une dizaine de jours, puis soumises à des injections dans l'abdomen et dans la veine, 66 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Certaines, génétiquement modifiées, sont plus sensibles aux infections. Le projet teste une stratégie pour freiner l'activité de cellules immunitaires impliquées dans le rejet chronique de greffe. Les organes sont prélevés après la mise à mort, que le porteur situe comme une étape avant des modèles de transplantation plus complexes.

Objectifs

Après une transplantation d’organe, le système immunitaire du receveur peut reconnaître le greffon comme étranger et l’attaquer. Ce phénomène peut entraîner une dégradation progressive du greffon pouvant conduire à sa perte. Certaines cellules du système immunitaire participent à ce processus en détruisant des cellules du greffon dans certaines situations. Les traitements actuellement disponibles pour limiter ces mécanismes de rejet présentent des limites et peuvent entraîner des effets indésirables importants. De plus, certains mécanismes impliqués dans ce type de rejet ne disposent pas aujourd’hui de stratégie thérapeutique spécifique. Mieux comprendre comment moduler l’activité de ces cellules pourrait contribuer au développement de nouvelles approches visant à limiter le rejet de greffe. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’une stratégie expérimentale visant à réduire l’activation de certaines cellules du système immunitaire. L’étude permettra notamment de comparer deux modalités d’administration d’un composé afin d’identifier les conditions permettant d’obtenir l’effet biologique recherché. L’efficacité de cette approche sera évaluée dans un modèle murin permettant d’étudier la capacité de ces cellules à détruire des cellules cibles.

Bénéfices attendus

Le rejet chronique est une cause fréquente de perte de greffon après une transplantation d’organe. Malgré les traitements disponibles, certains mécanismes du système immunitaire impliqués dans ce rejet restent difficiles à contrôler. Ce projet vise à évaluer une stratégie expérimentale permettant de moduler l’activité de certaines cellules du système immunitaire impliquées dans ces phénomènes. L’étude permettra de déterminer si cette approche peut limiter la destruction de cellules cibles dans un modèle murin. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe et d’évaluer la pertinence de cette stratégie dans un contexte expérimental. Ces travaux constituent une étape préalable à l’évaluation de cette approche dans des modèles plus complexes de transplantation et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer la survie des greffons chez les patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront un traitement administré par voie orale à l’aide d’une sonde de gavage. Cette administration sera réalisée soit quotidiennement, soit tous les deux jours selon les groupes expérimentaux, pendant une durée maximale d’environ dix jours. Une injection dans la cavité abdominale pourra être réalisée dans certains groupes afin de moduler l’activité de certaines cellules du système immunitaire. Une injection intraveineuse de cellules sera réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin d’évaluer l’activité de certaines cellules du système immunitaire. Un prélèvement sanguin unique pourra être effectué sous anesthésie gazeuse au cours de l’étude. Chaque animal recevra au maximum une injection intraveineuse, une injection dans la cavité abdominale et un prélèvement sanguin au cours de l’expérimentation. À la fin de l’étude, tous les animaux recevront une injection dans la cavité abdominale d’un anesthésique général avant d’être mis à mort, afin de garantir l’absence de douleur lors des prélèvements finaux. La durée totale de participation d’un animal à l’étude est d’environ 10 à 11 jours.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par voie orale peut entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’une gêne temporaire. Dans de rares cas, une mauvaise administration peut provoquer une irritation ou une difficulté à avaler. Les différentes injections réalisées au cours de l’étude, ainsi que le prélèvement sanguin, peuvent entraîner une gêne légère et transitoire au niveau du site d’injection, avec un risque faible de saignement ou d’irritation. Ces gestes sont réalisés sous anesthésie afin de limiter la douleur. Le traitement administré n’a pas montré de toxicité importante dans les études précédentes chez la souris. Toutefois, des effets modérés ne peuvent être exclus, tels qu’une baisse temporaire d’activité, une perte de poids ou des modifications du comportement. De manière générale, les effets indésirables attendus sont de faible intensité et de courte durée. Ils correspondent principalement à une gêne liée aux manipulations ou aux injections, pouvant durer de quelques minutes à quelques heures, et plus rarement jusqu’à 24 heures. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent une sensibilité accrue aux infections. Elles feront donc l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe d’altération de leur état général.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Des approches alternatives sans recours à l’animal ont été utilisées en amont du projet, notamment des modèles in vitro et à partir de cellules humaines, permettant d’évaluer l’effet d’un traitement sur l’activation de certaines cellules du système immunitaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, en particulier les interactions entre les différentes cellules ni les effets liés à l’administration du traitement dans l’ensemble du corps. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire afin d’évaluer l’efficacité et la tolérance du traitement dans un contexte physiologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir d’un calcul statistique préalable afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal a été fixé à 6 animaux par groupe. Plusieurs mesures sont mises en œuvre afin de réduire le nombre d’animaux : limitation du nombre de groupes au strict nécessaire, mise en place d’une stratégie progressive, avec une seconde procédure réalisée uniquement si la première ne permet pas d’obtenir un effet suffisant, répartition aléatoire des animaux entre les groupes, limitation des répétitions expérimentales au strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une durée minimale de 7 jours après leur arrivée afin de limiter le stress lié au transport et à leur nouvel environnement. Après chaque administration ou manipulation, une surveillance rapprochée sera réalisée afin de détecter rapidement tout signe de complication ou de détresse. En cas d’altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité, difficulté d’accès à la nourriture), des mesures de soutien adaptées seront mises en place, telles que la mise à disposition de nourriture au sol, d’eau gélifiée ou d’aliments enrichis faciles d’accès. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent une altération du système immunitaire pouvant les rendre plus sensibles aux infections. Elles sont hébergées dans des conditions sanitaires adaptées et feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général. Si un animal présente des signes de douleur, d’inconfort ou d’altération de son état de santé, une surveillance renforcée sera mise en place et, si nécessaire, il sera retiré de l’expérimentation. Des points limites seront définis afin d’éviter toute souffrance inutile. En cas de perte de poids importante, de détresse marquée ou d’altération persistante de l’état général, les animaux seront mis à mort de manière anticipée. Ces mesures permettent d’adapter la prise en charge des animaux en fonction de leur état afin de limiter au maximum la douleur, le stress et les nuisances tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence largement utilisé pour l’étude du système immunitaire et des mécanismes impliqués dans le rejet de greffe. Les processus étudiés chez cette espèce présentent des similarités avec ceux observés chez l’humain. Ce modèle permet de mettre en œuvre des approches expérimentales reproductibles et d’utiliser des souches spécifiques adaptées aux objectifs du projet, notamment pour étudier l’activité de certaines cellules du système immunitaire dans un organisme entier. L’utilisation de la souris permet ainsi de répondre aux objectifs scientifiques du projet dans des conditions maîtrisées, avec un nombre limité d’animaux et un niveau de contrainte modéré. Des animaux adultes âgés de plus de 12 semaines seront utilisés. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé, ce qui est nécessaire pour étudier les mécanismes impliqués dans la destruction de cellules cibles. L’utilisation d’animaux adultes permet également de limiter la variabilité observée chez des animaux plus jeunes et d’améliorer la reproductibilité des résultats. Ce stade de développement est donc le plus adapté pour atteindre les objectifs du projet tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.