Procédures modérées

90 souris transgéniques, porteuses d'oncogènes du papillomavirus humain, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Chacune reçoit des injections quotidiennes pendant trois mois ou un implant diffusant de l'estradiol, jusqu'à développer des lésions précancéreuses du col de l'utérus. Le projet se limite à valider génétiquement trois lignées destinées à de futures études sur le cancer. Les bénéfices décrits se réduisent à "garantir la robustesse scientifique" de ces travaux ultérieurs.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider génétiquement les constructions de trois modèles de souris transgéniques exprimant des oncogènes du papillomavirus humain (HPV), un virus fréquemment impliqué dans la survenue de cancers épithéliaux, notamment du col de l’utérus.

Bénéfices attendus

La validation génétique des trois lignées doit garantir la robustesse scientifique des résultats qui seront obtenus dans des études de carcinogenèse ultérieures.

Procédures

Durant ce projet, les animaux recevront soit une injection sous cutanée journalière pendant 3 mois (moins de 1 minute par injection), soit subiront une courte chirurigie sous anesthésie gazeuse de 5 minutes afin d'implanter un pellet libérant la molécule cible pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

Une injection peut induire une légère douleur et un stress lié à la contention, l'anesthésie peut induire une hypothermie et la chirurgie une légère douleur. Après 3 mois de traitement à l'estradiol les animaux présentent des pathologies comparable au stade précancereux du cancer du col de l'utérus décrit en clinique humaine, ne présentent aucun symptôme notable.

Devenir

À l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement des organes cibles et ainsi l'analyse génétique du modèle, essentiel pour comprendre la fonction du gène supprimé.

Remplacement

Dans ce projet visant à valider des modèles génétiquement modifiés destinés à l’étude de mécanismes physiologiques complexes, le recours à un mammifère est indispensable, aucune approche in vitro ni aucune modélisation informatique ne pouvant, à l’heure actuelle, se substituer à l’analyse du gène cible dans son environnement naturel et dans l’ensemble de ses interactions au sein de l’organisme

Réduction

Pour réaliser ce type d’analyse, un faible nombre d’animaux est requis par groupe. Ainsi, nous utiliserons cinq animaux par condition. Afin de disposer de contrôles adéquats, six groupes expérimentaux seront constitués par modèle de souris. Pour une mutation étudiée, nous emploierons donc 30 animaux. Cet effectif correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats analysables, permettant de conclure de manière fiable sur la bonne réalisation de l’étude, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Une surveillance quotidienne de leur état, surveillance du site d'injection ou du site d'implatation du pellet, une pesée hebdomadaire, ainsi qu’un suivi régulier de leur comportement et de leur état général seront mis en place afin de garantir leur bonne santé. En cas de conflit entre individus, l’animal dominant sera isolé et, si nécessaire, des soins locaux seront prodigués. Tout au long des procédures, des seuils limites spécifiques seront définis afin de garantir que les animaux demeurent dans des conditions éthiquement acceptables et de permettre une intervention rapide en cas de signe de souffrance ou d’altération du bien-être.

Choix des espèces

La souris est l’animal modèle de choix pour une première étude de la fonction d’un gène présent chez les mammifères. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. Les animaux de la cohorte seront des animaux jeunes âgés de 6-8 semaines à réception et seront traités à partir de 10 semaines d'âge, soit en tant que jeune adulte, lorsque tous les systèmes de l'organisme sont matures.

40 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines, avec des jeûnes de six heures, des introductions orales de colorant et de glucose et des prélèvements sanguins, pour mesurer le transit intestinal. L'étude cherche à décrire l'effet de la malnutrition infantile sur l'intestin, en comparant mâles et femelles. Le porteur affirme que ce travail est "indispensable" et ne peut être mené chez l'humain.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait ralentir le passage des aliments dans l’intestin. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une seule procédure expérimentale pour mesurer la vitesse de transit intestinal, qui est un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description extensive de la motilité intestinale permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

40 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Pour étudier différents paramètres du transit intestinal : toutes les souris subiront à 48 jours une mise à jeun de 6h, suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), à 52 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de glucose (10 sec), puis 15 min plus tard d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), et à 56 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec).

Impact sur les animaux

Les pesées et mesures hebdomadaires induisent un stress modéré, ainsi qu’un inconfort transitoire. Le prélèvement sanguin est invasif et peut induire une légère douleur. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les trois introductions orales nécessitent un jeûne de 6 heures induisant un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne. La récolte des féces est réalisée en cage individuelle, les animaux sont donc isolés pendant maximum 6h après l’introduction orale, induisant un stress modéré.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue de la mesure terminale des paramètres de transit, et du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin, à la fois à l’échelle de l’organe et au niveau moléculaire. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 10 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur la mesure la plus variable que nous connaissons déjà : la longueur de l’intestin, qui réagit de manière comparable chez les mâles et les femelles lorsqu’ils reçoivent un régime pauvre en protéines. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe. Pour éviter d’utiliser davantage d’animaux dans de futurs projets, tous les organes qui pourraient être utiles à d’autres recherches (comme certains tissus liés au métabolisme ou au système nerveux) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine, et la nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Nous surveillerons aussi leur prise alimentaire afin de vérifier qu’ils s’alimentent correctement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectués sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.

3 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées, une greffe de tumeur sous la peau, des séances d'imagerie sous anesthésie et jusqu'à douze prélèvements sanguins, pour tester une nanoparticule censée détourner le foie et mieux diriger les médicaments vers les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit la distribution d'un médicament dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer une stratégie visant à améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) tout en réduisant leur toxicité périphérique, en modulant la façon dont ces traitements se répartissent dans l’organisme, grâce à leur association à une nanoparticule lipidique conçue à cet effet. Après injection, de nombreux médicaments sont rapidement éliminés par le foie, principal mécanisme de détoxification de l’organisme. Cette élimination précoce peut limiter la quantité atteignant les tissus à traiter, notamment les tumeurs, tout en favorisant une accumulation hors cible susceptible d’induire des effets indésirables. La nanoparticule lipidique est administrée par voie IV, elle est conçue pour occuper de manière transitoire les voies hépatiques impliquées dans la clairance des médicaments. Cette occupation temporaire vise à augmenter la biodisponibilité systémique des agents administrés secondairement, à favoriser leur accumulation dans les tissus cibles et à réduire leur captation hépatique. Les objectifs de cette étude sont : (1) d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la biodisponibilité et la distribution hépatique de différents composés thérapeutiques chez des souris saines et/ou porteuses de xénogreffes tumorales ; (2) de caractériser la distribution de la nanoparticule lipidique et des composés associés au sein des principales populations cellulaires hépatiques ; (3) d’analyser l’accessibilité tumorale des composés avec ou sans prétraitement par la nanoparticule lipidique ; (4) d’évaluer l’effet de cette stratégie sur la croissance tumorale. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la modulation de la clairance hépatique, d’optimiser les paramètres d’administration (dose, séquence d’injection) et d’identifier un modèle tumoral pertinent ainsi qu’un composé thérapeutique adapté. L’étude, incluant des administrations répétées et une optimisation des modalités de traitement, vise également à répondre aux exigences réglementaires afin de se rapprocher des conditions cliniques d’utilisation.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la façon dont les agents thérapeutiques se répartissent dans l’organisme, et sur l’amélioration de leur effet antitumoral. À court terme, ils contribueront à une meilleure compréhension du design des nanomédecines et à l’optimisation des modalités d’administration et les caractéristiques des formulations, afin d’améliorer leur efficacité et leur équilibre bénéfice et effets indésirables. À plus long terme, cette stratégie pourrait lever une barrière biologique majeure liée à l’élimination rapide des médicaments par le foie, faciliter l’accès clinique à des molécules prometteuses et améliorer l’efficacité de traitements existants à des doses plus faibles, réduisant ainsi la toxicité pour les patients.

Procédures

Deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Ce procédé se fera une seule fois (injection unique) ou de façon répétée (une à deux fois par semaine sur une période à définir pouvant aller jusqu’à 3 mois). Examen d’imagerie non invasive sous anesthésie (cinétique sur 30 minutes maximum). Prélèvement sanguin d'un faible volume (1% volume sanguin total) maximum 5 fois par semaine sur animaux éveillés (Durée 1-4 min) ou volume de 7.5% du volume sanguin total une fois par semaine (Durée 1-4 min - Max 12 prélèvements). Injection de cellules tumorale sous cutanée sur animal vigile (une fois - durée 1 min). Une à deux semaines plus tard selon la croissance tumorale, une à deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Ce procédé se fera une seule fois (injection unique) ou de façon répétée (une fois par semaine sur une période à définir pouvant aller jusqu’à 3 mois).

Impact sur les animaux

La contention des souris peut induire un stress de courte durée. Les injections peuvent entraîner une douleur de courte durée ainsi qu’un stress transitoire. Les anesthésies de courte durée peuvent provoquer une hypothermie limitée et, dans de rares cas, une diminution transitoire de la respiration et/ou du rythme cardiaque. Par ailleurs, la croissance tumorale peut altérer l’état général des animaux, entraîner une gêne liée au volume tumoral et, dans certains cas, s’accompagner de phénomènes de nécrose tumorale. Les souris immunodéficientes présentent une susceptibilité accrue aux infections opportunistes et au stress expérimental. Les procédures peuvent entraîner une altération modérée de l’état général (perte de poids, diminution d’activité, inconfort post-procédure).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement du foie

Remplacement

Les modèles in silico reposent sur des équations et des hypothèses dérivées de données biologiques existantes, et ne peuvent donc pas prédire des phénomènes qui n’ont jamais été observés ou correctement paramétrés (ex. interactions spécifiques nanoparticules–foie ou nanoparticules–foie–tumeur, effets du prétraitement sur le microenvironnement vasculaire et immunitaire). De plus, la biodistribution implique des processus complexes à plusieurs niveaux (circulation sanguine, passage à travers les vaisseaux, élimination par le foie, captation par certaines cellules, hétérogénéité tumorale, etc.) qui dépendent de l’organisation tissulaire tridimensionnelle, du système immunitaire fonctionnel et de l’état physiologique global de l’animal, éléments qui ne sont pas intégralement capturables à ce jour par des modèles informatiques seuls. L’utilisation du modèle murin est justifiée par la nécessité d’évaluer la biodistribution de molécules thérapeutiques dans un organisme entier, disposant d’un système vasculaire, immunitaire et hépatique fonctionnel. Les approches in vitro, bien qu’utiles en phase de criblage initial, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions systémiques impliquées dans l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’élimination des composés thérapeutiques. En particulier, la clairance hépatique, la perfusion tissulaire et la contribution des différentes populations cellulaires du foie ne peuvent être étudiées de manière pertinente qu’au sein d’un organisme vivant. Le modèle murin, largement utilisé et bien caractérisé, constitue donc l’option la plus pertinente pour générer des données transposables.

Réduction

Pour limiter le recours aux animaux, les agents thérapeutiques candidats sont d’abord évalués in vitro afin de ne retenir que ceux ne présentant pas de toxicité cellulaire. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques adaptées, afin de garantir la soliditéet la fiabilité des résultats, tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire. Par ailleurs, le suivi répété de la répartition des composés chez un même animal au cours du temps (imagerie in vivo) contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires au cours de l’étude

Raffinement

Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation préalable et sont hébergés dans des conditions contrôlées, en groupe, avec un environnement adapté et enrichi, favorisant leur bien-être. Ils sont suivis quotidiennement par du personnel qualifié, incluant le suivi du poids, de l’état général et, le cas échéant, de la croissance tumorale. Un enrichissement adapté à l’espèce sera fourni dans toutes les cages, depuis l’arrivée des animaux jusqu’à la fin de l’étude (ex. : lanières de Kraft, coton). Un vétérinaire sera présent à l’animalerie plusieurs jours par semaine, et des soins vétérinaires d’urgence seront disponibles, y compris en dehors des jours ouvrés. Une attention particulière est portée à l’évaluation de tout signe d’inconfort, de douleur ou de détresse, et des critères d’arrêt anticipé sont appliqués strictement. Une anesthésie est réalisée lorsque nécessaire et le recours à des antalgiques est mis en œuvre afin de limiter la douleur associée aux manipulations. Pour les souris immunodéficientes (nude), l’hébergement se fait en portoirs ventilés et les manipulations sont réalisées dans des conditions d’hygiène renforcées, avec des instruments désinfectés avant utilisation, afin de limiter les risques d’infection.

Choix des espèces

Le modèle murin constitue une référence préclinique pour l’étude de la biodistribution des agents thérapeutiques, en raison de sa physiologie bien caractérisée, de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement définies et de la possibilité de réaliser des injections systémiques suivies d’analyses tissulaires détaillées. Deux modèles murins seront utilisés : des souris immunocompétentes et des souris Nude immunodéficientes. Les souris immunocompétentes, dotées d’un système immunitaire fonctionnel, constituent un modèle de référence en pharmacologie et permettent d’étudier les mécanismes de clairance hépatique dans un contexte immunocompétent. Les souris Nude, immunodéficientes en raison de l’absence de thymus, sont couramment utilisées pour les études d’efficacité impliquant des xénogreffes tumorales. Certains agents thérapeutiques de ce projet étant développés pour des applications oncologiques, leur efficacité sera évaluée sur des modèles Nude. La réalisation d’études de biodistribution sur ce même modèle permettra d’assurer la cohérence et la transposabilité des résultats obtenus. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte (entre 7 et 10 semaines) avec un poids minimal de 20 grammes, afin d’évaluer la distribution hépatique des agents thérapeutiques sur des animaux ayant un système immunitaire et des organes développés et matures.

Pour comparer deux schémas d'administration d'une immunothérapie associée à la radiothérapie, 1 740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale, des injections d'anticorps et une à trois séances d'irradiation sous anesthésie. L'objectif est de savoir si moins d'injections suffisent à conserver l'effet antitumoral. Parmi les bénéfices avancés figure la réduction du coût des traitements, présentée à côté de l'intérêt pour les patients.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’optimiser les modalités d’administration de traitements immunothérapeutiques à base d’anticorps, utilisés seuls ou en association avec la radiothérapie, afin de conserver une efficacité antitumorale satisfaisante tout en réduisant la charge thérapeutique et les effets indésirables pour l’animal. Les traitements par anticorps immunomodulateurs ont montré une efficacité importante en cancérologie, mais leur administration répétée peut être associée à des effets secondaires systémiques et à une augmentation des contraintes expérimentales. Par ailleurs, plusieurs données suggèrent que l’association avec la radiothérapie peut renforcer la réponse immunitaire antitumorale, ce qui soulève la question de la nécessité d’injections répétées pour obtenir un effet optimal. Dans cette étude préclinique, nous comparons deux schémas d’administration avec plusieurs modèles de tumeurs solides afin d’évaluer le contrôle de la croissance tumorale, l’évolution clinique des animaux et les modifications de la réponse immunitaire induites par les différents schémas de traitement.

Bénéfices attendus

Si les hypothèses de travail sont confirmées, ce projet pourrait montrer qu’une réduction du nombre d’administrations d’immunothérapie, lorsqu’elle est combinée à la radiothérapie, permet de conserver une efficacité antitumorale comparable aux schémas standards, tout en limitant les effets indésirables systémiques. Ces résultats pourraient contribuer à l’optimisation des stratégies thérapeutiques combinées en clinique humaine, en favorisant des protocoles plus sûrs et mieux tolérés. Par ailleurs, la diminution du nombre d’injections d’anticorps pourrait également représenter un bénéfice économique important, en réduisant le coût global des traitements immunothérapeutiques. Cet aspect est particulièrement pertinent dans un contexte de généralisation de ces traitements, où leur coût constitue un enjeu majeur pour les systèmes de santé. Enfin, l’identification de schémas d’administration plus courts et plus efficaces pourrait améliorer la compréhension des mécanismes d’activation immunitaire induits par la radiothérapie et aider à mieux définir les conditions nécessaires à une réponse thérapeutique optimale. À terme, ces données pourraient soutenir le développement de stratégies thérapeutiques plus personnalisées et plus durables pour les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Injections de cellules tumorales : – une injection pour les modèles à une tumeur ; – deux injections pour les modèles à deux tumeurs ; (durée approximative : 30 secondes par injection). • Traitements par immunothérapie : les anticorps seront administrés par injection intrapéritonéale, tous les 2 ou 3 jours selon le protocole expérimental, pour un maximum de quatre injections par animal (durée approximative : 30 secondes par injection). • Radiothérapie : les animaux recevront une anesthésie générale à l’isoflurane afin d’être placés dans les dispositifs d’irradiation : une séance d’irradiation localisée (n = 1), durée ~12 minutes ; ou (pour un autre modèle) trois séances d’irradiation localisée (n = 3), durée ~12 minutes chacune ; d'autres animaux auront une irradiation corporelle totale : une séance unique, durée ~12 minutes. Prélèvements sanguins : un prélèvement sanguin terminal pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde à l’isoflurane, par ponction de la veine sous-mandibulaire, au moment de l’euthanasie (durée approximative : 1 minute).

Impact sur les animaux

L’injection tumorale peut entraîner une gêne mécanique et une diminution d'appétit modérées liée à la croissance tumorale. Les injections d’anticorps peuvent induire un inconfort bref. La radiothérapie, réalisée sous anesthésie générale de courte durée, peut être associée à des effets transitoires tels qu’une fatigue passagère, une diminution temporaire légère de l’appétit ou un érythème local. Les études de toxicité peuvent entraîner des symptômes de garvité modérée tels que perte de poids, hyopthermie et prostration.

Devenir

À l’issue de chaque procédure (injection tumorale, traitement, irradiation), les animaux seront maintenus en vie jusqu’à la fin du suivi expérimental ou jusqu’à l’atteinte des critères de fin humanitaires prédéfinis. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés sous anesthésie générale pour la collecte des tissus destinés aux analyses immunologiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

Aucune méthode in vitro ou in silico ne permet actuellement de reproduire de manière fiable l’interaction complexe entre la radiothérapie, l’immunothérapie (anti-PD-1/PD-L1) et le système immunitaire entier. Les modèles cellulaires 2D ou 3D, bien qu’utiles pour des études mécanistiques partielles (cytotoxicité, signalisation), ne peuvent pas refléter la dynamique du microenvironnement tumoral, la réponse immunitaire adaptative ni la toxicité systémique observée in vivo. L’utilisation de modèles murins syngéniques immunocompétents est donc indispensable pour évaluer l’efficacité thérapeutique, la tolérance et les effets immunologiques globaux des traitements combinés. Les animaux seront utilisés uniquement lorsque cela est scientifiquement justifié, et le nombre sera limité au strict nécessaire selon un calcul de puissance statistique. En parallèle, les résultats obtenus pourront contribuer à réduire le recours futur aux modèles animaux en identifiant des schémas thérapeutiques plus courts et plus sûrs.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, (avec G*Power) afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale . De plus, une taille moyenne de 80-100mm3 a été fixée comme critère de démarrage pour randomiser les animaux. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie (isoflurane/Lidocaïne) adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections intrapéritonéales. Les conditions d'hébérgement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaires. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 7 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte, à la fois physiologiquement et immunologiquement. À cet âge, le système immunitaire des souris est pleinement développé, ce qui est essentiel pour des études impliquant des réponses immunitaires. En particulier, les interactions entre les cellules immunitaires et les tumeurs, ainsi que l’évaluation des thérapies immunomodulatrices, nécessitent un système immunitaire mature pour fournir des résultats fiables et transposables. L’utilisation de souris plus jeunes pourrait entraîner des réponses immunitaires immatures, tandis que des souris plus âgées pourraient présenter des modifications immunitaires liées à l’âge, ce qui pourrait biaiser les résultats. Par conséquent, cet âge est idéal pour garantir la pertinence des résultats immunologiques dans le cadre de notre étude

12 cochons vont être utilisés, tous mis à mort pour prélever leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des immunisations sous sédation puis sous anesthésie générale pour déclencher une maladie rénale rare, avec des prélèvements de sang et d'urine. Le projet vise à dater le début des lésions rénales afin de mieux interpréter une étude antérieure d'un candidat médicament, réclamée par les autorités de santé américaines. Le porteur écarte la souris et le rat, dont la cible du médicament diffère de celle de l'humain, et retient le cochon pour la proximité de ses reins.

Objectifs

La glomérulonéphrite à croissants est une maladie rare du rein qui abîme très rapidement les petits filtres du rein, appelés glomérules. Cette maladie est provoquée par une réaction excessive du système immunitaire contre le rein. Au cours de cette réaction, les glomérules produisent en excès une protéine (facteur de croissance) qui participe à l’apparition des lésions rénales. Une étude précédente menée chez le porc a montré la capacité d’un candidat médicament à protéger le rein en bloquant l’action de cette protéine d’intérêt. Le but de ce projet est de mieux comprendre à quel moment, au tout début de la maladie, cette protéine commence à augmenter et à quel moment les premières lésions du rein apparaissent. Cela permettra de savoir si, dans l’étude précédente, le traitement avait été donné alors que la maladie avait déjà commencé, ou au contraire très tôt avant l’apparition des premières lésions. Cette information est importante pour mieux interpréter les résultats déjà obtenus et pour poursuivre le développement du médicament dans des conditions proches de celles rencontrées chez les patients. Pour cela, les animaux seront observés à deux moments très précoces après le déclenchement de la maladie, puis comparés à des animaux sains. L’objectif est de décrire les toutes premières étapes de la maladie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet est de permettre le développement d’un nouveau traitement destiné à une maladie rénale rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement pleinement satisfaisant. Les autorités de santé américaines ont demandé des informations complémentaires pour s’assurer que ce traitement agit bien lorsque la maladie est déjà installée, et non avant son apparition. Une étude précédente avait été réalisée très tôt après le déclenchement de la maladie, ce qui nécessite aujourd’hui d’en préciser le contexte. L’étude proposée vise donc à mieux comprendre à quel moment la maladie débute réellement et à vérifier que le traitement est efficace dans des conditions comparables à celles des patients. Ces résultats sont essentiels pour accélérer le développement du médicament et améliorer à terme la prise en charge des personnes atteintes de cette maladie rare.

Procédures

Les animaux recevront une immunisation à J-6 par voie sous-cutanée sous sédation profonde (durée 30 min, 1 seule fois), puis une immunisation par voie veineuse, sous anesthésie générale, à J0 et à J1 (durée 2h à chaque fois). Ils auront un prélèvement sanguin et urinaire à J0, J1 (sous la même anesthésie générale réalisée pour l'immunisation, sans augmentation du temsp d'anesthésie) et J4, sous anesthésie générale (10-15 min).

Impact sur les animaux

Un stress léger à modéré de courte durée est attendu lors de la contention et de la manipulation des animaux. Les prélèvements sanguins et urinaires peuvent être à l'origine d'une légère irritation (rare) ou d'un petit hématome n'entrainant aucune gêne (occasionnellement) au point de ponction. L’immunisation est susceptible d’entrainer une inflammation locale limitée. Les nuisances seront limitées pour les animaux car la pathologie induite commencera tout juste à se développer (absence de douleur). Les animaux sont susceptibles, dans moins de 20% des cas, d’éprouver un choc de type allergique, sous anesthésie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs reins pour faire des analyses. Ces examens permettent d’évaluer la mise en place de la maladie.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthodes réalisées uniquement en laboratoire, sur ordinateur ou à partir de tissus isolés qui permettent de reproduire fidèlement l’ensemble des mécanismes en jeu dans cette maladie rénale rare. Celle-ci fait intervenir de nombreuses interactions complexes entre le système immunitaire, les cellules du rein et la circulation sanguine. L’objectif de l’étude étant de comprendre précisément à quel moment la maladie commence et comment elle évolue dans l’organisme, le recours à un modèle animal adapté reste aujourd’hui indispensable. Les approches alternatives existantes ne permettent pas encore de répondre à ces questions de manière fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique du projet. L’étude repose sur trois animaux étudiés au temps J1 de l’induction de la maladie, trois animaux au temps J4 et trois animaux contrôles, ce qui permet de caractériser l’installation de la pathologie et de disposer d’un point de référence sans multiplier inutilement les effectifs. Ce design expérimental s’appuie sur les données de variabilité obtenues lors des études antérieures et permet d’obtenir des informations robustes tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Trois animaux supplémentaires au maximum seront ajoutés, uniquement en cas de mortalité dans les groupes précédents, portant le nombre total à maximum 12.

Raffinement

Les porcs sont hébergés en groupes sociaux, dans des conditions correspondant aux besoins physiologiques de l’espèce. Des enrichissements variés sont mis à disposition. Les interventions sont réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress chez ces animaux. Des critères d’arrêt de l’expérimentation précoces et stricts seront définis afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les méthodes de prélèvements sont raffinées afin de limiter le risque d'iritation. La pathologie étant à un stade très précoce, les animaux ne présenteront pas de symptomatologie clinique apparente ni de signes de souffrance attendus. Aucune analgésie n’est donc nécessaire. Une surveillance régulière et adaptée sera mise en place, permettant toute intervention immédiate si nécessaire, conformément aux recommandations en vigueur, afin de minimiser au maximum toute contrainte ou détresse animale.

Choix des espèces

Le choix du porc comme modèle animal s’explique par sa grande ressemblance avec l’être humain, notamment pour le fonctionnement des reins. Les reins du porc fonctionnent de manière très proche de ceux de l’homme, ce qui permet d’étudier la maladie et l’effet d’un traitement dans des conditions proches de la réalité chez les patients. Les souris et les rats ne peuvent pas être utilisés dans ce cas, car la cible du médicament étudié n’est pas la même chez ces espèces et le traitement ne peut donc pas agir correctement. En revanche, chez le porc, cette cible est très similaire à celle de l’humain, ce qui permet d’évaluer de manière fiable l’efficacité du médicament. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 30 kg au début de l’étude, ce qui correspond à un stade où leur système immunitaire est déjà mature, garantissant des résultats plus pertinents et mieux transposables à l’homme.

Deux à quatre anesthésies générales de deux heures chacune pour des examens d'IRM : 18 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. La cuprizone incorporée à leur nourriture détruit la myéline et provoque des troubles moteurs, une perte de poids et des comportements anxieux, réversibles à l'arrêt du produit. Le projet compare une nouvelle méthode d'IRM à la technique de référence pour mesurer la myéline. Leur mise à mort sert à vérifier que les images correspondent à la réalité du cerveau.

Objectifs

De nombreuses maladies du cerveau et de la moelle épinière s’accompagnent d’une atteinte de la myéline, une structure agissant comme une couche isolante autour des neurones, permettant aux messages du cerveau de circuler plus vite et efficacement. Parmi ces maladies, nous retrouvons la sclérose en plaques (SEP), dont l'incidence est en augmentation depuis plusieurs années. Ainsi, pour mieux traiter ces patients, il est nécessaire de disposer d'outils en pratique clinique permettant de quantifier cette atteinte, et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet cela de façon non-invasive. Néanmoins, les techniques d’IRM actuellement utilisées en pratique clinique ne permettent pas de voir directement la myéline mais seulement les dégâts infligés au cerveau lors de l’atteinte de cette myéline. Depuis plusieurs années, des techniques d’IRM sont développées pour essayer de mesurer directement l’atteinte de la myéline, et il en existe aujourd’hui une qui est considérée comme la référence. Néanmoins, cette technique est complexe et nécessite une longue durée d’acquisition, rendant son utilisation en pratique clinique impossible en l’état. Nous avons donc développé une nouvelle technique d’IRM ciblant la myéline, plus simple dans sa mise en œuvre. Ce projet vise à tester cette nouvelle méthode d’imagerie, en la comparant à la technique de référence, à l’aide d’un modèle murin imitant la sclérose en plaques humaine : le modèle cuprizone. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir une nouvelle méthode d'IRM fiable, non invasive et applicable en conditions cliniques pour quantifier la myéline in vivo, ce qui fait actuellement défaut pour le suivi des patients atteints de SEP. Cette nouvelle approche sera aussi utile dans le cadre d’autres pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer. Ceci est d'autant plus important que le développement de thérapies innovantes visant à favoriser la remyélinisation (c’est-à-dire visant la réparation de la myéline atteinte, et donc la protection des neurones), devient une priorité depuis quelques années.

Procédures

Le traitement par cuprizone sera administré per os, directement incorporé au sein de la nourriture habituelle des souris, à la concentration de 0,2%. Les animaux bénéficieront de 2 à 4 sessions d’anesthésie générale gazeuse, afin de permettre leur immobilité et de réduire leur stress lors des examens par IRM. Chaque session aura une durée maximale de 2 heures.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par cuprizone peut entraîner chez la souris des troubles moteurs légers, à savoir principalement des troubles de la coordination et locomotion. Elle peut aussi entraîner des troubles comportementaux liés à des problèmes de mémoire et d’apprentissage, pouvant être à l’origine de comportements anxieux ou dépressifs. La cuprizone peut également avoir des effets physiologiques généraux avec une perte de poids et une baisse de l’activité. Toutefois, dès que l'on arrête de donner le produit à la 6ème semaine, le cerveau cesse d'être attaqué. Cela marque le début d'une phase de guérison où l'animal retrouve progressivement sa forme et son comportement normal. Par ailleurs, il peut y avoir un stress lié aux transports des souris entre les animaleries et la plateforme d'imagerie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever et analyser leur cerveau. Cette étape est indispensable pour vérifier que les images obtenues en IRM reflètent bien la réalité biologique observée dans le cerveau.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est obligatoire pour valider la robustesse de nouveaux paramètres IRM dans des conditions biologiques réelles. Ces validations constituent une étape incontournable avant toute transposition en clinique. A ce jour, malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, aucune alternative non animale ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes de démyélinisation et de remyélinisation in vivo.

Réduction

Le nombre de 18 souris est nécessaire et suffisant pour analyser la perte de myéline induite par le traitement à la cuprizone, la reconstitution de la myéline tout en considérant les variabilités inter-individus, aux 3 points temporels de notre étude. Le suivi longitudinal permet de réduire la variabilité inter-individuelle et le nombre total d’animaux utilisés, tout en évaluant la nouvelle technique IRM.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront prises au cours du suivi afin de réduire le stress engendré par les examens IRM répétés,les transports et les contentions multiples et les troubles induits par l'ingestion du médicament pour induire une démyélinisation . Ces mesures seront réalisées sous anesthésie générale, afin que l’animal ne bouge pas et permettra de diminuer le stress induit par le bruit des machines. L’hypothermie, induite par le passage dans la machine IRM sera prévenue par un maintien d’une température stable pendant toute la durée de l’anesthésie. Des points limites seront appliqués, conduisant selon la situation, à l’arrêt de la procédure et/ou à la mise à mort humanitaire conformément aux procédures en vigueur.

Choix des espèces

Le modèle cuprizone est le modèle de choix pour l'étude des changements du contenu en myéline dans le cerveau de souris. Il s’agira de souris femelles adultes ayant un développement cérébral achevé (âgées de 6 à 8 semaines) car la sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, touchant de façon prédominante les femmes.

192 souris axéniques, nées et élevées sans aucun microbe, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal de donneurs humains en surpoids, puis un régime riche en graisses, pour mesurer l'effet de bactéries lactiques et de lipides laitiers sur la santé métabolique. Un jeûne de six heures et un test de tolérance au glucose complètent le protocole. Le porteur décrit la souris axénique comme le seul modèle permettant d'attribuer les effets observés au microbiote transféré, sans microbiote résiduel pour brouiller les résultats.

Objectifs

Depuis quelques années, on sait que le microbiote intestinal joue un rôle dans le développement des maladies métaboliques telles que l’obésité ou le diabète de type II. Identifier des stratégies alimentaires qui permettraient de protéger le fonctionnement sain du microbiote intestinal est crucial pour contrer l’apparition de ces maladies. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence l’impact de bactéries lactiques et de lipides laitiers d’intérêt sur la flore intestinale. Pour ce faire, ces produits ont été ajoutés aux microbiotes de donneurs humains en surpoids. Dans le cadre de notre étude, ces microbiotes modifiés vont être transférés à des souris totalement dépourvues de bactéries, soumises à une alimentation riche en graisses. Les résultats obtenus doivent permettre de mettre en évidence l’effet protecteur des bactéries lactiques et des lipides laitiers sur les désordres métaboliques et montrer, le cas échéant, que cet effet protecteur passe par une modification du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Le rôle du microbiote intestinal dans le développement des maladies métaboliques est maintenant reconnu. Trouver des moyens de moduler ce microbiote de façon favorable pourrait ainsi être une stratégie de prévention de ces pathologies. Dans ce cadre, les résultats obtenus pourraient permettre de concevoir des formulations de bactéries/lipides bénéfiques pour la santé.

Procédures

Tous les gestes techniques seront réalisés sur des animaux vigiles. Les souris seront gavées 1 fois à l’aide d’une sonde de gavage souple (durée 15 secondes maximum) pour l’inoculation du microbiote. A la dernière semaine du protocole, les souris seront soumises 1 fois à un test de tolérance au glucose. Au préalable, elles seront mises à jeun 6h. Puis elles recevront 1 gavage de glucose (durée 15 secondes maximum) pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures durée inférieure à 10 secondes).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance liée au régime riche en graisses n’est attendue. Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des pesées et des prélèvements. Les animaux seront soumis à une légère douleur au moment des prélèvements sanguins. Les animaux seront soumis à un jeûne de 6 heures ce qui entraîne un stress, ainsi qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, tissu adipeux, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote intestinal et d’une intervention nutritionnelle sur le développement de maladies métaboliques nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux obtenus avec une intervention nutritionnelle.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. Les effets d’un régime hyperlipidique et les tests de glycémie sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. De plus, la taille de ces animaux permet leur hébergement en isolateur, condition particulière permettant le maintien du microbiote étudié, empêchant l’air ambiant de le modifier. Ils seront étudiés à l’âge adulte (8 semaines), l’objectif étant d’étudier les effets du microbiote intestinal et d’une intervention nutritionnelle sur le développement des maladies métaboliques chez l’adulte. La souris axénique est un animal né et élevé en conditions stériles, totalement dépourvu de tout microorganisme. Ce modèle est indispensable à notre étude car il constitue le seul système permettant d'attribuer causalement les effets physiologiques observés aux microbiotes humains transférés. En effet, si les souris possédaient déjà un microbiote endogène, il serait impossible de distinguer les effets du microbiote transféré de ceux du microbiote résiduel de l'animal.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un traitement pendant un mois, par voie orale ou par injections quotidiennes, avant des tests de vision et d'audition sous anesthésie. Ces souris reproduisent une maladie génétique rare, la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les troubles moteurs apparaissent vers six mois. Le porteur affirme que le recours à un modèle animal mammifère est "indispensable", aucun autre modèle ne présentant selon lui ces symptômes.

Objectifs

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique rare qui provoque une faiblesse des muscles, surtout dans les jambes et les pieds, rendant la marche difficile. Les patients peuvent aussi avoir des pieds déformés et une perte sensorielle. Une des formes les plus communes de cette maladie entraine une perte de la vue ou de l’audition. Cette maladie est causée par une mutation qui impacte le bon fonctionnement des mitochondries. A ce jour, les troubles de la vision et de l’audition n’ont pas encore été étudiés dans le modèle de souris qui reproduit cette maladie. De plus, il n’existe toujours pas de traitement efficace. C’est pourquoi nous proposons une nouvelle approche thérapeutique, en testant des molécules ciblant un récepteur clé dans le fonctionnement de la mitochondrie. Ce projet sera donc composé de deux objectifs : caractériser les troubles sensoriels du modèle souris et tester des molécules thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de caractériser la perte de vision et d'audition d'un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il permettra également d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés par nos collaborateurs chimistes sur ces déficits neurosensoriels. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour une pathologie n’ayant aucun traitement disponible à ce jour.

Procédures

Les animaux seront identifiés par marquage à l'oreille. LES MOLECULES THERAPEUTIQUES A TESTER SERONT EN PREMIERE INTENTION, DONNEES PAR VOIE ORALE, SOUS FORME DE PETITES GOUTTES DEPOSEES DELICATEMENT DANS LA BOUCHE, PENDANT 1 MOIS 6 JOURS/7, AVANT LES TESTS. SI LE GESTE N'EST PAS EFFICACE elles seront injectées quotidiennement dans le ventre en alternant la gauche et la droite, pendant 15 jours avant les tests fonctionnels. Deux tests d'évaluation de la vision seront réalisés sur animal vigile (durée 30 minutes) et sur animal anesthésié avec application d’un collyre dans l’œil pour dilater la pupille (durée 40 minutes). Le test auditif sera réalisé sous anesthésie (40 minutes).

Impact sur les animaux

La contention pour l’identification et les injections peut engendrer un léger stress et une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des injections. Les troubles locomoteurs caractérisés qui se développent à partir de 6 mois vont entrainer une gêne pour l’animal. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi sera mise en place afin de garantir le bien-être animal. Tous nos tests d'exploration fonctionnelle sont peu douloureux et sans conséquence physiologique à part un léger stress

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle animal de la pathologie est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptômes locomoteurs rapidement. Cela permet l'élaboration plus rapide d'un traitement curatif. Les troubles sensoriels quant à eux doivent être caractériser avant de pouvoir tester un potentiel traitement. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal mammifère pour étudier les fonctions auditives pertinentes chez l’humain.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous nous sommes basés sur notre expérience sur un modèle avec des troubles sensoriels similaires associé à une analyse de puissance pour calculer le nombre d’animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec des maisonnettes et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Pour éviter que ces souris ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur. Pour limiter l’agitation des souris présentant des troubles locomoteurs, l’enrichissement sera renforcé dans les cages (petites briques de bois, des frisures de papier kraft et des tubes en carton par exemple). Si nécessaire, la nourriture pourra être remplacée par du gel alimentaire. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Tout au long du projet, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux afin de minimiser au maximum la douleur, la détresse ou toute souffrance inutile. Les protocoles incluront l'utilisation systématique d'anesthésiques et d’analgésiques adaptés. Les points limites définis à l’avance feront l’objet d’une surveillance rigoureuse et quotidienne des animaux. Ces critères permettront de mettre un terme à l’expérimentation de manière anticipée si l’animal présente des signes de souffrance non contrôlable ou de détérioration de son état général (perte de poids significative, troubles moteurs graves, automutilation, perte d’autonomie, etc.). Le projet intègre également des techniques non invasives ou faiblement invasives ( examens auditifs/visuels) pour limiter l’impact des procédures sur les animaux.LA METHODE DE TRAITEMENT SERA RAFFINEE EN UTILISANT LA VOIE ORALE. L’euthanasie, lorsqu’elle est requise, sera réalisée selon les méthodes recommandées par les autorités compétentes (Directive 2010/63/UE), de manière rapide et sans douleur.

Choix des espèces

La pathologie étudiée est une pathologie multi-organes où les altérations locomotrices s'accompagnent de signes neurosensoriels. Un modèle de souris, permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests neurosensoriels seront réalisés sur les souris à 3 âges différents DANS LES DIFFERENTS GROUPES afin de pouvoir déterminer à quel moment les troubles apparaissent. Une fois que le stade d’apparition des symptômes sera identifié, les tests neurosensoriels seront reproduits après administration des molécules thérapeutiques.

2 320 souris vont être utilisées, toutes tuées sans réveil pour prélever leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une substance réactive est déposée dans leurs voies respiratoires pour déclencher une inflammation puis une fibrose pulmonaire, avec un risque de détresse respiratoire modérée. En fin d'étude, chaque animal passe trois à quatre heures en chambre de pléthysmographie. Ces modèles servent au développement préclinique de médicaments, la BPCO citée comme enjeu de santé publique restant l'horizon lointain de ces tests.

Objectifs

L’inflammation pulmonaire est une réponse biologique complexe du tissu pulmonaire à divers stimuli néfastes : pathogènes, cellules endommagées, substances irritantes, etc. L’inflammation est un mécanisme immunitaire protecteur impliquant les cellules immunitaires, les vaisseaux sanguins et différents messagers cellulaires. Depuis ces dernières décennies, on assiste à une augmentation significative des maladies inflammatoires du poumon, telles que l’asthme ou la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). L’inflammation peut être aiguë, c’est-à-dire temporaire, ou devenir chronique et donc persister un long moment. Le plus souvent, cette inflammation chronique va évoluer vers une fibrose du tissu pulmonaire qui modifiera la fonction pulmonaire. La BPCO est une maladie chronique inflammatoire qui touche le système respiratoire. La BPCO englobe au moins quatre phénomènes pathologiques, tels que l’emphysème pulmonaire, le remodelage des voies aériennes de petite taille, la bronchite chronique et l’hypertension artérielle pulmonaire. Le tabac est indiscutablement le facteur principal et aggravant de la BPCO chez l'homme. Le modèle animal idéal devrait reproduire les divers phénomènes pathologiques énumérés ci-dessus dans un court laps de temps. Les tests décrits dans ce projet ciblent l’inflammation et la fibrose du système respiratoire dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin d’évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à lutter contre certaines infections pulmonaires. Ces tests fournissent ainsi des données essentielles sur le potentiel thérapeutique des molécules étudiées.

Bénéfices attendus

Ces modèles d'inflammation ou de fibrose pulmonaire (processus pathologique au cours duquel un tissu normal est remplacé par un excès de tissu conjonctif fibreux, essentiellement constitué de collagène) sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies pulmonaires. Les traitements ont pour objectif de réduire les symptômes et d’améliorer la tolérance à l’effort des patients. A ce jour, la prise en charge de patients atteints de BPCO reste encore limitée et les conséquences ont un impact sociétal important (médical, psychologique, professionnel, social, familial). Le traitement antifibrosant par pirfénidone ou nintédanib ralentit l’aggravation de la maladie, mais n’entraîne pratiquement pas d’amélioration des symptômes (toux persistante par exemple). Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuive la recherche de nouveaux traitements efficaces et sans effets secondaires majeurs. Ainsi, les résultats attendus de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques permettant d’améliorer la qualité et l’espérance de vie des patients.

Procédures

Pour l'injection de la substance réactive sous aspiration oropharyngée (sous anesthésie légère), l'administration est de l'ordre de la minute. L’inflammation et la fibrose pulmonaire se développent progressivement sur une période de 21 jours (durée maximale de l’expérience). Les traitements sont classiquement administrés soit en aigu (1 fois) soit en chronique (en général 1 à 2 fois/jour pendant 3 semaines maximum). En fin d’étude (généralement le dernier jour, jour 21), les animaux sont placés dans des chambres de pléthysmographie pour l’enregistrement des paramètres respiratoires (stabilisation, puis enregistrement sur une période de 3-4 heures). Pendant l’étude, des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés (maximum 2, pas plus de 10% du volume sanguin au cours de l’étude). Enfin, un prélèvement sanguin ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie est réalisé juste avant l'euthanasie

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une réaction inflammatoire principalement localisée au niveau pulmonaire pouvant évoluer vers la fibrose. L'inflammation est liée aux effets de substances administrées par voie intra-trachéale dont les effets sont bien caractérisés. Dans le cas de l'inflammation pulmonaire et/ou de la fibrose, les paramètres respiratoires peuvent être altérés et induire une détresse respiratoire modérée. Les traitements testés peuvent potentiellement induire des effets secondaires qui dépendent de la nature du traitement (antiinflammatoire, antifibrotique, immunosuppresseur, etc.), tels que perte de poids, troubles gastro-intestinaux, altérations métaboliques…, qui seront surveillés étroitement afin de garantir le bien-être des animaux

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour recueil du liquide bronchoalvéolaire et des poumons (pas de réveil).

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro ont pu être réalisés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Nos données historiques ainsi que celles de la littérature indiquent qu'il est nécessaire d'inclure, selon le modèle, de 8 à 16 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) pour atteindre une sensibilité correcte. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce repose sur les données issues de la littérature scientifique. La souris est retenue pour ces études car elle constitue le modèle de référence pour l’exploration des mécanismes d’inflammation aiguë et de fibrose pulmonaire induites par des agents réactifs tels que le LPS ou la bléomycine (recrutement des cellules inflammatoires, activation macrophagique, signalisation TGF-β et dépôt de matrice..). Elle présente des voies immunitaires et des processus de remodelage tissulaire comparables à ceux de l’homme, permettant une transposition pertinente des résultats vers la physiopathologie humaine. De plus, la disponibilité de nombreux modèles génétiques validés chez la souris permet de mener une investigation mécanistique approfondie et robuste. Principalement sur des souris ayant été sevrées, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (classiquement souris agées de 10 semaines).

Exposées à l'alcool, opérées pour implanter un dispositif dans le cerveau, soumises à l'optogénétique, à des tests sociaux, à un stress de contention répété et à un isolement de dix jours, 756 souris enchaînent ces procédures dans des travaux impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour conserver leur cerveau. Ces souris portent une mutation liée à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Une modification récente ajoute une pompe implantée sous la peau diffusant de la nicotine en continu. Le même animal traverse plusieurs de ces étapes successivement, ce qui réduit, selon le porteur, le nombre total d'animaux utilisés.

Objectifs

Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.

Bénéfices attendus

Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.

Procédures

Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux). Certains animaux seront places en isolement social dans une cage contenant une roue d'activite pendant une periode de 10 jours avant d'etre replaces en cage collective (72 animaux). MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX RECEVRONT UN PETIT IMPLANT SOUS LA PEAU POUR DIFFUSER UNE PETITE QUANTITE D'UNE SUBSTANCE (NICOTINE) EN CONTINU (n=24).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à plusieurs types de procédures expérimentales pouvant entraîner des nuisances de sévérité variable. Certains seront exposés de manière volontaire à une solution contenant de l’alcool sur plusieurs semaines. Cette consommation, laissée au choix de l’animal, peut induire des effets relaxants et une modification transitoire de l’état émotionnel. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale visant à accéder à des structures cérébrales. Cette procédure peut entraîner une douleur modérée et une légère perte de poids pendant quelques jours après l’intervention. Des complications peuvent survenir, telles qu’un saignement, une infection locale ou une perte du dispositif implanté, pouvant conduire à une décision de mise à mort. MODIFICATION: UNE AUTRE INTERVENTION CONSISTE A IMPLANTER SOUS LA PEAU UN DISPOSITIF PERMETTANT L’ADMINISTRATION CONTINUE D’UNE SUBSTANCE. CETTE PROCEDURE PEUT PROVOQUER UNE DOULEUR LOCALE MODEREE ET TRANSITOIRE AINSI QU’UNE LEGERE PERTE DE POIDS. ELLE PEUT EGALEMENT ENTRAINER DES MODIFICATIONS TEMPORAIRES DE L’ACTIVITE ET DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Certains animaux feront l’objet de manipulations permettant de moduler l’activité de circuits cérébraux à l’aide de lumière. Ces manipulations peuvent induire un état anxieux léger et transitoire. D’autres procédures incluent la réalisation de tests comportementaux, pouvant générer un stress léger et de courte durée, ainsi que l’application ponctuelle d’un stress modéré. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés, entraînant une douleur brève au moment du geste. Enfin, certains animaux seront maintenus en isolement social pendant plusieurs jours, ce qui peut induire un stress modéré persistant durant toute la période d’isolement (10 jours maximum).

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain

Réduction

Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE, CELA LIMITE LES VARIATIONS DE CONCENTRATION DU PRODUIT DANS LE SANG ET PEUT AINSI REDUIRE LE NOMBRE DE SOURIS NECESSAIRES POUR OBTENIR DES RESULTATS FIABLES.

Raffinement

Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE. CELA EVITE DE FAIRE DE NOMBREUSES INJECTIONS CHAQUE JOUR.

Choix des espèces

La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.