Procédures sévères
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 500 souris sont utilisées sur trois ans pour 465 études précliniques, soit 100 à 400 souris par molécule testée, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont sensibilisées à des allergènes puis soumises à une épreuve qui peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, certaines lignées étant humanisées par greffe de cellules humaines. 12 400 sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général" après avoir reçu des candidats médicaments, et 2 100 passent au projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite d'en commander pour la formation. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation venant des études des années antérieures et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 500 souris seront utilisées, couvrant une période de [MODIFICATION] 3 ans, permettant de réaliser 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Effets d’une combinaison thérapeutique : Stimulation magnétique trans-spinale répétitive et rééducation locomotrice dans le cadre des lésions médullaires traumatiques.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À J0, 100 des 120 souris femelles subissent une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, puis, sept jours plus tard, deux semaines de stimulation magnétique pour quarante d'entre elles et quatre semaines de tapis roulant, deux fois dix minutes par jour, pour quarante autres. Toutes passent huit sessions de tests comportementaux, champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant, d'environ 45 minutes chacune, reçoivent des injections de traceurs au cours d'une chirurgie de 50 minutes, et sont mises à mort à J42 pour prélever la moelle et l'encéphale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et visent à savoir si la combinaison des deux traitements améliore la récupération motrice plus que chacun pris séparément. Sur les atteintes subies, le résumé tient en deux lignes, "Paralysie des membres postérieurs" et "Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s'abreuver après le réveil", pour une lésion médullaire suivie pendant six semaines.
Objectifs
La moelle épinière joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du système nerveux central. Elle permet la transmission des informations entre le cerveau et le reste du corps. Lorsqu’elle est lésée, les conséquences peuvent être majeures, entraînant une perte partielle ou totale de fonctions en dessous du niveau de la lésion. Ces lésions représentent ainsi des atteintes neurologiques graves, responsables de handicaps importants et durables pour les patients. La rééducation locomotrice constitue actuellement l’une des principales approches utilisées pour favoriser la récupération fonctionnelle. Toutefois, les améliorations obtenues restent souvent limitées. Dans ce contexte, de nouvelles approches capables de renforcer ces mécanismes de récupération sont activement recherchées. Parmi les stratégies prometteuses figure la stimulation magnétique trans-spinale répétitive, une technique non invasive et non douloureuse. Nous émettons l’hypothèse que la combinaison de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice pourrait permettre d’améliorer davantage la récupération motrice que chacune de ces approches utilisées séparément. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de ces stratégies thérapeutiques combinées chez la souris.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet permettra de mieux caractériser les effets combinés de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice sur la récupération fonctionnelle après lésion traumatique de la moelle épinière. Si les effets observés dans ce projet confirment son potentiel thérapeutique, cette approche pourrait constituer une stratégie intéressante pour améliorer la récupération fonctionnelle des patients après lésion médullaire, notamment en complément des protocoles de rééducation actuellement utilisés.
Procédures
120 souris femelles agées de 8 semaines seront utilisées. • Sur celles-ci, à l’exception du groupe control sans lésion, soit 100 souris, sera réalisée, à J0, une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 30 min. • L’ensemble des souris, soit 120 souris, réalisera des tests comportementaux (champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant), aux jours -7, 1, 7, 14, 21, 28, 35 et 42 post chirurgie. La réalisation de ces tests représentera un temps d’environ 45 minutes par souris et par session. • 7 jours après la lésion et ce pendant 14 jours, sous anesthésie générale, un tiers des souris (soit 40 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). • 7 jours après la lésion et ce pendant 28 jours, sur un tiers des souris (soit 40 souris), sera mis en place un protocole de rééducation par tapis roulant. Chacune de ces souris sera entrainée deux fois 10 minutes par jour à raison de cinq jours d’entrainement par semaine. • L’ensemble des animaux (120 souris), sous anesthésie générale, recevra des injections de traceurs rétrogrades au niveau de la moelle lombaire, en dessous du site de lésion. Cette chirurgie sera réalisée en 50 minutes. • L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié, 42 jours après la lésion afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
- Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le réveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (42 jours après la lésion médullaire) afin de procéder aux prélèvements de la moelle et de l’encéphale.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécessaire pour mesurer les effets de ces traitements après lésion médullaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des données issues des études précédemment réalisées dans notre laboratoire ainsi que de la variabilité observée pour les paramètres comportementaux étudiés. Les analyses comportementales nécessitent un effectif de 20 animaux par groupe afin de permettre la mise en évidence de différences significatives entre groupes à l’aide de tests statistiques adaptés (test de Mann-Whitney). Par ailleurs, les analyses histologiques seront réalisées en post-mortem sur un sous-groupe de 10 animaux issus de cet effectif de 20 animaux, nous affranchissant ainsi du recours à un lot supplémentaire d’animaux dédié à ces analyses. Cette stratégie permet d'obtenir la puissance statistique nécessaire tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie et tapis chauffant, et des points-limites adaptés à l’étude seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux effets combinés de deux thérapies dans le cadre des lésions médullaires. Les études préalablement réalisées l’ont été chez la souris. De ce fait, il est important de continuer ces travaux chez la souris. Les lésions médullaires chez l’Homme concerne en premier lieu le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Afin de répondre aux exigences réglementaires de contrôle de qualité de vaccins vétérinaires bénéficiant d’une AMM, ce projet vise à confirmer l’activité de formulations vaccinales destinées aux porcs, au moyen de procédures de classe de gravité sévère.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Les porcs témoins, qui ne reçoivent pas le vaccin, développent hyperthermie, anorexie, diarrhée suivie de méléna, amaigrissement, vomissements, ataxie et prostration après injection d'une souche virulente. 400 porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, à un âge de six à sept semaines pour l'épreuve de peste porcine classique. Ces épreuves servent à libérer des lots de vaccins vétérinaires déjà autorisés, la Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires demandant des tests sur des animaux non-humains pour l'autorisation de mise sur le marché. Après avoir énuméré ces symptômes, le porteur conclut que "Ces tests garantissent la sûreté, l'efficacité et la qualité du produit pour les animaux".
Objectifs
Afin d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires dans la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce projet vise à déterminer l’activité de vaccins destinés à des porcs. Les contrôles d’activité par épreuve se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche (les porcs vaccinés sont protégés). Ils sont effectués sur espèce cible. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats, certains obtenus sur l’animal. Ces tests permettent la libération de milliers de vaccins pour porcs par an.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la libération de milliers de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs.
Procédures
2 administrations sont prévues pour tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute 1 prélèvement sanguin est prévu sur tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute
Impact sur les animaux
Les témoins montrent les symptômes liés à la maladie infectieuse testée. Les dommages liés au test sont une souffrance pour les animaux témoins et une douleur légère avec une augmentation du stress due à des prélèvements, aux injections et aux manipulations. Chez les témoins, les symptômes les plus courants observés dans le cadre de ces tests sont l'hyperthermie, l’anorexie, la diarrhée suivie de méléna, un amaigrissement, des vomissements, des troubles nerveux (ataxie et agressivité) et une prostration. Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux.
Devenir
Les animaux non protégés sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements post-mortem. Tous les autres animaux sont euthanasiés du fait de l'injection d'une souche virulente
Remplacement
La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays tiers destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour l’AMM. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est imposé par la réglementation des pays. La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation de groupes témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont définis. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les porcs sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Les porcs disposent de morceaux de chaînes, de bouts de tuyaux dans leur box pour pouvoir s’occuper. Il est aussi possible de mettre à disposition des jouets à macher et des balles. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce choix résulte du fait que ce soit l’espèce cible. Les porcs doivent avoir entre 6 et 7 semaines pour le contrôle d’activité par épreuve de la peste porcine classique. Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
MODIFICATION Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris dont le score clinique atteint un seuil jugé critique sont mises à mort avant la fin de l'étude, le porteur écartant les analgésiques au motif qu'ils "modifient la réponse immune étudiée". 5 200 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un allergène alimentaire, arachide ou œuf, jusqu'à quatre fois pour les sensibiliser, puis subissent une épreuve allergique par voie orale, cutanée ou respiratoire, dont les effets déclarés vont jusqu'aux signes neurologiques et aux troubles respiratoires. Une partie sert de donneuse de cellules immunitaires ou de sérum à des souris receveuses déjà sensibilisées, l'ensemble visant l'essai clinique puis la mise sur le marché de préparations vaccinales.
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 3 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène. ---------------- AJOUT :3/ Comprendre et documenter le mécanisme d’action d’un vaccin thérapeutique en opérant le transfert de populations de cellules immunitaires ou sérum d’une souris dite « donneuse », qui aura reçu préalablement le candidat vaccin ou un « placebo », vers une souris dite « receveuse », laquelle aura préalablement été sensibilisée à un allergène alimentaire (ex l’arachide, œufs...) La souris « receveuse » sera alors éprouvée par cet allergène. La réaction allergique sera monitorée et la réponse immunitaire sera analysée ex vivo. Il est attendu que le transfert de certaines cellules immunitaires ou sérum de la souris donneuse permettrait à la souris receveuse sensibilisée de ne pas développer de manifestations cliniques allergiques à la suite d’une épreuve.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin tolérogène. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde. ---------------------------------- AJOUT : Le développement de candidats vaccins tolérogènes constituerait une avancée majeure dans la lutte contre l’augmentation continue de la prévalence des allergies alimentaires. À terme, ces approches innovantes pourraient améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en réduisant le risque de réactions allergiques sévères, voire potentiellement mortelles, à l’échelle mondiale.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). ---------------AJOUT / L’injection de cellules ou sérum par voie intraveineuse génère des signes cliniques légers FIN.-------------- Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). ------------AJOUT Ces signes seront surtout attendus dans les groupes de souris qui ne seront pas vacciné ou encore dans le cadre ayant reçu les cellules ou le sérum des souris « placebo ». FIN ---------------------Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Lésion médullaire et régulation de la pression artérielle : rôle du segment thoracique 2 et modulation sérotoninergique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
33 rates subissent une lésion chirurgicale de la moelle épinière et présenteront une paralysie des pattes arrière, parfois des épaules au bas du corps, avec une vessie vidée à la main chaque jour. 88 rates en tout sont utilisées, 25 anesthésiées environ 4 h 30 sans jamais se réveiller, les 30 dernières opérées deux fois puis hébergées seules et sans enrichissement pendant 48 heures, isolées encore cinq jours, et placées chaque semaine sur un tapis roulant pour mesurer la reprise de la marche. Le niveau de souffrance déclaré est sévère, et toutes sont mises à mort pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur cherche à savoir comment la position de la lésion modifie la pression artérielle dans les heures et le jour qui suivent, et clôt les bénéfices attendus sur une phrase, "Les bénéfices sont à long termes".
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière représentent un problème majeur de santé publique. Au-delà des paralysies et des pertes sensorielles bien connues, elles entraînent souvent de graves troubles du fonctionnement automatique de l’organisme, en particulier au niveau cardiovasculaire. Les patients peuvent ainsi présenter des anomalies de la pression artérielle et du rythme cardiaque, des difficultés de régulation de la température corporelle ou des troubles urinaires et digestifs. Chez les personnes atteintes d’une lésion à la moelle épinière au-dessus de la 6ᵉ vertèbre thoracique, ces complications cardiovasculaires sont particulièrement sévères et constituent une cause majeure de mortalité. Tout de suite après la lésion, la chute importante de la pression artérielle associée à un ralentissement du cœur, représente un risque vital immédiat. Si les mécanismes d’adaptation qui apparaissent à long terme sont aujourd’hui mieux compris, les premières heures et les premiers jours après la lésion restent encore peu étudiés, alors qu’ils sont déterminants pour la survie et le pronostic des patients. Certaines régions de la moelle épinière jouent un rôle clé dans le contrôle cardiovasculaire. La zone de la moelle épinière lésée joue un rôle prépondérant dans les symptômes observés chez les patients et dans la capacité des traitements pharmacologiques à être efficaces. Ce projet vise à comprendre comment la position d’une lésion de la moelle épinière peut modifier la pression artérielle chez le rat, immédiatement après la blessure et le lendemain, et à identifier les régions de la moelle qui sont importantes pour réguler le cœur et la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche a pour but d’approfondir nos connaissances sur les problèmes cardiovasculaires qui surviennent après une lésion de la moelle épinière, notamment au niveau des vertèbres cervicales ou thoraciques hautes. L’objectif est aussi d’étudier comment des médicaments agissant directement sur la moelle épinière pourraient atténuer ces troubles. Même si cette étude est avant tout fondamentale, les résultats obtenus pourraient, à terme, ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et aider à mieux soigner les patients atteints de lésions médullaires, en améliorant la prise en charge de leurs troubles autonomes. Les bénéfices sont à long termes.
Procédures
25 animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse pendant environ 4h30 sans se réveiller de cette chirurgie (animaux non vigile). 33 animaux subiront une lésion médullaire. La chirurgie de la lésion durera environ 40 minutes. Ces animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement (animaux paralysés vigiles pendant 24h puis enregistrement sur animaux non vigiles). 30 animaux seront soumis à 2 chirurgies successives de maximum 1h chacune. Ils seront soumis ensuite à un hébergement individuel sans enrichissement pendant 48h pour permettre leur traitement post-lésionnel, puis encore 5 jours pour suivre leur reprise de la fonction digestive (reprise spontanée). 15 jours après la 2ème chirurgie, ils seront soumis à un test de score moteur pour évaluer la reprise de la marche (marche sur un tapis roulant afin d’évaluer la récupération locomotrice des pattes arrière grâce à notre molécule test) de 3 à 5 minutes sur un tapis roulant toutes les semaines pendant 4 semaines. Ces mêmes rats seront injectés quotidiennement (moins d’une minute) en sous-cutanée et sous lésionnel (traitement chronique) (animaux paralysés vigiles pendant 28 jours).
Impact sur les animaux
Des animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Cette paralysie entrainera un stress lié à leur condition pendant 3 à 4 jours, le temps de s’adapter à leur environnement. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement et pourra engendrer un stress transitoire de quelques minutes. Pendant 2 jours post-lésionnel, ils seront placés en hébergement individuel sans enrichissement pouvant induire de l’inconfort. Après la réintroduction de l’enrichissement, ils resteront isolés 5 jours maintenant le stress de la séparation avec un congénère. Toutes les semaines pendant 5 minutes les animaux subiront un stress car ils seront placés sur un tapis roulant pour évaluer leur marche
Devenir
Les animaux seront prélevés post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les troubles cardiovasculaires qui apparaissent après une lésion de la moelle épinière. La régulation de la pression artérielle et du rythme cardiaque repose sur des interactions complexes qui se désorganisent profondément suite à une lésion médullaire. Sans données expérimentales obtenues directement sur des modèles animaux, il est impossible de créer des modèles informatiques précis ou d'évaluer l'effet de médicaments ciblant ces circuits. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour atteindre les objectifs de cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour permettre des analyses statistiques robustes et se base sur le n des lots enregistrés dans le précédent projet. Par ailleurs, une pré-étude exploratoire sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux afin d’évaluer la pertinence du traitement pharmacologique en fonction du niveau de lésion. Cette approche permettra de cibler le niveau lésionnel le plus pertinent et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les interventions chirurgicales et les soins réalisés s’appuient sur l’expérience de l’équipe avec ce modèle de lésion de la moelle épinière, ainsi que sur les recommandations publiées par d’autres équipes spécialisées. L’ensemble du protocole a été validé par l’équipe vétérinaire du site, et des ajustements ont été mis en place au fur et à mesure des difficultés rencontrées, toujours en concertation avec le vétérinaire. Les animaux seront opérés sous anesthésie générale par inhalation. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés pendant et après l’intervention, en combinant plusieurs types d’antalgiques, et seront poursuivis pendant au moins trois jours afin de limiter l’inconfort. Après la lésion, l’environnement des animaux sera spécialement adapté : accès facilité à l’eau et à la nourriture, revêtements antidérapants pour aider aux déplacements, et alimentation liquide pendant les premiers jours afin de prévenir les troubles digestifs. Lorsque les animaux ne peuvent pas uriner seuls, la vessie sera vidée manuellement plusieurs fois par jour, et un traitement antibiotique sera administré pour prévenir les infections. Des critères d’arrêt stricts, définis avec l’équipe vétérinaire, seront appliqués tout au long de l’étude afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle dont la physiologique reste malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière suite à une lésion. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets, correspondant à des rats femelles âgés de 6 à 7 semaines au moment de l’implantation, et donc de 8 à 9 semaines au moment de la lésion.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par le métapneumovirus humain (hMPV) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par le métapneumovirus humain, 1 350 souris développent une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires que le porteur annonce comme attendues, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Elles subissent des gavages, des injections intramusculaires, intranasales et rétro-orbitaires, ces dernières pouvant provoquer un saignement autour de l'œil, ainsi qu'une vaccination par électroporation susceptible d'entraîner un problème de mobilité. Aucun anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur expliquant que ces molécules "pourraient interférer avec nos résultats". Le nombre de souris par procédure n'est pas donné, renvoyé au protocole, et la mesure de la respiration peut immobiliser chaque souris jusqu'à trois heures sans que sa fréquence soit précisée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal la modélisation, la caractérisation et l’utilisation de modèles murins précliniques pour l’étude des infections par le métapneumovirus humain (hMPV), incluant les différentes souches virales, dans le but de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer de nouvelles stratégies de traitements. Plus précisément, les objectifs sont les suivants : (1) Développement et validation de modèles murins d’infection par le hMPV : -Utiliser des lignées murines sensibles à l’infection afin de reproduire les différentes formes cliniques de la maladie ou réaliser de l’adaptation virale chez nos modèles murins, -Evaluer le mécanisme de l’infection, la multiplication ainsi que la répartition du virus dans les tissus. (2) Caractérisation des réponses immunitaires : -Etudier la réponse immunitaire et inflammatoire induite par le virus, notamment dans les poumons et autres organes (système nerveux central, intestin, ORL, foie), -Identifier les paramètres associés aux formes plus sévères ou prolongées de la maladie. (3) Evaluation de vaccins ou traitements candidats : -Tester l’efficacité de nouvelles molécules antivirales, modifiant le système immunitaire ou encore de vaccins pour limiter la quantité de virus, réduire les symptômes et prévenir les complications, -Etudier les mécanismes d’action des ces traitements in vivo. (4) Application des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) : -Effectuer une analyse à grande échelle préalable des molécules sur des modèles cellulaires pour réduire l’utilisation d’animaux, -Optimiser les plans expérimentaux pour minimiser le nombre d’animaux et réduire leur inconfort.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les hPMV et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par le muscle, - Par le nez, - Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. L’acquisition comprendra entre 5 minutes et 1h d’adaptation permettant à la souris de stabiliser sa respiration et entre 5 minutes et 2h d’acquisition de données. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Avant la perfusion terminale, un antidouleur sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques (comme la pléthysmographie). Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. -Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. -Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. -Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. -Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. -Pléthysmographie : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. -Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève. Vaccination par électroporation : peut entrainer un problème de mobilité. L’infection par le virus hMPV peut entraîner altération de l’état général (aspect du poil, posture), perte de poids, fièvre, modifications comportementales et respiratoires. Ces paramètres sont suivis via une grille de score spécifique. Une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires sont attendues et évaluées respectivement par analyses respiratoire et d’organes.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront mis à mort conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature. Ainsi que des souris âgées de 70-78 semaines afin d’étudier l’effet de hMPV chez les individus âgés.
Recherche préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques contre la maladie polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Gavées ou injectées jusqu'à deux fois par jour pendant dix semaines, après une délétion du gène Pkd1 déclenchée par tamoxifène, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous isoflurane, précédée ou non d'une exsanguination. Les kystes rénaux qui se forment dégradent progressivement la fonction rénale, avec déshydratation et dégradation de l'état général. Le projet cherche des composés contre la polykystose rénale, maladie pour laquelle un seul traitement existe aujourd'hui. Le porteur énumère les effets indésirables attendus sans y compter la paralysie, et prévoit par ailleurs de la nourriture mouillée et de l'eau gélifiée près de la souris paralysée par le tamoxifène.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la tolérance de nouveaux composés thérapeutiques dans un modèle murin pertinent de polykystose rénale. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris dont la délétion du gène Pkd1, dont la mutation est responsable de 80-90% des cas de polykystose rénale chez l’humain, est induite par administration de tamoxifène. Ce modèle inductible permet de travailler avec l’inactivation du gène uniquement à l’âge adulte, car son inactivation globale est létale in utero. Ce modèle présente l’avantage d’une bonne homogénéité phénotypique et permet l’utilisation de l’ensemble des animaux générés, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux. Suite à l’induction, les animaux recevront les composés d’intérêt afin d’évaluer leur impact sur la progression de la maladie, notamment sur le développement des kystes rénaux et les paramètres fonctionnels associés.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour la polykystose rénale autosomique dominante. En effet, actuellement, on estime à environ 12 millions le nombre de patients au niveau mondial. Plus de la moitié des patients progressent en insuffisance rénale terminale nécessitant une dialyse ou une transplantation rénale avant 65 ans. Actuellement seul un traitement est disponible, le tolvaptan, mais il ne fait que limiter la progression de la maladie chez certains patients et induit une forte polyurie, ce qui fait que des patients ne continuent pas le traitement. Ce projet vise à permettre le développement de nouveaux médicaments en s’appuyant sur un modèle murin pertinent permettant d’étudier la progression des kystes et la fonction rénale. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension de la maladie et au développement préclinique de candidats médicaments, avec pour objectif à terme de ralentir l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale et d’améliorer la prise en charge des patients, tout en s’inscrivant dans une démarche de réduction et de raffinement de l’utilisation des animaux.
Procédures
1) Induction de la maladie par administration orale de tamoxifène 2) Afin de suivre le développement de la maladie, 5 prélèvements sanguins pourront être réalisés à la veine submandibulaire (50 à 100µl, 30 secondes chacun, réalisés sous anesthésie) 3) l’imagerie des reins par rayon X nécessite l’injection en intraveineux d’un produit de contraste (moins de 60 secondes, réalisée sous anesthésie) 4) Afin de relier l’efficacité des composés à leurs taux sériques, une pharmacocinétique pourra être effectuée une fois par étude. Ainsi, au maximum 3 prélèvements de maximum 30 μL de sang par souris (veine saphène médiale ou veine submentale en moins de 30 secondes, réalisé sur souris vigiles) seront réalisés pendant la même journée ou étalés sur 2 journées. Le volume total de ces prélèvements n’excédera pas 10% du volume sanguin des souris et les prélèvements seront effectués sur animaux vigiles. 5) Pose du dispositif du Medibeacon mesure de la filtration glomérulaire, les animaux sont rasés et épilés, mise en place d’un petit capteur (1 cm2) sur le dos, fixé par du sparadrap, placement vigile en cage individuelle pendant 1h puis retour dans sa cage d’origine, maximum 1 fois pendant l’étude. 6) Injection par voie veineuse rétro-orbitaire d’une sonde fluorescente (2mL/kg) sous anesthésie gazeuse (isoflurane, induction : 2.5-5% / Maintien : 2-3%), la même anesthésie ayant servi à la pose du dispositif du Medibeacon, maximum 1 fois pendant l’étude. 7) Les composés et leurs solvants seront administrés soit par gavage (maximum deux fois par jour) ou injection sous cutanée (maximum deux fois par jour) pendant 10 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile. 8) En fin d'étude ou le cas échéant pour des raisons éthiques, les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’isoflurane, par dislocation cervicale précédée ou non d’une exsanguination (sans ouverture de l’abdomen).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus dans ce projet sont principalement liés au développement progressif de la polykystose rénale ainsi qu’aux procédures expérimentales mises en œuvre. L’induction de la délétion du gène Pkd1 entraîne l’apparition de kystes rénaux conduisant à une altération progressive de la fonction rénale, pouvant se traduire par une dégradation de l’état général (‘Body Condition Scoring for Mice’), une déshydratation ou des signes d’inconfort. Les administrations de tamoxifène et des composés testés, réalisées par voie orale ou systémique, peuvent également induire un stress transitoire lié à la contention ainsi que des effets indésirables propres aux molécules administrées. Les prélèvements sanguins répétés pour le suivi du BUN sont susceptibles de provoquer un inconfort modéré et un stress ponctuel. L’imagerie par micro-CT, bien que non invasive, nécessite une anesthésie nécessaire à l’injection intraveineuse du produit de contraste et au maintien des animaux lors de l’analyse, pouvant entraîner un stress physiologique transitoire ainsi que de faibles risques de complications liés à l’injection intraveineuse (irritation locale, inflammation, extravasation ou difficulté d’injection) et à l’anesthésie. L’analyse de la fonction rénale nécessite également une anesthésie de courte durée ainsi qu’une injection intraveineuse de produit fluorescent. Le positionnement du capteur Medibeacon sur la peau à l’aide d’un adhésif peut provoquer une irritation cutanée légère et transitoire au niveau de la zone de fixation. En cas de plaie ouverte, elle peut être nettoyée avec de la vétédine pour désinfection et du Vétramil sera ajoutée pour améliorer la récupération. Comme pour toute administration intraveineuse, de faibles risques de complications locales tels qu’une irritation, un hématome ou une extravasation peuvent être observés. Enfin, l’évolution de la maladie peut conduire à une dégradation de l’état clinique en fin d’étude. Afin de limiter ces nuisances, les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier avec des points limites prédéfinis, et toute souffrance sera réduite au maximum par des mesures adaptées, incluant si nécessaire une euthanasie anticipée. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé, dans le respect des bonnes pratiques et des principes de raffinement.
Devenir
Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés pour l’analyse de la physiopathologie.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle cellulaire ni organoïde ne permet de reproduire fidèlement l’ensemble des mécanismes impliqués dans la formation des kystes rénaux, ni la complexité architecturale et cellulaire des structures rénales associées à cette pathologie. Cette limite expérimentale rend indispensable le recours à des modèles in vivo pour évaluer de manière pertinente l’efficacité et la tolérance de candidats médicaments. Les études chez l’animal permettent en effet de préserver l’intégrité des organes concernés ainsi que les interactions cellulaires, tissulaires et systémiques impliquées dans le développement de la maladie. Elles constituent ainsi une étape essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques et pour évaluer le potentiel thérapeutique de stratégies innovantes..
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Le modèle choisi présente une bonne reproductibilité et une homogénéité du développement de la maladie, permettant de limiter la variabilité expérimentale et donc le nombre d’animaux requis par groupe. De plus, l’ensemble des animaux générés pourra être inclus dans les études grâce à l’induction contrôlée de la maladie après la naissance. Le suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps, notamment par imagerie µCT et analyses sanguines répétées, permettra également de limiter le nombre total d’animaux nécessaires en évitant la constitution de cohortes supplémentaires à différents temps expérimentaux.
Raffinement
Les points finaux ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des animaux. Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, pour préserver leurs interactions sociales. L’environnement est enrichi par des objets adaptés à l’espèce avec une mise en place de matériel permettant la nidification Les animaux sont observés quotidiennement. Les animaux sont anesthésiés pour les gestes générant du stress dans la mesure du possible, lorsque la procédure le permet.. Dans le cas des paralysies potentielles (et possiblement transitoires), liées à l’administration de tamoxifène, de la nourriture mouillée et de l’eau gélifiée sera mise près de l’animal paralysé.
Choix des espèces
L’utilisation de souriceaux est nécessaire dans ce projet car l’induction de la délétion du gène Pkd1 doit être réalisée à un stade précoce du développement post-natal afin d’obtenir un modèle de polykystose rénale reproductible et compatible avec l’évaluation thérapeutique. Une induction réalisée chez des animaux plus âgés entraîne une progression plus lente et plus variable de la maladie, moins adaptée aux objectifs de l’étude. L’administration de tamoxifène à l’âge de 17 jours permet d’obtenir un développement homogène des lésions rénales pour le suivi expérimental et l’évaluation des traitements pendant l’âge adulte. Ce choix est donc indispensable pour garantir la pertinence scientifique du modèle et limiter la variabilité expérimentale.
Rôle de CaMK1D dans l’anorexie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées sans réveil au terme du protocole, pour que leurs tissus soient prélevés, 420 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La nourriture leur est retirée vingt-deux heures par jour pendant trois jours, restituée de 17 h à 19 h, avec une roue de course en accès permanent, et elles peuvent perdre du poids, devenir hypothermes et voir leur état général se dégrader, ce que le porteur nomme "les paramètres d'intérêt scientifique du projet". Chacune est hébergée seule pendant toute la durée du protocole. Le protocole démarre au quarantième jour de vie, période péripubertaire que le porteur présente comme la fenêtre de vulnérabilité maximale, et seules des femelles sont utilisées, la maladie humaine touchant principalement des femmes jeunes.
Objectifs
L'anorexie nerveuse est un trouble du comportement alimentaire sévère caractérisé par une restriction volontaire et excessive de la prise alimentaire et une hyperactivité physique. Elle touche principalement les femmes jeunes et représente le trouble psychiatrique avec le taux de mortalité le plus élevé. Malgré son impact considérable sur la qualité de vie et la survie, aucun traitement pharmacologique efficace n'existe à ce jour. On sait que la sensation de faim est contrôlée par une région du cerveau qui intègre les signaux du corps indiquant un déficit énergétique. Dans l'anorexie, les neurones qui déclenchent normalement la sensation de faim semblent incapables de générer une réponse suffisante malgré la restriction alimentaire et la perte de poids. Mais le mécanisme précis par lequel cette dysfonction s'installe reste inconnu. Des études génétiques menées chez des patients atteints d'anorexie nerveuse ont identifié des variants de certains gènes comme facteurs de risque de la maladie. Nos recherches ont identifié des protéines présentes dans les neurones de la faim qui semblent contrôler leur capacité à répondre aux signaux de déficit énergétique. En l'absence de ces protéines, les neurones de la faim répondent de façon altérée à la restriction alimentaire. Ce projet vise à comprendre comment ces protéines contrôlent la vulnérabilité à l'anorexie, et à évaluer si agir sur elles pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique pour aider les personnes atteintes d'anorexie nerveuse à rétablir une prise alimentaire normale et améliorer leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre pourquoi certains individus sont plus vulnérables que d'autres à développer une anorexie, en identifiant comment des protéines présentes dans les neurones de la faim contrôlent la réponse du cerveau à la restriction alimentaire. Ces connaissances combleront une lacune majeure dans la compréhension de l'anorexie nerveuse, pour laquelle aucun traitement pharmacologique efficace n'existe à ce jour. À plus long terme, comprendre ce mécanisme ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements capables de restaurer la capacité du cerveau à déclencher la sensation de faim chez les personnes atteintes d'anorexie nerveuse. Cela représente un enjeu majeur car cette maladie est associée au taux de mortalité le plus élevé parmi les troubles psychiatriques et touche principalement des femmes jeunes. Les découvertes réalisées dans ce projet pourraient également s'appliquer à d'autres formes d'anorexie associées au cancer, au vieillissement ou aux maladies inflammatoires chroniques, élargissant ainsi considérablement leur impact potentiel sur la santé humaine
Procédures
Le projet comprend trois groupes expérimentaux de souris femelles adolescentes. Le groupe ABA (anorexie basée sur l'activité) est soumis à une restriction alimentaire de 2 heures par jour pendant 3 jours, avec accès permanent à une roue de course. Le groupe restriction alimentaire sans roue est soumis à la même restriction sans accès à la roue, afin de distinguer l'effet de la restriction seule de l'effet combiné restriction et hyperactivité. Le groupe contrôle conserve un accès libre à la nourriture avec accès à la roue. Restriction alimentaire, sur animal vigile. Réalisée sur les groupes ABA et restriction sans roue pendant 3 jours consécutifs. La nourriture est retirée et restituée 2 heures par jour de 17h00 à 19h00. Chirurgie terminale sans réveil. Réalisée une seule fois sur l'ensemble des animaux à l'issue de la phase de récupération, sous anesthésie générale profonde et précédée d'une analgésie. Cette intervention permet le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses et entraîne la mise à mort de l'animal sans réveil. Durée totale de la procédure, environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés à la restriction alimentaire et à l'hyperactivité physique qui constituent le modèle étudié. Durant la phase de restriction alimentaire, les souris pourront présenter une perte de poids progressive, une réduction de la prise alimentaire volontaire, une hypothermie et une altération de l'état général. L'hyperactivité sur la roue de course associée à la restriction alimentaire constitue la procédure la plus contraignante de ce protocole et peut engendrer une fatigue physique et un stress modéré à sévère. Ces manifestations sont inhérentes au modèle d'anorexie basée sur l'activité et représentent les paramètres d'intérêt scientifique du projet. L'hébergement individuel pendant toute la durée du protocole peut engendrer un stress lié à l'isolement social. La phase de récupération après rétablissement de l'accès libre à la nourriture peut s'accompagner d'une hyperphagie transitoire sans danger pour l'animal. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience. Globalement les effets indésirables attendus sont modérés à sévères durant la phase de restriction alimentaire. À l'issue de l'étude les animaux sont mis à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie profonde.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue du protocole pour permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses, ou en cours d'expérience lors de l'atteinte des points limites afin d'abréger toute souffrance.
Remplacement
Les questions posées dans ce projet nécessitent d'étudier comment les neurones de la faim répondent à une restriction alimentaire prolongée associée à une hyperactivité physique, et pourquoi certains individus génétiquement modifiés sont plus vulnérables que d'autres à développer un comportement anorexique. Ces phénomènes font intervenir des interactions complexes entre les circuits neuronaux hypothalamiques, les signaux hormonaux périphériques et le comportement alimentaire et moteur qu'aucun modèle informatique ou culture cellulaire ne peut reproduire. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont de ce projet pour valider les mécanismes moléculaires impliqués. Ces expériences permettent de réduire le recours à l'animal en limitant les expériences chez la souris aux seules questions qui ne peuvent pas être résolues autrement. Cependant le recours à l'animal vivant est indispensable. La mesure du comportement alimentaire, de l'hyperactivité physique sur roue de course et de la vulnérabilité individuelle à l'anorexie nécessite un organisme intègre. Enfin l'utilisation de souris génétiquement modifiées est la seule approche permettant de démontrer le rôle causal des protéines étudiées dans ce contexte. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable et ne peut pas être remplacée par des alternatives non animales pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d'un calcul statistique rigoureux réalisé à partir de données préliminaires disponibles au laboratoire sur la prise alimentaire et le poids corporel de souris soumises à un jeûne prolongé. Ce calcul garantit que le nombre d'animaux utilisés est suffisant pour obtenir des résultats fiables, sans être supérieur au strict nécessaire. Il indique un effectif de 15 animaux par groupe auquel un coefficient de 25% est ajouté pour tenir compte des pertes éventuelles liées aux points limites, portant l'effectif à 20 animaux par groupe. Le projet comprend trois conditions expérimentales, le protocole d'anorexie basée sur l'activité (ABA) qui associe restriction alimentaire et accès à une roue de course, la restriction alimentaire sans roue de course et le groupe contrôle avec accès libre à la nourriture. Ces trois conditions sont appliquées à sept génotypes distincts, soit un total de 420 animaux sur l'ensemble du projet. Les groupes contrôles sont mutualisés entre les lignées, chaque lignée étant comparée à ses propres animaux de la même portée afin de s'affranchir de la variabilité liée aux fonds génétiques issus des croisements. Plusieurs mesures sont prises pour limiter le nombre total d'animaux utilisés. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont pour valider les hypothèses mécanistiques et limiter le recours à l'animal aux seules questions ne pouvant pas être résolues autrement. Les tissus prélevés lors de la mise à mort sont partagés entre toutes les analyses prévues afin qu'un même animal contribue simultanément à l'ensemble des mesures sans nécessiter d'animaux supplémentaires. L'utilisation d'animaux de la même portée comme contrôles permet de réduire la variabilité entre les individus et donc le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Plusieurs mesures concrètes sont mises en place pour réduire au minimum le stress et la souffrance des animaux tout au long de ce projet. Les animaux sont manipulés régulièrement par le même opérateur avant le début du protocole afin de les habituer à la contention. Chaque animal est observé quotidiennement et tout animal atteignant un point limite est mis à mort immédiatement par dislocation cervicale, afin de ne pas prolonger sa souffrance. Les cages individuelles sont enrichies avec des matériaux de nidification, un abri en carton, du coton et un tube permettant la préhension sans saisie manuelle directe. Les cages sont transparentes et disposées côte à côte afin de maintenir un contact visuel, olfactif et auditif entre les animaux malgré l'hébergement individuel. La roue de course est introduite lors de la phase d'acclimatation de 4 jours avant la restriction alimentaire. Tout au long du projet, une veille scientifique est assurée afin d'intégrer les nouvelles techniques de raffinement disponibles. Toute évolution des recommandations en matière de bien-être animal sera immédiatement prise en compte.
Choix des espèces
L'anorexie nerveuse implique des interactions complexes entre les circuits neuronaux hypothalamiques, les signaux hormonaux périphériques et le comportement alimentaire et moteur qui ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant entier. Les organismes plus simples comme la mouche du vinaigre ou le ver de terre ne possèdent pas de région cérébrale comparable à celle étudiée dans ce projet, ni de neurones équivalents aux neurones de la faim de la souris et de l'homme. Ils ne permettent donc pas d'étudier la vulnérabilité à l'anorexie basée sur l'activité ni le comportement alimentaire dans ce contexte. De plus les outils génétiques utilisés dans ce projet sont spécifiquement développés et validés chez la souris. Le recours à la souris est donc indispensable et constitue le modèle le plus pertinent scientifiquement tout en représentant le niveau de complexité biologique minimal requis pour répondre aux questions posées. Le protocole ABA est réalisé à partir du jour postnatal 40, soit environ 5 semaines et demi. Cet âge correspond à la période péripubertaire qui représente la fenêtre de vulnérabilité maximale à l'anorexie basée sur l'activité chez la souris, en cohérence avec l'épidémiologie de l'anorexie nerveuse qui débute le plus fréquemment à l'adolescence chez les patients. Des souris femelles sont utilisées en raison de la prévalence majoritairement féminine de cette maladie et de la robustesse du phénotype ABA documentée chez les femelles dans la littérature.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases-modification
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés au stade embryonnaire puis anesthésiés jusqu'à une fois par jour pour des séances d'imagerie de une à deux heures, certains intubés quatre heures d'affilée pendant près d'un an, 680 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères. Les adultes porteurs de mélanomes nagent moins droit et moins vite, développent des abcès ou des œdèmes, respirent mal, mangent moins et s'éloignent de leurs congénères, et les larves de moins de quinze jours, hébergées seules pour le suivi, peuvent souffrir de l'isolement. Le porteur écrit pourtant que des points limites ont été établis pour éviter "toute souffrance animale". Tous sont mis à mort en fin de procédure, pour les prélèvements et pour empêcher les tumeurs de croître davantage.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Modification: l'utilisation d'une approche CRISPR permet de substituer une lignée transgénique et diminuer le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) . Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum , sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie , jusqu'à une fois toutes les deux semaines. Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Modification: l'utilisation de CRISPR permet de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie. Modifications: amélioration de l'anésthésie et enrichissement des aquariums. Suppression du génotypage.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Établissement d’un modèle murin de chimiothérapie afin d’évaluer les effets thérapeutiques de probiotiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Quarante pour cent de nourriture en moins pendant vingt et un jours, et jusqu'à trente-sept jours seules en cage : 118 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes mises à mort pour collecter leurs organes. Elles reçoivent une chimiothérapie, cinq à sept injections dans le ventre, autant sous la peau, jusqu'à seize administrations orales d'un probiotique et deux à trois prises de sang sous anesthésie. Le porteur écrit que la chimiothérapie ne devrait induire "que pas ou peu d'effets secondaires sur le bien-être de l'animal", et rapporte la faim à la restriction calorique. Des souris mâles C57BL6J de treize semaines ont été retenues pour la connaissance de leur flore intestinale, l'isolement étant maintenu pendant la renutrition pour éviter des combats que le porteur juge susceptibles de tuer des animaux non-humains.
Objectifs
La dénutrition associée à une altération de l'absorption intestinale est un phenomène couramment observé après une chirurgie de l'intestin ou une chimiotherapie. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte dont la fonction intestinale est dégradée. Un probiotique se définit comme un microorganisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de chimiothérapie chez la souris. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses dérivés peut limiter les effets de cette chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients traités par chimiothérapie afin de limiter les éffets secondaires associés, mais aussi des patients ayant subit une intervention chirurgicale de l'intestin qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.
Procédures
- Individualisation des animaux : 106 souris au maximum pendant une durée maximum de 37 jours. - Restriction alimentaire : 106 souris maximum pendant 21 jours - Prélèvement de sang sur l'animal anesthésié : 2 à 3 fois maximum pour 110 souris maximum,cela prend moins d'une minute. - 5 à 7 Injections dans le ventre sur l'animal vigile : 110 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. - 5 à 7 injections sous la peau sur animal vigile : 110 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. 16 administrations orales maximum d'un probiotique : 70 souris maximum.
Impact sur les animaux
- Le stress lié au traitement par chimiothérape ne devrait induire que pas ou peu d'effets secondaires sur le bien-être de l'animal. - La sensation de faim associée à une restriction calorique de 40% de leur prise alimentaire moyenne. Ce temps de restriction sera de 21 jours maximum. - Le stress associé à l'individualisation des animaux pendant la durée de l'expérience en cas de restriction calorique. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. - Le stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal. - Le stress associé aux prélèvements sanguins qui seront espacés d'au moins 7 jours et seront fait sous anesthésie. - Le traitement par un probiotique ou ses dérivés qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue une petite quantité de solution qui sera alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute. le stress associé à une injection sous la peau et la contention associée de moins d'une minute.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une chimiothérapie éventuellement associée à une restriction calorique ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte étudié.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Nous avons prévu de réaliser ce projet de manière séquentielle et de ne réaliser les procédures que si les résultats précédents le justifie. Dans une optique de réduction, nous allons également prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, foie, tissu adipeux, par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, nous n'utiliserons que des animaux de plus de 20g au debut du projet. Les animaux seront pesés à minima toute les semaines afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie suivis d’un point de compression jusqu’à l’arrêt complet du saignement. En cas de restriction calorique, les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement probiotique ou par ses dérivés se fera en déposant délicatement une petite quantité de solution dans le creux de la joue. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser les effets d'une chimiothérapie chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris C57BL6J mâles de 13 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement)
Etude de la variabilité individuelle au stress et de la réponse aux antidépresseurs dans des modèles murins de stress chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour identifier des marqueurs de la réponse aux antidépresseurs, 7 776 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes mises à mort pour prélever le sang, le cerveau et des organes. Elles subissent un stress chronique de deux à trois heures par jour pendant huit à douze semaines, jusqu'à soixante injections quotidiennes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie du crâne de vingt minutes à cinq heures suivie de neuf semaines d'hébergement individuel. Le porteur annonce des batteries hebdomadaires de trois tests répétés quatre fois, puis une batterie finale de quatre à dix tests, sans nommer aucun de ces tests comportementaux. Le stress infligé doit provoquer dépression, anhédonie, anxiété et retrait social, et les points limites déclenchent un renforcement des antalgiques ou la mise à mort.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin urgent de meilleure prise en charge du trouble dépressif majeur. Il repose sur la récente découverte d'un facteur de transcription en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la dépression qui (i) permet de développer des stratégies innovantes d’identification de biomarqueurs précoces de la réponse, non réponse aux antidépresseurs, (ii) s'appuie sur des mécanismes biologiques robustes, plausibles et novateurs, (iii) sont transposables à la physiopathologie humaine, ainsi qu'aux phases de Recherche et Développement et aux futurs essais cliniques. Les antidépresseurs occupent une place centrale dans la prise en charge de la dépression, grâce à leur accessibilité étendue et à leur efficacité prouvée, qui s'avère similaire d'un médicament à l'autre. En utilisant des antidépresseurs classique, nous voulons vérifier si les biomarqueurs de la réponse au traitement antidépresseur , (i) dépendent des propriétés spécifiques de l'antidépresseur, comme sa capacité à bloquer la recapture d’un neurotransmetteur en particulier, (ii) peuvent être corréler à des modification les fonctions cérébrales impactés par le trouble dépressif majeur, (iii) peuvent être la cible de modification l’expression génétique permettant d’établir un lien entre vulnérabilité ou résilience au stress. Pour mieux refléter la complexité des situations cliniques, nous proposons d’évaluer ces traitements dans des modèles murin de stress chroniques bien établis, intégrant des dimensions physiques, psychologiques et sociales.
Bénéfices attendus
Nous déploierons ensuite des efforts de Recherche et Développement auprès des acteurs cliniques, institutionnels et privés. Les résultats à long terme créeraient idéalement une valeur supplémentaire par rapport aux stratégies thérapeutiques existantes avec des approches « complémentaires », un potentiel d'amélioration majeur dans la pharmacologie du trouble dépressif majeur (action rapide, meilleure efficacité). Une prise en charge pharmacologique plus abordable de la dépression signifie (i) une guérison plus précoce réduisant les souffrances et les effets secondaires inutiles, (ii) une amélioration de la qualité de vie des 300 millions de personnes souffrant de dépression dans le monde et de leurs familles, (iii) réduction du fardeau social et des coûts de santé publique.
Procédures
Une partie des souris subiront une procédure chirurgicale. Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 20-40minutes ou 3-5 heures par souris, accompagnée d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront soumises à une procédure de stress chronique moyen répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 2-3 heures pendant 8-12 semaines. Les animaux stressés recevront une injection quotidienne de l’antidépresseur ou de composés ayant des effets antidépresseurs allant de 1 injection à 60 injections (animal vigile à raison de quelques secondes par animal). Leur état émotionnel d’anxiété/dépression, de nociception et de cognition sera suivi avec tâches comportementales sur animaux vigiles. Ce suivi se fera avec une batterie hebdomadaire de 3 tests répétés 4 fois. La dernière batterie comportementale sera plus complète, elle comportera de 4 à 10 tests et s’étalera sur 1 à deux semaines. Les animaux ayant subis une intervention chirurgicale pour y implanter des électrodes seront suivis avec une batterie comportementale de 5-7 tests répétés en 3 temporalités (avant stress, après stress, après traitement). Leur activité cérébrale sera mesurée en vigile pendant les taches comportementales. La durée d’un test sera de 10 minutes à 1 heure et l’animal effectuera jusqu’à deux tests par jour. Jusqu’à cinq prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, avec une intervention de moins d’une minute. Chaque prélèvement sanguin sera espacé d’au moins 10-15 jours.
Impact sur les animaux
Dans le protocole de stress chronique moyen imprédictible, en plus du stress physique les souris seront soumises de façon répétée à un stress psychologique moyen susceptible de causer des symptômes de dépression, d’anhédonie, d’anxiété, un retrait social chez un sous-groupe d’individus ainsi qu'une perte de qualité de pelage. Ces dimensions seront surveillées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé. Les injections intrapéritonéales chroniques peuvent provoquer des effets secondaires mineurs, ou inconfort comme une douleur légère et transitoire, voir une irritation locale autour du site d’injection. La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire pendant l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant le stress chronique moyen imprédictible pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’éventuellement une augmentation de l’anxiété. Cependant, dans nos conditions expérimentales, l’hébergement individuel n’induit ni stéréotypies ni modifications du comportement émotionnel basal. Les tests de comportement ne montrent pas de changements notables mais nous pouvons considérer une certaine fatigue dans le cadre de batteries de plusieurs tests qui seront répétées au cours du protocole de stress et du traitement antidépresseur.
Devenir
L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Pour une grande partie des animaux du sang, leurs cerveaux et des organes périphériques seront récoltés en vue de procéder à des analyses de biologie moléculaire ou d'anatomie/imagerie et, où chaque animal représente un individu unique.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro avec des modèles cellulaires, les effets de la dépression, du stress, et des antidépresseurs se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures d’expérimentations animales décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress ou les drogues sur des circuits neuronaux intacts. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Nous essayons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir effectuer des études invasives qui ne sont pas faisables chez les sujets humains. Avec l’approche translationelle que nous avons adopté, les résultats obtenus au sein de notre laboratoire sont complémentaires de ceux obtenus chez l’homme.
Réduction
Les études prévues nécessiteront l’utilisation de 7776 animaux. Cet effectif représente un maximum. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par un calcul de puissance afin de s'assurer qu'il soit suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux impliqués. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées. Cette approche nous permet de répondre à la question principale du projet et en optimisant l'effectif, nous garantissons non seulement des résultats fiables, mais aussi une minimisation de l'impact sur les animaux.
Raffinement
Les souris seront placées dans une animalerie aux conditions d’hébergement conformes à la réglementation pour l’espèce utilisée. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire). Des points limites spécifiques ont été établis pour permettre d’évaluer l’état de douleur de l’animal agir en conséquence afin d’éviter toute souffrance supplémentaire, soit par un renforcement du traitement antalgique/analgésique, soit par une euthanasie. Pour le suivi post opératoire, une grille de scoring sera mise en place pour garantir le bien-être des animaux. De plus, un anesthésique local sous forme de crème est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au début et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’antiinflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de détérioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront en hébergement individuel pendant environ 9 semaines.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de la dépression clairement établis chez la souris. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des gènes dans le cerveau permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Expériences chez des animaux adultes : Les souris tests seront réceptionnés à l'âge de 6-7 semaines puis utilisés en procédure à l'âge adultes (âge entre 8 et 16 semaines). Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles affectifs à l’âge adulte en prenant en compte la variabilité individuelle et le dimorphisme sexuel.
Détermination de l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle d’hépatectomie partielle chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Amputés d'une partie du foie sous anesthésie générale, jusqu'à deux fois, puis soumis à jusqu'à cinq prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et à deux jeûnes de vingt heures, 1 070 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous mis à mort pour mesurer la régénération du foie et prélever organes et fluides. Certains sont hébergés seuls jusqu'à dix jours après la chirurgie, deux fois au plus. L'objet est de tester des candidats médicaments censés améliorer la récupération du foie après une ablation chez l'être humain. La liste des atteintes déclarées s'arrête pourtant au "stress mineur", à une douleur "équivalente à la piqure d'une aiguille" et à une douleur postopératoire qualifiée de modérée, sans qu'aucune souffrance sévère y soit décrite.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de candidats médicaments destinés à améliorer la réponse du foie après une lésion aiguë. Chez l’homme, ce type de lésion peut survenir notamment lors d’une atteinte d’origine médicamenteuse ou après une chirurgie du foie, comme une hépatectomie partielle (= HP, ablation d’une partie du foie), traitement de référence dans le cancer du foie. Ces situations peuvent conduire à une insuffisance hépatique lorsque la quantité de foie restante devient insuffisante pour assurer une fonction normale. Il est donc nécessaire d’identifier des traitements capables de favoriser la régénération du tissu hépatique, de soutenir la récupération des fonctions du foie et de limiter les conséquences générales liées à cette perte transitoire d’activité. L’évaluation sera réalisée chez le rat, espèce couramment utilisée pour l’étude de la régénération hépatique. La lésion sera induite par une hépatectomie partielle, correspondant au retrait chirurgical d’une proportion définie du foie (un ou plusieurs lobes), sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Selon les objectifs expérimentaux, les candidats médicaments pourront être administrés avant, pendant ou après la chirurgie, afin d’évaluer leur effet sur la régénération hépatique, la fonction du foie, la prise en charge chirurgicale et l’état général de l’animal. Les animaux seront suivis à différents temps après l’intervention afin de mesurer la régénération du foie et les effets des traitements testés. Le recours à l’animal est nécessaire car la régénération hépatique dépend d’interactions complexes entre le foie, la circulation sanguine, le système immunitaire, le métabolisme et d’autres organes. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de façon complète par des modèles in vitro ou in silico. Les résultats obtenus contribueront au développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer la récupération après une atteinte aiguë du foie ou après une chirurgie hépatique
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est l’amélioration de la connaissance des effets de candidats médicaments sur la réponse à une lésion hépatique aiguë. À court terme, ce projet permettra de générer des données précliniques robustes sur la capacité de ces composés soit à stimuler la régénération hépatique après une atteinte aiguë, soit à compenser certaines conséquences secondaires liées à l’altération de la fonction hépatique, soit à aider dans les chirurgies d’hépatectomie partielle chez l’homme. À plus long terme, les données obtenues pourront contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à favoriser la récupération hépatique après lésion aiguë et à réduire les conséquences secondaires d’une défaillance hépatique aiguë chez l’homme. Le projet contribuera également à l’amélioration des connaissances scientifiques sur les modèles expérimentaux de lésion hépatique aiguë chez le rongeur et sur leur prise en charge.
Procédures
Les rats de ce projet subiront une ablation partielle du foie par chirurgie, nécessitant une anesthésie gazeuse ou fixe (2 fois max, environ 40 min/chirurgie) et des soins post opératoires impliquant des administrations de médicaments (max 4 administrations/ 24h, durée max 2 min, sur une période de 3 jours max). Ils subiront des administrations de candidats médicaments (max 2 administrations /24h, durée max 2 min, sur une période de 28 jours max) et des prélèvements sanguins (maximum 5 prélèvements /24h, durée : moins de 30 sec/prélèvement). Les administrations ou prélèvements de sang pourront nécessiter une anesthésie gazeuse (1 à 4 fois max, environ 10 min/prélèvement ; 1h max pour administration). Le nombre total d’anesthésie (chirurgie + prélèvement de sang et/ou administration) ne pourra excéder 5. Ils pourront être mis à jeun, avec jusqu' à 2 mises à jeun maximum (durée maximum de la mise à jeun de 20h), et un minimum de 72h d'intervalle entre 2 mises à jeun. Ils pourront être hébergés individuellement après la chirurgie si besoin (maximum deux fois, avec une durée maximale de 10 jours pour chaque période d’hébergement individuel).
Impact sur les animaux
L’administration des candidats médicaments ou de référence pourra entrainer un stress mineur de courte durée et une douleur équivalente à la piqure d’une aiguille. Lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Dans le cas des anesthésies pour la chirurgie ou un prélèvement/une administration, celle-ci peut induire un stress à l’endormissement. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture la veille de l'administration du composé d'intérêt, et un stress mineur lors de d'hébergement individuel post chirurgie. De par le modèle, ils subiront après la chirurgie une douleur modérée.
Devenir
Euthanasie des animaux pour mesurer le ratio de régénération hépatique/ réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels terminaux / suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s).
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’un modèle animal, car la régénération du foie après une hépatectomie partielle est un processus complexe qui ne peut pas être reproduit entièrement par des méthodes alternatives. Des modèles réalisés en laboratoire, comme les cultures 3D de cellules hépatiques ou les organoïdes, peuvent être utiles en amont pour étudier certains mécanismes. Cependant, ils ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions observées dans un organisme vivant. Après une résection du foie, la régénération hépatique dépend non seulement des cellules hépatiques restantes, mais aussi de la pression de la circulation sanguine, de la matrice extra cellulaire, du système immunitaire, du métabolisme, de l’organisation du tissu hépatique et des échanges avec d’autres organes (intestins, poumons, rate, reins, système nerveux central). Ces interactions sont indispensables pour évaluer correctement l’efficacité, la tolérance et les effets biologiques globaux des candidats médicaments. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de remplacer complètement l’étude chez l’animal pour ce type de projet.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (n=6-10 par groupe). L’effectif sera fondé sur les données de la littérature pour ce type de modèle, puis adapté au plus juste. Il sera raffiné pour chaque étude en fonction de l’objectif expérimental, du nombre de groupes, de la variabilité attendue du modèle et de l’acte de chirurgie, du type d’HP, du critère principal d’évaluation et de l’effet biologique minimal jugé pertinent.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par - Mise à jeun limitée à la durée minimale nécessaire, sans cumul des périodes de jeûne, et respectant un intervalle minimal entre deux mises à jeun afin d’éviter tout effet indésirable et stress supplémentaire pour l’animal. Une supplémentation en glucose sera ajoutée dans l’eau du biberon. - Un protocole anesthésique et analgésique adapté aux procédures chirurgicales et à la période post-opératoire. - Après la chirurgie, un suivi clinique quotidien (grille de scoring, poids, observation clinique, surveillance de la cicatrisation) permettant une adaptation rapide des soins. Un soutien nutritionnel (alimentaire et hydrique) sera mis en place. - Un hébergement individuel sera assuré en post-opératoire afin de favoriser la récupération et la cicatrisation. L’animal restera en contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères (cages transparentes et ouvertes). En plus de l’enrichissement classique, un sur-enrichissement sera spécifiquement mis en place (lanières de papier Kraft pour accentuer son besoin de cachette). - Les prélèvements sanguins et tissulaires seront réalisés selon la méthode la moins invasive compatible avec les exigences scientifiques, et optimisés afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des points limites définis permettront le recours à un traitement adapté ou à l’euthanasie si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus utilisée pour le modèle d’HP en raison de son anatomie hépatique en lobes bien individualisés, permettant une chirurgie simple, standardisée et reproductible avec une bonne réussite. Sa taille facilite les gestes chirurgicaux et le suivi post-opératoire. Ce modèle étant largement décrit dans la littérature, il permet également une comparaison fiable des résultats expérimentaux. Animaux adultes ou jeunes adultes (au moins 7 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Le choix d'animaux adultes ou jeunes adultes est justifié par la nécessité d’un foie d’une taille suffisante pour assurer la bonne faisabilité de la chirurgie.