Procédures sévères
Mise au point du suivi de l’infection virale d’un virus non replicatif (VSVdeltaG) et d’un virus replicatif (Cedar) par imagerie in vivo chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées dans le nez, dans le ventre et dans le crâne, 40 souris reçoivent jusqu'à six injections chacune et trois à six anesthésies, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. L'infection intracérébrale par le virus réplicatif peut provoquer des tremblements, une perte d'équilibre et des mouvements frénétiques dès le troisième jour. Le porteur inscrit pourtant ce projet dans "une démarche de raffinement et de réduction", au motif que l'imagerie évitera de tuer des souris à chaque point d'analyse. Toutes sont tuées à la fin du protocole, celles infectées dans le crâne dès l'apparition des premiers tremblements, avec une surveillance deux fois par jour à partir du jour où les premières morts peuvent survenir.
Objectifs
Nous nous intéressons à la biologie des paramyxovirus. Actuellement, pour suivre l’évolution d’une infection, il est nécessaire de mettre à mort des animaux à différents moments afin de mesurer la quantité de virus présente dans leurs organes. Cette méthode est lourde et ne permet pas d’observer l’infection au cours du temps chez un même animal. L’objectif de ce projet est de mettre en place une approche d’imagerie in vivo permettant de suivre la multiplication du virus et les organes qu’il infecte, sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Cette méthode permettra d’observer l’évolution de l’infection en temps réel et de manière moins invasive et réduira de façon importante le nombre d'animaux utilisé. À plus long terme, cette technologie pourra également être utilisée pour évaluer l’efficacité de nouvelles constructions vaccinales. Dans un premier temps, cette demande vise donc à établir les conditions permettant de visualiser la prolifération virale par imagerie. Pour cela, nous utiliserons deux types de virus modifiés, l'un incapable de se répliquer, l'autre oui. Ces virus sont également modifiés pour émettre de la lumière sur le même principe que les lucioles. Après infection par différentes voies, nous mesurerons l’expression de ces gènes rapporteurs afin de visualiser et quantifier la progression de l’infection chez l’animal vivant.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de raffinement et de réduction. Ces données permettront de développer et valider une méthode non invasive d’imagerie in vivo pour suivre la progression d’infections virales chez la souris en réduisant fortement le nombre total d’animaux dans les protocoles de suivis à long terme.
Procédures
Dans une première expérience, chaque souris revevra le virus dans le nez (10sec), le ventre (10sec), et dans le crane (20sec), et recevra 3 administrations de produit lumineux, soit un totale de 6 injections par souris, + 3 périodes d’anesthésie. Dans une deuxième expérience, chaque souris sera inoculée soit dans le nez, le ventre, ou le crane et administrées chaque jour d’imagerie avec le produit lumineux soit 5 fois concernant les groupes inoculés avec le virus dans le nez ou le ventre (6 injections), et donc 5 et 6 périodes d’anesthésie, respectivement.
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau, dans le cerveau et dans l'abdomen peuvent entraîner une douleur au niveau du site d'injection. Les virus non réplicatifs n’induisent pas de signe clinique. Le virus replicatif administré dans le ventre ou par une goutte dans le nez n’entraîne pas de signe pathologique observable dans les conditions prévues. En revanche, l’infection intracérébrale par le virus réplicatif peut induire l’apparition de signes neurologiques, de type tremblements, perte d’équilibre, mouvement frénétiques, hyperactivité dès 3 jours post-infection.
Devenir
Les animaux étant infectés par des virus, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Remplacement
La réplication virale est un phénomène biologique complexe, impliquant de multiples interactions cellulaires et se déroulant dans divers organes. Cette complexité ne peut pas être reproduite in vitro et ne peut être étudiée qu’à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Pour ce projet il est prévu d’utiliser 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Dans la procédure 1, nous réaliserons une étude séquentielle, nous utiliserons les mêmes animaux pour les 3 voies d'inoculation des virus en respectant les 48 heures nécessaires entre les différentes inoculations ce qui permet de limiter drastiquement le nombre de groupe et donc d’animaux impliqués dans l’étude. Le nombre d'individu par groupe a fait l'objet d'une réflexion réalisé sur la base de résultats précédemment obtenues sur la caractérisation du modèle, ce dernier nous permettant ainsi d'évaluer le nombre minimal de souris par groupe sans pour autant mettre en péril les résultats scientifiques ainsi que les tests statistiques qui assureront la validité des résultats
Raffinement
Suite à l'inoculation dans le crane les souris seront suivies quotidiennement, et à partir de 3 jours (jour auquel les premières mortalités peuvent être observées) post-infection elles seront suivies à minima 2 fois par jour. Dès l'apparition des premiers signes neurologiques (tremblements) les animaux seront anesthésié puis mis à mort. Les injections seront réalisées sous brève anesthésie avec un gaz approprié. Le suivi de la dissémination du virus Cedar sera réalisé par imagerie bioluminescente, tous les 2 jours (2/4/6/8/10). La visualisation dans la machine sera réalisée sous anesthésie gazeuse et sur un plateau chauffé à 37°C. Des points limites adaptés ont été définis (signes neurologiques et état général de l'animal). La durée maximum du projet sera de 10 jours.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris s’impose en raison de la nécessité d’utiliser des animaux génétiquement modifiés. De plus, nous avons déjà caractérisé le modèle d’infection par un virus réplicatif chez la souris dans le cadre d'un projet précedent ; nous connaissons ainsi les effets attendus de chaque voie d’inoculation. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au démarrage de l'expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Etude pilote : Exploration du rôle de la voie de signalisation YAP/TAZ dans la formation de cellules résistantes à la radiothérapie dans le cancer du sein chez un modèle souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Régler les paramètres d'un appareil d'irradiation destiné aux rongeurs, tel est l'objet de cette étude pilote. 36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit sous anesthésie une greffe de cellules tumorales mammaires sur les deux flancs, un suivi de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine, puis 45 minutes d'anesthésie pour l'irradiation, avec irritation, perte de poils et dépigmentation possibles sur la zone irradiée. Aucun traitement n'est évalué à ce stade, le porteur décrivant cette mise au point comme "indispensable" avant une seconde étude, elle-même préclinique.
Objectifs
Malgré les progrès de la médecine, le cancer du sein est le cancer le plus frequemment observé et reste actuellement la première cause de décès par cancer chez les femmes en France. Le cancer de sein développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé, notamment lorsque que des métastases apparaissent. La mise en oeuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de pouvoir réaliser dans le futur des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité d’un candidat médicament en combinaison avec de la radiothérapie. Pour cela, il est nécessaire de mettre au point en amont les conditions d’irradation des tumeurs avec un équipement de pointe dédié à la radiothérapie chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre au point les conditions de radiothérapie des tumeurs mammaires murines. Cette étape est indispensable avant de pouvoir envisager de réaliser dans une seconde étude des tests précliniques dans des conditions de traitements (radiothérapie combinée à un composé pharmacologique) réalistes et au plus proche du contexte des patientes.
Procédures
L’ensemble des animaux devra être transplantés par chirurgie sous anesthésie (1x15min). Le suivi du développement tumoral sera effectué bihebdomadairement par une mesure au pied à coulisse (contention de 2 min). Les actes de pesées de poids corporel seront réalisés à minima bihebdomadaires et dureront quelques secondes. Les souris seront également anesthésiées lors de l’irradiation de la tumeur (1x45min).
Impact sur les animaux
La greffe de cellules tumorales peut engendrer des douleurs, une perte de poids ainsi qu’un risque d’infection au site d’incision. Le développement d’une tumeur mammaire pourrait s’accompagner d’une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer et plus rarement d’une perte de poids. Les actes réguliers de pesée du poids corporel, de manipulation lors des mesures du volume tumoral et d’anesthésies associées aux chirurgies et à l’irradiation seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L’irradiation de la tumeur et les effets indésirables associés pourront engendrer un stress de courte durée, une perte de poids, une déshydratation mais aussi une irritation, une, alopécie et/ou une hypopigmentation du territoire irradié.
Devenir
Afin de caractériser l’effet de l’irradiation, notament l’effet biologique, nous récupérons en fin d’expérience les tumeurs des animaux. Nous réaliserons pour cela une mise à mort de l’ensemble des animaux du projet.
Remplacement
Notre projet, avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de prélèvements tumoraux, de cultures de cellules. Ces expériences permettent de sélectionner les traitements les plus prometteurs. Une telle approche permettra de réduire significativement le nombre d’animaux que nous utiliserons réellement. Cependant, le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeuthique chez les patientes. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine. D’autre part, la transplantation sera réalisée au niveau des 2 flancs afin de diviser par 2 le nombre d’animaux nécessaires.
Réduction
Avant d’impliquer des animaux, chaque modèle cellulaire sera testé in vitro pour caractériser les effets biologiques de l’irradiation sur chacun d’entre eux. Après cette étape, la mise au point du protocole d’irradiation in vivo reste inévitable et nécessitera de tester plusieurs doses de radiothérapie afin de déterminer les conditions expérimentales idéales au plus proche des cas cliniques.
Raffinement
Tout au long de cette étude, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées ainsi qu’une pesée à minima bihebdomadaire seront effectuées par du personnel compétent afin de détecter le plus précocement possible toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action la plus appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les procédures chirurgicales et l’irradiation seront réalisées sur tapis chauffant et sous anesthésie avec, dans le cas de la chirurgie, une analgésie pré- et post-opératoire pour une meilleure prise en compte de la douleur et réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif (mesures au pied à coulisse).
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Pour cette étude, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propes études pour ce type de modèle de transplantation de cellules tumorales murines, c’est à dire des souris « jeunes adultes », âgées de 6 à 10 semaines au moment de la greffe.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids, ou dont le score sur l'échelle de grimace dépasse 7 pendant les 48 heures critiques, sont mises à mort. 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit un traumatisme crânien à J0, puis des séances d'IRM et des évaluations neurologiques à J7, J21, J60 et J90, avant une perfusion intracardiaque au terme des trois mois, l'ensemble servant à tester un anticorps produit au laboratoire. Le porteur affirme par ailleurs que les souris se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "sickness behavior syndrom", description à confronter aux douleurs post-opératoires et aux déficits fonctionnels qu'il énumère lui-même.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens modérés à sévères (TC), qui restent mal pris en charge en clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal). Le projet se déroule dans deux EU, EU1/2 et EU2/2.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.
Procédures
Procédure 1 : traumatisme crânien (J0) / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=120) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90) Procédure 2 : traumatisme crânien+ traitements (J0), / IRM + évaluation neurologique (J7, J21, J60 et J90) / perfusion intracardiaque (J90) (n=60) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J90). Les chirurgies, sessions d'imagerie et perfusions seront réalisées dans l'EU1/2; les évaluations neurologiques et l'hébergement des animaux seront réalisés dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications (Vegliante et al., 2019 ; Drieu et al., 2022). En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale, locale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation et réactivité de l’animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l'intervention. Le transport entre les deux EU (reliés par un couloir de 20 mètres) se fera à l’aide de chariots adaptés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
MODIFICATION : DM-1 : Mesure de l’efficacité de nouvelles molécules antivirales contre le virus SARS-CoV-2 et ses variants chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Infectées par le SARS-CoV-2 sous anesthésie générale, 312 souris reçoivent des injections d'antiviraux ou de placebo à huit reprises et trois prélèvements de sang à la lancette, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'infection doit provoquer une perte de poids et une chute de température, avec une survie de quinze jours annoncée, les points limites étant ajustés au fil d'observations biquotidiennes. Toutes sont tuées à la fin du protocole, cerveau, poumons, intestin, rate et sang étant prélevés post mortem pour mesurer la charge virale et suivre les antiviraux dans les tissus. Le porteur écrit que "200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire" pour atteindre ses objectifs, alors que le projet en déclare 312, l'ajout de souris étant l'objet même de cette modification.
Objectifs
Les conjugués peptide-porphyrine sont des médicaments antiviraux à très large spectre capables de pénétrer dans le cerveau et le placenta, et donc de protéger le système nerveux central et les fœtus contre l'action des virus. Ils doivent leur large spectre d'activité à la cible particulière qu'ils visent dans la structure virale : l'enveloppe lipidique. Cette classe de composés compromet l'intégrité des enveloppes et les virus sont incapables de réparer les dommages, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. La preuve de concept a été établie in vitro avec les virus SARS-CoV-2 et Zika et in vivo avec le virus Zika. Il est nécessaire de valider l'activité antivirale des conjugués contre le SARS-CoV-2. Dans ce cadre, les trois conjugués préalablement validés pour leur efficacité contre plusieurs souches de SARS-CoV-2 sont des candidats prometteurs pour une visée thérapeutique. Il est nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ces antiviraux injectés à plusieurs temps à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 devraient initier une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de signes cliniques. MODIFICATION : DES RESULTATS ENCOURAGEANTS ONT ETE OBTENUS ; LA MODIFICATION DE PROJET PORTE SUR L’AJOUT D’ANIMAUX AFIN D’OPTIMISER LE TRAITEMENT ANTIVIRAL EN TESTANT DIFFERENTES CHARGES VIRALES ET DIFFERENTES VOIES D’ADMINISTRATION.
Bénéfices attendus
La validation des antiviraux testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’améliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19.
Procédures
Tous les animaux, soit 312 souris. Des prises de sang seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une lancette (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Administration des anti-viraux ou placebo sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique antivirale (5 minutes par animal, 8 fois). Challenge infectieux sous anesthésie générale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptômes généralisés mais avec une faible mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire ainsi qu’une perte de température est attendue suivi d’une survie de 15 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon les observations biquotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie sous-cutanée ou en voie intrapéritonéale pour les anesthésies générales ou des traitements peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantation de la puce télémétrique. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal. La prise de sang peut aussi engendrer un stress et une douleur légère au point de prélèvement lors de l’utilisation de la lancette.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (cerveaux, poumons, intestin, rate, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le suivi des antiviraux dans les tissus, pour le recrutement cellulaire et la réponse immunitaire induite.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Cette taille d’échantillon de 12 souris permet de détecter un effet modéré. Au total, 200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques (efficacité antivirale) tout en respectant le principe de réduction des 3R.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe social, dans des cages respectant les surfaces réglementaires et dans un environnement enrichi par différents types comme de la cellulose ou du sizzle, des bâtonnets de bois et des tunnels ou maisonnette/dôme… Les animaux sont transportés via un transporteur agréé dans un véhicule adapté et respectant au mieux les conditions et paramètres environnementales jusqu’à leur acheminement dans leur lieu d’hébergement définitif où ils sont ainsi manipulés pour les déplacer de la boite de transport vers la cage d’hébergement. Lors de cette manipulation, il est implanté la puce télémétrique. Ensuite vient la phase d’acclimatation où les animaux vont s’habituer progressivement à leur nouvel environnement et à la visite quotidienne des techniciens animaliers. Dès leur arrivée et pendant l’acclimatation, une récompense alimentaire sera distribuée aux animaux de type, graine à décortiquer, popcorn... Puis durant la procédure après chaque manipulation sur l’animal, afin de récompenser et favoriser l’acceptation des gestes. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites via un suivi clinique. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les injections pour les anesthésies et les traitements seront réalisés par voie sous-cutanée, moins nocive que la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. L’euthanasie au pentobarbital pouvant provoquer des douleurs, les animaux seront anesthésiés avant l’injection létale. Les prélèvements de sang seront espacés de plus d’une semaine.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris humanisée est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 500 souris sont utilisées sur trois ans pour 465 études précliniques, soit 100 à 400 souris par molécule testée, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont sensibilisées à des allergènes puis soumises à une épreuve qui peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, certaines lignées étant humanisées par greffe de cellules humaines. 12 400 sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général" après avoir reçu des candidats médicaments, et 2 100 passent au projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite d'en commander pour la formation. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation venant des études des années antérieures et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 500 souris seront utilisées, couvrant une période de [MODIFICATION] 3 ans, permettant de réaliser 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Effets d’une combinaison thérapeutique : Stimulation magnétique trans-spinale répétitive et rééducation locomotrice dans le cadre des lésions médullaires traumatiques.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À J0, 100 des 120 souris femelles subissent une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, puis, sept jours plus tard, deux semaines de stimulation magnétique pour quarante d'entre elles et quatre semaines de tapis roulant, deux fois dix minutes par jour, pour quarante autres. Toutes passent huit sessions de tests comportementaux, champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant, d'environ 45 minutes chacune, reçoivent des injections de traceurs au cours d'une chirurgie de 50 minutes, et sont mises à mort à J42 pour prélever la moelle et l'encéphale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et visent à savoir si la combinaison des deux traitements améliore la récupération motrice plus que chacun pris séparément. Sur les atteintes subies, le résumé tient en deux lignes, "Paralysie des membres postérieurs" et "Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s'abreuver après le réveil", pour une lésion médullaire suivie pendant six semaines.
Objectifs
La moelle épinière joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du système nerveux central. Elle permet la transmission des informations entre le cerveau et le reste du corps. Lorsqu’elle est lésée, les conséquences peuvent être majeures, entraînant une perte partielle ou totale de fonctions en dessous du niveau de la lésion. Ces lésions représentent ainsi des atteintes neurologiques graves, responsables de handicaps importants et durables pour les patients. La rééducation locomotrice constitue actuellement l’une des principales approches utilisées pour favoriser la récupération fonctionnelle. Toutefois, les améliorations obtenues restent souvent limitées. Dans ce contexte, de nouvelles approches capables de renforcer ces mécanismes de récupération sont activement recherchées. Parmi les stratégies prometteuses figure la stimulation magnétique trans-spinale répétitive, une technique non invasive et non douloureuse. Nous émettons l’hypothèse que la combinaison de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice pourrait permettre d’améliorer davantage la récupération motrice que chacune de ces approches utilisées séparément. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de ces stratégies thérapeutiques combinées chez la souris.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet permettra de mieux caractériser les effets combinés de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice sur la récupération fonctionnelle après lésion traumatique de la moelle épinière. Si les effets observés dans ce projet confirment son potentiel thérapeutique, cette approche pourrait constituer une stratégie intéressante pour améliorer la récupération fonctionnelle des patients après lésion médullaire, notamment en complément des protocoles de rééducation actuellement utilisés.
Procédures
120 souris femelles agées de 8 semaines seront utilisées. • Sur celles-ci, à l’exception du groupe control sans lésion, soit 100 souris, sera réalisée, à J0, une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 30 min. • L’ensemble des souris, soit 120 souris, réalisera des tests comportementaux (champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant), aux jours -7, 1, 7, 14, 21, 28, 35 et 42 post chirurgie. La réalisation de ces tests représentera un temps d’environ 45 minutes par souris et par session. • 7 jours après la lésion et ce pendant 14 jours, sous anesthésie générale, un tiers des souris (soit 40 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). • 7 jours après la lésion et ce pendant 28 jours, sur un tiers des souris (soit 40 souris), sera mis en place un protocole de rééducation par tapis roulant. Chacune de ces souris sera entrainée deux fois 10 minutes par jour à raison de cinq jours d’entrainement par semaine. • L’ensemble des animaux (120 souris), sous anesthésie générale, recevra des injections de traceurs rétrogrades au niveau de la moelle lombaire, en dessous du site de lésion. Cette chirurgie sera réalisée en 50 minutes. • L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié, 42 jours après la lésion afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
- Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le réveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (42 jours après la lésion médullaire) afin de procéder aux prélèvements de la moelle et de l’encéphale.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécessaire pour mesurer les effets de ces traitements après lésion médullaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des données issues des études précédemment réalisées dans notre laboratoire ainsi que de la variabilité observée pour les paramètres comportementaux étudiés. Les analyses comportementales nécessitent un effectif de 20 animaux par groupe afin de permettre la mise en évidence de différences significatives entre groupes à l’aide de tests statistiques adaptés (test de Mann-Whitney). Par ailleurs, les analyses histologiques seront réalisées en post-mortem sur un sous-groupe de 10 animaux issus de cet effectif de 20 animaux, nous affranchissant ainsi du recours à un lot supplémentaire d’animaux dédié à ces analyses. Cette stratégie permet d'obtenir la puissance statistique nécessaire tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie et tapis chauffant, et des points-limites adaptés à l’étude seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux effets combinés de deux thérapies dans le cadre des lésions médullaires. Les études préalablement réalisées l’ont été chez la souris. De ce fait, il est important de continuer ces travaux chez la souris. Les lésions médullaires chez l’Homme concerne en premier lieu le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Afin de répondre aux exigences réglementaires de contrôle de qualité de vaccins vétérinaires bénéficiant d’une AMM, ce projet vise à confirmer l’activité de formulations vaccinales destinées aux porcs, au moyen de procédures de classe de gravité sévère.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Les porcs témoins, qui ne reçoivent pas le vaccin, développent hyperthermie, anorexie, diarrhée suivie de méléna, amaigrissement, vomissements, ataxie et prostration après injection d'une souche virulente. 400 porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, à un âge de six à sept semaines pour l'épreuve de peste porcine classique. Ces épreuves servent à libérer des lots de vaccins vétérinaires déjà autorisés, la Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires demandant des tests sur des animaux non-humains pour l'autorisation de mise sur le marché. Après avoir énuméré ces symptômes, le porteur conclut que "Ces tests garantissent la sûreté, l'efficacité et la qualité du produit pour les animaux".
Objectifs
Afin d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires dans la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce projet vise à déterminer l’activité de vaccins destinés à des porcs. Les contrôles d’activité par épreuve se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche (les porcs vaccinés sont protégés). Ils sont effectués sur espèce cible. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats, certains obtenus sur l’animal. Ces tests permettent la libération de milliers de vaccins pour porcs par an.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la libération de milliers de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs.
Procédures
2 administrations sont prévues pour tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute 1 prélèvement sanguin est prévu sur tous les animaux en vigile. L'acte dure moins d'une minute
Impact sur les animaux
Les témoins montrent les symptômes liés à la maladie infectieuse testée. Les dommages liés au test sont une souffrance pour les animaux témoins et une douleur légère avec une augmentation du stress due à des prélèvements, aux injections et aux manipulations. Chez les témoins, les symptômes les plus courants observés dans le cadre de ces tests sont l'hyperthermie, l’anorexie, la diarrhée suivie de méléna, un amaigrissement, des vomissements, des troubles nerveux (ataxie et agressivité) et une prostration. Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux.
Devenir
Les animaux non protégés sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements post-mortem. Tous les autres animaux sont euthanasiés du fait de l'injection d'une souche virulente
Remplacement
La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays tiers destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour l’AMM. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est imposé par la réglementation des pays. La réduction du nombre est possible grâce à la mutualisation de groupes témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont définis. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les porcs sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Les porcs disposent de morceaux de chaînes, de bouts de tuyaux dans leur box pour pouvoir s’occuper. Il est aussi possible de mettre à disposition des jouets à macher et des balles. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce choix résulte du fait que ce soit l’espèce cible. Les porcs doivent avoir entre 6 et 7 semaines pour le contrôle d’activité par épreuve de la peste porcine classique. Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.
MODIFICATION Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris dont le score clinique atteint un seuil jugé critique sont mises à mort avant la fin de l'étude, le porteur écartant les analgésiques au motif qu'ils "modifient la réponse immune étudiée". 5 200 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un allergène alimentaire, arachide ou œuf, jusqu'à quatre fois pour les sensibiliser, puis subissent une épreuve allergique par voie orale, cutanée ou respiratoire, dont les effets déclarés vont jusqu'aux signes neurologiques et aux troubles respiratoires. Une partie sert de donneuse de cellules immunitaires ou de sérum à des souris receveuses déjà sensibilisées, l'ensemble visant l'essai clinique puis la mise sur le marché de préparations vaccinales.
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 3 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène. ---------------- AJOUT :3/ Comprendre et documenter le mécanisme d’action d’un vaccin thérapeutique en opérant le transfert de populations de cellules immunitaires ou sérum d’une souris dite « donneuse », qui aura reçu préalablement le candidat vaccin ou un « placebo », vers une souris dite « receveuse », laquelle aura préalablement été sensibilisée à un allergène alimentaire (ex l’arachide, œufs...) La souris « receveuse » sera alors éprouvée par cet allergène. La réaction allergique sera monitorée et la réponse immunitaire sera analysée ex vivo. Il est attendu que le transfert de certaines cellules immunitaires ou sérum de la souris donneuse permettrait à la souris receveuse sensibilisée de ne pas développer de manifestations cliniques allergiques à la suite d’une épreuve.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin tolérogène. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde. ---------------------------------- AJOUT : Le développement de candidats vaccins tolérogènes constituerait une avancée majeure dans la lutte contre l’augmentation continue de la prévalence des allergies alimentaires. À terme, ces approches innovantes pourraient améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en réduisant le risque de réactions allergiques sévères, voire potentiellement mortelles, à l’échelle mondiale.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). ---------------AJOUT / L’injection de cellules ou sérum par voie intraveineuse génère des signes cliniques légers FIN.-------------- Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). ------------AJOUT Ces signes seront surtout attendus dans les groupes de souris qui ne seront pas vacciné ou encore dans le cadre ayant reçu les cellules ou le sérum des souris « placebo ». FIN ---------------------Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Lésion médullaire et régulation de la pression artérielle : rôle du segment thoracique 2 et modulation sérotoninergique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
33 rates subissent une lésion chirurgicale de la moelle épinière et présenteront une paralysie des pattes arrière, parfois des épaules au bas du corps, avec une vessie vidée à la main chaque jour. 88 rates en tout sont utilisées, 25 anesthésiées environ 4 h 30 sans jamais se réveiller, les 30 dernières opérées deux fois puis hébergées seules et sans enrichissement pendant 48 heures, isolées encore cinq jours, et placées chaque semaine sur un tapis roulant pour mesurer la reprise de la marche. Le niveau de souffrance déclaré est sévère, et toutes sont mises à mort pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur cherche à savoir comment la position de la lésion modifie la pression artérielle dans les heures et le jour qui suivent, et clôt les bénéfices attendus sur une phrase, "Les bénéfices sont à long termes".
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière représentent un problème majeur de santé publique. Au-delà des paralysies et des pertes sensorielles bien connues, elles entraînent souvent de graves troubles du fonctionnement automatique de l’organisme, en particulier au niveau cardiovasculaire. Les patients peuvent ainsi présenter des anomalies de la pression artérielle et du rythme cardiaque, des difficultés de régulation de la température corporelle ou des troubles urinaires et digestifs. Chez les personnes atteintes d’une lésion à la moelle épinière au-dessus de la 6ᵉ vertèbre thoracique, ces complications cardiovasculaires sont particulièrement sévères et constituent une cause majeure de mortalité. Tout de suite après la lésion, la chute importante de la pression artérielle associée à un ralentissement du cœur, représente un risque vital immédiat. Si les mécanismes d’adaptation qui apparaissent à long terme sont aujourd’hui mieux compris, les premières heures et les premiers jours après la lésion restent encore peu étudiés, alors qu’ils sont déterminants pour la survie et le pronostic des patients. Certaines régions de la moelle épinière jouent un rôle clé dans le contrôle cardiovasculaire. La zone de la moelle épinière lésée joue un rôle prépondérant dans les symptômes observés chez les patients et dans la capacité des traitements pharmacologiques à être efficaces. Ce projet vise à comprendre comment la position d’une lésion de la moelle épinière peut modifier la pression artérielle chez le rat, immédiatement après la blessure et le lendemain, et à identifier les régions de la moelle qui sont importantes pour réguler le cœur et la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche a pour but d’approfondir nos connaissances sur les problèmes cardiovasculaires qui surviennent après une lésion de la moelle épinière, notamment au niveau des vertèbres cervicales ou thoraciques hautes. L’objectif est aussi d’étudier comment des médicaments agissant directement sur la moelle épinière pourraient atténuer ces troubles. Même si cette étude est avant tout fondamentale, les résultats obtenus pourraient, à terme, ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et aider à mieux soigner les patients atteints de lésions médullaires, en améliorant la prise en charge de leurs troubles autonomes. Les bénéfices sont à long termes.
Procédures
25 animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse pendant environ 4h30 sans se réveiller de cette chirurgie (animaux non vigile). 33 animaux subiront une lésion médullaire. La chirurgie de la lésion durera environ 40 minutes. Ces animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement (animaux paralysés vigiles pendant 24h puis enregistrement sur animaux non vigiles). 30 animaux seront soumis à 2 chirurgies successives de maximum 1h chacune. Ils seront soumis ensuite à un hébergement individuel sans enrichissement pendant 48h pour permettre leur traitement post-lésionnel, puis encore 5 jours pour suivre leur reprise de la fonction digestive (reprise spontanée). 15 jours après la 2ème chirurgie, ils seront soumis à un test de score moteur pour évaluer la reprise de la marche (marche sur un tapis roulant afin d’évaluer la récupération locomotrice des pattes arrière grâce à notre molécule test) de 3 à 5 minutes sur un tapis roulant toutes les semaines pendant 4 semaines. Ces mêmes rats seront injectés quotidiennement (moins d’une minute) en sous-cutanée et sous lésionnel (traitement chronique) (animaux paralysés vigiles pendant 28 jours).
Impact sur les animaux
Des animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Cette paralysie entrainera un stress lié à leur condition pendant 3 à 4 jours, le temps de s’adapter à leur environnement. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement et pourra engendrer un stress transitoire de quelques minutes. Pendant 2 jours post-lésionnel, ils seront placés en hébergement individuel sans enrichissement pouvant induire de l’inconfort. Après la réintroduction de l’enrichissement, ils resteront isolés 5 jours maintenant le stress de la séparation avec un congénère. Toutes les semaines pendant 5 minutes les animaux subiront un stress car ils seront placés sur un tapis roulant pour évaluer leur marche
Devenir
Les animaux seront prélevés post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les troubles cardiovasculaires qui apparaissent après une lésion de la moelle épinière. La régulation de la pression artérielle et du rythme cardiaque repose sur des interactions complexes qui se désorganisent profondément suite à une lésion médullaire. Sans données expérimentales obtenues directement sur des modèles animaux, il est impossible de créer des modèles informatiques précis ou d'évaluer l'effet de médicaments ciblant ces circuits. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour atteindre les objectifs de cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour permettre des analyses statistiques robustes et se base sur le n des lots enregistrés dans le précédent projet. Par ailleurs, une pré-étude exploratoire sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux afin d’évaluer la pertinence du traitement pharmacologique en fonction du niveau de lésion. Cette approche permettra de cibler le niveau lésionnel le plus pertinent et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les interventions chirurgicales et les soins réalisés s’appuient sur l’expérience de l’équipe avec ce modèle de lésion de la moelle épinière, ainsi que sur les recommandations publiées par d’autres équipes spécialisées. L’ensemble du protocole a été validé par l’équipe vétérinaire du site, et des ajustements ont été mis en place au fur et à mesure des difficultés rencontrées, toujours en concertation avec le vétérinaire. Les animaux seront opérés sous anesthésie générale par inhalation. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés pendant et après l’intervention, en combinant plusieurs types d’antalgiques, et seront poursuivis pendant au moins trois jours afin de limiter l’inconfort. Après la lésion, l’environnement des animaux sera spécialement adapté : accès facilité à l’eau et à la nourriture, revêtements antidérapants pour aider aux déplacements, et alimentation liquide pendant les premiers jours afin de prévenir les troubles digestifs. Lorsque les animaux ne peuvent pas uriner seuls, la vessie sera vidée manuellement plusieurs fois par jour, et un traitement antibiotique sera administré pour prévenir les infections. Des critères d’arrêt stricts, définis avec l’équipe vétérinaire, seront appliqués tout au long de l’étude afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle dont la physiologique reste malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière suite à une lésion. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets, correspondant à des rats femelles âgés de 6 à 7 semaines au moment de l’implantation, et donc de 8 à 9 semaines au moment de la lésion.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par le métapneumovirus humain (hMPV) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par le métapneumovirus humain, 1 350 souris développent une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires que le porteur annonce comme attendues, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Elles subissent des gavages, des injections intramusculaires, intranasales et rétro-orbitaires, ces dernières pouvant provoquer un saignement autour de l'œil, ainsi qu'une vaccination par électroporation susceptible d'entraîner un problème de mobilité. Aucun anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur expliquant que ces molécules "pourraient interférer avec nos résultats". Le nombre de souris par procédure n'est pas donné, renvoyé au protocole, et la mesure de la respiration peut immobiliser chaque souris jusqu'à trois heures sans que sa fréquence soit précisée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal la modélisation, la caractérisation et l’utilisation de modèles murins précliniques pour l’étude des infections par le métapneumovirus humain (hMPV), incluant les différentes souches virales, dans le but de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer de nouvelles stratégies de traitements. Plus précisément, les objectifs sont les suivants : (1) Développement et validation de modèles murins d’infection par le hMPV : -Utiliser des lignées murines sensibles à l’infection afin de reproduire les différentes formes cliniques de la maladie ou réaliser de l’adaptation virale chez nos modèles murins, -Evaluer le mécanisme de l’infection, la multiplication ainsi que la répartition du virus dans les tissus. (2) Caractérisation des réponses immunitaires : -Etudier la réponse immunitaire et inflammatoire induite par le virus, notamment dans les poumons et autres organes (système nerveux central, intestin, ORL, foie), -Identifier les paramètres associés aux formes plus sévères ou prolongées de la maladie. (3) Evaluation de vaccins ou traitements candidats : -Tester l’efficacité de nouvelles molécules antivirales, modifiant le système immunitaire ou encore de vaccins pour limiter la quantité de virus, réduire les symptômes et prévenir les complications, -Etudier les mécanismes d’action des ces traitements in vivo. (4) Application des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) : -Effectuer une analyse à grande échelle préalable des molécules sur des modèles cellulaires pour réduire l’utilisation d’animaux, -Optimiser les plans expérimentaux pour minimiser le nombre d’animaux et réduire leur inconfort.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les hPMV et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par le muscle, - Par le nez, - Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. L’acquisition comprendra entre 5 minutes et 1h d’adaptation permettant à la souris de stabiliser sa respiration et entre 5 minutes et 2h d’acquisition de données. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Avant la perfusion terminale, un antidouleur sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques (comme la pléthysmographie). Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. -Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. -Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. -Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. -Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. -Pléthysmographie : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. -Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève. Vaccination par électroporation : peut entrainer un problème de mobilité. L’infection par le virus hMPV peut entraîner altération de l’état général (aspect du poil, posture), perte de poids, fièvre, modifications comportementales et respiratoires. Ces paramètres sont suivis via une grille de score spécifique. Une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires sont attendues et évaluées respectivement par analyses respiratoire et d’organes.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront mis à mort conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature. Ainsi que des souris âgées de 70-78 semaines afin d’étudier l’effet de hMPV chez les individus âgés.
Recherche préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques contre la maladie polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Gavées ou injectées jusqu'à deux fois par jour pendant dix semaines, après une délétion du gène Pkd1 déclenchée par tamoxifène, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous isoflurane, précédée ou non d'une exsanguination. Les kystes rénaux qui se forment dégradent progressivement la fonction rénale, avec déshydratation et dégradation de l'état général. Le projet cherche des composés contre la polykystose rénale, maladie pour laquelle un seul traitement existe aujourd'hui. Le porteur énumère les effets indésirables attendus sans y compter la paralysie, et prévoit par ailleurs de la nourriture mouillée et de l'eau gélifiée près de la souris paralysée par le tamoxifène.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité et la tolérance de nouveaux composés thérapeutiques dans un modèle murin pertinent de polykystose rénale. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris dont la délétion du gène Pkd1, dont la mutation est responsable de 80-90% des cas de polykystose rénale chez l’humain, est induite par administration de tamoxifène. Ce modèle inductible permet de travailler avec l’inactivation du gène uniquement à l’âge adulte, car son inactivation globale est létale in utero. Ce modèle présente l’avantage d’une bonne homogénéité phénotypique et permet l’utilisation de l’ensemble des animaux générés, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux. Suite à l’induction, les animaux recevront les composés d’intérêt afin d’évaluer leur impact sur la progression de la maladie, notamment sur le développement des kystes rénaux et les paramètres fonctionnels associés.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour la polykystose rénale autosomique dominante. En effet, actuellement, on estime à environ 12 millions le nombre de patients au niveau mondial. Plus de la moitié des patients progressent en insuffisance rénale terminale nécessitant une dialyse ou une transplantation rénale avant 65 ans. Actuellement seul un traitement est disponible, le tolvaptan, mais il ne fait que limiter la progression de la maladie chez certains patients et induit une forte polyurie, ce qui fait que des patients ne continuent pas le traitement. Ce projet vise à permettre le développement de nouveaux médicaments en s’appuyant sur un modèle murin pertinent permettant d’étudier la progression des kystes et la fonction rénale. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension de la maladie et au développement préclinique de candidats médicaments, avec pour objectif à terme de ralentir l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale et d’améliorer la prise en charge des patients, tout en s’inscrivant dans une démarche de réduction et de raffinement de l’utilisation des animaux.
Procédures
1) Induction de la maladie par administration orale de tamoxifène 2) Afin de suivre le développement de la maladie, 5 prélèvements sanguins pourront être réalisés à la veine submandibulaire (50 à 100µl, 30 secondes chacun, réalisés sous anesthésie) 3) l’imagerie des reins par rayon X nécessite l’injection en intraveineux d’un produit de contraste (moins de 60 secondes, réalisée sous anesthésie) 4) Afin de relier l’efficacité des composés à leurs taux sériques, une pharmacocinétique pourra être effectuée une fois par étude. Ainsi, au maximum 3 prélèvements de maximum 30 μL de sang par souris (veine saphène médiale ou veine submentale en moins de 30 secondes, réalisé sur souris vigiles) seront réalisés pendant la même journée ou étalés sur 2 journées. Le volume total de ces prélèvements n’excédera pas 10% du volume sanguin des souris et les prélèvements seront effectués sur animaux vigiles. 5) Pose du dispositif du Medibeacon mesure de la filtration glomérulaire, les animaux sont rasés et épilés, mise en place d’un petit capteur (1 cm2) sur le dos, fixé par du sparadrap, placement vigile en cage individuelle pendant 1h puis retour dans sa cage d’origine, maximum 1 fois pendant l’étude. 6) Injection par voie veineuse rétro-orbitaire d’une sonde fluorescente (2mL/kg) sous anesthésie gazeuse (isoflurane, induction : 2.5-5% / Maintien : 2-3%), la même anesthésie ayant servi à la pose du dispositif du Medibeacon, maximum 1 fois pendant l’étude. 7) Les composés et leurs solvants seront administrés soit par gavage (maximum deux fois par jour) ou injection sous cutanée (maximum deux fois par jour) pendant 10 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile. 8) En fin d'étude ou le cas échéant pour des raisons éthiques, les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’isoflurane, par dislocation cervicale précédée ou non d’une exsanguination (sans ouverture de l’abdomen).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus dans ce projet sont principalement liés au développement progressif de la polykystose rénale ainsi qu’aux procédures expérimentales mises en œuvre. L’induction de la délétion du gène Pkd1 entraîne l’apparition de kystes rénaux conduisant à une altération progressive de la fonction rénale, pouvant se traduire par une dégradation de l’état général (‘Body Condition Scoring for Mice’), une déshydratation ou des signes d’inconfort. Les administrations de tamoxifène et des composés testés, réalisées par voie orale ou systémique, peuvent également induire un stress transitoire lié à la contention ainsi que des effets indésirables propres aux molécules administrées. Les prélèvements sanguins répétés pour le suivi du BUN sont susceptibles de provoquer un inconfort modéré et un stress ponctuel. L’imagerie par micro-CT, bien que non invasive, nécessite une anesthésie nécessaire à l’injection intraveineuse du produit de contraste et au maintien des animaux lors de l’analyse, pouvant entraîner un stress physiologique transitoire ainsi que de faibles risques de complications liés à l’injection intraveineuse (irritation locale, inflammation, extravasation ou difficulté d’injection) et à l’anesthésie. L’analyse de la fonction rénale nécessite également une anesthésie de courte durée ainsi qu’une injection intraveineuse de produit fluorescent. Le positionnement du capteur Medibeacon sur la peau à l’aide d’un adhésif peut provoquer une irritation cutanée légère et transitoire au niveau de la zone de fixation. En cas de plaie ouverte, elle peut être nettoyée avec de la vétédine pour désinfection et du Vétramil sera ajoutée pour améliorer la récupération. Comme pour toute administration intraveineuse, de faibles risques de complications locales tels qu’une irritation, un hématome ou une extravasation peuvent être observés. Enfin, l’évolution de la maladie peut conduire à une dégradation de l’état clinique en fin d’étude. Afin de limiter ces nuisances, les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier avec des points limites prédéfinis, et toute souffrance sera réduite au maximum par des mesures adaptées, incluant si nécessaire une euthanasie anticipée. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé, dans le respect des bonnes pratiques et des principes de raffinement.
Devenir
Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés pour l’analyse de la physiopathologie.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle cellulaire ni organoïde ne permet de reproduire fidèlement l’ensemble des mécanismes impliqués dans la formation des kystes rénaux, ni la complexité architecturale et cellulaire des structures rénales associées à cette pathologie. Cette limite expérimentale rend indispensable le recours à des modèles in vivo pour évaluer de manière pertinente l’efficacité et la tolérance de candidats médicaments. Les études chez l’animal permettent en effet de préserver l’intégrité des organes concernés ainsi que les interactions cellulaires, tissulaires et systémiques impliquées dans le développement de la maladie. Elles constituent ainsi une étape essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques et pour évaluer le potentiel thérapeutique de stratégies innovantes..
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Le modèle choisi présente une bonne reproductibilité et une homogénéité du développement de la maladie, permettant de limiter la variabilité expérimentale et donc le nombre d’animaux requis par groupe. De plus, l’ensemble des animaux générés pourra être inclus dans les études grâce à l’induction contrôlée de la maladie après la naissance. Le suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps, notamment par imagerie µCT et analyses sanguines répétées, permettra également de limiter le nombre total d’animaux nécessaires en évitant la constitution de cohortes supplémentaires à différents temps expérimentaux.
Raffinement
Les points finaux ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des animaux. Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, pour préserver leurs interactions sociales. L’environnement est enrichi par des objets adaptés à l’espèce avec une mise en place de matériel permettant la nidification Les animaux sont observés quotidiennement. Les animaux sont anesthésiés pour les gestes générant du stress dans la mesure du possible, lorsque la procédure le permet.. Dans le cas des paralysies potentielles (et possiblement transitoires), liées à l’administration de tamoxifène, de la nourriture mouillée et de l’eau gélifiée sera mise près de l’animal paralysé.
Choix des espèces
L’utilisation de souriceaux est nécessaire dans ce projet car l’induction de la délétion du gène Pkd1 doit être réalisée à un stade précoce du développement post-natal afin d’obtenir un modèle de polykystose rénale reproductible et compatible avec l’évaluation thérapeutique. Une induction réalisée chez des animaux plus âgés entraîne une progression plus lente et plus variable de la maladie, moins adaptée aux objectifs de l’étude. L’administration de tamoxifène à l’âge de 17 jours permet d’obtenir un développement homogène des lésions rénales pour le suivi expérimental et l’évaluation des traitements pendant l’âge adulte. Ce choix est donc indispensable pour garantir la pertinence scientifique du modèle et limiter la variabilité expérimentale.
Rôle de CaMK1D dans l’anorexie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées sans réveil au terme du protocole, pour que leurs tissus soient prélevés, 420 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La nourriture leur est retirée vingt-deux heures par jour pendant trois jours, restituée de 17 h à 19 h, avec une roue de course en accès permanent, et elles peuvent perdre du poids, devenir hypothermes et voir leur état général se dégrader, ce que le porteur nomme "les paramètres d'intérêt scientifique du projet". Chacune est hébergée seule pendant toute la durée du protocole. Le protocole démarre au quarantième jour de vie, période péripubertaire que le porteur présente comme la fenêtre de vulnérabilité maximale, et seules des femelles sont utilisées, la maladie humaine touchant principalement des femmes jeunes.
Objectifs
L'anorexie nerveuse est un trouble du comportement alimentaire sévère caractérisé par une restriction volontaire et excessive de la prise alimentaire et une hyperactivité physique. Elle touche principalement les femmes jeunes et représente le trouble psychiatrique avec le taux de mortalité le plus élevé. Malgré son impact considérable sur la qualité de vie et la survie, aucun traitement pharmacologique efficace n'existe à ce jour. On sait que la sensation de faim est contrôlée par une région du cerveau qui intègre les signaux du corps indiquant un déficit énergétique. Dans l'anorexie, les neurones qui déclenchent normalement la sensation de faim semblent incapables de générer une réponse suffisante malgré la restriction alimentaire et la perte de poids. Mais le mécanisme précis par lequel cette dysfonction s'installe reste inconnu. Des études génétiques menées chez des patients atteints d'anorexie nerveuse ont identifié des variants de certains gènes comme facteurs de risque de la maladie. Nos recherches ont identifié des protéines présentes dans les neurones de la faim qui semblent contrôler leur capacité à répondre aux signaux de déficit énergétique. En l'absence de ces protéines, les neurones de la faim répondent de façon altérée à la restriction alimentaire. Ce projet vise à comprendre comment ces protéines contrôlent la vulnérabilité à l'anorexie, et à évaluer si agir sur elles pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique pour aider les personnes atteintes d'anorexie nerveuse à rétablir une prise alimentaire normale et améliorer leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre pourquoi certains individus sont plus vulnérables que d'autres à développer une anorexie, en identifiant comment des protéines présentes dans les neurones de la faim contrôlent la réponse du cerveau à la restriction alimentaire. Ces connaissances combleront une lacune majeure dans la compréhension de l'anorexie nerveuse, pour laquelle aucun traitement pharmacologique efficace n'existe à ce jour. À plus long terme, comprendre ce mécanisme ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements capables de restaurer la capacité du cerveau à déclencher la sensation de faim chez les personnes atteintes d'anorexie nerveuse. Cela représente un enjeu majeur car cette maladie est associée au taux de mortalité le plus élevé parmi les troubles psychiatriques et touche principalement des femmes jeunes. Les découvertes réalisées dans ce projet pourraient également s'appliquer à d'autres formes d'anorexie associées au cancer, au vieillissement ou aux maladies inflammatoires chroniques, élargissant ainsi considérablement leur impact potentiel sur la santé humaine
Procédures
Le projet comprend trois groupes expérimentaux de souris femelles adolescentes. Le groupe ABA (anorexie basée sur l'activité) est soumis à une restriction alimentaire de 2 heures par jour pendant 3 jours, avec accès permanent à une roue de course. Le groupe restriction alimentaire sans roue est soumis à la même restriction sans accès à la roue, afin de distinguer l'effet de la restriction seule de l'effet combiné restriction et hyperactivité. Le groupe contrôle conserve un accès libre à la nourriture avec accès à la roue. Restriction alimentaire, sur animal vigile. Réalisée sur les groupes ABA et restriction sans roue pendant 3 jours consécutifs. La nourriture est retirée et restituée 2 heures par jour de 17h00 à 19h00. Chirurgie terminale sans réveil. Réalisée une seule fois sur l'ensemble des animaux à l'issue de la phase de récupération, sous anesthésie générale profonde et précédée d'une analgésie. Cette intervention permet le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses et entraîne la mise à mort de l'animal sans réveil. Durée totale de la procédure, environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés à la restriction alimentaire et à l'hyperactivité physique qui constituent le modèle étudié. Durant la phase de restriction alimentaire, les souris pourront présenter une perte de poids progressive, une réduction de la prise alimentaire volontaire, une hypothermie et une altération de l'état général. L'hyperactivité sur la roue de course associée à la restriction alimentaire constitue la procédure la plus contraignante de ce protocole et peut engendrer une fatigue physique et un stress modéré à sévère. Ces manifestations sont inhérentes au modèle d'anorexie basée sur l'activité et représentent les paramètres d'intérêt scientifique du projet. L'hébergement individuel pendant toute la durée du protocole peut engendrer un stress lié à l'isolement social. La phase de récupération après rétablissement de l'accès libre à la nourriture peut s'accompagner d'une hyperphagie transitoire sans danger pour l'animal. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience. Globalement les effets indésirables attendus sont modérés à sévères durant la phase de restriction alimentaire. À l'issue de l'étude les animaux sont mis à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie profonde.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue du protocole pour permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses, ou en cours d'expérience lors de l'atteinte des points limites afin d'abréger toute souffrance.
Remplacement
Les questions posées dans ce projet nécessitent d'étudier comment les neurones de la faim répondent à une restriction alimentaire prolongée associée à une hyperactivité physique, et pourquoi certains individus génétiquement modifiés sont plus vulnérables que d'autres à développer un comportement anorexique. Ces phénomènes font intervenir des interactions complexes entre les circuits neuronaux hypothalamiques, les signaux hormonaux périphériques et le comportement alimentaire et moteur qu'aucun modèle informatique ou culture cellulaire ne peut reproduire. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont de ce projet pour valider les mécanismes moléculaires impliqués. Ces expériences permettent de réduire le recours à l'animal en limitant les expériences chez la souris aux seules questions qui ne peuvent pas être résolues autrement. Cependant le recours à l'animal vivant est indispensable. La mesure du comportement alimentaire, de l'hyperactivité physique sur roue de course et de la vulnérabilité individuelle à l'anorexie nécessite un organisme intègre. Enfin l'utilisation de souris génétiquement modifiées est la seule approche permettant de démontrer le rôle causal des protéines étudiées dans ce contexte. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable et ne peut pas être remplacée par des alternatives non animales pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d'un calcul statistique rigoureux réalisé à partir de données préliminaires disponibles au laboratoire sur la prise alimentaire et le poids corporel de souris soumises à un jeûne prolongé. Ce calcul garantit que le nombre d'animaux utilisés est suffisant pour obtenir des résultats fiables, sans être supérieur au strict nécessaire. Il indique un effectif de 15 animaux par groupe auquel un coefficient de 25% est ajouté pour tenir compte des pertes éventuelles liées aux points limites, portant l'effectif à 20 animaux par groupe. Le projet comprend trois conditions expérimentales, le protocole d'anorexie basée sur l'activité (ABA) qui associe restriction alimentaire et accès à une roue de course, la restriction alimentaire sans roue de course et le groupe contrôle avec accès libre à la nourriture. Ces trois conditions sont appliquées à sept génotypes distincts, soit un total de 420 animaux sur l'ensemble du projet. Les groupes contrôles sont mutualisés entre les lignées, chaque lignée étant comparée à ses propres animaux de la même portée afin de s'affranchir de la variabilité liée aux fonds génétiques issus des croisements. Plusieurs mesures sont prises pour limiter le nombre total d'animaux utilisés. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont pour valider les hypothèses mécanistiques et limiter le recours à l'animal aux seules questions ne pouvant pas être résolues autrement. Les tissus prélevés lors de la mise à mort sont partagés entre toutes les analyses prévues afin qu'un même animal contribue simultanément à l'ensemble des mesures sans nécessiter d'animaux supplémentaires. L'utilisation d'animaux de la même portée comme contrôles permet de réduire la variabilité entre les individus et donc le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Plusieurs mesures concrètes sont mises en place pour réduire au minimum le stress et la souffrance des animaux tout au long de ce projet. Les animaux sont manipulés régulièrement par le même opérateur avant le début du protocole afin de les habituer à la contention. Chaque animal est observé quotidiennement et tout animal atteignant un point limite est mis à mort immédiatement par dislocation cervicale, afin de ne pas prolonger sa souffrance. Les cages individuelles sont enrichies avec des matériaux de nidification, un abri en carton, du coton et un tube permettant la préhension sans saisie manuelle directe. Les cages sont transparentes et disposées côte à côte afin de maintenir un contact visuel, olfactif et auditif entre les animaux malgré l'hébergement individuel. La roue de course est introduite lors de la phase d'acclimatation de 4 jours avant la restriction alimentaire. Tout au long du projet, une veille scientifique est assurée afin d'intégrer les nouvelles techniques de raffinement disponibles. Toute évolution des recommandations en matière de bien-être animal sera immédiatement prise en compte.
Choix des espèces
L'anorexie nerveuse implique des interactions complexes entre les circuits neuronaux hypothalamiques, les signaux hormonaux périphériques et le comportement alimentaire et moteur qui ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant entier. Les organismes plus simples comme la mouche du vinaigre ou le ver de terre ne possèdent pas de région cérébrale comparable à celle étudiée dans ce projet, ni de neurones équivalents aux neurones de la faim de la souris et de l'homme. Ils ne permettent donc pas d'étudier la vulnérabilité à l'anorexie basée sur l'activité ni le comportement alimentaire dans ce contexte. De plus les outils génétiques utilisés dans ce projet sont spécifiquement développés et validés chez la souris. Le recours à la souris est donc indispensable et constitue le modèle le plus pertinent scientifiquement tout en représentant le niveau de complexité biologique minimal requis pour répondre aux questions posées. Le protocole ABA est réalisé à partir du jour postnatal 40, soit environ 5 semaines et demi. Cet âge correspond à la période péripubertaire qui représente la fenêtre de vulnérabilité maximale à l'anorexie basée sur l'activité chez la souris, en cohérence avec l'épidémiologie de l'anorexie nerveuse qui débute le plus fréquemment à l'adolescence chez les patients. Des souris femelles sont utilisées en raison de la prévalence majoritairement féminine de cette maladie et de la robustesse du phénotype ABA documentée chez les femelles dans la littérature.