Procédures sévères
Implication de l’autophagie dans l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique à la suite d’un hémorragie intracérébrale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Une heure d'acclimatation dans la salle, l'anesthésie à l'isoflurane, une craniotomie, puis l'injection de collagénase ou de 100 microlitres de son propre sang dans le striatum pour provoquer une hémorragie cérébrale. Trois heures plus tard, un double cathéter est inséré aux mêmes coordonnées pour liquéfier puis aspirer l'hématome, ou une aiguille aspire quinze minutes durant, deux fois. 3 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués par perfusion intracardiaque pour prélever les tissus et isoler les vaisseaux du cerveau. L'effectif comprend 3 360 rats pour les expériences et 80 "dédiés à l'entraînement des expérimentateurs", nombre que le porteur dit pouvoir ajuster à la baisse selon l'aisance et l'habileté de chacun.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre comment les vaisseaux sanguins du cerveau réagissent après une hémorragie cérébrale (un saignement dans le cerveau). Il est connu qu'une hémorragie abîme la paroi des vaisseaux, la rendant poreuse. Nous voulons étudier un mécanisme naturel de "nettoyage" et de réparation de ces cellules, pour voir s'il aide à maintenir l'étanchéité des vaisseaux sanguins. Bien que ce mécanisme ait été étudié dans d'autres cellules du cerveau, son rôle exact dans les vaisseaux sanguins après une hémorragie reste inconnu. Notre projet vise donc à : Observer comment ce système de réparation naturel évolue au fil du temps après l'hémorragie. - Comprendre comment l'opération chirurgicale consistant à retirer le sang accumulé (le traitement utilisé chez les patients à l'hôpital) modifie ce mécanisme de réparation. - Ce projet apportera de nouvelles connaissances qui pourraient, à terme, améliorer la prise en charge et les traitements des patients victimes d'une hémorragie cérébrale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des connaissances inédites sur la façon dont les vaisseaux du cerveau réagissent et s'abîment après une hémorragie cérébrale. Ces résultats auront deux retombées principales : •Sur le plan fondamental : Mieux comprendre les systèmes d'autodéfense et de réparation des vaisseaux sanguins du cerveau. •Sur le plan médical (préclinique) : Évaluer très précisément l'impact et l'efficacité des chirurgies actuelles (qui visent à retirer le sang) sur la santé des cellules cérébrales. Cela permettra d'orienter les futures stratégies médicales.
Procédures
1- Acclimatation des animaux. Procédure : Mise en condition des rats dans la salle expérimentale avant manipulation. Durée : 1 heure. 1 fois par animal. 2- Anesthésie générale et préparation chirurgicale. Procédure : Induction et maintien de l’anesthésie à l’isoflurane (5 % induction, 2 % maintien), installation sur couverture chauffante, application de lidocaïne dans les conduits auditifs et sur la zone d’incision, pommade ophtalmique. Durée : 5–10 minutes. 3- Chirurgie stéréotaxique – Induction d’une hémorragie intracérébrale (HIC) - modèle collagénase. Procédure : Réalisation d’une craniotomie et injection intrastriatale de collagénase (2µl 1µl, 0,5µl/min, 0,2UI). Durée : 5–10 minutes. 4. Chirurgie stéréotaxique – Induction d’une hémorragie intracérébrale (HIC) -modèle sang autologue. Procédure : Réalisation d’une craniotomie et injection intrastriatale de 100 µL de sang autologue prélevé à partir de la veine caudale (20 µL/min pendant 5 min). Durée : 30–40 minutes. 5. Évacuation de l’hématome par fibrinolyse in situ. Procédure : 3 heures après induction de l’HIC, sous anesthésie, insertion d’un double cathéter (2 × 25G) aux coordonnées stéréotaxiques initiales. Injection de 2 µL de NaCl, rtPA ou urokinase, suivie 30 minutes plus tard de l’aspiration du sang liquéfié. Durée : 45–60 minutes. 6. Évacuation de l’hématome par aspiration mécanique. Procédure : insertion d’une aiguille 23G reliée à une seringue de 1 mL. Aspiration douce et contrôlée pendant 15 minutes, répétée une fois. Durée: 30-40 minutes. 7. Imagerie par résonance magnétique (IRM). Procédure : Séquences T2/T2* pour évaluation des lésions cérébrales sous anesthésie. Durée : 20–30 minutes. 8. IRM avec injection de gadolinium. Procédure : Injection intraveineuse de gadopentétate de dimeglumine suivie d’une acquisition T1 pondérée. Durée : 20 minutes. 9. IRM avec microparticules magnétiques. Procédure : Injection intraveineuse de particules magnétiques couplées à des anticorps anti-VCAM-1, puis séquence IRM T2*. Durée : 20 minutes. 10. Test de perméabilité vasculaire – Bleu Evans. Procédure: Injection en IV de Bleu Evans. Durée: 40 à 45 min. 11. Mise à mort par perfusion intracardiaque. Durée: 10-15 min.
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou des effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (comme l’insertion d’une aiguille par exemple) seront empêchées par l’utilisation de la lidocaïne en spray ou en crème 5min avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons la buprénorphine en injection sous-cutanée à la concentration de 0.3mg/mL à la posologie 0,1mg/kg, sous forme d’une injection unique. Enfin, pour les procédures où la chirurgie est estimée la plus sévère, comme la laparo-thoracotomie, sur conseil du vétérinaire affilié à notre laboratoire, un morphinique fort est préconisé. Le fentanyl pourrait être utilisé, 3-5 minutes avant le début de la procédure, à une dose de 0.3mg/kg injecté à un volume de 100µL en intra-péritonéal. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés seront mis à mort afin de prélever les tissus permettant des investigations histologiques, ainsi que l’isolement des vaisseaux cérébraux pour des analyses moléculaires complémentaires (Western blot, RT-qPCR ou dosage protéique).
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de respecter le principe de réduction des 3R. Le nombre d’animaux a été déterminé en fonction : • De la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées, • De nos travaux antérieurs publiés, • Et de la littérature scientifique disponible. L’effectif total nécessaire pour mener à bien ce projet est de 3360 rats, auxquels s’ajoutent 80 animaux dédiés à l’entraînement des expérimentateurs. Le nombre de 3440 animaux a été évalué et validé par un calcul de puissance statistique (power analysis, α = 0,05 ; puissance = 80 %) afin de garantir la robustesse des résultats tout en limitant le recours aux animaux. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM, MPIO, imagerie au gadolinium) permet de suivre les lésions cérébrales et d’étudier la distribution des produits dans le même animal, réduisant ainsi significativement le nombre total requis. Enfin, le nombre d’animaux destinés à l’entraînement (80) pourra être ajusté à la baisse en fonction de l’aisance, de l’habileté et de l’expérience de chaque expérimentateur dans la réalisation de ces gestes techniques.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus appropriée pour ce projet, car il permet de reproduire une hémorragie intracérébrale (HIC) avec un volume suffisant pour envisager une évacuation chirurgicale, ce qui n’est pas réalisable dans des modèles de plus petite taille (ex. souris). Le rat est par ailleurs l’une des espèces les plus utilisées en neurosciences expérimentales. Son système nerveux central est bien documenté, et son anatomie ainsi que sa physiologie cérébrale présentent des similarités importantes avec celles de l’Homme, en particulier concernant la vascularisation cérébrale et l’organisation de la barrière hémato-encéphalique. De plus, les modèles d’HIC chez le rat (modèle à la collagénase et modèle d’injection de sang autologue) sont validés et largement utilisés dans la littérature, ce qui garantit la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Enfin, notre équipe dispose d’une expertise reconnue dans l’utilisation de ces modèles, ce qui rend cette espèce particulièrement pertinente pour atteindre les objectifs de ce projet. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade de jeune adulte. Ce stade est adapté car il représente un âge où le développement cérébral est complet et où la barrière hémato-encéphalique est pleinement fonctionnelle, ce qui permet de modéliser de manière pertinente les mécanismes observés chez l’adulte humain. De plus, les jeunes adultes présentent une meilleure tolérance aux procédures chirurgicales et aux anesthésies, tout en limitant la variabilité liée aux phénomènes de vieillissement ou aux pathologies liées à l’âge.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un anticorps anti interleukine 6 dans un modèle de myocardite auto-immune chez le rat : EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une heure d'IRM sous anesthésie profonde après la pose d'un cathéter, aux quatorzième et vingt-huitième jours, plus trois échocardiographies sous anesthésie profonde : 130 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection unique dans la patte déclenche chez eux une myocardite auto-immune, inflammation du muscle cardiaque qui affaiblit la contraction du cœur et peut mener à une fatigue, un essoufflement à l'effort et, plus rarement, une insuffisance cardiaque. Suivent quatre injections hebdomadaires d'un anticorps anti-interleukine 6, des pesées tous les deux jours et jusqu'à six prélèvements de sang sur six semaines. Le porteur attend du traitement "une potentielle réduction de la mortalité dans ce groupe expérimental", "ce qui pourrait se traduire par une gravité moindre", quand l'induction de la maladie, elle, est prévue pour tous.
Objectifs
La myocardite est une inflammation du tissu musculaire du cœur, le myocarde, qui affaiblit la fonction de contraction de cœur. Elle représente ainsi la 3ème cause de mort cardiaque subite chez le jeune. L’analyse d’un prélèvement du myocarde pour effectuer le diagnostic tend à être remplacée de nos jours par l’imagerie moins invasive. Pour l’instant, il n’existe pas de traitement spécifique de la myocardite. Récemment, l’interleukine 6, un médiateur pro-inflammatoire, apparaît comme une cible intéressante. Objectifs concrets : Nous souhaitons déterminer l’effet d’un traitement visant à inhiber l’interleukine 6 sanguine sur l’inflammation au niveau sanguin et au niveau du myocarde chez des animaux souffrant de myocardite. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’identifier le mode d’action du traitement inhibiteur de l’interleukine 6 au cours de la myocardite, afin d’envisager un traitement thérapeutique chez le patient souffrant de myocardite.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes sur une durée de 35 jours : Mise en place d'un modèle de myocardite par injection unique d’un produit induisant l’inflammation, sous anesthésie (durée inférieure à 10min), EU1 Traitement anti-inflammatoire hebdomadaire par injection sous-cutanée ou intraveineuse (Durée par injection : environ 3min) 4 injections sur 4 semaines, EU1 Pesée tous les deux jours (durée : inférieure à 2 min) pendant 4 semaines, EU1 Prélèvements sanguins : maximum 6 prélèvements sur 6 semaines (Durée environ 1mn par prélèvement) EU1 Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) suivie d’une imagerie IRM avec injection de produit de contraste (durée : environ 1h) au 14ème, 28ème jour EU2 Echocardiographies sous anesthésie profonde (durée : 20min) au premier jour, 21ème et 35ème jour EU1
Impact sur les animaux
Le modèle de myocardite auto-immune par immunisation peut induire une légère douleur de courte durée au moment de l’injection du produit induisant l’inflammation au niveau de la patte des animaux. Ce modèle induit une dysfonction du cœur dû au développement de la pathologie, pouvant mener à une fatigue et un essoufflement à l’effort, et dans de rares cas à une insuffisance cardiaque. Lors des protocoles d’imagerie non invasive, un léger inconfort/stress de courte durée peut apparaitre à l’induction de l’anesthésie et au réveil ; de même qu’un stress léger de courte durée lors des manipulations/contentions. Les injections peuvent entrainer une légère douleur de courte durée au point d’injection. Si le traitement par l’anticorps anti IL6 est efficace, nous nous attendons à ce que les animaux appartenant au groupe traité présentent une amélioration notable de leur état évalué par une réduction des marqueurs inflammatoires, une amélioration des paramètres fonctionnels et par conséquent, une potentielle réduction de la mortalité dans ce groupe expérimental.Ce qui pourrait se traduire par une gravité moindre.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer et analyser les différents organes d'intérêt (cœur en particulier), permettant ainsi de confirmer et compléter les résultats obtenus in vivo (imagerie) en identifiant les mécanismes impliqués.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est justifiée notamment par le rôle central de l’imagerie in vivo dans la caractérisation du modèle de myocardite et de l’imagerie de l’inflammation pour le diagnostic. Le mécanisme d’action de l’anti IL-6 au niveau de l’organisme entier n’est actuellement pas reproductible in vitro ou ex vivo. En effet, il n’existe pas de modèles cellulaires ou ex vivo d’un modèle de myocardite autoimmune dans la littérature actuellement. De plus , une approche in vitro ou ex vivo ne tiendrait pas compte de l’effet sytémique de IL6 que nous voulons explorer dans cette étude car nous nous intéressons à son rôle dans la circulation sanguine et le mécanisme d’action de l’interleukine 6 requiert la communication entre les organes impliqués dans l’inflammation et le cœur.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 130 animaux sur 4ans. Le suivi longitudinal par imagerie évite de mettre à mort des animaux à chaque point temporel d’intérêt pour récolter les informations.
Raffinement
Les animaux auront un temps d'acclimatation et un enrichissement de leur milieu. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle afin de vérifier que les animaux s'alimentent correctement. La douleur des animaux sera réduite au minimum en veillant à couvrir les différents temps d'études par une analgésie. Les prélèvements sanguins ont été mutualisés avec les examens d’imagerie pour limiter le nombre d’anesthésie et utiliser la même voie que le cathéter utilisé pour l’injection du produit de contraste lors de l’imagerie. Suite à notre expérience dans une précédente étude, l’induction de la myocardite a été raffinée par l’utilisation d’une demi-dose de la solution d’immunisation, diminuant ainsi l’altération cardiaque et la mortalité, et se rapprochant de la majorité des patients myocardite à traiter. L’un des objectifs du projet est également de valider un mode d’injection moins invasif (sous cutanée). Différents point limites ont été définis afin de ne pas poursuivre l'étude si les animaux présentent des signes de souffrance ou de douleur. Plus précisément, l’ensemble des procédures auront lieu dans l’EU1, sauf l’imagerie IRM dans l’EU2. Le transport des animaux sera assuré dans une cage de transport dédiée, et nécessite moins de 5min de marche porte à porte par les souterrains de nos bâtiments (à température ambiante).
Choix des espèces
Le rat est l'espèce animale la plus utilisée dans ce modèle de myocardite expérimentale auto-immune et parmi les espèces animales, celle qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine du rat sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement pertinente pour étudier les pathologies inflammatoires. Il s’agira de jeunes adultes (250-300g) mâles et femelles. La myocardite est en effet une pathologie touchant les adultes d’environ 40 ans
Validation préclinique d’un outil théranostique protéique innovant pour le cancer du sein et de l’ovaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
403 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, certaines recevant jusqu'à quatre injections d'anti-inflammatoire et six injections d'un produit d'imagerie après la greffe de cellules tumorales. Le développement de la tumeur élargit leur abdomen et le rend, selon le porteur, "sensible à la palpation", avec un inconfort "voire des douleurs sévères". Le marqueur fluorescent testé doit permettre de distinguer les ganglions atteints de ceux qui restent sains lors des chirurgies du cancer du sein, et la même protéine sert de transporteur pour un anticancéreux chez des souris porteuses de tumeurs ovariennes. Le porteur annonce des "avancées majeures" pour le diagnostic ganglionnaire et un traitement qui "réduirait fortement les atteintes aux tissus sains", quand l'élargissement douloureux de l'abdomen figure, lui, parmi les effets attendus du protocole.
Objectifs
Le projet a pour objectif de développer un nouvel outil capable de détecter et de traiter certains cancers de manière ciblée. Dans le cancer du sein, les ganglions lymphatiques sont souvent retirés lors des chirurgies puis analysés afin de vérifier la présence de cellules cancéreuses, ils sont alors dits métastatiques. Cependant, le retrait de ganglions sains peut être inutile et peut réduire l'efficacité de certains traitements faisant appel au système immunitaire. Le premier objectif du projet est d'évaluer un marqueur fluorescent permettant d'identifier les ganglions contenant des cellules cancéreuses. Cette approche pourrait aider les chirurgiens à mieux identifier les ganglions métastatiques à retirer et à préserver ceux qui sont sains, afin d’optimiser l’efficacité de certains traitements. Le second objectif est d'utiliser cette même technologie pour transporter un médicament anticancéreux directement vers les cellules tumorales. L'efficacité de cette stratégie sera comparée à celle du médicament administré seul dans un modèle expérimental de cancer de l'ovaire. Des études préalables sur des cellules issues de patientes permettront de déterminer la dose la plus adaptée avant les expérimentations chez l'animal. À terme, ce projet pourrait contribuer au développement de traitements plus ciblés, limitant les effets sur les tissus sains.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir la preuve de concept préclinique de l’efficacité d’une plateforme protéique (i) d’une part en tant qu’agent d’imagerie pour le diagnostic préopératoire d’infiltration ganglionnaire de patientes atteintes d’un adénocarcinome mammaire et (ii) d’autre part en tant que cargo thérapeutique pour la délivrance ciblée de principe actif dans un modèle de cancer épithélial ovarien métastatique avec pour objectif de rendre les chimiothérapies hyperthermiques intrapéritonéales ciblantes pour en améliorer l’efficacité tout en minimisant les effets secondaires. La qualité et l’exhaustivité de cette exérèse est le facteur pronostic le plus déterminant pour la survie de ces patientes. Par ailleurs, la démonstration du drainage lymphatique spécifique du traceur vers les ganglions métastatiques ouvre la voie à un diagnostic préopératoire plus précis : seules les structures réellement atteintes seraient retirées, préservant ainsi les ganglions sains et améliorant l’efficacité ultérieure des immunothérapies thérapeutiques ou de maintien. Le développement de la même protéine en tant que cargo thérapeutique répond quant à lui à l’absence de chimiothérapies ciblantes pour le traitement des cancers ovariens avancés. Contrairement aux traitements actuels non ciblant, ce traitement cible spécifiquement biomarqueur universel des cancers épithéliaux, exprimé sélectivement sur le tissu tumoral et masqué sur le tissu sain, et libère sa charge cytotoxique une fois internalisé par les cellules ciblées. Cette approche réduirait fortement les atteintes aux tissus sains et augmenterait l’efficacité locale du traitement. L’ensemble du projet apporte ainsi des avancées majeures pour la précision du diagnostic ganglionnaire préopératoire et pour le développement de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins invasives.
Procédures
Certains animaux recevront une injection de cellules puis jusqu’à 4 injections d’un anti-inflammatoire et 6 injections d’une molécule pour l’imagerie alors que d’autres ne recevront qu’une injection de cellules et une injection de marqueur. Chaque injection durera un maximum de 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’injection, sous anesthésie gazeuse, au niveau de la glande mammaire peut induire une douleur légère. De plus, un stress physique modéré peut être induit au moment des injections intrapéritonéales sous anesthésie gazeuse pour l’imagerie in vivo. Suite à la xénogreffe, les animaux pourront présenter un inconfort voire des douleurs sévères dû au développement tumoral causant un élargissement de leur abdomen le rendant sensible à la palpation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation (prélèvement post-mortem des ganglions lymphatiques et organes). Cela permettra d’évaluer la spécificité du signal fluorescent ex vivo.
Remplacement
Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés au développement tumoral : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées à partir de biopsies, en culture 2D ou 3D et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont transplantées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour le traitement testé d’atteindre les cellules cibles. De plus, il est impossible d’étudier le développement métastatique dans des modèles in vitro. Ces limitations rendent donc incontournable le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies antitumorales.
Réduction
La taille de l’échantillon, pour ces deux études comparatives, est déterminée via l’application d’une méthodologie statistique et de la bibliographie. L'effectif nécessaire a été déterminé par une analyse de puissance, permettant de garantir l’efficacité ou non des traitements. Le nombre de souris déterminé, permettra de ne pas surdimensionner, et de ne pas utiliser des souris inutilement, ou de sous-dimensionner les deux études (rendant les résultats non exploitables). Les analyses statistiques des résultats obtenus se feront par des comparaisons multiples entre les différents groupes de souris, une moyenne +/- accompagnée d’un écart type. Concernant les deux modèles présentés, le suivi de la croissance tumorale se fera : par imagerie non invasive de luminescence, et de fluorescence ; ce qui permettra de limiter le nombre de souris utilisées. Des études pilotes auront été réalisées en amont pour déterminer les doses idéales de molécule cytotoxique. Pour un travail en aveugle, les souris issues des différents groupes seront mélangées dans les cages. Les prélèvements tissulaires post-mortem seront conservés par inclusion en paraffine à des fins d’étude histologique.
Raffinement
Les grilles de scorings spécifiques sont mises en place pour définir des points limites spécifiques à chaque modèle. Durant toute la période d’expérimentation, l’observation de l’état général des animaux et les pesées seront réalisées quotidiennement. Un analgésique locorégional sera administré avant l'injection, et cette dernière se fera sous anesthésie gazeuse, puis un second analgésique sera administré jusqu'à 3 jours post-injection pour réduire la douleur. Après l’anesthésie, l’animal sera replacé dans sa cage et observé jusqu’à son réveil complet. De plus, durant l’imagerie in vivo, les souris seront aussi anesthésiées, et déposées sur un tapis chauffant à 37°C.
Choix des espèces
Les souris sont le modèle expérimental le plus représentatif des ces pathologies. Nous utiliserons des animaux adultes, sexuellement matures (8-10 semaines)
Étude de l’impact d’une protéine humaine sur le développement du cancer colorectal associé à une inflammation chronique de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection unique d'une substance chimique qui initie le développement tumoral, une substance dans l'eau de boisson pour modifier leur flore intestinale, une administration orale d'une suspension de micro-organismes intestinaux, et des prélèvements de sang et de matières fécales. Le porteur décrit une diarrhée parfois hémorragique, une perte de poids, des douleurs abdominales et une déshydratation lors des phases d'induction de l'inflammation, puis une altération progressive de l'état général à mesure que les lésions tumorales du côlon apparaissent. Les bénéfices sont renvoyés au long terme, sous forme de "nouvelles pistes" de prévention du cancer du côlon chez les personnes atteintes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, tandis que les atteintes décrites, elles, sont au programme.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, provoquent une inflammation durable de la paroi intestinale et augmentent le risque de développer un cancer du côlon. Les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin jouent un rôle important dans ce processus : certains déséquilibres peuvent favoriser l’inflammation et le développement de tumeurs, tandis que d’autres peuvent contribuer à protéger l’intestin. Ce projet vise à étudier le rôle d’une protéine humaine impliquée dans le contrôle de l’inflammation et dans les interactions entre l’organisme et les micro-organismes intestinaux. Des résultats préliminaires suggèrent que cette protéine pourrait limiter l’inflammation et réduire le risque de cancer du côlon. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette protection et de déterminer si les effets observés sont liés aux modifications des micro-organismes intestinaux. Pour cela, un modèle de souris reproduisant le développement progressif d’un cancer du côlon associé à une inflammation chronique de l’intestin sera utilisé.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux comprendre le lien entre les micro-organismes présents dans l’intestin, l’inflammation chronique et le développement du cancer du côlon. Il permettra d’évaluer si une protéine humaine impliquée dans la régulation de l’inflammation joue un rôle protecteur contre le développement de ce cancer, et d’identifier les mécanismes associés aux bactéries intestinales, au métabolisme ou au système immunitaire qui pourraient constituer de nouvelles pistes pour des stratégies de prévention ou de prise en charge. Le projet cherchera également à déterminer si cet effet protecteur peut être transmis en modifiant les micro-organismes intestinaux. À long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles approches pour prévenir le cancer du côlon chez les personnes atteintes de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
Procédures
Les animaux seront soumis à une série d’interventions non chirurgicales visant à étudier le développement d’un cancer du côlon associé à une inflammation intestinale. Ces interventions comprennent une injection unique d’une substance chimique destinée à initier le développement tumoral, l’administration orale d’une substance destinée à modifier les micro-organismes intestinaux (administrée dans l’eau de boisson sur des périodes limitées et définies), une administration orale unique d’une suspension de micro-organismes intestinaux, ainsi que des prélèvements de sang et de matières fécales. Les administrations orales seront réalisées selon un calendrier expérimental défini comprenant plusieurs cycles sur une période de quelques semaines à quelques mois. Les prélèvements de sang seront effectués à un nombre limité de reprises à l’aide de techniques couramment utilisées chez la souris, et les prélèvements de matières fécales seront réalisés de manière non invasive. Aucune intervention chirurgicale n’est prévue. À l’issue de l’étude ou lors de l’atteinte des critères définis, les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse des tissus.»
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé peut entraîner une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée, parfois hémorragique, une perte de poids, une altération de l’état général, une diminution de l’activité, des douleurs abdominales et une déshydratation en cas d’atteinte plus sévère. Ces effets sont principalement observés lors des phases d’induction de l’inflammation. L’injection intrapéritonéale de la substance chimique utilisée pour initier le modèle peut provoquer un stress transitoire lié à la contention et à l’injection. Les administrations par voie orale réalisées dans le cadre des transplantations peuvent également entraîner un stress bref et, de manière exceptionnelle, un risque de fausse route. À plus long terme, le développement de lésions tumorales colorectales peut entraîner une altération progressive de l’état général, associée à une perte de poids, une diminution de l’activité et des signes de fatigue ou d’inconfort.»
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, l’ensemble des animaux sera euthanasié afin de permettre la collecte des tissus nécessaires aux analyses prévues dans le projet. Aucun animal ne sera maintenu en vie après la phase expérimentale, la finalité scientifique reposant sur l’étude tissulaire post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à étudier comment la protéine REG3A protège contre le cancer du côlon associé à l’inflammation. Ce processus implique des interactions complexes entre l’intestin, le système immunitaire, le microbiote et les tissus environnants. Les méthodes in vitro (cellules en culture ou organoïdes) ou les simulations informatiques ne permettent pas de reproduire cette complexité ni d’étudier la progression de la maladie dans un organisme entier. Le modèle de souris utilisé permet d’observer toutes ces interactions dans un contexte vivant et de tester de manière fiable l’effet de REG3A sur la prévention et la progression des lésions intestinales. Les expériences animales sont donc indispensables pour atteindre les objectifs du projet, aucun modèle alternatif ne permettant actuellement de répondre à ces questions..
Réduction
Le nombre de souris utilisé a été déterminé à l’aide de logiciels de calcul statistique adaptés, afin de garantir la robustesse des analyses tout en utilisant le plus petit nombre d’animaux possible. Cette approche permet d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le principe de réduction. Les animaux seront utilisés de manière optimisée, notamment par la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus lorsque cela est possible, afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. L’ensemble des conditions expérimentales est standardisé afin de limiter les variations biologiques non pertinentes et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues pour réduire au maximum le stress et l’inconfort des souris tout en permettant d’obtenir des résultats scientifiques fiables. Les animaux sont observés chaque jour, y compris les week-ends et jours fériés, afin de détecter précocement tout signe de douleur, de malaise ou d’altération de l’état général (perte de poids, comportement anormal, isolement, poil hérissé). L’évaluation du bien-être repose sur une grille de points limites définie permettant une appréciation objective de l’état des animaux et la mise en œuvre de mesures adaptées en cas d’atteinte de ces critères. Les manipulations nécessaires (pesées, prélèvements ou autres gestes techniques) sont réalisées par du personnel formé, de manière rapide et avec un minimum de contention afin de limiter le stress. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies afin de favoriser les comportements naturels et améliorer leur bien-être.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car elles sont largement utilisées en recherche biomédicale et permettent de reproduire de manière fiable les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du côlon associé à une inflammation intestinale. Leur homogénéité génétique limite la variabilité individuelle et facilite les comparaisons entre groupes expérimentaux. Le modèle utilisé reproduit des caractéristiques proches de la maladie humaine, notamment l’inflammation chronique de l’intestin et le développement progressif de lésions tumorales. L’étude est réalisée sur des animaux jeunes adultes, chez lesquels l’organisme et le microbiote intestinal sont stabilisés, ce qui garantit des conditions expérimentales reproductibles et pertinentes pour l’analyse des mécanismes étudiés.
Comprendre comment un dérèglement de la lecture des gènes peut perturber l’immunité et favoriser l’inflammation.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une paralysie partielle ou complète des membres postérieurs, une diarrhée avec douleur viscérale, une perte de poids importante : ces états déclenchent la mise à mort immédiate des souris qui les atteignent. 2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent jusqu'à trois administrations en sept jours pour provoquer une inflammation du système nerveux central, ou une injection unique pour provoquer une inflammation du côlon, et sont suivies quarante à soixante jours avec des pesées au moins quotidiennes. Le projet porte sur une protéine, Cbx5, dont le dérèglement aggrave ces deux inflammations chez les souris porteuses de la modification génétique, le porteur annonçant à terme des traitements adaptés "aux particularités de chaque patient".
Objectifs
Les maladies auto-immunes et inflammatoires, comme la sclérose en plaques ou certaines maladies intestinales, touchent de plus en plus de personnes dans le monde. Malgré les progrès de la médecine, les traitements actuels ne sont pas toujours efficaces. Pour mieux les combattre, il est crucial de comprendre comment ces maladies se développent au niveau des cellules et des mécanismes internes du corps. Les études menées sur des animaux, comme les souris, permettent de reproduire certaines caractéristiques de ces maladies chez l’humain. Cela aide les chercheurs à tester de nouvelles pistes thérapeutiques avant de les appliquer aux patients. Notre projet vise à étudier le rôle d’une protéine spécifique, appelée Cbx5, qui pourrait influencer le fonctionnement du système immunitaire. En utilisant des modèles animaux, nous allons analyser si un dysfonctionnement de cette protéine favorise le développement de maladies auto-immunes. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes en jeu et, à terme, d’ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet étudie comment un déséquilibre dans le fonctionnement du système immunitaire peut rendre les souris plus vulnérables aux maladies auto-immunes et inflammatoires. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes qui relient ces dérèglements au développement de maladies comme la sclérose en plaques ou certaines affections intestinales. En se concentrant sur les cellules du système immunitaire, cette étude pourrait identifier des éléments clés — comme des protéines ou des types spécifiques de cellules — qui pourraient devenir des cibles pour de nouveaux traitements. Les résultats pourraient aider à mieux prévenir et soigner ces maladies, en adaptant les solutions aux particularités de chaque patient.
Procédures
Les souris recevront des administrations visant à induire soit une inflammation du système nerveux central (modèle d’EAE), soit une inflammation du côlon (modèle de colite expérimentale), afin d’étudier les mécanismes immunopathologiques et leurs effets systémiques. Pour la procédure EAE, les animaux recevront jusqu’à 3 administrations au maximum sur une période de 7 jours, réalisées sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress. Pour la procédure colite, une injection unique est réalisée également sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis sur une durée maximale de 40 à 60 jours selon la procédure. Le suivi comprend une observation clinique quotidienne, renforcée en phase aiguë, ainsi que des pesées au minimum quotidiennes (jusqu’à deux fois par jour en cas de dégradation clinique) pour surveiller l’évolution de l’état général. Des prélèvements de fèces non invasifs seront réalisés régulièrement afin d’analyser les paramètres inflammatoires et le microbiote. L’état des animaux sera évalué à l’aide de grilles de score intégrant les signes cliniques généraux, digestifs, neurologiques et la température corporelle, permettant d’appliquer les points limites définis. En fin de protocole ou en cas d’atteinte des points limites, les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement des organes d’intérêt (cerveau, moelle épinière, tractus digestif et organes lymphoïdes) en vue des analyses.
Impact sur les animaux
Chez les souris étudiées, la modification génétique introduite n’a pas d’effet visible sur la santé en conditions basales : les animaux présentent une croissance, une reproduction et un comportement maternel comparables aux témoins. En revanche, lors de l’induction d’une inflammation (EAE ou colite expérimentale), cette modification est associée à une aggravation de la sévérité des pathologies. Dans le modèle d’EAE, cela peut se traduire par une faiblesse progressive des membres postérieurs, une perte de coordination pouvant évoluer vers une paralysie partielle ou complète, et une diminution de la capacité de déplacement et d’alimentation. Dans les cas sévères, une prostration peut être observée. Dans le modèle de colite, les animaux peuvent présenter une perte de poids, une diminution de l’appétit, une altération de l’état général, ainsi que des signes digestifs tels que diarrhée et inconfort abdominal compatible avec une douleur viscérale, avec possible déshydratation en cas d’évolution défavorable. Les interventions (injections, pesées, prélèvements de fèces) sont brèves et standardisées, et ne sont pas associées à des effets secondaires durables attendus, hormis un stress transitoire lié à la manipulation. L’ensemble de ces effets est intégré au suivi clinique afin d’adapter la surveillance et d’appliquer les points limites définis
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et leurs organes seront prélevés pour être analysés en laboratoire
Remplacement
Le principe de remplacement (utiliser des méthodes alternatives à l’expérimentation animale) n’est pas applicable à ce projet. En effet, les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas d’étudier de manière fiable le système immunitaire dans des conditions proches des maladies humaines. Les réactions complexes comme le stress, l’inflammation ou l’auto-immunité impliquent l’organisme entier et ne peuvent pas être reproduites intégralement en laboratoire (in vitro). Une veille bibliographique a déjà été réalisée avant le dépôt du dossier pour vérifier l’absence de méthodes de remplacement adaptées. Cette veille se poursuivra tout au long du projet afin de s’assurer qu’aucune alternative valable ne sera négligée
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé au minimum nécessaire, en tenant compte de la variance biologique observée et des analyses statistiques prévues. Afin de réduire le nombre d’animaux, tous les échantillons prélevés sont conservés à -80 °C et dans une banque de données, ce qui permet leur réutilisation ou leur emploi comme témoins dans des expériences ultérieures. Les données de la littérature sur des modèles animaux similaires montrent que des groupes de 12 animaux par expérience sont suffisants pour obtenir des résultats robustes. Les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps à l’aide de techniques non invasives, telles que le suivi du poids, l’observation de la consistance des fèces et l’évaluation de paramètres cliniques pertinents. Cette approche permet de suivre chaque animal de manière longitudinale, là où il aurait été nécessaire auparavant d’euthanasier plusieurs individus à chaque étape d’une étude, réduisant ainsi significativement le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, une analyse rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience afin d’identifier les possibilités de diminution supplémentaire du nombre d’animaux pour les études futures.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation sont encadrées par une procédure de suivi du bien-être animal. Pour chaque protocole, des critères de tolérance ont été définis afin de limiter la souffrance ou l’angoisse, tels que des signes de douleur intense, une perte de poids importante ou une altération notable de l’état général ; tout animal atteignant ces critères sera immédiatement mis à mort. Des mesures sont mises en place pour réduire l’anxiété et l’impact environnemental, notamment via un enrichissement amélioré comprenant des cachettes et des objets à ronger. Les animaux restent dans leur cage avec leurs congénères habituels et disposent d’un accès libre à l’eau et à la nourriture. Une surveillance quotidienne par le personnel animalier ou les expérimentateurs permet de détecter toute souffrance ou signe de mal-être, selon les critères définis pour chaque expérience. Une analyse rétrospective sera réalisée à l’issue de chaque étude afin d’identifier des améliorations possibles pour réduire la souffrance animale dans les protocoles futurs. Enfin, pour toutes les interventions telles que les injections ou les prélèvements, les animaux recevront une anesthésie appropriée, garantissant le raffinement des procédures.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de celles de l’espèce humaine, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de projet. Cette espèce offre par ailleurs des avantages pratiques décisifs : faible coût, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport et de manipulation, ainsi qu’une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Notre projet repose sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, nécessitant également des animaux témoins, sans alternative disponible dans d’autres espèces. Enfin, la souris bénéficie d’outils expérimentaux essentiels pour étudier avec précision les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Les souris utilisées seront âgées d’au moins six semaines, car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures, et cet âge correspond également aux pratiques courantes dans la littérature pour ces modèles.
Etude de l’effet de candidats médicaments dans un modèle d’infarctus du myocarde par ligature de l’artère coronaire avec insuffisance cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le protocole dépend de la demande des laboratoires pharmaceutiques, jusqu'à l'âge des rats retenus pour chaque série. 1 770 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Une chirurgie de trente minutes bloque l'arrivée du sang dans une artère du cœur pour provoquer un infarctus, suivie d'un suivi pouvant atteindre vingt-sept semaines, d'une pompe implantée au cours d'une seconde chirurgie, de huit échographies au maximum, de prélèvements sanguins jusqu'à trois fois par semaine et de mesures de pression terminales. Le porteur attend une mortalité liée à la chirurgie ou aux complications cardiaques, et présente l'établissement comme "prestataire de service".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont l'une des principales causes de décès dans le monde. Parmi elles, l'infarctus du myocarde, communément appelé « crise cardiaque », est provoqué par l'obstruction d'une artère coronaire qui prive une partie du cœur de son apport en oxygène. Cette atteinte peut entraîner une dégradation durable de la fonction cardiaque et évoluer vers une insuffisance cardiaque chronique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques destinées à limiter les conséquences d'un infarctus du myocarde ou à ralentir l'apparition d'une insuffisance cardiaque après cet événement. Pour cela, un modèle expérimental reproduisant chez le rat certaines caractéristiques de la maladie observée chez l'humain sera utilisé. Les médicaments étudiés pourront agir à différents niveaux : réduction des lésions cardiaques provoquées par l'infarctus, amélioration de la fonction du cœur, limitation des modifications morphologiques du cœur ou ralentissement de la progression vers l'insuffisance cardiaque. L'efficacité des composés sera évaluée grâce à différentes mesures de la structure et du fonctionnement du cœur ainsi qu'à l'analyse de tissus et d’indicateurs biologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques à la suite d’une crise cardiaque et de mieux identifier les molécules en développement les plus prometteuses avant leur évaluation chez l’humain.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale visant à reproduire une crise cardiaque. Cette chirurgie, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, consiste à bloquer l’arrivée de sang dans l’artère irriguant le cœur afin de provoquer une atteinte contrôlée du muscle cardiaque. La durée de cette intervention est d'environ 30 minutes. Après une période de récupération, les animaux pourront recevoir les traitements expérimentaux selon différentes voies d'administration. Ces administrations pourront être répétées tout au long du suivi, pendant une durée pouvant atteindre 27 semaines. Les animaux pourront subir une chirurgie supplémentaire d’environ 15-25 minutes, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, afin d’implanter une pompe qui permettra de diffuser les médicaments testés en continu. Des examens d'imagerie cardiaque (échocardiographie) seront réalisés sous anesthésie légère afin d'évaluer l'évolution de la fonction cardiaque. Jusqu'à sept examens intermédiaires ainsi qu'un examen final pourront être effectués, chaque séance durant environ 20 minutes. Des prélèvements sanguins pourront également être réalisés jusqu'à trois fois par semaine sur 28 jours maximum, ou jusqu’à dix fois sur 24 à 72h maximum, afin d'étudier les indicateurs biologiques et la présence des médicaments dans l'organisme. Enfin, des mesures de pressions terminales seront réalisées sous anesthésie générale (environ 20 minutes) en fin d'étude avant le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques.
Impact sur les animaux
L'intervention chirurgicale peut entraîner une douleur ou un inconfort transitoire malgré les mesures d'analgésie mises en place. Dans les heures ou les jours suivant l'opération, les animaux peuvent présenter une diminution temporaire de leur activité, une baisse de l'appétit ou une perte de poids. Le blocage du flux sanguin dans l’artère irrigant le cœur, induit une atteinte cardiaque pouvant provoquer une diminution progressive de la fonction du cœur et, dans certains cas, une insuffisance cardiaque. Une mortalité liée à la chirurgie ou aux complications cardiaques est également attendue. Les traitements administrés peuvent occasionnellement entraîner des effets secondaires liés au composé étudié ou à la voie d'administration. Les injections répétées, les prélèvements sanguins et les périodes de contention nécessaires à certaines procédures peuvent être sources de stress léger et de gêne passagère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de pouvoir récupérer le coeur et d'autres tissus pour faire une analyses approfondies de l'effets des médicaments testés sur ces organes.
Remplacement
Avant toute étude chez l'animal, les nouvelles molécules thérapeutiques sont évaluées à l'aide de méthodes alternatives appropriées, telles que des essais sur des cellules. Toutefois, ces méthodes ne permettent pas de reproduire l'ensemble des interactions complexes observées dans un organisme vivant, notamment les conséquences d'une crise cardiaque sur le fonctionnement du système cardiovasculaire, la distribution du médicament dans l'organisme ou l'évolution d’indicateurs biologiques. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour obtenir les informations indispensables à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique des composés étudiés.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé à partir de l'expérience acquise avec ce modèle expérimental et d'analyses statistiques permettant d'obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant les effectifs. Les mêmes animaux sont suivis tout au long de l'étude grâce à des examens répétés, ce qui réduit le nombre total d'animaux nécessaires. La répartition des groupes et l'utilisation de méthodes statistiques adaptées contribuent également à limiter les effectifs tout en garantissant la qualité scientifique des résultats.
Raffinement
Toutes les procédures susceptibles d'entraîner une douleur ou un inconfort sont réalisées sous anesthésie et accompagnées d'une prise en charge analgésique adaptée. Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation avant le début des expérimentations et sont hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec enrichissement du milieu et surveillance régulière. L'état de santé des animaux est évalué tout au long de l'étude à l'aide de critères prédéfinis permettant de détecter précocement toute souffrance. Des soins complémentaires, une adaptation des traitements ou une mise à mort anticipée sont mis en œuvre dès que nécessaire afin d'éviter toute souffrance inutile. Les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et expérimenté afin de limiter au maximum le stress et les nuisances associés aux manipulations.
Choix des espèces
De nombreuses études expérimentales sur l'infarctus du myocarde utilisent les rats. En effet, cette espèce possède un système cardiaque similaire à celui de l'humain et l'ensemble des paramètres mesurés lors d'une procédure expérimentale d’IM sont identiques à ceux mesurés chez le patient humain. Cette espèce développe des lésions cardiaques reproductibles, ce qui en fait un modèle préclinique de choix. Son utilisation a permis de développer et de tester de nombreux médicaments ayant donné lieu à des essais cliniques. Des rongeurs mâles ou femelles adultes (à partir de 6 semaines pour les mâles et 8 semaines pour les femelles) au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. En tant que prestataire de service, le choix de l’âge des animaux utilisés pour chaque série expérimentale dépend de la demande des laboratoires pharmaceutiques.
États de vigilance et circuits neuronaux chez la souris au cours de tâches appétitives et d’évitement, de la chasse aux grillons à la fuite devant la menace
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une première chirurgie de deux heures, une seconde de quatre à six heures au moins sept jours plus tard, puis des enregistrements cérébraux courant sur dix à douze semaines : 536 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées à l'issue pour vérifier que les électrodes visaient bien les zones ciblées. Les souris implantées vivent seules pour protéger le matériel, et réalisent jusqu'à trente sessions de quarante-cinq minutes où elles chassent des grillons ou fuient une menace visuelle. L'objectif déclaré est de relier la vision, la décision d'approche ou de fuite, le sommeil et le stress, avec pour horizon lointain la compréhension de l'anxiété et de la dépression. Le porteur retient la souris parce qu'elle exprime "spontanément des comportements naturels de chasse et d'évitement de prédateurs", ce qui dispense de longs apprentissages.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment la vision guide des décisions rapides chez la souris, notamment lorsqu'il s'agit de s'approcher d'un stimulus appétitif ou d'éviter une menace. Il cherche également à déterminer comment ces expériences visuelles fortes influencent ensuite les états cérébraux, en particulier le sommeil et les réponses émotionnelles. L'objectif est d'établir un lien entre le traitement des scènes visuelles naturelles, les stratégies comportementales d'approche et de fuite, et la régulation du sommeil et du stress. À terme, ces connaissances pourraient contribuer à mieux comprendre comment certaines expériences émotionnelles perturbent le sommeil, un mécanisme impliqué dans l'anxiété et la dépression.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d’abord améliorer les connaissances de base sur la façon dont la vision, les émotions et le sommeil interagissent. En observant des comportements naturels, il permettra de mieux comprendre comment des scènes visuelles réalistes influencent les décisions d’approche ou de fuite, puis la qualité du sommeil. À plus long terme, ces connaissances pourraient aider à mieux comprendre pourquoi certains stress visuels ou émotionnels dérèglent le sommeil, un problème fréquent dans l’anxiété et la dépression, et orienter le développement de nouvelles stratégies pour améliorer le sommeil et la gestion du stress.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux grandes catégories d'interventions. Premièrement, des séances comportementales en état d'éveil : les souris vigiles réalisent au maximum deux sessions par jour d'environ 45 minutes chacune, pendant une période maximale de trois semaines comprenant 15 jours de test, soit jusqu'à 30 sessions par animal. Deuxièmement, pour une partie des animaux, des interventions chirurgicales sous anesthésie générale : une première intervention d'environ 2 heures, suivie, au moins 7 jours plus tard pour certains animaux, d'une seconde intervention également sous anesthésie, plus complexe d'une durée de 4 à 6 heures. Après une phase de récupération post-chirurgicale, ces animaux font l'objet d'enregistrements chroniques de leur activité cérébrale, musculaire et cardiaque lors de sessions comportementales (deux sessions de 45 minutes par jour, sur des blocs de 5 jours séparés par 2 jours de pause) et pendant les 24 heures suivant chaque session. Ces enregistrements peuvent se poursuivre sur une durée totale ne dépassant pas 10 à 12 semaines après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues concernent la chirurgie d’implantation, le port des implants, l’isolement en cage individuelle et l’exposition à des situations potentiellement stressantes sur de courtes périodes. À court terme, après la chirurgie (quelques heures à 1–2 jours), des effets indésirables moyennement douloureux et de courte durée peuvent survenir. À moyen et long terme, la présence d’électrodes et de fibres peut entraîner une gêne locale, ou une gêne mécanique le temps que les animaux s’y habituent, ainsi qu’un stress lié à l’hébergement individuel nécessaire pour protéger les implants. Les tâches comportementales peuvent induire un stress émotionnel aigu le temps du test en lui-même et est réversible un fois qu’il est terminé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de leur participation au projet. Pour garantir les résultats obtenus, il faut analyser le cerveau des animaux post mortem afin de vérifier que les dispositifs ont bien été placés aux endroits ciblés et que les signaux enregistrés proviennent des régions cérébrales visées. Cette vérification est indispensable pour garantir la validité des résultats.
Remplacement
Ce projet porte sur des comportements complexes faisant intervenir simultanément la vision, la prise de décision, les émotions et le sommeil. Ces phénomènes nécessitent un organisme complet, avec une vision, une motricité, des émotions et un sommeil fonctionnels, et ne peuvent pas être reproduits uniquement sur des tissus isolés, des modèles informatiques ou chez des animaux au système nerveux très simple. Les modèles computationnels permettent de simuler certains aspects du traitement visuel, mais ne rendent pas compte des interactions entre vision, comportement et états cérébraux dans un organisme vivant. Les cultures cellulaires et tissus isolés ne permettent pas d'étudier des comportements intégrés. Les organismes invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales impliquées dans la régulation du sommeil et des émotions.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé à l'avance pour obtenir des résultats fiables en utilisant le minimum nécessaire, sur la base d'analyses statistiques de puissance. Chaque animal est suivi sur plusieurs volets du projet (comportement, activité cérébrale, sommeil), ce qui limite le nombre de groupes expérimentaux et réduit le nombre total d’animaux. Par ailleurs, les conditions expérimentales les plus informatives sont identifiées progressivement au cours du projet, ce qui permet de concentrer les expériences suivantes sur les situations les plus pertinentes et d'éviter des expériences inutiles.
Raffinement
Plusieurs mesures sont prévues pour limiter au maximum l’inconfort et le stress. Les souris sont d’abord habituées aux différents environnements utilisés. Les animaux sont suivis et une grille de score avec des points limites précoce est utilisé pour détecter tout signe de douleur ou d’inconfort. Les gestes invasifs sont réalisés sous anesthésie avec des antalgiques adaptés et les animaux implantés sont logés individuellement dans des cages enrichies.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris, qui est la plus adaptée aux objectifs de ce projet portant sur le comportement, la physiologie et le fonctionnement du cerveau. Les souris adultes expriment spontanément des comportements naturels de chasse et d'évitement de prédateurs, ce qui permet d'étudier directement des réponses d'approche et de fuite guidées par la vision, sans passer par de longs apprentissages artificiels. Chez la souris, les cycles de sommeil, les réponses au stress et de nombreux aspects du fonctionnement cérébral sont déjà bien décrits, ce qui facilite l'interprétation des résultats et la comparaison avec des travaux antérieurs. De plus, il existe des lignées génétiquement modifiées qui permettent de suivre ou de moduler l'activité de groupes précis de neurones impliqués dans la vision, le stress ou le sommeil. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte, c’est-à-dire entre 6 et 22 semaines après la naissance. Cet intervalle correspond à un stade où les comportements innés de chasse et d’évitement sont pleinement exprimés et stables, et où les cycles de sommeil sont matures.
Toxicité cardiopulmonaire des microplastiques inhalés dans un modèle de pathologie broncho-pulmonaire chronique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Pour mesurer ce que des microplastiques inhalés font aux poumons et au cœur de rats atteints d'une maladie respiratoire chronique provoquée en laboratoire, 80 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, tous tués à l'issue pour prélever cœur, poumons, muscles et vaisseaux. Ils sont exposés plusieurs fois à des particules fines sous anesthésie sur cinq semaines, reçoivent un composant bactérien qui imite une infection pulmonaire, courent quinze minutes sur un tapis roulant et passent une échographie cardiaque. Le porteur annonce une gêne respiratoire modérée, une accélération du rythme respiratoire, une baisse d'activité physique et une perte de poids. Une perte de poids ou des signes de détresse respiratoire sévère constituent les points limites, et déclenchent la mise à mort du rat concerné.
Objectifs
L’air que nous respirons est de plus en plus pollué : fumées d’usines, poussières fines, et surtout microplastiques (des morceaux de plastique invisibles à l’œil nu). En France, nous en inhalons 30 000 par jour, et jusqu’à 2,8 millions en Chine ! Pourtant, on ne connaît pas encore bien leurs effets sur la santé. Que se passe-t-il dans notre corps ? Ces particules, une fois respirées, peuvent s’enfoncer profondément dans les poumons, affaiblir nos défenses immunitaires, provoquer des inflammations ou des maladies comme l’asthme ou la BPCO (une maladie pulmonaire chronique), et enfin passer dans le sang, avec des risques encore mal compris pour le cœur et les vaisseaux sanguins. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1/Comment le corps (poumons et système cardiovasculaire) réagit-il à ces microplastiques, chez une personne en bonne santé ou atteinte de BPCO ? 2/ Où ces particules se propagent-elles dans l’organisme ? 3/ Quels sont les effets sur le fonctionnement des poumons et du cœur ? Les résultats seront comparés à des analyses de tissus pulmonaires de patients atteints de BPCO, pour mieux comprendre les risques réels.
Bénéfices attendus
Le projet vise à étudier la distribution des particules fines d’origine microplastique dans l'organisme et d’approfondir notre compréhension des mécanismes impliqués dans les effets cardiopulmonaires. Cette étude permettra d’identifier les altérations inflammatoires, structurelles et fonctionnelles induites par ces particules, en mettant en évidence leur impact sur les voies physiopathologiques sous-jacentes. Elle contribuera également à mieux cerner les risques associés à une exposition chronique, offrant ainsi des perspectives pour l’évaluation des dangers environnementaux et la mise en place de stratégies de prévention en santé publique. Les résultats obtenus avec le modèle animal seront mis en perspective avec des données obtenues sur des biopsies humaines de patients BPCO.
Procédures
Certains animaux seront soumis aux mêmes procédures expérimentales. Chez l’animal éveillé, une mesure de la fonction respiratoire sera réalisée dans une chambre d’exploration pendant environ 15 minutes. Un test d’effort sur tapis roulant sera également effectué pendant environ 15 minutes. Les animaux seront exposés plusieurs fois à des particules fines sous anesthésie sur 5 semaines. Nous mimerons une infection pulmonaire avec un composant bactérien pour faire réagir le système immunitaire. Cette procédure est susceptible d’entraîner une nuisance transitoire pouvant se manifester par une diminution temporaire de l’activité, une altération modérée de l’état général ou une gêne respiratoire. Enfin, la fonction cardiaque sera évaluée par échographie sous anesthésie, pendant environ 15 minutes. Les animaux feront l’objet d’une surveillance adaptée tout au long de l’étude afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort, par exemple lorsqu’ils sont manipulés, maintenus dans les chambres d’explorartion, ou lors de mesures et prélèvements. Une agitation excessive ou persistante est surveillée pour garantir leur bien-être. Les animaux peuvent présenter des symptômes transitoires liés au modèle de maladie respiratoire chronique , tels qu'une gêne respiratoire modérée, une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l'activité physique et une perte de poids. Une perte de poids ou l'apparition de signes de détresse respiratoire sévère constituent des points limites et entraîneront l'euthanasie de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Différents organes (cœur, poumons, muscles, vaisseaux sanguins) seront prélevés pour d’autres études. Ce processus est essentiel pour obtenir une compréhension détaillée des éventuelles altérations tissulaires et pour évaluer les atteintes pulmonaires et cardiaques consécutives à l’exposition aux microplastiques.
Remplacement
La BPCO est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Les expériences sur les rongeurs demeurent indispensables pour mener des explorations in vivo et, surtout, ex vivo. Nous optimisons nos expériences pour utiliser le moins d’animaux possible. Chaque rongeur subit plusieurs analyses complémentaires, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats scientifiques plus riches et fiables. Le nombre d’animaux inclus a été calculé statistiquement pour garantir la robustesse des résultats.
Réduction
Nous avons conçu ce projet de manière à utiliser le moins d'animaux possible. Plusieurs mesures et analyses seront réalisées sur chaque animal afin d'obtenir un maximum d'informations à partir d'un même individu. Cette approche permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la qualité scientifique des résultats. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.
Raffinement
Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en inconfort, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Des protocoles d’habituation ont été mis en place pour que les animaux s’habituent aux procédures et réduire leur stress. Afin d’éviter tout inconfort, les animaux seront anesthésiés et analgésiés si nécessaire en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement utilisé et bien caractérisé sur le plan cardiovasculaire. Sa physiologie cardiaque présente de nombreuses similitudes avec celle de l’Homme, tant sur le plan de la régulation que de l’organisation anatomique et fonctionnelle du cœur, permettant l’étude approfondie des mécanismes impliqués, de l’échelle moléculaire aux mesures in vivo. Les études seront réalisées sur des rats adultes mâles et femelles âgés de 8 semaines.
Susceptibilité à l’épilepsie chez deux nouveaux modèles murins génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposée à une température élevée pendant vingt minutes pour provoquer des crises fébriles, ou injectée avec des molécules qui déclenchent des crises d'épilepsie, une partie des 1 240 souris de ce projet subit des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. D'autres reçoivent un implant cérébral sous anesthésie puis vivent seules jusqu'à cinq semaines, avec des enregistrements de dix heures par jour sur quatorze journées consécutives et un suivi vidéo du comportement dont le résumé ne dit pas ce qui y est observé. Le porteur indique que l'induction des crises provoque une fatigue intense et une réduction de la mobilité pendant deux à sept jours, et qu'il arrive que des crises très sévères soient fatales. Il présente par ailleurs l'hébergement en groupe comme respectant la "nature sociale" des souris, l'hébergement individuel n'étant employé que lorsqu'il est "indispensable pour protéger un implant".
Objectifs
Pour fonctionner correctement, le cerveau a besoin d'un équilibre précis entre les signaux qui activent les neurones et ceux qui les freinent. Une protéine spécifique joue un rôle clé dans le maintien de cet équilibre. Lorsque le gène responsable de la fabrication de cette protéine est altéré, les neurones peuvent devenir trop excitables, ce qui peut provoquer des crises d'épilepsie. Des travaux préliminaires menés dans notre laboratoire et par nos collaborateurs ont montré que des souris porteuses d'une anomalie de ce gène - la même que celle découverte chez un enfant atteint d'une forme sévère d'épilepsie - font des crises spontanées à l'âge adulte. Toutefois, ces crises restent rares et nous ne savons pas encore quelles zones du cerveau sont touchées, ni comment elles se déclenchent. Nous étudions également une autre famille de souris chez lesquelles une des deux formes de la protéine que nous étudions a été supprimée. Nos premiers résultats laissent penser que ces souris pourraient, elles aussi, être plus vulnérables aux crises, mais qu'elles pourraient en même temps disposer de défenses naturelles contre l'installation d'une épilepsie durable. Ce projet poursuit donc trois grands objectifs : - Repérer les zones du cerveau impliquées dans les crises chez les souris porteuses de l'anomalie génétique, grâce à une technique qui permet de rendre visibles les neurones actifs au moment d'une crise ; - Mesurer la facilité avec laquelle des crises peuvent être déclenchées dans ces deux lignées de souris génétiquement modifiées, à l'aide de substances utilisées de façon courante en recherche pour provoquer des crises de manière contrôlée ; - Déterminer si la suppression d'une forme de la protéine d’intérêt protège ou non contre le développement d'une épilepsie chronique, en utilisant un modèle expérimental reconnu et proche de ce qui est observé chez les patients. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre comment les anomalies de cette protéine conduisent à l'épilepsie et d'évaluer si elle pourrait représenter une cible pour le développement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
L'épilepsie touche environ 50 millions de personnes dans le monde, et près d'un tiers des patients ne répondent pas correctement aux traitements existants. Parmi les causes identifiées, certaines anomalies génétiques perturbent une protéine clé du cerveau, dont le rôle est de maintenir l'équilibre entre les signaux qui activent les neurones et ceux qui les freinent. Lorsque cet équilibre est rompu, les neurones deviennent trop excitables, ce qui peut déclencher des crises d'épilepsie, parfois sévères et résistantes aux médicaments. Ce projet apportera deux types de bénéfices majeurs : 1) Mieux comprendre l'origine des crises pour mieux les traiter. En identifiant précisément quelles zones du cerveau sont touchées et comment les crises se déclenchent lorsque le gène de la protéine d’intérêt est altéré, ces travaux fourniront des informations essentielles pour concevoir, à terme, des traitements mieux ciblés et plus efficaces pour les patients porteurs de ce type d'anomalie génétique. Actuellement, ces patients disposent de très peu d'options thérapeutiques adaptées à la cause précise de leur maladie. 2) Ouvrir la voie à une nouvelle classe de médicaments. La protéine que nous étudions existe sous deux formes légèrement différentes dans le cerveau. En déterminant si l'une de ces formes peut être ciblée sans affecter l'autre, ce projet permettra d'évaluer la faisabilité d'une approche thérapeutique entièrement nouvelle. Si cette piste se confirme, elle pourrait déboucher sur le développement de médicaments plus sélectifs, avec potentiellement moins d'effets indésirables. Au-delà de l'épilepsie, ces résultats pourraient également bénéficier aux patients atteints d'autres maladies neurologiques dans lesquelles la même protéine ne fonctionne pas correctement, comme certains troubles du développement cérébral ou des douleurs chroniques. En résumé, ce projet vise à transformer des connaissances fondamentales sur les mécanismes de l'épilepsie en pistes concrètes pour le développement de nouveaux traitements, répondant à un besoin médical aujourd'hui largement insatisfait.
Procédures
Afin d’identifier le patrimoine génétique de nos animaux de lignées génétiquement modifiées nous prélèverons un petit fragment de tissu chez tous les souriceaux (animal vigile, une seule fois, durée inférieure à 1 minute). Par la suite, certains animaux se verront administrer une molécule permettant d’activer une modification génétique une fois par jour pendant une durée maximale de 5 jours (vigile, quelques secondes par administration). Ils seront également filmés pendant les 5 jours d’administration (5 jours consécutifs) et hébergés seuls sur cette durée afin de pouvoir les identifier. Une partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Dès cette chirurgie ils seront hébergés seuls (3 semaines maximum). Ils recevront ensuite des injections permettant d’induire le modèle d’épilepsie (vigile, 1 injection, quelques secondes par injection) de même pour un autre lot d’animaux n’ayant pas eu de chirurgie. Tous seront ensuite filmés et enregistrés pour le suivi de leur activité cérébrale (une seule fois, animal vigile, 2h10 environ). Un dernier lot d‘animaux recevra des injections permettant d’induire le modèle d’épilepsie (vigile, 6 injections maximum, quelques secondes par injection), puis après 4 semaines minimum, aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Puis leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur 14 journées consécutives pendant 10h environ par jour. Dès la chirurgie, et lors de ces enregistrements, ces animaux seront hébergés seuls pour une durée de 5 semaines maximum. Un autre lot d'animaux sera exposé à une température élevée pendant 20 minutes maximum afin de provoquer des crises fébriles.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera associé à une légère et brève douleur, ainsi qu’un risque rare de saignement. La modification génétique d’une partie des animaux provoquera des crises d’épilepsie spontanées. Ces épisodes engendrent un stress et une fatigue marqués, pouvant s'accompagner d'une baisse d'activité et d'une perte de poids durant quelques heures à quelques jours. Pour une autre partie des animaux la mutation génétique sera associée à de légères difficultés respiratoires passagères visibles juste à partir de la naissance jusqu’à 5 jours d’âge, ce qui peut être une source de stress pour les petits et la mère. L'induction de crises d'épilepsie provoque une fatigue intense et une réduction de la mobilité pendant 2 à 7 jours. L’injection des molécules pour mettre en place le modèle peut induire des effets périphériques (accélération du pouls, sudation, saignements). Il arrive que des crises très sévères soient fatales pour les animaux. Les injections seront associées à une légère et brève douleur au point d’injection. Les administrations orales peuvent irriter l’œsophage. La chirurgie sera associée à un risque de douleur post-opératoire et de perte de poids transitoire durant les 48 heures suivant l'opération. Le matériel implanté pour enregistrer l’activité cérébrale peut occasionner une gêne physique pour la souris ou, plus rarement, un risque de perte ou d'infection. L’anesthésie générale réalisée pour les chirurgies sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et plus rarement de difficultés cardiaques et respiratoires. L'hyperthermie induite peut engendrer un stress, des convulsions, une perte de conscience et des difficultés respiratoires. Enfin, l'hébergement individuel, rendu nécessaire pour protéger les dispositifs de mesure, peut générer un stress lié à au manque de contact sociaux pour ces animaux habitués à vivre en groupe.
Devenir
L'objectif principal est d'analyser précisément comment certaines mutations génétiques modifient la structure et le fonctionnement des réseaux de neurones. Ces analyses (biochimiques ou microscopiques) nécessitent de prélever le cerveau des animaux après la fin des observations comportementales ou des enregistrements d'activité. Ainsi tous les animaux impliqués dans ces analyses devront être euthanasiés pour répondre à notre question scientifique. Les autres animaux du projet seront euthanasiés car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés dans un autre projet en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Notre projet s'inscrit dans une démarche de recherche de long terme. Avant d’envisager des études sur les animaux, notre équipe a travaillé durant plusieurs années sur des méthodes alternatives. Nous avons ainsi caractérisé les effets des mutations génétiques étudiées au niveau le plus simple : à l’échelle de la molécule et de la cellule. Ces recherches ont été menées sur des cultures de neurones et des modèles cellulaires simplifiés en laboratoire. Bien que riches d'enseignements, ces tests « en tube » ou sur des cellules isolées ne permettent pas de reproduire la complexité d'une pathologie comme l'épilepsie. L’épilepsie n’est pas seulement le dysfonctionnement d’une cellule, mais le résultat d’une activité anormale et synchronisée de milliards de neurones organisés en réseaux complexes, interagissant avec l’ensemble de l'organisme. Pour progresser dans la compréhension de cette maladie et espérer mettre au point de nouveaux traitements, il est aujourd'hui indispensable d'observer ces phénomènes chez un organisme vivant complet. Seul un modèle vivant permet de : - Évaluer précisément la sévérité et le déroulement des crises d'épilepsie. - Analyser comment les structures cérébrales communiquent entre elles lors de ces crises. - Vérifier si les mécanismes observés en cellule se confirment dans un environnement biologique réel et complexe. À ce jour, il n’existe aucune simulation informatique ou culture de tissus suffisamment sophistiquée pour remplacer totalement l'étude de l'activité cérébrale globale liée à l'épilepsie. Le recours aux souris est donc une étape scientifique nécessaire pour valider nos hypothèses et avancer vers des solutions thérapeutiques pour les patients.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été rigoureusement calculé pour chaque expérience (1240 au total). Nous utilisons des méthodes de calcul statistique qui permettent de définir précisément la taille des groupes nécessaire pour que les résultats soient significatifs et indiscutables, tout en veillant à utiliser le nombre d’individus minimum strictement requis. Ce calcul prend également en compte les éventuels aléas techniques afin de garantir la réussite de l'étude sans avoir à la recommencer, ce qui utiliserait davantage d'animaux. Afin de limiter le nombre total de sujets, nous avons conçu nos procédures pour recueillir un maximum d'informations sur chaque individu. Par exemple, une même souris fera l'objet d'observations de son comportement et d'enregistrements de son activité cérébrale. Après l’euthanasie, son cerveau sera systématiquement prélevé pour mener plusieurs types d'analyses microscopiques et biochimiques. Cette approche multi-facette permet d’obtenir une compréhension complète des mécanismes de l'épilepsie sans avoir à créer des groupes d'animaux distincts pour chaque type de mesure. Nous portons une attention particulière à la gestion de nos colonies de souris. Le nombre d’accouplements est strictement planifié et limité en fonction des besoins réels des expériences afin de ne produire que le nombre strictement nécessaire d’animaux.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans un environnement contrôlé (température, cycle de lumière) et enrichi pour favoriser leurs comportements naturels. Elles disposent de matériaux pour construire des nids (carrés de coton) et de bâtonnets à ronger au minimum. L’hébergement en groupe est privilégié pour respecter leur nature sociale, l’hébergement individuel n’étant utilisé que de manière temporaire lorsqu'il est indispensable pour protéger un implant ou assurer un suivi précis. Tous les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise au vétérinaire, à la structure chargée du bien-être animal et à notre équipe pour assurée une prise en charge adaptée pour chaque animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux afin de profiter de la cicatrisation rapide des jeunes animaux. Nos procédures d’induction de la pathologie sont raffinées afin de provoquer le moins possible d’effets indésirables aux animaux et d’assurer la meilleure prise en charge possible. Une surveillance quotidienne est assurée par un personnel qualifié. Pour les procédures induisant une fatigue ou une perte d’appétit (comme après une crise d'épilepsie), des soins de soutien sont mis en place : mise à disposition de nourriture ramollie et d'eau sous forme gélifiée dans le fond de la cage pour faciliter l'alimentation et l'hydratation sans effort. De plus, nous privilégions, chaque fois que possible, l’administration de traitements de manière volontaire (à la pipette) afin de réduire le stress lié aux manipulations. Pour chaque intervention chirurgicale, un protocole strict est appliqué : les animaux sont placés sous anesthésie générale et bénéficient d’une anesthésie locale complémentaire. Des médicaments antidouleur (analgésiques) sont administrés avant l’acte et maintenus pendant au moins 48 heures après la chirurgie. Durant l’opération et le réveil, les animaux sont maintenus au chaud sur des tapis chauffants et reçoivent un gel protecteur pour éviter la sécheresse oculaire. Nous les surveillons spécifiquement après ces gestes pour s’assurer de leur bonne récupération. Des points limites sont définis, ces critères d’alerte précis et quantifiables permettront une prise en charge des animaux pour éviter toute souffrance..
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche sur l'épilepsie, nous avons choisi de travailler exclusivement avec la souris. Ce choix repose sur plusieurs raisons scientifiques et éthiques majeures. La souris est le modèle animal le plus adapté pour étudier les maladies neurologiques humaines comme l'épilepsie pour trois raisons principales : Proximité biologique : Le cerveau de la souris et celui de l'humain partagent une organisation et des mécanismes de communication entre neurones très similaires. Modélisation génétique : C'est l'espèce pour laquelle les outils de modification génétique sont les plus performants. Cela nous permet d'étudier précisément des mutations identiques à celles découvertes chez des patients humains souffrant d'épilepsies sévères du nourrisson. Connaissances accumulées : Notre équipe possède une expertise de plusieurs années sur ces lignées de souris, ce qui garantit la fiabilité des résultats et une parfaite maîtrise des soins à leur apporter. Les expériences sont réalisées sur des animaux à différents stades de leur vie, choisis précisément en fonction des objectifs scientifiques : Phase précoce (10 jours) : Un test de suscpetibilité aux crises sera effectué à ce stade afin de déterminer si une susceptibilité précoce existe. Phase juvénile et adulte (à partir d'un mois) : La majorité des tests de susceptibilité aux crises et les enregistrements de l'activité cérébrale sont effectués sur des souris âgées de 1 à 2 mois. Ce stade est crucial car il permet d'étudier le cerveau avant ou au tout début de l'apparition des premières crises spontanées, afin de comprendre comment la maladie s'installe. Suivi à long terme : Certains groupes sont suivis jusqu'à l'âge de 4 mois ou plus pour caractériser l'évolution de l'épilepsie vers une forme chronique, ce qui reflète la réalité de la pathologie chez les patients. Stades précoces (nouveau-nés) : L'étude inclut également une surveillance dès la naissance pour certaines lignées présentant des particularités respiratoires transitoires, afin de comprendre l'impact de ces mutations sur le développement très précoce du système nerveux. Ce choix de stades de développement permet de couvrir l'ensemble du cycle de la maladie, depuis les premières anomalies cellulaires jusqu'à l'installation d'une épilepsie durable, tout en limitant la durée des procédures au strict nécessaire pour obtenir des réponses scientifiques valables.
Remodelage des cartes du cortex moteur après déafférentaion vestibulaire chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Une solution chimique injectée à travers le tympan sous anesthésie lèse leur système vestibulaire, puis une électrode est implantée dans le cortex moteur après prélèvement d'un volet osseux de 5 mm sur 5 mm : 240 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. La cartographie du cortex moteur dure de cinq à six heures sous anesthésie générale, la lésion vestibulaire de quarante à quatre-vingt-dix minutes. L'objectif déclaré est de caractériser les remaniements du cortex moteur après une perte d'équilibre, une question que le porteur présente comme encore inexplorée. Les tests comportementaux reviennent à neuf reprises entre le premier et le trentième jour, quinze minutes par session, sans que le résumé précise lesquels.
Objectifs
Le sens de l'équilibre est basé sur un ensemble de capteurs localisés dans l'oreille interne, qui constituent le système vestibulaire. Dans ce projet, nous allons réaliser une lésion du système vestibulaire chez le rat, un modèle animal représentatif de la pathologie vestibulaire chez le patient. Il représente un outil expérimental particulièrement pertinent, car il reproduit de manière fiable plusieurs caractéristiques observées chez les patients avec une atteinte vestibulaire périphérique (vertiges, déficits de la posture et de la locomotion). Il existe de fortes interactions anatomiques et fonctionnelles entre les systèmes vestibulaire et moteur. Nous allons étudier, au niveau d’une zone cérébrale qui contrôle les mouvements volontaires (cortex moteur primaire), les modifications cérébrales induites par une lésion vestibulaire contrôlée et reproductible. Les informations vestibulaires contribuent en permanence au contrôle de la posture, à la planification des mouvements et à l'adaptation motrice. Une altération durable de ces informations est donc susceptible d'induire des changements au sein des réseaux neuronaux impliqués dans le contrôle moteur. Pourtant, à ce jour, aucune étude n'a caractérisé les conséquences d'une lésion vestibulaire sur le cortex moteur. L'étude proposée répond ainsi à une question scientifique originale et encore inexplorée. Nous faisons l'hypothèse qu'une lésion vestibulaire périphérique induit des remaniements significatifs du cortex moteur, reflétant des mécanismes de plasticité neuronale destinés à compenser la perte des informations vestibulaires. Ainsi, identifier ces modifications permettra de mieux comprendre comment le cerveau s'adapte à une perte vestibulaire et de déterminer plus spécifiquement le rôle du cortex moteur dans les processus de récupération fonctionnelle.
Bénéfices attendus
En France, les déficits vestibulaires représentent 5% des urgences à l’hôpital et 300 000 consultations par semaine. La perte de l’équilibre constitue un vrai handicap sensoriel et moteur et les déficits vestibulaires affectent grandement la vie quotidienne des patients. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la compensation vestibulaire restent en partie méconnus, notamment dans les zones cérébrales motrices qui nous intéressent dans ce projet. Les résultats attendus pourraient contribuer à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'optimisation des stratégies de rééducation vestibulaire. Une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans la compensation vestibulaire pourrait, à terme, favoriser le développement d'approches innovantes visant à améliorer la récupération motrice et l'autonomie des patients atteints de vestibulopathies périphériques.
Procédures
- Lésion vestibulaire : Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la locomotion) : de 40 à 90 min. - Tests comportementaux à J1, J2, J3, J4, J7, J10, J15, J21 et J30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. - prélèvement d'un volet osseux (5 mm x 5 mm) sous anesthésie générale pour l'implantation d'une électrode dans le cortex moteur permettant la réalisation ultérieure de la cartographie : 1 heure - Cartographie du cortex moteur (sous anesthésie générale) - stimulation cérébrale et enregistrements des mouvements de la patte postérieure (durée de cette cartographie : 5 à 6h) - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale pour prélever le cerveau : 30mn.
Impact sur les animaux
Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids attendue chez les animaux les premiers jours après la lésion vestibulaire (environ 5 à 10%). L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10 min). Lors de la lésion vestibulaire et des enregistrements cérébraux, les animaux sont sous anesthésie générale, 40 à 90 min pour la lésion vestibulaire, 5 à 6 h pour la cartographie électrophysiologique à la suite de laquelle les animaux seront très profondément anesthésiés avant leur perfusion qui permettra le prélèvement du cerveau.
Devenir
La totalité des animaux du projet (n=240 ; 7 groupes) feront l'objet une perfusion intracardiaque afin de prélever le cerveau pour des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Les objectifs même de cette étude, axés sur la compréhension des mécanismes de plasticité mis en jeu après une déafférentation vestibulaire et leur corrélation avec la récupération fonctionnelle nécessitent le recours à des animaux. En effet, nos questionnements impliquent des approches invasives in vivo qui permettent une résolution spatiale et temporelle des changements corticaux qui ne peuvent être obtenues par une exploration fonctionnelle chez l’homme, ni par des méthodes in vitro ou in silico. L’utilisation de rats est donc nécessaire et incontournable et n'est pas remplaçable par d’autres modèles alternatifs.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été fixé au regard de la littérature sur le remodelage des cartes corticales à n=10/groupe/sexe. Une perte de 20% maximum est envisagée (mauvaise diffusion de la solution chimique à travers le tympan lors de la lésion, défaillance physiologique de l’animal lors de la cartographie corticale, problèmes techniques -parasitage des signaux électrophysiologiques cérébraux…-). Cela nous amène à fixer le nombre de rats par groupe à n=12/groupe/sexe.
Raffinement
Une médication adaptée (anesthésiques, analgésiques) sera mise en œuvre pour éviter toute douleur ou souffrance des animaux. Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire la lésion vestibulaire, les animaux seront sous anesthésie générale. La température de l’animal sera maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution sera appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil, une solution hydratante sera injectée pour compenser les pertes liquidiennes lié à la chirurgie. Les biberons des cages seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. Le suivi de poids, ainsi que l’évaluation de l’apparence et du comportement des animaux (réalisée avec une grille de score adaptée pour reconnaitre les points limites et actions à entreprendre, mais également les points d’arrêts de l’expérimentation) seront effectués quotidiennement durant la première semaine, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin des tests comportementaux. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) sera donnée aux animaux après les tests comportementaux. Lors de la cartographie motrice réalisée sous anesthésie générale, l’hydratation de l’animal sera maintenue et renouvelée toute les heures grâce à une solution injectable. Une solution sera appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire et la température de l’animal sera maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée. Tout au long de la procédure chirurgicale, des points limites seront définis visant à éviter, réduire ou supprimer la douleur ou la souffrance de l’animal. Une fois les enregistrements cérébraux terminés, les animaux seront de nouveau anesthésiés profondément avant de réaliser une perfusion intracardiaque et de prélever leur cerveau. En ce qui concerne les conditions d’hébergement, et selon les nouvelles directives européennes, en plus d’un accès libre à l’eau de boisson et à la nourriture, de la litière à base de frisure de papier sera disposée dans les cages et renouvelée lors de chaque change. Les animaux seront hébergés par deux dans des cages transparentes afin de conserver une communication visuelle, auditive et olfactive avec les autres animaux de la pièce d'hébergement.
Choix des espèces
Les études antérieures dans le domaine de la plasticité post-lésionnelle du cortex cérébral ont été menées chez l’humain, le primate non-humain et, majoritairement, chez le rat. Par ailleurs, les études développées dans le laboratoire sur la plasticité corticale ont été réalisées chez le rat avec des approches électrophysiologiques, immunohistochimiques et comportementales. Les études du laboratoire dans ce domaine constituent des études de référence importantes pour la comprehension des mécanismes de la compensation vestibulaire. De même, les tests comportementaux visant à évaluer les déficits vestibulaires et leur récupération sont bien standardisés dans les études conduites chez le rat et sont maîtrisés dans notre laboratoire. Cette étude sera réalisée chez le rat adulte. Les animaux seront âgés d'au moins 3 mois, âge auquel le système nerveux est considéré comme mature. Selon les courbes de poids fournies par Charles River, le poids des rats mâles sera compris entre 300 et 350 g, tandis que celui des femelles sera compris entre 200 et 250 g au début des expérimentations.
Etude de l’efficacité de vaccins antivarioliques contre le virus cowpox à court et long terme dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 786 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Le protocole prévoit une ou deux injections d'un vaccin candidat, jusqu'à six prélèvements sanguins sous sédation, et pour une partie d'entre elles une inoculation intranasale du virus cowpox sous anesthésie. L'infection peut provoquer une perte de poids, de la prostration, un affaissement de la paupière, des difficultés respiratoires et des lésions cutanées, et le porteur indique qu'elle peut aussi entraîner la mort, généralement entre le septième et le neuvième jour. Sur le remplacement, il écrit qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les réponses immunitaires "à l'échelle d'un organisme entier".
Objectifs
La variole, l’un des plus gros fléaux qu’ait connu l’humanité, est causée par le virus de la variole, un virus du genre Orthopoxvirus (OPXV). Déclarée éradiquée par l’OMS en 1980 après des campagnes de vaccination massives, on craint sa résurgence, naturelle notamment par la fonte du permafrost ou d’origine intentionnelle. Les vaccins antivarioliques dits de 1ère génération présentent des effets secondaires importants et les rendent inadaptés aux patients fragiles. Ceux de 3ème génération sont plus sûrs, mais leur efficacité contre le virus de la variole reste inconnue chez l’homme et leur production n’est pas assurée en France. Le besoin de développement de nouveaux vaccins sûrs, efficaces, faciles et rapides à produire contre les OPXV est à l’origine d’un projet collaboratif européen visant à garantir une indépendance durable vis-à-vis des ressources extra-européennes. L’objectif est de concevoir des vaccins innovants basés sur différentes technologies : sous forme de vaccin vivant atténué ou à partir de fragment du virus (vaccin protéique, à ARN messager ou intégrés dans un vecteur viral inoffensif, comme le vaccin contre la rougeole). Ces vaccins candidats seront testés dans un modèle préclinique et leurs efficacités seront comparées avec le vaccin antivariolique de 1ère et de 3ème génération contre un OPXV. Nous aurons recours à un modèle murin infecté par le virus cowpox, comme modèle d’infection expérimental des OPXV. Ce dernier peut induire une pathologie chez la souris similaire à celle observée chez un patient ayant contracté la variole, ce qui en fait un bon modèle pour tester l’efficacité des vaccins. Les objectifs sont les suivants: -Comparer l’immunogénicité et l’efficacité des vaccins antivarioliques à court et long terme contre le virus cowpox en modèle murin. -Etablir les corrélats de protection contre le virus cowpox conférés par les vaccins candidats : identifier un ou plusieurs paramètres biologiques (quantité d’anticorps ou quantité de cellules immunitaires) après vaccination capable de réduire la sévérité des symptômes lors d’une infection par le virus cowpox en modèle murin.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet permettront à terme 1) d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats vaccins contre les OPXV dans un modèle préclinique et 2) d’acquérir des données préliminaires permettant de consolider l’étude de l’efficacité d’un vaccin en cours de développement en phase clinique, où l’analyse des corrélats de protection chez l’homme est fortement recommandée par l’Agence européenne des médicaments.
Procédures
Pour les immunisations, les interventions sont légères : les animaux seront sédatés puis immunisés avec un des candidats vaccins du projet à une ou deux injections espacées de quatre semaines par différentes voies d’inoculation en fonction du type de vaccin. Cette dernière technique a été historiquement employée lors des campagnes de vaccination antivariolique. L’ensemble des interventions dureront maximum 5 minutes par animal. La réponse des animaux aux différents vaccins, sera suivie grâce à des prélèvements sanguins (6 maximum), réalisés sur animaux sédatés. Un prélèvement sanguin en fin d’étude sera réalisé sur animaux sédatés également. L’ensemble des interventions dureront maximum 5 minutes par animal. Pour étudier la réponse immunitaire, des transferts d’anticorps ou de cellules seront réalisés sur animal vigile et dureront maximum 3 minutes par animal. Pour les infections par le virus cowpox,. Ils seront anesthésiés avant l’inoculation intranasale d’une solution contenant le virus. L’ensemble des interventions durera maximum 10 minutes par animal. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins peuvent présenter un inconfort de courte durée lors du prélèvement lié à la contention. La ponction peut occasionnellement entrainer la formation d’une croûte au niveau du site de prélèvement, sans conséquence notable sur l’animal. Le modèle d’infection par le virus cowpox dans le modèle murin a été établi précédemment dans la littérature et a permis l’évaluation de candidats vaccins antivarioliques. L’inoculation d’une solution entraîne une gêne des voies aériennes non douloureuse et très passagère (quelques secondes). Les animaux infectés par le le virus cowpox peuvent présenter une perte de poids, une baisse de l’activité, de la prostration ainsi qu’un affaissement de la paupière. On peut également observer des difficultés respiratoires et des lésions cutanées. L’infection par cette souche virale peut également entraîner la mort de l’animal (généralement entre le 7ème et 9ème jour post-infection).
Devenir
Les procédures comprennent des prélèvements post mortem de plusieurs organes pour conduire des analyses des réponses cellulaires et de titre viral. À l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés pour réaliser ces prélèvements.
Remplacement
L’évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin dans un modèle préclinique est une étape incontournable dans le processus de développement d’un vaccin. A ce jour, il n’existe pas de modèle de cultures cellulaires in vitro permettant de récapituler à l’échelle d’un organisme entier les réponses immunitaires et la protection face à une infection virale.
Réduction
Avec l’appui des données dans la littérature utilisant un vaccin sous-unitaire antivariolique, le nombre d’animaux nécessaires par groupe est calculé pour avoir un effectif minimum suffisant permettant une analyse statistique significative entre deux traitements différents. Pour les tests d’immunogénicité et d’efficacité, il nous faudrait disposer d’au moins 6 et 7 animaux par groupe, respectivement. Compte tenu du risque de mortalité lié à des aléas extérieurs, nous estimons nécessaire d’augmenter les effectifs de chaque groupe infecté d’un1 individu.
Raffinement
À leur arrivée, les souris passeront par une phase d’acclimatation de deux semaines. Elles seront identifiées Une semaine d’acclimatation supplémentaire sera réalisée après le puçage. Les souris seront hébergées en groupe sociaux stables dans des cages respectant les conditions réglementaires. De plus, les animaux disposeront d’un espace suffisant et complexe leur permettant d’exprimer un comportement normal. L’introduction de boules de coton, d’igloos en carton, de blocs de bois, de tubes en carton et quelques grains autoclavés sont généralement dispersés au sein de la cage afin de limiter le stress le plus possible. Pour les prélèvements sanguins et les immunisations, tous les animaux d’une même cage seront traités de la même manière au même moment. Avant chaque intervention, une sédation sera appliquée. Une anesthésie locale sera appliquée en complément pour certaines procédures. Pour les instillations intranasales du virus cowpox, les animaux seront anesthésiés avant son inoculation. Après anesthésie, le réveil des animaux sera contrôlé et ils seront replacés dans les cages uniquement lorsqu’ils seront parfaitement réveillés et mobiles. Des grilles de scoring permettront d’évaluer cliniquement l’état de l’animal tout au long de ce protocole expérimental et de définir la démarche à suivre pour circonscrire toutes éventuelles altérations de celui-ci.
Choix des espèces
L’évaluation d’un nouveau vaccin antivariolique ne peut pas être prouvée chez l’homme par des études cliniques en raison de l’éradication de la variole. Pour évaluer l’efficacité d’un vaccin antivariolique à spectre large contre les OPXV, l’infection expérimentale par un virus de la famille du genre Orthopoxvirus dans un modèle mammifère est le seul moyen permettant d’évaluer la protection conférée par un vaccin à l’échelle d’un organisme entier. La souris est un modèle pertinent pour évaluer les réponses immunitaires et l’efficacité conférées des vaccins antivarioliques. En effet, celle-ci est sensible à l’infection par le virus cowpox, un orthopoxvirus, et récapitule certains signes cliniques et symptômes observés chez des patients infectés par le virus de la variole. De plus, les réponses immunes spécifiques suite à l’infection par le virus cowpox par voie intranasale ont été caractérisées. Ainsi, le même modèle murin sera employé pour réaliser les essais dans ce projet. Nous commencerons le suivi après une semaine d’acclimatation soit à 6 semaines de vie des animaux correspondant à des souris au début de l’âge adulte, ayant atteint leur maturité sexuelle.
MODIFICATION_Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
115 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur abdomen est ouvert sur cinq à six millimètres pour implanter dans leur prostate des cellules de cancer prostatique humain, puis rouvert par la même voie pour appliquer pendant 120 secondes une torche à plasma froid, censée détruire les cellules restées en place après ablation de la tumeur chez les patients. Celles du groupe témoin servant au suivi de la survie seront menées jusqu'aux points limites, c'est-à-dire laissées se dégrader jusqu'au seuil qui déclenche leur mise à mort. Le porteur écrit que la réponse au plasma froid sur le site d'implantation "reste inconnue", tout en qualifiant la souris de "modèle préclinique incontournable" pour valider cette technique.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitement par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal. Cette demande étant une extension d'une DAP précédemment déposée permettant d'inclure une modification des sites de conduites des expérimentations ainsi que d'une activité de reproduction. Les premières expérimentations faites avec la torche à plasma n'ont pas montrer d'effets inflammatoires ni d'effets indésirables. MODIFICATION Il est à noter que le lot control pour le suivi de la survie, les animaux seront amenés jusqu'aù points limites.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.
Réduction
MODIFICATION Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 115 animaux seront utilisés au total. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué.
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture que notre groupe a déjà publier (article disponible sur demande). Nous utiliserons des individus de 2 à 5 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.