Procédures sévères

Pour identifier ce qui fait passer une peur normale à une peur incontrôlable, 1 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever les échantillons. Chacune subit une injection sous brève anesthésie, une chirurgie de la tête de 45 minutes, quatre jours de tests de mémoire, puis une dernière injection sous contention. Le porteur résume les atteintes en une phrase, "Les animaux subiront des stimuli générant du stress", sans nommer les tests comportementaux employés ni décrire le choc traumatique infligé. Il indique s'appuyer sur une grille de critères d'arrêt et de points limites permettant d'évaluer l'état de souffrance et de décider, avec la vétérinaire, du traitement ou de la mise à mort.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre ce qui se passe quand une protéine augmente dans le cerveau après un choc traumatique. L'idée est d'identifier les cellules et molécules responsables du passage d'une peur normale à une peur incontrôlable, comme dans le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Pour rendre notre étude plus précise, nous allons examiner le rôle de cette protéine dans différentes cellules du cerveau lors du développement d’un profil TSPT chez la souris. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de bloquer cette protéine dans des types cellulaires spécifiques, afin d’identifier exactement d’où elle provient. Cela nous permettra aussi d’observer la forme de ces cellules marquées et de voir si le stress traumatique les modifie. Enfin, nous étudierons si l’augmentation de cette protéine perturbe la communication entre les neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra à court terme de mieux comprendre le lien entre notre protéine d’intérêt et la pathologie du TSPT. Si nous démontrons un mécanisme d’action précis de cette protéine sur différentes cellules, cela pourrait aboutir au développement d’un traitement visant à inhiber cette protéine comme traitement préventif/curatif lors de l’exposition à un stress intense ou lors d'un traumatisme chez l'Homme. De plus, une meilleure compréhension des bases pathophysiologiques sous-tendant les pathologies liées au stress tel que le TSPT sont nécessaire afin de faire évoluer les méthodes de prévention, de diagnostique et de traitement de ces maladies de plus en plus prévalentes sur le long terme.

Procédures

Les souris seront brièvements anesthésiées pour recevoir une injection (30s), une chirurgie au niveau de la tête sous anesthésie générale (45min), des tests de comportements pour étudier la mémoire sur une durée de 4 jours (entre 2 et 6 min par jour), suivi d'une dernière injection sur animal immobilisé (30s).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des stimuli générant du stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les échantillons nécessaires pour les analyses proposées dans ce projet.

Remplacement

Afin d’étudier les effets d’un stress sur le comportement d’un organisme, il est pour l’instant impossible d’utiliser des méthodes alternatives aux modèles animaux. Cependant, nous avons tester en amont les hypothèses moléculaires sur des modèles in vitro. Les résultats préliminaires confirment un effet délétère sur la survie cellulaire lors de l’application de corticostérone ou directement de PAI-1 sur les astrocytes. L’utilisation d’animaux se justifie par l’absence d’alternative permettant de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier des comportements liés au stress.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécessaires pour les prélèvements et analyses ex vivo et pour les analyses comportementales, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et des femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets du test.

Raffinement

Les animaux seront gardés au minimum deux par deux, dans des cages transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton). De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Au cours des 2 procédures, les animaux seront anethésiés et recevront des antalgiques en cas de besoin afin de réduire la douleur. Nous avons établi une grille de critères d’arrêt et de points limites qui permet d’évaluer l’état de souffrance de l’animal et en accord avec la vétérinaire, de prendre les décisions adaptées de traitement ou de mise à mort.

Choix des espèces

- La grande majorité des données relatives aux comportements liés au stress sont basées sur l’utilisation de souris. L’organisation du système nerveux central de cette souche est assez proche de celle de l’Homme, ce qui permet une extrapolation acceptable des résultats obtenus chez ces espèces à l’espèce humaine. - Les validations de la procédure de mémoire traumatique en termes de conditions comportementales et pharmacologiques étant déjà réalisées chez la souris, ceci permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. - La souris est un mammifère qui présente une bonne proximité phylogénétique avec l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. - La souris offre de nombreuses possibilités d’animaux transgéniques permettant d’étudier l’effet de molécules/facteurs sur le système nerveux central via l’étude du comportement. Tous les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 7 à 16 semaines environ) car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité intrinsèque des mécanismes étudiés dans ce projet.

Dès que l'affaiblissement est avéré, la souris est mise à mort, la croissance de la tumeur dans les fémurs pouvant provoquer une paralysie des membres arrière. 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales dans le fémur sous anesthésie, des prélèvements de sang jusqu'à une fois par semaine et un traitement oral ou intrapéritonéal trois à cinq jours par semaine, sa douleur étant évaluée par un score de grimaces. Le projet vise à expliquer les rechutes du lymphome folliculaire, avec des cibles thérapeutiques que le porteur qualifie de "potentielles", quand la paralysie possible et la gravité sévère sont annoncées d'emblée.

Objectifs

Le lymphome folliculaire est un cancer du sang issu de la prolifération de cellules immunitaires, les cellules B. Il atteint deux sites principalement : les ganglions et la moelle osseuse. Il représente un problème important car, même si les traitements permettent souvent de contrôler la maladie, ils ne permettent pas de la guérir définitivement. En effet, de nombreux patients répondent bien aux traitements, qui associent généralement une chimiothérapie à un anticorps ciblant les cellules B, mais la maladie finit souvent par réapparaître. D’après la connaissance actuelle, les cellules qui donneraient naissance au lymphome folliculaire peuvent être présentes dans l’organisme avant même que la maladie soit détectable et peuvent rester présentes après le traitement, ce qui pourrait expliquer les rechutes. Également plusieurs études suggèrent que ces cellules seraient localisées dans la moelle osseuse. Nos premiers résultats suggèrent que la survie de ces cellules est favorisée par certaines cellules immunitaires présentes également dans la moelle osseuse. Notre projet vise donc à mieux comprendre le rôle de ces cellules immunitaires dans le lymphome folliculaire. Pour cela, nous allons créer un modèle de lymphome chez la souris, étudier les différentes cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse et observer comment elles interagissent avec les cellules cancéreuses et peuvent influencer leur développement. Nous chercherons également à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques liées à ces interactions. L’objectif final est de mieux comprendre comment les cellules immunitaires de la moelle osseuse peuvent aider les cellules donnant lieu au lymphome folliculaire à survivre, afin de développer de nouveaux traitements capables de limiter la progression de la maladie et surtout d’éviter les rechutes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de disposer d’un modèle murin de lymphome pertinent pour des études mécanistiques : caractérisation des cellules présentes dans la moelle osseuse dans le contexte du lymphome folliculaire et caractérisation de leurs interactions et des mécanismes par lesquels elles influencent le maintien et la survie des cellules à l'origine du lymphome folliculaire. Il permettra ainsi d’avancer dans la compréhension du mécanisme de rechute du lymphome folliculaire et d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (injection unique en pré-opératoire de quelques secondes) : greffe de cellules tumorales dans le fémur (la durée de la réalisation de l'ensemble de la greffe est estimée à 5 minutes). Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Les animaux pourront recevoir 3 à 5 jours par semaine un traitement par voie orale ou intrapéritonéale (1 minute).

Impact sur les animaux

Les administrations par injections provoqueront une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille. Les prélèvements de sang provoqueront une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille et pourront provoquer un stress, qui sera limité par le fait qu'une habituation à la manipulation sera réalisée au préalable. La procédure chirurgicale de greffe (dans le fémur) réalisée sous anesthésie et analgésie pourra induire une légère douleur durant les heures qui suivront. En fin de développement tumoral, celui-ci peut entraîner un affaiblissement de l’animal, c’est pourquoi les souris expérimentées seront suivies régulièrement avec une attention particulière à la perte de poids, au score de grimaces (méthode scientifique permettant d'évaluer la douleur en observant les expressions faciales) et à la mobilité des animaux (la croissance tumorale dans les fémurs pouvant engendrer une paralysie des membres arrière). Dès que l'affaiblissement sera avéré, l'animal sera euthanasié en lien avec les points limites établis.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes pour analyse.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de réponses aux traitements des lymphomes ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) qui est particulièrement cruciale dans la cadre du lymphome folliculaire dont les cellules tumorales se caractérisent par de nombreuses interactions avec les cellules les environnant : les cellules immunitaires et stromales. Une compréhension complète des mécanismes de réponses aux traitements des lymphomes nécessite donc la mise en place et la caractérisation de modèles murins qui ont l'avantage de permettre de reproduire au plus près la pathologie humaine avec tous ces acteurs cellulaires.

Réduction

Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats exploitables, ainsi le nombre de souris par lot est adapté à chaque type d'analyse. Le nombre d'animaux est limité à 8 pour les mises au point et test d’atteinte des points limites. En effet, les groupes de souris sont dimensionnés, grâce à un calcul d'effectif, pour permettre de visualiser une différence en termes de jour d’atteinte des points limites entre le groupe de référence et le groupe recevant les cellules modifiées ou un traitement. L’effectif des lots d'animaux est dimensionné à 10 dans les études du compartiment de la moelle osseuse où se développent les cellules tumorales afin de récupérer suffisamment de chaque type cellulaire (cellules immunitaires, cellules stromales et cellules tumorales de la moelle osseuse) à analyser.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • un suivi adapté des animaux et des points limites pertinents permettant de détecter rapidement les signes de souffrance, • le recours à des anti-douleurs adaptés et aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (prévention de la sécheresse oculaire, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. Le stress des souris sera également limité au maximum grâce à un enrichissement (coton, "maisons" en carton, boîtes à œufs) et grâce à une habituation progressive à être manipulées.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes pour comprendre le cancer et évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux car elle possède de grandes similitudes biologiques avec l’espèce humaine (nombreux gènes communs impliqués dans le développement de cancers...) et qu'elle développe de façon spontanée ou induite des cancers comparables rapport à ceux de l'espèce humaine. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, c'est-à-dire quand elles seront de jeunes adultes. Cela permet qu'elles aient terminé leur développement avec une croissance corporelle stabilisée et un système immunitaire fonctionnel et sans présenter les effets biologiques du vieillissement.

Deux chirurgies du cerveau sous anesthésie générale, espacées de plusieurs semaines, de quarante à soixante minutes chacune, pour injecter des vecteurs viraux puis implanter les dispositifs d'enregistrement : 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont ensuite hébergées seules pour protéger les implants, et une partie subit une restriction d'eau que le porteur décrit comme une contrainte modérée pouvant durer plusieurs semaines, destinée à les motiver pendant les tests. Ces tests, de dix à vingt jours à raison de séances de trente à soixante minutes, portent sur le choix entre éviter un danger et obtenir une récompense, avec enregistrement de l'activité cérébrale. Le résumé ne précise ni la nature du danger auquel les souris sont exposées, ni les tests employés, désignés seulement comme des situations "associées à des conséquences positives ou négatives".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment le cerveau prend des décisions dans des situations impliquant des émotions, par exemple lorsqu’un individu doit choisir entre éviter un danger ou obtenir une récompense. Dans la vie quotidienne, ces décisions reposent sur l’évaluation de différents éléments, comme le caractère positif ou négatif d’un événement et son importance relative. Les chercheurs cherchent à comprendre comment ces informations sont traitées par le cerveau et comment elles influencent le comportement. L’objectif est d’identifier les mécanismes cérébraux qui permettent d’adapter les décisions en fonction du contexte et des expériences passées.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans la prise de décision liée aux émotions. Il contribuera à améliorer les connaissances fondamentales sur le fonctionnement du cerveau et sur la manière dont les individus évaluent leur environnement. À moyen terme, ces résultats permettront de mieux comprendre comment certaines situations peuvent conduire à des comportements inadaptés, notamment lorsqu’un individu accorde trop d’importance à un danger ou, au contraire, ne le prend pas suffisamment en compte. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la compréhension de certaines maladies psychiatriques, comme les troubles anxieux ou le stress post-traumatique, et aider à identifier de nouvelles pistes pour leur prise en charge.

Procédures

Les animaux subissent deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie générale et espacées de plusieurs semaines. Chaque intervention dure environ 40 à 60 minutes et permet soit l’injection de vecteurs viraux dans le cerveau, soit l’implantation des dispositifs nécessaires aux enregistrements et aux manipulations expérimentales. Après une période de récupération, les animaux participent à des tests comportementaux visant à étudier leurs réactions face à différentes situations associées à des conséquences positives ou négatives. Ces tests sont réalisés pendant une période de 10 à 20 jours selon le protocole expérimental et les performances de l’animal. Chaque session dure généralement entre 30 et 60 minutes. Au cours de ces tests, l’activité cérébrale est enregistrée afin de mieux comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans les comportements observés. Le nombre exact de séances comportementales dépend de la progression de l’apprentissage de chaque animal.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur post-opératoire modérée liée aux interventions chirurgicales. Cette douleur est limitée par la mise en place d’une prise en charge analgésique adaptée. Un inconfort temporaire peut également être observé pendant la phase de récupération. L’hébergement individuel nécessaire à la protection des implants et au suivi expérimental peut constituer une source de stress liée à l’isolement social. Cet effet est limité par la mise en place d’un enrichissement adapté des cages ainsi que par le maintien de contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux hébergés dans la même salle. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress modéré lié aux manipulations répétées et à l’exposition à des situations nouvelles. Dans certains groupes, une restriction hydrique contrôlée est mise en place afin de motiver les animaux lors des tests comportementaux. Cette contrainte est étroitement surveillée et adaptée individuellement, mais peut représenter une contrainte modérée pendant plusieurs semaines.

Devenir

Euthanasie des animaux pour prélèvements du cerveau pour des études post mortem

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour étudier le fonctionnement du cerveau dans des situations réelles impliquant des comportements et des émotions. Ces phénomènes résultent d’interactions complexes entre différentes régions du cerveau et ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec des modèles informatiques ou des cellules en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base d’une estimation de la variance associée à ce type de données, afin d’assurer l’atteinte d’une puissance statistique suffisante. Le calcul théorique conduit à un effectif de 15 souris par groupe. Le projet comprend une phase pilote (20 groupes) permettant d’optimiser les paramètres expérimentaux et comportementaux avant la mise en œuvre de l’étude principale (20 groupes). Cette étape permet de limiter les ajustements méthodologiques en cours d’étude et contribue ainsi à réduire le nombre total d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation de ce protocole est estimé à 600.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les interventions chirurgicales sont réalisées avec une prise en charge adaptée de la douleur. Les animaux sont progressivement habitués aux manipulations afin de réduire leur stress. Les conditions expérimentales sont adaptées à chaque animal, notamment en ce qui concerne la motivation et les contraintes liées aux tests. Un suivi régulier permet de s’assurer de leur bon état de santé. Des points limites prédéfinis sont utilisés afin de détecter précocement toute altération de l’état des animaux. En cas de signes cliniques, des soins conservatoires adaptés sont mis en place. La prise en charge des animaux repose sur un arbre décisionnel structuré, permettant d’adapter les mesures à la gravité de la situation. Des critères d’arrêt des souffrances sont définis et conduisent, si nécessaire, à l’arrêt de la procédure et à une mise à mort anticipée.

Choix des espèces

La souris est utilisée car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des mécanismes cérébraux impliqués dans l’apprentissage, l’adaptation comportementale et le traitement des informations sensorielles. Ses capacités d’apprentissage et d’adaptation permettent d’étudier des comportements complexes dans des conditions expérimentales contrôlées. Des souris jeunes adultes âgées de 8 à 12 semaines au début des expérimentations seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent un cerveau mature et des performances comportementales stables, tout en limitant les effets liés au développement ou au vieillissement qui pourraient influencer les résultats. Par ailleurs, les nombreuses connaissances accumulées sur cette espèce ainsi que la disponibilité d’outils génétiques, viraux et neurobiologiques adaptés permettent d’interpréter les résultats de manière fiable et de les comparer avec ceux de la littérature scientifique, ce qui est essentiel pour faire progresser les connaissances dans ce domaine.

Des souriceaux dès leur naissance, et des embryons modifiés génétiquement dans l'utérus de leur mère, forment une part des 2 357 souris utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, les souriceaux sont tatoués à la patte, un fragment de queue est prélevé pour le génotypage et une solution contenant un traceur est injectée dans leur cerveau sous anesthésie par le froid, que le porteur qualifie de "technique indolore adaptée aux nouveau-nés". Une zone de l'os du crâne est ensuite retirée et remplacée par une lamelle de verre fixée sur la tête, pour observer le cerveau au microscope pendant que la souris éveillée se déplace sur un tapis roulant, ces séances étant répétées de la naissance à l'âge adulte. Les mères ayant subi la laparotomie et l'électroporation in utero allaitent leur portée jusqu'au sevrage à vingt et un jours, puis sont tuées.

Objectifs

Ce projet fait suite à nos précédents travaux visant à comprendre comment le cerveau s'organise très tôt après la naissance, et comment cette période clé de développement influence son bon fonctionnement à l'âge adulte. Ce nouveau projet comporte deux volets complémentaires : Caractériser le développement normal des réseaux hippocampiques et néocorticaux (les circuits de cellules situés dans les régions du cerveau responsables de la mémoire, de l'apprentissage et de la perception sensorielle), avec une attention particulière portée au rôle des interneurones (des neurones "régulateurs" qui agissent comme des chefs d'orchestre pour freiner et synchroniser l'activité globale du cerveau). Identifier les altérations de cette mise en place observées dans des modèles pathologiques, plus particulièrement liés aux troubles du spectre autistique (TSA). Nous utiliserons le modèle de la souris afin de suivre l'activité neuronale au cours du temps par des techniques d'imagerie optique sur l'animal vivant. Notre équipe dispose d'une solide expertise dans l'application de ces techniques, tant chez les souris nouveau-nées que chez les adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet est essentiel pour comprendre comment s'organisent les réseaux de cellules de notre cerveau, en particulier dans les zones responsables des fonctions intellectuelles et de la mémoire, qui sont souvent touchées par diverses maladies. À court terme, il permettra de découvrir de façon très précise le rôle de chaque type de cellule nerveuse et la manière dont elles évoluent pendant la croissance. Concernant les maladies liées au développement du cerveau, comme les Troubles du Spectre Autistique (autisme), notre hypothèse est que les anomalies génétiques modifient le développement normal du cerveau, affectant la manière dont les cellules grandissent et se connectent entre elles. En observant la maturation de ces cellules, notre approche permettra de faire le lien entre le rôle des gènes et la mise en place des réseaux cérébraux, apportant ainsi des connaissances clés pour comprendre l'origine de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions chirurgicales et d'observation réalisées sous anesthésie et avec une prise en charge stricte de la douleur. Un suivi quotidien de leur bien-être sera assuré. Les interventions comprennent : L'identification et le prélèvement génétique : Dès la naissance, les souriceaux sont identifiés rapidement par un petit tatouage sur la patte. Un infime fragment de queue est prélevé pour vérifier leur profil génétique. Une injection intracérébrale : Chez le nouveau-né, une petite quantité d'une solution contenant un traceur microscopique est injectée dans le cerveau, sous anesthésie par le froid (technique indolore adaptée aux nouveau-nés). Une chirurgie d'observation du cerveau : Sous anesthésie générale, une petite zone de l'os du crâne est retirée et remplacée par une fine lamelle de verre. Cette "fenêtre" transparente, fixée sur la tête, permet d'observer l'intérieur du cerveau au microscope. L'observation de l'activité du cerveau (imagerie) : Grâce à la fenêtre crânienne et aux traceurs injectés, nous observons l'activité des cellules du cerveau de l'animal lorsqu'il est éveillé et qu'il se déplace librement sur un tapis roulant. Les animaux y sont habitués en douceur et les séances sont de courte durée. Ces observations sont répétées sur plusieurs jours à différents âges (de la naissance à l'âge adulte). L'intervention sur l'embryon : Pour un groupe spécifique, une chirurgie abdominale (laparotomie) est réalisée sur la mère au milieu de sa gestation, sous anesthésie générale. Cette opération permet d'insérer, à l'aide d'un léger courant électrique, des modifications génétiques directement dans le cerveau de l'embryon pour étudier l'autisme. La mère se réveille ensuite et met bas naturellement. Les petits suivront alors le même parcours d'observation au microscope décrit ci-dessus. Le prélèvement des tissus : À la fin de toutes les observations, les souris sont euthanasiées sans douleur sous anesthésie très profonde. Leur cerveau est prélevé à l'aide d'un produit fixateur pour pouvoir l'analyser en détail au microscope.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sur les animaux sont principalement liés à la douleur causée par les injections intra cérébrales ou à l’implantation d’une fenêtre d’imagerie sur le crâne. Ces deux opérations sont faites sous anesthésie générale. Bien que le cerveau lui-même ne soit pas sensible à la douleur, les tissus l’entourant (crâne, dure-mère) peuvent s'enflammer et produire de la douleur. Pour parer à cette éventualité, la douleur au moment de l’opération sera prise en charge par un analgésique. Par ailleurs, la douleur et le stress occasionnés par l’implant chronique de la fenêtre optique seront suivis de près tous les jours et la douleur sera minimisée, si besoin, par l'administration d'analgésiques. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés. De notre expérience, cet implant ne génère pas de douleur excessive et ne nécessite généralement pas l'administration d’analgésique en dehors de la chirurgie proprement dite. Les procédures de ce projet étant classées en gravité sévère, une appréciation rétrospective sera réalisée à l'issue du projet afin d'évaluer l'atteinte des objectifs et les dommages réels subis par les animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort (euthanasiés) sans douleur à la fin des expérimentations. Cette procédure est indispensable pour prélever leur cerveau et réaliser des analyses microscopiques sur les tissus. Ces analyses permettent de vérifier les observations faites du vivant de l'animal et de valider que les bons réseaux de neurones ont bien été ciblés. Concernant les souris gestantes ayant subi la chirurgie abdominale visant à modifier génétiquement les embryons (pour étudier l'autisme), elles se réveillent après l'opération, bénéficient d'une prise en charge de la douleur et mettent bas naturellement. Leurs petits sont ensuite inclus dans les étapes d'observation au microscope et seront, à leur tour, euthanasiés à la fin des observations pour l'analyse de leur cerveau. Les mères ayant subi la laparotomie pour l’électroporation in utero ne seront pas gardées en vie à l'issue de l'étude. Elles assurent l’élevage et l’allaitement de leur portée jusqu’au sevrage (P21), puis sont euthanasiées.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, il est indispensable d'étudier le cerveau au sein d'un organisme entier, sur un animal vivant, éveillé et libre de ses mouvements. À ce jour, seules des recherches menées sur l'animal peuvent apporter ces connaissances, dont bénéficieront à terme les études chez l'homme. En effet, les méthodes de remplacement menées en laboratoire (comme la culture de cellules ou de « mini-cerveaux » en éprouvette) ne permettent pas de reproduire un cerveau complet et adulte avec toutes ses connexions. Par ailleurs, nous ne connaissons pas encore assez bien le cerveau pour pouvoir remplacer ces expériences par des simulations sur ordinateur. C’est d’ailleurs l'un des grands enjeux de notre projet : en observant très précisément comment communiquent les différentes cellules du cerveau, nous espérons récolter suffisamment de données pour permettre, à l'avenir, la création de telles simulations informatiques.

Réduction

Notre méthode de travail vise à réduire fortement le nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables. Le principal moyen d'y parvenir est d'utiliser une technique d'observation au microscope qui permet de suivre les mêmes souris au fur et à mesure de leur croissance. Contrairement aux méthodes classiques qui obligent à utiliser et à euthanasier de nouveaux groupes d'animaux à chaque âge étudié pour comprendre leur évolution, notre méthode permet d'observer plusieurs fois les mêmes individus à différentes étapes clés de leur vie, depuis leur naissance jusqu'à l'âge adulte.

Raffinement

Tout au long de l'expérimentation, un suivi quotidien sera assuré. Des décisions relatives au bien-être animal seront prises selon des règles strictes permettant d'interrompre l'expérience ou d'euthanasier l'animal en cas de souffrance. Le bien-être des animaux (tant pour les souris gestantes que pour leurs petits, ou après les chirurgies) fera l'objet d'évaluations régulières : prise de poids, croissance, aspect général et comportement. Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés et aux jeunes souris lors des chirurgies afin de réduire la douleur et le stress. Le protocole inclut l'utilisation systématique d'anesthésies, la gestion de la douleur, l'utilisation de tapis chauffants, le respect strict des règles d'hygiène, la protection des yeux, la réhydratation, ainsi qu'un suivi très attentif après l'opération (notamment au moment de replacer les nouveau-nés avec leur mère). Les mères et leurs nouveau-nés, opérés ou non, seront hébergés dans des armoires ventilées où l'environnement est contrôlé. Leurs cages seront enrichies avec de petites cabanes en carton et du papier spécial permettant aux femelles de construire des nids douillets. Les souris plus âgées bénéficieront des mêmes conditions de confort. Enfin, lors des observations au microscope, les animaux seront maintenus bien au chaud à l’aide d’une lampe chauffante pour éviter qu'ils ne se refroidissent en dehors de leur cage.

Choix des espèces

Le modèle de la souris est particulièrement adapté pour répondre à nos objectifs scientifiques : Il a été démontré que les cellules régulatrices du cerveau que nous étudions sont très similaires entre l'humain et la souris, ce qui en fait un excellent modèle. Notre équipe possède une grande expérience technique sur la souris, que ce soit pour la mise en place minutieuse de la "fenêtre" sur le crâne ou pour l'observation de son cerveau au microscope du vivant de l'animal. Il existe chez la souris de nombreuses lignées génétiquement modifiées indispensables à ce projet, qui permettent de cibler très précisément certaines familles de cellules pour observer ou manipuler leur activité. La souris étant très largement utilisée en recherche sur le cerveau, nos résultats seront d’un intérêt majeur pour l'ensemble de la communauté scientifique afin de mieux comprendre le développement du cerveau et les mécanismes liés aux maladies infantiles (troubles neurodéveloppementaux). Stades de développement utilisés : Les animaux seront étudiés à quatre stades clés de leur développement après la naissance : Stade nouveau-né (de la naissance à 5 jours) Stade jeune (de 5 à 14 jours) Stade adolescent (de 15 à 30 jours) Stade adulte (au-delà de 2 mois) L'objectif de ce projet est de comprendre comment l'activité des réseaux de cellules du cerveau évolue au cours du temps, à la fois dans un développement normal, dans des modèles d'autisme, et jusqu'à l'âge adulte. Le découpage de nos observations en ces quatre fenêtres temporelles est absolument indispensable pour couvrir toutes les étapes critiques de la construction et de la maturation du cerveau.

Greffés de cellules tumorales dans le cerveau à J0, transportés deux jours plus tard pendant quatre heures vers une plateforme d'imagerie, opérés à J10 pour un retrait partiel de la tumeur, 27 rats subissent ensuite trois examens TEP avec injection d'un traceur radioactif et quatre IRM sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur classe la greffe et l'exérèse comme sévères, note que la chirurgie est "assez invasive" et que la tumeur peut provoquer des symptômes neurologiques. L'objet est de suivre par imagerie la dégradation d'un gel de chitosane déposé dans la cavité opératoire, et la reprise de la tumeur. Tous les rats sont mis à mort après le dernier examen, le porteur écrivant qu'ils sont "tous porteurs d'une tumeur cérébrale (avec un pronostic défavorable)".

Objectifs

Les tumeurs intracérébrales représentent la forme la plus agressive des tumeurs du système nerveux central sans possibilité curative. Une infiltration des cellules cancéreuses dans le tissu cérébral sain favorisent inévitablement la reprise tumorale. Le traitement standard actuel consiste en une résection chirurgicale (=retrait de la tumeur) suivie d’une radiothérapie (traitements par rayons X) combinée à une chimiothérapie (traitement médicamentaux). Le projet proposé s’appuie sur un modèle de tumeurs cérébrales chez le rat. Après avoir implanté la tumeur dans le cerveau des animaux, celle ci est retirée chirurgicalement (exérèse) et partiellement (comme dans le cas d'une chirurgie chez l'être humain). Les cellules résiduelles sont à l'origine de la récidive (reprise tumorale) survenant après l'opération. Lors de la chirurgie d'exerèse, la cavité formée lors du retrait de la masse initiale sera laissée telle quelle (non comblée) ou un gel formant un réseau sera déposé à l'intérieur (tapissant ainsi la cavité opératoire). L'objectif de ce projet est ainsi de caractériser par imagerie le comportement de ce gel mais aussi de caractériser la récidive tumorale. Pour ce faire, nous réaliserons d'une part des examens TEP (Tomographie par Emission de Positons) via l'injection d'un traceur radioactif qui permet de visualiser les foyers de récidive tumoraux. D'autre part, le comportement du gel sera évalué grâce à l'outil d'imagerie par IRM (Imagerie à Résonance Magnétique) via un suivi longitudinal permettant d'estimer l'évolution du volume tumoral et de suivre la dégradation du gel au cours du temps. Ce projet est un projet multisite à cause de contraintes techniques liées aux équipements, ainsi il se déroulera dans 2 établissements utilisateurs successifs (EU1/2 puis EU 2/2)

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet initial permettront en première intention de caractériser le modèle de tumeur cérébral opéré (dont la tumeur a été retirée chirurgicalement) en présence ou non d'un gel marqué avec un agent de contraste. Le phénomène de récidivie tumorale inhérant à la chirurgie ainsi que le comportement du gel déposé au sein même de la cavité opératoire pourront ainsi être appréhendés respectivement grâce à l'imagerie TEP et aux acquisitions IRM. Cette étape de caractérisation est indispensable avant même de pouvoir proposer l'application de ce gel dans la cavité opératoire comme nouvelle voie de stratégie thérapeutique pour la recherche clinique. Le bénéfice attendu est donc à plus long terme d'utiliser ce gel comme vecteur thérapeutique et adapter à posteriori son utilisation en cancérologie humaine.

Procédures

- Greffe des cellules tumorales dans le tissu cérébral (modèle intracérébral) à J0 (1 itération/1h) - Transport sur la plateforme d'imagerie à J2=2 jours post-greffe (1 itération/4h) - Dégreffe/exerèse= chirurgie qui consiste à retirer la tumeur qui se trouve dans le cerveau à J10=10 jours post greffe (1 itération/1h) - Examens TEP : J15/J22/J29 (3 itérations/50 min par temps d'imagerie) - Examens IRM : J9, J14, J21, J28 (4 itérations/1h par temps d'imagerie. L'examen TEP (Tomographie par Emission de Positon) est une technique d'imagerie qui permet d'identifier les foyers tumoraux notamment grâce à l'injection d'un produit radioactif qui vient se fixer spécifiquement sur le tissu malade et qui permet sa visualisation en regardant l'image générée. L'examen IRM (Imagerie par Résonance Magnéique) est une technique d'imagerie qui permettra d'identifier les différentes structures cérébrales ainsi que le gel présent au sein de la cavité opératoire et de suivre sa dégradation au cours du temps. La répartition des interventions dans chaque EU se fera de la façon suivante : - EU1/2 : réception des animaux, acclimatation, puis chirurgie d'implantation des cellules tumorales (greffe des cellules tumorales dans le cerveau, EU de départ pour le transport des animaux vers l'EU 2/2, -EU2/2 : EU d'arrivée suite au transport des animaux depuis l'EU1/2, examens d'imagerie, chirurgie de retrait de la masse tumorale, mise à mort de tous les animaux en fin de projet.

Impact sur les animaux

Chirurgie d'implantation des cellules tumorales puis retrait chirurgical de la tumeur (exérèse) classées sévères mais médication pour limiter la souffrance des animaux. Le développement de la tumeur (modèle infiltrant) peut engendrer des symptômes neurologiques mais la chirurgie d'exérèse se fait assez précocement bien avant l'apparition de signes cliniques (J10). Le transport des animaux à J+2 sur la plateforme d'imagerie constitue également une nuisance. La chirurgie opératoire est assez invasive mais une surveillance accrue des animaux sera réalisée afin de garantir leur bien-être. Les sessions IRM et TEP nécessiteront des anesthésies répétées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort selon les méthodes en vigueur à l'issue du dernier temps d'imagerie. L'ensemble des données collectées grâce aux acquisitions d'imagerie permettront de caractériser le modèle de reprise tumorale avec l'implantation d'un gel et permettront de répondre à la question scientifique initiale. Les animaux étant tous porteurs d'une tumeur cérébrale (avec un pronostic défavorable), il est donc nécessaire de mettre à mort l'ensemble des animaux du projet à l'issue du dernier examen.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible car le développement et la réponse au traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques extrêmement complexes qui ne peuvent pas être mimés en dehors d'un organisme entier. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. L’ensemble de ces facteurs dynamiques ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

En prenant en considération les contraintes du projet et en utilisant un logiciel de simulation afin d'établir l'effectif des animaux à inclure dans l'étude, il s'avère que 27 animaux au total seront nécessaires, pour une répartition de 9 animaux par groupe. Cet effectif intègre la perte possible d'un animal par groupe à la suite de l'intervention chirurgicale et d'éventuels problèmes rencontrés à l'issue du transport des animaux entre établissements utilisateurs (plateforme différente pour réaliser les imageries). Cet effectif est le minimum requis pour permettre des analyses statistiques pertinentes.

Raffinement

Quel que soit le site d'hébergement (projet multisite) , les animaux bénéficieront d'un hébergement selon les conditions réglementaires. Les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux sur chaque site. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après le retrait chirurgical de la tumeur (médication contre la douleur, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Ils seront effectués par du personnel qualifié et expérimenté. Pendant l’examen, le niveau d'anesthésie sera surveillé en temps réel à l'aide de paramètres tels que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire, garantissant ainsi un état stable et sécurisé pour les animaux. Après la procédure, les animaux seront surveillés pendant le processus de réveil dans un environnement calme et contrôlé. En outre, une grille de score permet un contrôle quotidien de l'état général de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles animaux majoritairement utilisés pour les études en cancérologie sont les modèles murins : souris et rats. Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante pour une implantation intracérébrale de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour s'affranchir des limitations de résolution offertes par l’imagerie et permettre une injection du gel. Les rats immunocompétents présentent l'avantage d'avoir un système immunitaire intégralement préservé et sont une souche de référence utilisée pour le développement d’un modèle murin de tumeurs cérébrales. De plus, les cellules tumorales ont été isolées d’une tumeur chez le rat, il n'y a donc pas de risques de rejet. Des rats âgés de 6 semaines seront utilisés à un stade où leur conformation crâniale est achevée.

Une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis l'ouverture du crâne pour retirer la tumeur, avec des hémorragies possibles et une pression intracrânienne modifiée : 1 434 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois jours après la résection, une partie reçoit radiothérapie et chimiothérapie jusqu'à trois fois en trois jours, une autre se voit poser une fenêtre d'observation sur le crâne, et le sang est prélevé deux à trois fois par semaine pendant toute l'étude. Le porteur écrit que la craniotomie est "à l'origine d'une douleur mesurée" mais que "la résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses". Il ajoute qu'aucun effet secondaire n'est décrit dans la littérature pour les thérapies ciblées envisagées, et qu'aucune douleur n'est donc attendue de leur administration.

Objectifs

Les glioblastomes (GBM) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives chez l’adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire au maximum la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie (protocole de Stupp), la survie moyenne des patients n’excède pas 15 mois en raison de l’apparition, quasi-systématique, de récidives. Le principal facteur supposé pouvant expliquer l’apparition de ces récidives est la repousse de cellules très invasives, se propageant à partir de la masse tumorale. L’environnement protecteur empêche l’élimination de ces cellules par le protocole de Stupp. L'unité gliovasculaire (UGV) faite de cellules tumorales, de cellules immunitaires et de cellules cérébrales localisées à proximité des vaisseaux sanguins- est une niche protectrice favorisant la survie, la résistance au traitement et la dissémination des cellules de GBM. Elle a la pleine compétence pour jouer un rôle clé dans la récidive mais son rôle dans ce processus est encore mal connu. Mieux comprendre le comportement des cellules tumorales ainsi que le rôle du microenvironnement au sein de l'unité gliovasculaire et identifier des biomarqueurs spécifiques de la récurrence pourraient transformer considérablement notre vision actuelle de la thérapie des GBM et ainsi améliorer la prise en charge des GBM chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l’adulte et l’un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements très lourds (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie), la rechute est pratiquement inévitable (90%). Des données de la littérature ainsi que les résultats préliminaires obtenus au laboratoire, suggèrent que l’unité gliovasculaire (cellules tumorales, endothéliales, péricytaires, astrocytaires et immunitaires) pourrait jouer un rôle déterminant dans la survie des cellules tumorales après traitement. Cette étude nous permettra de définir précisément le rôle de l’unité gliovasculaire dans la résistance au traitement et sera déterminante pour l’identification de cibles thérapeutiques. Ce projet s’insère dans une grande étude réalisée en collaborations avec plusieurs équipes de recherche sur le glioblastome (cliniciens et chercheurs). Les résultats obtenus dans notre modèle préclinique murin seront ensuite validés à partir de biopsie de patients traités ou non au protocole de Stupp. L'application directe et immédiate de ces connaissances pourrait ainsi favoriser le développement de nouvelles thérapies ciblées, dont le GBM a urgemment besoin puisqu’ aucune amélioration thérapeutique pertinente n'a été apportée ces 15 dernières années. Malgré les efforts massifs déployés dans le domaine clinique et de la recherche, le traitement du GBM reste l'un des défis les plus difficiles à relever en oncologie clinique. Presque tous les patients atteints de GBM reçoivent le protocole de Stupp, qui est la norme en matière de soins ; par conséquent, beaucoup d'entre eux bénéficieraient de stratégies thérapeutiques visant à accroître son efficacité. Dans ce contexte, il s'agit d'une approche entièrement nouvelle issue d'une idée novatrice. Les résultats de ce projet jetteront les bases des objectifs futurs : déterminer de nouvelles voies et stratégies pour cibler les voies de résistance gliovasculaire post-Stupp et améliorer le traitement en collaboration avec les cliniciens. La compréhension de la résistance des GBM au protocole Stupp et de la biologie de l’unité gliovasculaire pourraient transformer considérablement notre vision actuelle du traitement des GBM dans le but ultime d’améliorer la survie des patients.

Procédures

L’objectif 1er de cette étude est d’établir un modèle pré-clinique de traitement du GBM chez la souris (protocole de Stupp). Pour cela, différents groupes de souris seront constitués. Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau de tous les lots d’animaux (anesthésie de 20min/souris). Groupe 1 : dans cette première procédure visant à mettre au point le retrait chirurgical de la tumeur, des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau (durée de l’anesthésie : 30 min). Après le développement de la tumeur les souris sont opérées afin de procéder au retrait de la tumeur (durée de l’anesthésie : 30min). Groupe 2 : Après mise au point du retrait de la tumeur avec le groupe 1, nous implanterons des cellules tumorales dans de nouvelles souris. Après développement de la tumeur, elle sera retirée. 3 jours après la résection de la tumeur, les animaux anesthésiés seront traités par radiothérapie (durée 15 minutes). Un traitement sera également administré directement dans l’abdomen de l’animal vigile (5 minutes). Ces traitements (radiothérapie et chimiothérapie) seront répétés au maximum 3 fois sur 3 jours consécutifs. Groupe 3 : sur certaines souris du groupe 2, une fenêtre d’observation sera posée après la résection (durée d’anesthésie 30 min). Ces animaux seront également traités par chimiothérapie et radiothérapie selon le même protocole décrit plus haut. Les animaux seront suivis par imagerie une fois avant le début du traitement puis en fin de traitement à raison d’une fois par semaine pendant 3 semaines. MODIFICATION Des prélevements de sang seront réalisés à raison de 2 à 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (1min/souris). Groupe 4 : un dernier lot d’animaux bénéficiera en plus du protocole Stupp (comme décrit pour le groupe 2 : retrait chirurgical de la tumeur, irradiation, chimiothérapie), une thérapie ciblée par injection ou par voie orale (environ 1 min/souris, 7 administrations max /semaine), qui pourra être administrée pendant le protocole Stupp, quelques jours après, ou quelques semaines après selon la dynamique d’activation des cibles identifiées.

Impact sur les animaux

Lors de l’injection : Les animaux greffés avec les cellules tumorales vont développer une tumeur cérébrale dont la taille sera évaluée fréquemment par dosage sanguin. Lors la résection : L’os du crane étant peu innervé, la craniotomie est à l’origine d’une douleur mesurée. La résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses. Cependant, la craniotomie peut engendrer un changement de pression intracrânienne et la résection en elle-même peut être à l’origine de petites hémorragies. Suite à cette intervention, une réduction des mouvements et de la mobilité de l’animal, une perte de coordination peuvent subvenir dans les heures qui suivent la chirurgie. Dans les jours suivant, une perte de poids peut également être observé. Le traitement aux rayonnement ionisants n’entraine pas d’inconfort en lui-même et est réalisé sur des animaux anesthésiés Les nuisances attendues suite à l’injection de la chimiothérapie seront celles liées à l’injection (douleur légère de courte durée). D’après notre expérience aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ce traitement. MODIFICATION Lors de l’injection des thérapies ciblées : Les nuisances attendues suite à l’administration des traitements seront celles liées à l’injection (stress et douleur légers, de courte durée). D’après la littérature disponible, aucun effet secondaire n’est décrit pour les drogues envisagées. De fait, aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ces traitements. Les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la queue de l’animal provoqueront une douleur légère et un stress de courte durée chez la souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des résultats préliminaires du laboratoire couplés à des données de la littérature nous mènent à penser que les modifications de comportement des cellules tumorales après traitement (protocole de Stupp) sont intimement dépendantes de leur environnement. Or, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus : il est aujourd’hui impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo. C’est pour cela que nous devons avoir recours à des études sur l’animal dans lequel tous les paramètres sont réunis. Notre hypothèse est qu’après le traitement les cellules tumorales résiduelles localisées au sein de l’unité gliovasculaire protectrices sont à l’origine de la récidive. Nous avons développé des méthodes alternatives pour éviter au maximum d’avoir recours aux animaux. Ainsi, nous avons au préalable observé in vitro que des cellules de GBM acquéraient un phénotype de résistance lorsqu’elles étaient au contact de vaisseaux sanguins. Cependant, ce modèle ne représente qu’une version simplifiée du microenvironnement tumoral. En effet, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus il nous est donc impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons fait un travail de recherche bibliographique rigoureux. De plus, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d’animaux. En effet : 1-Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur qui sera résécable environ un mois après l’injection. Nous ne testerons donc pas différentes concentrations de cellule. 2-Nous maitrisons la résection de la tumeur 3-Pour le traitement radio et chimiothérapeutique, nous avons mené de nombreuses expériences in vitro qui nous permettent de cibler les doses et le timing de traitement ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux utilisés. 4-Le suivi régulier de la progression tumorale grâce à la mesure d’un marqueur sanguin nous permet de savoir quand effectuer la résection mais également de monitorer la récurrence de la tumeur ce qui réduira également le nombre d’animaux utilisés. 5-Les analyses requièrent une faible quantité de matériel et permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. 6-Nos analyses bioinformatiques poussées nous aideront dans le choix des cibles thérapeutiques, ce qui nous permet de diminuer le nombre de cibles à tester et de privilégier les plus pertinentes.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, en particulier dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis individuellement et ce plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin d’assurer leur bien-être. Celui-ci sera évalué selon une grille de score. Si nécessaire, les expérimentations seront stoppées avant toute souffrance. Les manipulations lourdes sont faites sous anesthésie et les animaux recevront systématiquement les traitements antibiotiques et analgésiques adaptés pendant et après les opérations. Dès l’apparition d’une tumeur de taille importante (évaluée par un marqueur sanguin) les animaux sont suivis quotidiennement afin d'évaluer leur bien-être selon la grille de score jointe. En cas de signes de détresse les soins adaptés seront apportés (analgésie, hydratation …). Si aucun soulagement n’est possible ils seront mis à mort.

Choix des espèces

Nos expérimentations seront menées chez la souris, modèle de choix pour les expériences en cancérogenèse. Leur petite taille, et la méthodologie expérimentale bien établie en font une espèce animale pertinente pour les expériences de laboratoire. Nous étudierons des lignées cellulaires humaines et murines. Deux souches de souris seront utilisées dont des souris immunodéficientes pouvant recevoir des injections de cellules humaines sans développer de réactions immunitaires contre celles-ci. A l’inverse, l’autre lignée de souris est immunocompétente et permet donc de réaliser notre étude dans un contexte de réponse immunitaire complète. Adulte de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale mais également avec un potentiel de croissance limité afin d’éviter que les dispositifs chirurgicaux (fenêtres crâniennes) ne gênent leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie.