Procédures sévères

Deux chirurgies du cerveau en dix jours, puis sept examens d'imagerie sous anesthésie en un mois, c'est le calendrier imposé à chacun des 27 rats de ce projet, tous tués à l'issue du dernier examen, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est greffée au premier jour, retirée partiellement au dixième comme elle le serait chez un être humain, la cavité étant laissée vide ou tapissée d'un gel de chitosane dont il s'agit de suivre la dégradation par IRM. Le porteur classe l'implantation et l'exérèse en gravité sévère et signale que le développement tumoral peut provoquer des symptômes neurologiques, la chirurgie étant pratiquée avant leur apparition. Le rat a été retenu pour la taille de son cerveau, qui laisse la tumeur atteindre un volume suffisant pour dépasser les limites de résolution de l'imagerie et permettre l'injection du gel.

Objectifs

Les tumeurs intracérébrales représentent la forme la plus agressive des tumeurs du système nerveux central sans possibilité curative. Une infiltration des cellules cancéreuses dans le tissu cérébral sain favorisent inévitablement la reprise tumorale. Le traitement standard actuel consiste en une résection chirurgicale (=retrait de la tumeur) suivie d’une radiothérapie (traitements par rayons X) combinée à une chimiothérapie (traitement médicamentaux). Le projet proposé s’appuie sur un modèle de tumeurs cérébrales chez le rat. Après avoir implanté la tumeur dans le cerveau des animaux, celle-ci est retirée chirurgicalement (exérèse) et partiellement (comme dans le cas d'une chirurgie chez l'être humain). Les cellules résiduelles sont à l'origine de la récidive (reprise tumorale) survenant après l'opération. Lors de la chirurgie d'exerèse, la cavité formée lors du retrait de la masse initiale sera laissée telle quelle (non comblée) ou un gel formant un réseau sera déposé à l'intérieur (tapissant ainsi la cavité opératoire). L'objectif de ce projet est ainsi de caractériser par imagerie le comportement de ce gel mais aussi de caractériser la récidive tumorale. Pour ce faire, nous réaliserons d'une part des examens TEP (Tomographie par Emission de Positons) via l'injection d'un traceur radioactif qui permet de visualiser les foyers de récidive tumoraux. D'autre part, le comportement du gel sera évalué grâce à l'outil d'imagerie par IRM (Imagerie à Résonance Magnétique) via un suivi longitudinal permettant d'estimer l'évolution du volume tumoral et de suivre la dégradation du gel au cours du temps. Ce projet est un projet multisite à cause de contraintes techniques liées aux équipements.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet initial permettront en première intention de caractériser le modèle de tumeur cérébral opéré (dont la tumeur a été retirée chirurgicalement) en présence ou non d'un gel marqué avec un agent de contraste. Le phénomène de récidivie tumorale inhérant à la chirurgie ainsi que le comportement du gel déposé au sein même de la cavité opératoire pourront ainsi être appréhendés respectivement grâce à l'imagerie TEP et aux acquisitions IRM. Cette étape de caractérisation est indispensable avant même de pouvoir proposer l'application de ce gel dans la cavité opératoire comme nouvelle voie de stratégie thérapeutique pour la recherche clinique. Le bénéfice attendu est donc à plus long terme d'utiliser ce gel comme vecteur thérapeutique et adapter à posteriori son utilisation en cancérologie humaine.

Procédures

- Greffe des cellules tumorales dans le tissu cérébral (modèle intracérébral) à J0 (1 itération/1h) - Transport sur la plateforme d'imagerie à J2=2 jours post-greffe (1 itération/4h) - Dégreffe/exerèse= chirurgie qui consiste à retirer la tumeur qui se trouve dans le cerveau à J10=10 jours post greffe (1 itération/1h) - Examens TEP : J15/J22/J29 (3 itérations/50 min par temps d'imagerie) - Examens IRM : J9, J14, J21, J28 (4 itérations/1h par temps d'imagerie. L'exmen TEP (Tomographie par Emission de Positon) est une technique d'imagerie qui permet d'identifier les foyers tumoraux notamment grâce à l'injection d'un produit radioactif qui vient se fixer spécifiquement sur le tissu malade et qui permet sa visualisation en regardant l'image générée. L'examen IRM (Imagerie par Résonance Magnéique) est une technique d'imagerie qui permettra d'identifier les différentes structures cérébrales ainsi que le gel présent au sein de la cavité opératoire et de suivre sa dégradation au cours du temps. tumorales dans le tissu cérébral (modèle orthotopique) à J0 (1 itération/1h) - Dégreffe : chirurgie d'exerèse à J10 (1 itération/1h) - examens TEP : J22/J29 (2 itérations/50 min par temps cinétique) - examens IRM : J9, J14, J21, J28 (4 itérations/1h30 par temps cinétique).

Impact sur les animaux

Chirurgie d'implantation des cellules tumorales puis retrait chirurgical de la tumeur (exérèse) classées sévères mais médication pour limiter la souffrance des animaux. Le développement de la tumeur (modèle infiltrant) peut engendrer des symptômes neurologiques mais la chirurgie d'exerèse se fait assez précocément bien avant l'apparition de signes cliniques (J10). Le transport des animaux à J+2 sur la plateforme d'imagerie constitue également une nuisance. La chirurgie opératoire est assez invasive mais une surveillance accrue des animaux sera réalisée afin de garantir leur bien-être. Les sessions IRM et TEP nécessiteront des anesthésies répétées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort selon les méthodes en vigueur à l'issue du dernier temps d'imagerie.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible car le développement et la réponse au traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques extrêmement complexes qui ne peuvent pas être mimés en dehors d'un organisme entier. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. L’ensemble de ces facteurs dynamiques ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

En prenant en considération les contraintes du projet et en utilisant un logiciel de simulation afin d'établir l'effectif des animaux à inclure dans l'étude, il s'avère que 27 animaux au total seront nécessaires, pour une répartition de 9 animaux par groupe. Cet effectif intègre la perte possible d'un animal par groupe suite à l'intervention chirurgicale et d'éventuels problèmes rencontrés à l'issue du transport des animaux entre établissements utilisateurs (plateforme différente pour réaliser les imageries). Cet effectif est le minimum requis pour permettre des analyses statistiques pertinentes.

Raffinement

Quel que soit le site d'hébergement (projet multisite) , les animaux bénéficieront d'un hébergement selon les conditions réglementaires. Les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux sur chaque site. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après le retrait chirurgical de la tumeur (médication contre la douleur, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Ils seront effectués par du personnel qualifié et expérimenté. Pendant l’examen, le niveau d'anesthésie sera surveillé en temps réel à l'aide de paramètres tels que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire, garantissant ainsi un état stable et sécurisé pour les animaux. Après la procédure, les animaux seront surveillés pendant le processus de réveil dans un environnement calme et contrôlé. En outre, une grille de score permet un contrôle quotidien de l'état général de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles animaux majoritairement utilisés pour les études en cancérologie sont les modèles murins : souris et rats. Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante pour une implantation intracérébrale de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour s'affranchir des limitations de résolution offertes par l’imagerie et permettre une injection du gel. Les rats immunocompétents présentent l'avantage d'avoir un système immunitaire intégralement préservé et sont une souche de référence utilisée pour le développement d’un modèle murin de tumeurs cérébrales. De plus, les cellules tumorales ont été isolées d’une tumeur chez le rat, il n'y a donc pas de risques de rejet. Des rats âgés de 6 semaines seront utilisés à un stade où leur conformation crâniale est achevée.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès le jour de leur naissance et jusqu'à trois jours d'âge, les souriceaux reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, avec un risque d'hémorragie, d'hypothermie et de rejet de la portée par leur mère, puis subissent la pose chirurgicale d'un dispositif sur la tête, une privation visuelle installée par chirurgie et maintenue 72 heures, et jusqu'à trois séances d'enregistrement d'une heure la tête immobilisée. Ce que le porteur en attend reste lointain, mieux comprendre comment se construisent les circuits du cortex visuel et, à plus long terme, éclairer des troubles du développement cérébral ou des atteintes précoces de la vision. Le calendrier des mises à mort suit celui de la période sensible du cortex visuel de la souris, située entre 21 et 27 jours après la naissance, les analyses ayant lieu entre 18 et 21 jours, autour de 23 à 30 jours, ou entre 49 et 110 jours.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre pourquoi une zone spécifique du cerveau nommée cortex visuel est particulièrement malléable pendant une courte période du développement. Nous étudierons comment certaines connexions entre neurones se mettent en place avant, pendant et après cette période, et comment une modification temporaire de l’expérience visuelle peut remodeler ces circuits. L’objectif est d’identifier les mécanismes qui rendent le cerveau plus sensible à l’expérience à ce moment précis de la vie.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de mieux comprendre comment se construisent les circuits de la zone spécifique du cerveau étudiée ici (cortex visuel) au cours du développement. À plus long terme, il pourrait aider à mieux comprendre certaines situations dans lesquelles cette maturation se déroule mal, par exemple lors de troubles du développement du cerveau ou de certaines atteintes précoces de la vision. Il pourrait aussi contribuer à identifier des pistes pour restaurer de la plasticité (faculté à se remodeler) dans le cerveau adulte.

Procédures

Tous les souriceaux recevront une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 5minutes environ) sous anesthésie générale. Minimum 10 jours après cette injection, ces animaux auront une procédure chirurgicale pour l’implantation d’un dispositif sur leur tête. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Il y aura ensuite une première séance d’enregistrement par imagerie sous anesthésie générale pour une partie des animaux (60minutes maximum, 1 seule session) ou éveillés pour l’autre partie. Dans ce dernier cas, les animaux seront habitués au dispositif expérimental pendant 2-3 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h maximum. Une chirurgie sera ensuite réalisée pour tous les animaux afin de mettre en place notre modèle de privation sensorielle (une fois, sous anesthésie générale et analgésie adaptée, durée 10 minutes). Ce modèle sera maintenu pendant 72 h maximum, puis retiré sous anesthésie générale (une fois, durée 5 minutes). Chez les animaux imagés sous anesthésie, l'enregistrement post-privation est réalisé dans le prolongement direct de cette même anesthésie, sans réveil intermédiaire (1 session, 60 minutes maximum) : aucune anesthésie supplémentaire n'est donc nécessaire pour ces animaux. Chez les animaux imagés en condition vigile, le retrait des sutures est suivi d'un réveil complet en chambre chauffée, puis les enregistrements sont réalisés chez l'animal éveillé, à raison d'une session par jour d'une heure maximum, pendant 3 jours consécutifs au maximum, soit 3 sessions par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. L’injection chez les souriceaux est associée à un risque d’hémorragie, une hypothermie et un risque de rejet de la portée par la mère. Les chirurgies seront associées à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours. Les anesthésies générales entraineront des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiorespiratoire. De plus, après l'implantation du dispositif, l'animal pourra ressentir un inconfort et une gêne due à l’encombrement. Il existe également un risque rare de perte ou d’infection du dispositif. L’habituation des animaux à la condition de fixation de la tête peut également représenter une source de stress. La privation sensorielle impliquera des risques de gênes, d’inconfort et de stress pour les animaux. Afin de réaliser une imagerie du cerveau chez les animaux éveillés leur tête devra être immobilisée, ce qui limitera les mouvements de leur tête et génèrera un stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la procédure afin de prélever les organes d’intérêt pour réaliser des analyses histologiques, anatomiques, électrophysiologiques ou d’imagerie ex vivo indispensables pour répondre à l’objectif scientifique du projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement l’ensemble des interactions entre le cerveau en développement, les voies visuelles et l’expérience sensorielle. L’étude de la période critique nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Des approches sur cellules sont toutefois utilisées en amont lorsque cela est possible, par exemple pour vérifier certains outils expérimentaux, afin de limiter le recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats solides et statistiquement analysables. Les groupes ont été définis à partir des questions scientifiques posées, des connaissances déjà disponibles et d’estimations d’effectifs permettant d’éviter des répétitions inutiles. Le projet comprend 480 souris réparties en 48 lots de 10 animaux, cet effectif a été déterminé à partir de calcul statistiques et permettra de comparer les conditions essentielles tout en respectant le principe de réduction. Les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce, avec accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, et bénéficieront d’un enrichissement du milieu adapté. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne ; toute anomalie sera prise en charge en concertation avec la structure chargée du bien-être animal et les vétérinaires. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin de prévenir toute souffrance. Pour toutes les interventions chez les souriceaux un raffinement spécifique sera mis en œuvre, en réduisant au strict minimum la durée de manipulation et de séparation de la mère, en utilisant un matériel adapté (cadre stéréotaxique équipé d'adaptateurs pour souriceaux, système de fixation de tête léger et de profil bas (anneau de 20 mm, < 1 g) et en veillant à la récupération de la température corporelle avant la remise en cage. Nous vérifierons également leur bonne prise en charge par leur mère après leur retour en cage. Par ailleurs, pendant la gestation, les mères seront habituées à l’expérimentateur par des manipulations régulières, afin de limiter le stress lors des interventions sur les souriceaux. Les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées selon leur nature. Après les chirurgies, les animaux seront maintenus au chaud, surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés avec leurs congénères. Ils seront ensuite suivis quotidiennement pendant 3 jours jusqu’à récupération clinique satisfaisante. Un soutien alimentaire sera mis à disposition en période post-opératoire pour faciliter la récupération des animaux. Pour les procédures d’imagerie, la durée sera limitée au minimum nécessaire, lors des imageries anesthésiées un maintien de la température corporelle, une protection oculaire et une surveillance adaptée seront assurées. Les animaux réalisant les imageries éveillées seront tout d’abord habitués au dispositif de manière progressive pendant plusieurs jours.

Choix des espèces

Chez les mammifères, y compris l’humain, le cerveau possède des mécanismes de plasticité assez similaires. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris peuvent aider à mieux comprendre certains processus comparables chez l’humain. La souris est un modèle particulièrement utile pour étudier le développement et l’adaptation du cortex visuel, notamment pendant une phase clé appelée « période critique de plasticité ». Durant cette période, le cerveau est très sensible aux expériences visuelles et peut modifier son fonctionnement en réponse à son environnement. Dans ce projet, nous utiliserons quatre lignées de souris génétiquement modifiées. Elles permettront d’observer ou de cibler certaines populations de neurones, en particulier les neurones inhibiteurs. Certaines de ces souris expriment également un indicateur fluorescent qui permet de suivre l’activité des neurones. Ces outils nous aideront à mieux comprendre comment différentes populations de cellules participent au développement du cortex visuel et à son adaptation après une privation sensorielle. Chez la souris, la période critique du cortex visuel a lieu principalement entre 21 et 27 jours après la naissance. Afin d’étudier le rôle de certains gènes dans ce phénomène, leur activité sera modifiée avant cette période, pour laisser le temps à la modification d’être efficace. Les injections nécessaires seront donc réalisées très tôt après la naissance, entre le jour de la naissance et 3 jours d’âge. Une privation sensorielle sera ensuite effectuée à différents moments du développement, avant, pendant ou après cette période sensible, afin d’évaluer la capacité du cortex visuel à s’adapter. Les analyses seront réalisées à différents âges selon les groupes, notamment entre 18 et 21 jours, autour de 23 à 30 jours, ou plus tard, entre 49 et 110 jours, à l’aide de techniques d’imagerie et de marquage cellulaire.

Injectées vigiles d'un large volume de liquide qui fait pousser des tumeurs dans leur foie, 1 440 souris reçoivent ensuite une chimiothérapie deux fois par semaine, un anticorps deux fois par semaine et un second anticorps toutes les deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'ensemble sert à évaluer si un anticorps couplé à un médicament anticancéreux fait mieux que le traitement de référence du cholangiocarcinome, dont le résumé indique que seuls 25 % des patients y répondent. Le porteur écrit que l'injection d'un large volume peut provoquer du stress et peut-être de la douleur, et que les tumeurs du foie peuvent entraîner une gêne. Un prélèvement sanguin terminal clôt le protocole, puis toutes les souris sont tuées pour que leur foie soit collecté.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la combinaison du traitement standard du cholangiocarcinome et un anticorps associé à un médicament anticancéreux pour une meilleure prise en charge des cholangiocarcinome. Le cholangiocarcinome est un adénocarcinome du système hépatobiliaire hautement agressif et représente le 2ème cancer du foie le plus fréquent. Le traitement de référence combine la chimiothérapie avec immunomodulateur impliqué dans l’échappement immunitaire. Cependant, seuls 25% des patients répondent à cette combinaison pour 2% de réponse complète. Il y a donc un besoin urgent d’améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs. Nous avons récemment développé une nouvelle version de notre anticorps, associée à un médicament anticancéreux. Grâce à cette approche, le médicament est délivré directement aux cellules cancéreuses, ce qui permet de cibler plus précisément la tumeur, d'améliorer l'efficacité du traitement et de limiter les effets indésirables sur les tissus sains. L’objectif de notre projet est de continuer nos recherches sur le cholangiocarcinome et d’aller plus loin en évaluant l’efficacité de la nouvelle version de notre anticorps dans ce cancer par rapport au traitement de référence. Nous allons évaluer l’efficacité de la combinaison du traitement actuellement utilisé pour les cholangiocarcinome avec notre anticorps par rapport au traitement de référence seul sur la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de déterminer si l’ajout de cet anticorps améliore l’efficacité du traitement standard dans un modèle préclinique pertinent. Ce projet vise ainsi à générer des données précliniques nécessaires pour apprécier l’intérêt du ciblage de cette voie dans le cholangiocarcinome et à évaluer la pertinence d’une approche combinatoire. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le cholangiocarcinome, une pathologie pour laquelle les options de traitement restent limitées.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection rapide d’un large volume de liquide. Cette injection est réalisée sur animaux vigile. Les animaux recevront un traitement par chimiothérapie 2 fois par semaine, d’un anticorps 2 fois par semaine et d’un second anticorps 1 fois toutes les 2 semaines par injection. Ces injections sont réalisées sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisées. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

L’injection d’un large volume peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus. Les injections répétées induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre de l’aiguille. Le traitement par chimiothérapie peut entrainer une perte de poids de la souris. Nous nous attendons également à une diminution de la pression tumoral en présence de notre anticorps.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe sociaux sur portoir ventilé. Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les animaux sont manipulés à l’aide de tubes de manipulation pour limiter tout stress.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour l’étude de cette pathologie. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de minimum 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire et hépatique mature.

4 macaques vont être utilisés, deux à longue queue et deux rhésus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, alors que le porteur annonce n'employer que "deux singes adultes", l'une ou l'autre espèce devant être utilisée "en fonction de leur disponibilité". Chacun reçoit un traitement immunosuppresseur pendant toute la durée de l'étude et subit deux chirurgies de deux heures, l'une pour provoquer un traumatisme crânien, l'autre pour greffer des neurones dans la lésion ainsi créée. S'y ajoutent des IRM sous anesthésie avec injection de produit de contraste, des prises de sang, et des séances de comportement de trente minutes à une heure passées en chaise de contention, dont le résumé ne précise pas la nature. Tous seront tués pour l'examen de leur cerveau, le porteur justifiant de ne recourir qu'au primate non-humain par l'absence de "modèles mathématiques valide et réaliste" des lésions du traumatisme crânien.

Objectifs

Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Cette étude pilote s’inscrit dans un projet plus vaste d’évaluation thérapeutique de greffe de neurones corticaux dans le but d’une réparation de lésion cérébrale. Pour cette étude, deux singes adultes seront utilisés afin de modéliser le traumatisme crânien, d’évaluer les conséquences post traumatiques sur le comportement, d’évaluer l’étendue des lésions en imagerie et de valider la technique de greffe de neurones. Nous évaluerons également quelle est la récupération fonctionnelle, par des tests de comportement et par imagerie afin de caractériser complètement le modèle avant de passer à l’étude thérapeutique plus complète.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien en termes de comportement et d’imagerie cérébrale des lésions mais aussi de la récupération post traumatique en vue d’une étude thérapeutique utilisant la greffe de neurones.

Procédures

Administration orale du traitement pour l’immunosuppression (Etablissement Utilisateur 1, toute la durée de l’étude), à l’anesthésie pour l’IRM par injection intramusculaire, injection intraveineuse pour le produit de contraste (Etablissement utilisateur 2, 2 heures). Prélèvements sanguins (Etablissement Utilisateur1, 15 minutes), traumatisme crânien (Etablissement Utilisateur 1, 2 heures). Comportement (30 minutes à 1 heure, Etablissement Utilisateur 1).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés 1) aux conséquences du traitement pour l’immunosuppression (toute la durée de l’étude, inconfort), à l’anesthésie pour l’IRM et aux douleurs liées aux 2 chirurgies (2 heures pour chaque, modérée). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (sous anesthésie, légère, 15 minutes, stress), à la chirurgie pour mimer le traumatisme crânien (stress, modérée, 2 heures), au comportement (durée du test de 30 minutes à 1 heure, en chaise).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du Primate non-humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valide et réaliste permettant d’étudier les lésions dues à un traumatisme crânien. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs, est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité, nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études post-mortem visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de (Primates non-humains) PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

A leur arrivée, les singes sont acclimatés pendant 2 à 3 semaines dans l’animalerie en volière. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, avec des points limites associés spécifiques de la chirurgie, des soins appropriés en cas d’atteinte de ces points limites, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le transport du singe pour réaliser l’IRM s’effectue sous anesthésie dans une cage dédiée, sur chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. Il est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.

Choix des espèces

La proximité d’espèce avec l’homme fera toujours du primate non-humain un modèle de choix dans la phase finale de détermination de nouveau traitements thérapeutiques, ceci est encore plus vrai dans ce cas précis avec ce modèle de lésions cérébrale et en tant qu’étude pilote en vue d’une greffe de neurones issue de cellules souches humains. Deux espèces de macaques, proches l’une de l’autre, seront utilisés, car ils sont effectivement très proches sur le plan évolutif et génétique, ils appartiennent au même genre (Macaca), ce qui explique leurs nombreuses similitudes morphologiques, comportementales et biologiques. L’une ou l’autre des espèces sera utilisée en fonction de leur disponibilité.

Toutes tuées par perfusion intracardiaque au terme de trois mois de suivi, pour produire des tissus destinés à l'histologie et au dosage de protéines, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce résumé porte sur le second des deux établissements d'un même projet sur le traumatisme crânien, celui qui héberge les souris et réalise les évaluations neurologiques, les chirurgies et l'imagerie ayant lieu dans l'autre. Les souris perdent du poids, souffrent après l'opération et présentent des déficits fonctionnels, atteintes que le porteur énumère sans les détailler. Le résumé déposé pour le premier établissement déclare lui aussi 180 souris, sans que ni l'un ni l'autre précise s'il s'agit des mêmes individus transportés entre les deux unités.

Objectifs

Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens modérés à sévères (TC), qui restent mal pris en charge en clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal). Le projet se déroule dans deux EU, EU1/2 et EU2/2.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.

Procédures

Procédure 1 : traumatisme crânien (J0) / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=120) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90) Procédure 2 : traumatisme crânien+ traitements (J0), / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=60) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90). Les chirurgies, sessions d'imagerie et perfusions seront réalisées dans l'EU1/2; les évaluations neurologiques et l'hébergement des animaux seront réalisés dans l'EU 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications (Vegliante et al., 2019 ; Drieu et al., 2022). En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale, locale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation et réactivité de l’animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l'intervention. Le transport entre les deux EU (reliés par un couloir de 20 mètres) se fera à l’aide de chariots adaptés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.

Régler les paramètres d'un appareil d'irradiation destiné aux rongeurs, tel est l'objet de cette étude pilote. 36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit sous anesthésie une greffe de cellules tumorales mammaires sur les deux flancs, un suivi de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine, puis 45 minutes d'anesthésie pour l'irradiation, avec irritation, perte de poils et dépigmentation possibles sur la zone irradiée. Aucun traitement n'est évalué à ce stade, le porteur décrivant cette mise au point comme "indispensable" avant une seconde étude, elle-même préclinique.

Objectifs

Malgré les progrès de la médecine, le cancer du sein est le cancer le plus frequemment observé et reste actuellement la première cause de décès par cancer chez les femmes en France. Le cancer de sein développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé, notamment lorsque que des métastases apparaissent. La mise en oeuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de pouvoir réaliser dans le futur des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité d’un candidat médicament en combinaison avec de la radiothérapie. Pour cela, il est nécessaire de mettre au point en amont les conditions d’irradation des tumeurs avec un équipement de pointe dédié à la radiothérapie chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre au point les conditions de radiothérapie des tumeurs mammaires murines. Cette étape est indispensable avant de pouvoir envisager de réaliser dans une seconde étude des tests précliniques dans des conditions de traitements (radiothérapie combinée à un composé pharmacologique) réalistes et au plus proche du contexte des patientes.

Procédures

L’ensemble des animaux devra être transplantés par chirurgie sous anesthésie (1x15min). Le suivi du développement tumoral sera effectué bihebdomadairement par une mesure au pied à coulisse (contention de 2 min). Les actes de pesées de poids corporel seront réalisés à minima bihebdomadaires et dureront quelques secondes. Les souris seront également anesthésiées lors de l’irradiation de la tumeur (1x45min).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules tumorales peut engendrer des douleurs, une perte de poids ainsi qu’un risque d’infection au site d’incision. Le développement d’une tumeur mammaire pourrait s’accompagner d’une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer et plus rarement d’une perte de poids. Les actes réguliers de pesée du poids corporel, de manipulation lors des mesures du volume tumoral et d’anesthésies associées aux chirurgies et à l’irradiation seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L’irradiation de la tumeur et les effets indésirables associés pourront engendrer un stress de courte durée, une perte de poids, une déshydratation mais aussi une irritation, une, alopécie et/ou une hypopigmentation du territoire irradié.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de l’irradiation, notament l’effet biologique, nous récupérons en fin d’expérience les tumeurs des animaux. Nous réaliserons pour cela une mise à mort de l’ensemble des animaux du projet.

Remplacement

Notre projet, avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de prélèvements tumoraux, de cultures de cellules. Ces expériences permettent de sélectionner les traitements les plus prometteurs. Une telle approche permettra de réduire significativement le nombre d’animaux que nous utiliserons réellement. Cependant, le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeuthique chez les patientes. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine. D’autre part, la transplantation sera réalisée au niveau des 2 flancs afin de diviser par 2 le nombre d’animaux nécessaires.

Réduction

Avant d’impliquer des animaux, chaque modèle cellulaire sera testé in vitro pour caractériser les effets biologiques de l’irradiation sur chacun d’entre eux. Après cette étape, la mise au point du protocole d’irradiation in vivo reste inévitable et nécessitera de tester plusieurs doses de radiothérapie afin de déterminer les conditions expérimentales idéales au plus proche des cas cliniques.

Raffinement

Tout au long de cette étude, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées ainsi qu’une pesée à minima bihebdomadaire seront effectuées par du personnel compétent afin de détecter le plus précocement possible toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action la plus appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les procédures chirurgicales et l’irradiation seront réalisées sur tapis chauffant et sous anesthésie avec, dans le cas de la chirurgie, une analgésie pré- et post-opératoire pour une meilleure prise en compte de la douleur et réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif (mesures au pied à coulisse).

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Pour cette étude, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propes études pour ce type de modèle de transplantation de cellules tumorales murines, c’est à dire des souris « jeunes adultes », âgées de 6 à 10 semaines au moment de la greffe.

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids, ou dont le score sur l'échelle de grimace dépasse 7 pendant les 48 heures critiques, sont mises à mort. 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit un traumatisme crânien à J0, puis des séances d'IRM et des évaluations neurologiques à J7, J21, J60 et J90, avant une perfusion intracardiaque au terme des trois mois, l'ensemble servant à tester un anticorps produit au laboratoire. Le porteur affirme par ailleurs que les souris se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "sickness behavior syndrom", description à confronter aux douleurs post-opératoires et aux déficits fonctionnels qu'il énumère lui-même.

Objectifs

Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens modérés à sévères (TC), qui restent mal pris en charge en clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal). Le projet se déroule dans deux EU, EU1/2 et EU2/2.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.

Procédures

Procédure 1 : traumatisme crânien (J0) / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=120) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90) Procédure 2 : traumatisme crânien+ traitements (J0), / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=60) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90). Les chirurgies, sessions d'imagerie et perfusions seront réalisées dans l'EU1/2; les évaluations neurologiques et l'hébergement des animaux seront réalisés dans l'EU 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications (Vegliante et al., 2019 ; Drieu et al., 2022). En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale, locale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation et réactivité de l’animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l'intervention. Le transport entre les deux EU (reliés par un couloir de 20 mètres) se fera à l’aide de chariots adaptés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.

Infectées par le SARS-CoV-2 sous anesthésie générale, 312 souris reçoivent des injections d'antiviraux ou de placebo à huit reprises et trois prélèvements de sang à la lancette, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'infection doit provoquer une perte de poids et une chute de température, avec une survie de quinze jours annoncée, les points limites étant ajustés au fil d'observations biquotidiennes. Toutes sont tuées à la fin du protocole, cerveau, poumons, intestin, rate et sang étant prélevés post mortem pour mesurer la charge virale et suivre les antiviraux dans les tissus. Le porteur écrit que "200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire" pour atteindre ses objectifs, alors que le projet en déclare 312, l'ajout de souris étant l'objet même de cette modification.

Objectifs

Les conjugués peptide-porphyrine sont des médicaments antiviraux à très large spectre capables de pénétrer dans le cerveau et le placenta, et donc de protéger le système nerveux central et les fœtus contre l'action des virus. Ils doivent leur large spectre d'activité à la cible particulière qu'ils visent dans la structure virale : l'enveloppe lipidique. Cette classe de composés compromet l'intégrité des enveloppes et les virus sont incapables de réparer les dommages, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. La preuve de concept a été établie in vitro avec les virus SARS-CoV-2 et Zika et in vivo avec le virus Zika. Il est nécessaire de valider l'activité antivirale des conjugués contre le SARS-CoV-2. Dans ce cadre, les trois conjugués préalablement validés pour leur efficacité contre plusieurs souches de SARS-CoV-2 sont des candidats prometteurs pour une visée thérapeutique. Il est nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ces antiviraux injectés à plusieurs temps à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 devraient initier une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de signes cliniques. MODIFICATION : DES RESULTATS ENCOURAGEANTS ONT ETE OBTENUS ; LA MODIFICATION DE PROJET PORTE SUR L’AJOUT D’ANIMAUX AFIN D’OPTIMISER LE TRAITEMENT ANTIVIRAL EN TESTANT DIFFERENTES CHARGES VIRALES ET DIFFERENTES VOIES D’ADMINISTRATION.

Bénéfices attendus

La validation des antiviraux testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’améliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19.

Procédures

Tous les animaux, soit 312 souris. Des prises de sang seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une lancette (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Administration des anti-viraux ou placebo sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique antivirale (5 minutes par animal, 8 fois). Challenge infectieux sous anesthésie générale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptômes généralisés mais avec une faible mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire ainsi qu’une perte de température est attendue suivi d’une survie de 15 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon les observations biquotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie sous-cutanée ou en voie intrapéritonéale pour les anesthésies générales ou des traitements peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantation de la puce télémétrique. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal. La prise de sang peut aussi engendrer un stress et une douleur légère au point de prélèvement lors de l’utilisation de la lancette.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (cerveaux, poumons, intestin, rate, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le suivi des antiviraux dans les tissus, pour le recrutement cellulaire et la réponse immunitaire induite.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Cette taille d’échantillon de 12 souris permet de détecter un effet modéré. Au total, 200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques (efficacité antivirale) tout en respectant le principe de réduction des 3R.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe social, dans des cages respectant les surfaces réglementaires et dans un environnement enrichi par différents types comme de la cellulose ou du sizzle, des bâtonnets de bois et des tunnels ou maisonnette/dôme… Les animaux sont transportés via un transporteur agréé dans un véhicule adapté et respectant au mieux les conditions et paramètres environnementales jusqu’à leur acheminement dans leur lieu d’hébergement définitif où ils sont ainsi manipulés pour les déplacer de la boite de transport vers la cage d’hébergement. Lors de cette manipulation, il est implanté la puce télémétrique. Ensuite vient la phase d’acclimatation où les animaux vont s’habituer progressivement à leur nouvel environnement et à la visite quotidienne des techniciens animaliers. Dès leur arrivée et pendant l’acclimatation, une récompense alimentaire sera distribuée aux animaux de type, graine à décortiquer, popcorn... Puis durant la procédure après chaque manipulation sur l’animal, afin de récompenser et favoriser l’acceptation des gestes. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites via un suivi clinique. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les injections pour les anesthésies et les traitements seront réalisés par voie sous-cutanée, moins nocive que la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. L’euthanasie au pentobarbital pouvant provoquer des douleurs, les animaux seront anesthésiés avant l’injection létale. Les prélèvements de sang seront espacés de plus d’une semaine.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris humanisée est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.