Procédures sévères

Injectés au stade embryonnaire puis anesthésiés jusqu'à une fois par jour pour des séances d'imagerie de une à deux heures, certains intubés quatre heures d'affilée pendant près d'un an, 680 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères. Les adultes porteurs de mélanomes nagent moins droit et moins vite, développent des abcès ou des œdèmes, respirent mal, mangent moins et s'éloignent de leurs congénères, et les larves de moins de quinze jours, hébergées seules pour le suivi, peuvent souffrir de l'isolement. Le porteur écrit pourtant que des points limites ont été établis pour éviter "toute souffrance animale". Tous sont mis à mort en fin de procédure, pour les prélèvements et pour empêcher les tumeurs de croître davantage.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Modification: l'utilisation d'une approche CRISPR permet de substituer une lignée transgénique et diminuer le nombre d'animaux.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.

Procédures

Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) . Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum , sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie , jusqu'à une fois toutes les deux semaines. Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.

Réduction

Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Modification: l'utilisation de CRISPR permet de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie. Modifications: amélioration de l'anésthésie et enrichissement des aquariums. Suppression du génotypage.

Choix des espèces

Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.

Quarante pour cent de nourriture en moins pendant vingt et un jours, et jusqu'à trente-sept jours seules en cage : 118 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes mises à mort pour collecter leurs organes. Elles reçoivent une chimiothérapie, cinq à sept injections dans le ventre, autant sous la peau, jusqu'à seize administrations orales d'un probiotique et deux à trois prises de sang sous anesthésie. Le porteur écrit que la chimiothérapie ne devrait induire "que pas ou peu d'effets secondaires sur le bien-être de l'animal", et rapporte la faim à la restriction calorique. Des souris mâles C57BL6J de treize semaines ont été retenues pour la connaissance de leur flore intestinale, l'isolement étant maintenu pendant la renutrition pour éviter des combats que le porteur juge susceptibles de tuer des animaux non-humains.

Objectifs

La dénutrition associée à une altération de l'absorption intestinale est un phenomène couramment observé après une chirurgie de l'intestin ou une chimiotherapie. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte dont la fonction intestinale est dégradée. Un probiotique se définit comme un microorganisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de chimiothérapie chez la souris. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses dérivés peut limiter les effets de cette chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter les effets secondaires d'une chimiothérapie et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients traités par chimiothérapie afin de limiter les éffets secondaires associés, mais aussi des patients ayant subit une intervention chirurgicale de l'intestin qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.

Procédures

- Individualisation des animaux : 106 souris au maximum pendant une durée maximum de 37 jours. - Restriction alimentaire : 106 souris maximum pendant 21 jours - Prélèvement de sang sur l'animal anesthésié : 2 à 3 fois maximum pour 110 souris maximum,cela prend moins d'une minute. - 5 à 7 Injections dans le ventre sur l'animal vigile : 110 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. - 5 à 7 injections sous la peau sur animal vigile : 110 souris maximum, le geste prend moins d'une minute. 16 administrations orales maximum d'un probiotique : 70 souris maximum.

Impact sur les animaux

- Le stress lié au traitement par chimiothérape ne devrait induire que pas ou peu d'effets secondaires sur le bien-être de l'animal. - La sensation de faim associée à une restriction calorique de 40% de leur prise alimentaire moyenne. Ce temps de restriction sera de 21 jours maximum. - Le stress associé à l'individualisation des animaux pendant la durée de l'expérience en cas de restriction calorique. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. - Le stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal. - Le stress associé aux prélèvements sanguins qui seront espacés d'au moins 7 jours et seront fait sous anesthésie. - Le traitement par un probiotique ou ses dérivés qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue une petite quantité de solution qui sera alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute. le stress associé à une injection sous la peau et la contention associée de moins d'une minute.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une chimiothérapie éventuellement associée à une restriction calorique ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte étudié.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Nous avons prévu de réaliser ce projet de manière séquentielle et de ne réaliser les procédures que si les résultats précédents le justifie. Dans une optique de réduction, nous allons également prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, foie, tissu adipeux, par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, nous n'utiliserons que des animaux de plus de 20g au debut du projet. Les animaux seront pesés à minima toute les semaines afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie suivis d’un point de compression jusqu’à l’arrêt complet du saignement. En cas de restriction calorique, les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement probiotique ou par ses dérivés se fera en déposant délicatement une petite quantité de solution dans le creux de la joue. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser les effets d'une chimiothérapie chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris C57BL6J mâles de 13 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement)

Pour identifier des marqueurs de la réponse aux antidépresseurs, 7 776 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes mises à mort pour prélever le sang, le cerveau et des organes. Elles subissent un stress chronique de deux à trois heures par jour pendant huit à douze semaines, jusqu'à soixante injections quotidiennes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie du crâne de vingt minutes à cinq heures suivie de neuf semaines d'hébergement individuel. Le porteur annonce des batteries hebdomadaires de trois tests répétés quatre fois, puis une batterie finale de quatre à dix tests, sans nommer aucun de ces tests comportementaux. Le stress infligé doit provoquer dépression, anhédonie, anxiété et retrait social, et les points limites déclenchent un renforcement des antalgiques ou la mise à mort.

Objectifs

Ce projet répond à un besoin urgent de meilleure prise en charge du trouble dépressif majeur. Il repose sur la récente découverte d'un facteur de transcription en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la dépression qui (i) permet de développer des stratégies innovantes d’identification de biomarqueurs précoces de la réponse, non réponse aux antidépresseurs, (ii) s'appuie sur des mécanismes biologiques robustes, plausibles et novateurs, (iii) sont transposables à la physiopathologie humaine, ainsi qu'aux phases de Recherche et Développement et aux futurs essais cliniques. Les antidépresseurs occupent une place centrale dans la prise en charge de la dépression, grâce à leur accessibilité étendue et à leur efficacité prouvée, qui s'avère similaire d'un médicament à l'autre. En utilisant des antidépresseurs classique, nous voulons vérifier si les biomarqueurs de la réponse au traitement antidépresseur , (i) dépendent des propriétés spécifiques de l'antidépresseur, comme sa capacité à bloquer la recapture d’un neurotransmetteur en particulier, (ii) peuvent être corréler à des modification les fonctions cérébrales impactés par le trouble dépressif majeur, (iii) peuvent être la cible de modification l’expression génétique permettant d’établir un lien entre vulnérabilité ou résilience au stress. Pour mieux refléter la complexité des situations cliniques, nous proposons d’évaluer ces traitements dans des modèles murin de stress chroniques bien établis, intégrant des dimensions physiques, psychologiques et sociales.

Bénéfices attendus

Nous déploierons ensuite des efforts de Recherche et Développement auprès des acteurs cliniques, institutionnels et privés. Les résultats à long terme créeraient idéalement une valeur supplémentaire par rapport aux stratégies thérapeutiques existantes avec des approches « complémentaires », un potentiel d'amélioration majeur dans la pharmacologie du trouble dépressif majeur (action rapide, meilleure efficacité). Une prise en charge pharmacologique plus abordable de la dépression signifie (i) une guérison plus précoce réduisant les souffrances et les effets secondaires inutiles, (ii) une amélioration de la qualité de vie des 300 millions de personnes souffrant de dépression dans le monde et de leurs familles, (iii) réduction du fardeau social et des coûts de santé publique.

Procédures

Une partie des souris subiront une procédure chirurgicale. Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 20-40minutes ou 3-5 heures par souris, accompagnée d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront soumises à une procédure de stress chronique moyen répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 2-3 heures pendant 8-12 semaines. Les animaux stressés recevront une injection quotidienne de l’antidépresseur ou de composés ayant des effets antidépresseurs allant de 1 injection à 60 injections (animal vigile à raison de quelques secondes par animal). Leur état émotionnel d’anxiété/dépression, de nociception et de cognition sera suivi avec tâches comportementales sur animaux vigiles. Ce suivi se fera avec une batterie hebdomadaire de 3 tests répétés 4 fois. La dernière batterie comportementale sera plus complète, elle comportera de 4 à 10 tests et s’étalera sur 1 à deux semaines. Les animaux ayant subis une intervention chirurgicale pour y implanter des électrodes seront suivis avec une batterie comportementale de 5-7 tests répétés en 3 temporalités (avant stress, après stress, après traitement). Leur activité cérébrale sera mesurée en vigile pendant les taches comportementales. La durée d’un test sera de 10 minutes à 1 heure et l’animal effectuera jusqu’à deux tests par jour. Jusqu’à cinq prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, avec une intervention de moins d’une minute. Chaque prélèvement sanguin sera espacé d’au moins 10-15 jours.

Impact sur les animaux

Dans le protocole de stress chronique moyen imprédictible, en plus du stress physique les souris seront soumises de façon répétée à un stress psychologique moyen susceptible de causer des symptômes de dépression, d’anhédonie, d’anxiété, un retrait social chez un sous-groupe d’individus ainsi qu'une perte de qualité de pelage. Ces dimensions seront surveillées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé. Les injections intrapéritonéales chroniques peuvent provoquer des effets secondaires mineurs, ou inconfort comme une douleur légère et transitoire, voir une irritation locale autour du site d’injection. La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire pendant l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant le stress chronique moyen imprédictible pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’éventuellement une augmentation de l’anxiété. Cependant, dans nos conditions expérimentales, l’hébergement individuel n’induit ni stéréotypies ni modifications du comportement émotionnel basal. Les tests de comportement ne montrent pas de changements notables mais nous pouvons considérer une certaine fatigue dans le cadre de batteries de plusieurs tests qui seront répétées au cours du protocole de stress et du traitement antidépresseur.

Devenir

L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Pour une grande partie des animaux du sang, leurs cerveaux et des organes périphériques seront récoltés en vue de procéder à des analyses de biologie moléculaire ou d'anatomie/imagerie et, où chaque animal représente un individu unique.

Remplacement

Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro avec des modèles cellulaires, les effets de la dépression, du stress, et des antidépresseurs se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures d’expérimentations animales décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress ou les drogues sur des circuits neuronaux intacts. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Nous essayons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir effectuer des études invasives qui ne sont pas faisables chez les sujets humains. Avec l’approche translationelle que nous avons adopté, les résultats obtenus au sein de notre laboratoire sont complémentaires de ceux obtenus chez l’homme.

Réduction

Les études prévues nécessiteront l’utilisation de 7776 animaux. Cet effectif représente un maximum. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par un calcul de puissance afin de s'assurer qu'il soit suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux impliqués. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées. Cette approche nous permet de répondre à la question principale du projet et en optimisant l'effectif, nous garantissons non seulement des résultats fiables, mais aussi une minimisation de l'impact sur les animaux.

Raffinement

Les souris seront placées dans une animalerie aux conditions d’hébergement conformes à la réglementation pour l’espèce utilisée. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire). Des points limites spécifiques ont été établis pour permettre d’évaluer l’état de douleur de l’animal agir en conséquence afin d’éviter toute souffrance supplémentaire, soit par un renforcement du traitement antalgique/analgésique, soit par une euthanasie. Pour le suivi post opératoire, une grille de scoring sera mise en place pour garantir le bien-être des animaux. De plus, un anesthésique local sous forme de crème est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au début et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’antiinflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de détérioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront en hébergement individuel pendant environ 9 semaines.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de la dépression clairement établis chez la souris. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des gènes dans le cerveau permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Expériences chez des animaux adultes : Les souris tests seront réceptionnés à l'âge de 6-7 semaines puis utilisés en procédure à l'âge adultes (âge entre 8 et 16 semaines). Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles affectifs à l’âge adulte en prenant en compte la variabilité individuelle et le dimorphisme sexuel.

2 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, chacune pouvant subir jusqu'à cinq injections dans le ventre sans anesthésie, une chirurgie du crâne de trente minutes à une heure trente, puis des sessions d'enregistrement de quatre heures, quotidiennes la première semaine et hebdomadaires ensuite. Une épilepsie du lobe temporal leur est provoquée par injection de kainate directement dans le cerveau, et une partie d'entre elles reçoit en plus des électrodes ou une lentille optique intracérébrale. Le porteur écrit que ces crises ne sont pas douloureuses mais qu'elles génèrent un stress chez la souris. Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, alors que les retombées annoncées pour les patients pharmaco-résistants restent au conditionnel et à trois ou quatre ans de travaux supplémentaires.

Objectifs

L’épilepsie correspond à un ensemble de pathologies qui se caractérisent par une hyperactivité synchronisée de réseaux de neurones du cerveau et qui touche 600000 personnes en France. Il n’existe pas de médicaments permettant de soigner les causes de l’épilepsie mais seulement des anti-épileptiques qui régulent l'activité des réseaux neuronaux excitateurs ou inhibiteurs pour limiter ou empêcher les crises et qui ont de nombreux effets secondaires indésirables. Il est donc urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager les patients pharmaco-résistants aux anti-épileptiques et/ou véritablement soigner l’épilepsie. L'épilepsie du lobe temporal (ELT) est la forme la plus fréquente d'épilepsie focale focale (c.a.d. limitée à une région du cerveau) qui touche environ 60% des patients. Au cours des quinze dernières années, il a été montré que l’ELT s’accompagne d’une réaction inflammatoire au niveau des régions cérébrales les plus touchées, notamment l’hippocampe. Identifier les mécanismes inflammatoires et immunitaires impliqués dans l’ELT pourrait ouvrir la voie à de nouvelles solutions thérapeutiques. Nos travaux sont centrés sur des cellules de soutien des neurones, appelées cellules gliales, qui aident au bon fonctionnement des neurones, et plus récemment, sur les lymphocytes T dans la progression de l’ELT. Les cellules gliales acquièrent des caractéristiques spécifiques dans les aires du cerveau touchées par les crises. Dans un modèle murin d’ELT, nos études suggèrent que les cellules gliales sont responsables d’une modification de la transmission synaptique dans l’hippocampe épileptique. Nous voulons étudier les mécanismes par lesquels les cellules gliales impactent la progression des crises dans notre modèle d’ELT. De plus, nos résultats actuels indiquent que les lymphocytes T ont des effets protecteurs dans ce modèle murin d’ELT et nous voulons identifier les mécanismes impliqués dans cette protection, en ciblant en particulier les voies de signalisation impliquant les cellules gliales.

Bénéfices attendus

De plus en plus de données indiquent que les cellules gliales et immunitaires contribuent à la progression de l’ELT. Identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les dysfonctions des cellules gliales et immunitaires permettrait d’envisager de nouvelles voies thérapeutiques qui ne cibleraient pas les neurones et pourraient avoir moins d’effets secondaires indésirables. Les premiers résultats de ce projet en continuité avec nos travaux actuels seront publiés dans des journaux à comité de lecture en « open access » d’ici deux ans. Les autres parties de ce projet nécessiteront 3 à 4 ans supplémentaires pour être finalisées. A plus long terme, nous discutons régulièrement avec des médecins pour voir comment nos résultats pourraient mener à des développements thérapeutiques pour la prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux de ce projet recevront une ou plusieurs (jusqu’à 5) injections intrapéritonéales pour manipuler pharmacologiquement les cellules immunitaires ou les cellules du système nerveux central. Ces injections sont réalisées sans anesthésie lors d’une contention manuelle. Des injections intracérébrales de virus permettant d’induire l’expression d’un biosenseur fluorescent ou d’inhiber l’expression d’un gène seront réalisées sur une partie des souris. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale lors d’une chirurgie qui dure 30 minutes. Une injection intrapéritonéale d’un analgésique est réalisée avant la chirurgie. L’expression du virus n’entraine aucune douleur ou gène de l’animal. Des injections intracérébrales de kainate ou de solution saline (groupe contrôle) seront réalisées pour induire une épilepsie du lobe temporal chez tous les animaux de ce projet. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale lors d’une chirurgie qui dure 30 minutes. Une injection intrapéritonéale d’un analgésique est réalisée avant la chirurgie. Une partie de ces mêmes animaux sera également implantée, lors de la même chirurgie, avec des électrodes intracérébrales pour suivre l’activité neuronale. Dans ce cas la durée de la chirurgie est d’une heure. Enfin, certains de ces animaux seront implantés lors de la même chirurgie avec une lentille optique intracérébrale pour suivre les variations de fluorescence d’un biosenseur. Dans ce cas la chirurgie dure 1h30. Plusieurs jours après la chirurgie, les animaux équipés d’électrodes intracérébrales et d’une lentille optique seront enregistrés sans anesthésie et libre de leurs mouvements, lors de sessions d’une durée de 4h à des fréquences quotidiennes, pendant la première semaine, ou hebdomadaires, pendant la phase chronique. Pour cela les animaux sont d’abord habitués à la préhension pendant les 3 jours précédents le premier enregistrement qui nécessite de connecter les implants au système d’enregistrement. Pour cela la souris éveillée est maintenue en contention sur une grille et les implants sont connectés au système d’enregistrement via des fils souples qui laissent la souris libre de ses mouvements. L’enceinte d’enregistrement contient de la nourriture et un accès à de l’eau.

Impact sur les animaux

- Contention de l’animal suivie d’une injection intrapéritonéale, ce qui entraine en stress léger et une douleur légère et de courte durée. - Intervention chirurgicale intracérébrale sous anesthésie générale, ce qui peut entrainer une douleur modérée au réveil et pendant 1 jour ou 2. Le comportement des souris est observé pendant la semaine qui suit la chirurgie et tout comportement anormal ou signe physique anormal (perte de poids, prostration, poils ébouriffés…) entrainera une action vétérinaire appropriée (administration d’analgésiques, de serum physiologique, d’antibiotique). - Le modèle d’épilepsie utilisé dans ce projet déclenche des crises d’épilepsie dans une région particulière du cerveau (crise focale). Ces crises ne sont pas douloureuses mais génèrent un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort. Les organes, en particulier le cerveau, seront prélevés pour réaliser des études histologiques, moléculaires, cellulaires et physiologiques.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les relations entre différents types cellulaires du cerveau et du système immunitaire au cours des différentes phases de l'épilepsie. Ces cellules sont par nature très sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans l’épilepsie il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Les études récentes montrent que les propriétés morphologiques, moléculaires et physiologiques des cellules gliales du cerveau placées en culture diffèrent de façon substantielle de celles des cellules gliales in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent à terme identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant avoir un impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Pour définir statistiquement la taille des lots d’animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés ainsi que sur une évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris « tests/KO » avec les souris « contrôles » issues des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.

Raffinement

Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (abri, buchette, et coton pour le nid). Nous manipulerons les animaux régulièrement pour les habituer à notre présence. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et application d’analgésique. Tout au long de chaque procédure, les animaux seront surveillés (quotidiennement après les chirurgies puis de façon hebdomadaire). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer la santé des animaux et apporter les réponses adaptées. Nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité, décrit dans les points limites. Pour aider à la prise de décision, cette grille de score contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par euthanasie.

Choix des espèces

Les souris sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. Le modèle d’épilepsie du lobe temporal que nous utilisons pour ce projet reproduit assez fidèlement la pathologie humaine avec sclérose hippocampique. Nous utiliserons des souris adultes âgées entre 2 et 3 mois en début de procédure pour nous affranchir des effets liés au développement et à la sénescence. Nous utiliserons des souris contrôles et des souris transgéniques permettant d’invalider un gène ou d’en exprimer d’autres dans des cellules spécifiques. Ces lignées transgéniques n’ont pas de phénotype dommageable.

802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines maintenues sous anesthésie quatre heures d'affilée pour l'étude d'une thrombose déclenchée au laser, sept heures pour celle d'une inflammation locale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et se répartissent sur cinq établissements : irradiation puis greffe de moelle osseuse dans l'un, infection bactérienne et mise à mort dans les quatre-vingt-seize heures dans un autre, ligature d'un vaisseau abdominal sous anesthésie suivie de quarante-huit heures de survie dans un dernier. Il s'agit de comprendre comment une protéine kinase agit sur l'inflammation, la formation de caillots et la paroi des vaisseaux, les retombées pour les patients restant au stade d'une cible thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucune méthode de substitution pertinente n'est disponible et que le recours à la souris ne peut être évité.

Objectifs

Nous avons identifi? que l?inhibition d'une prot?ine diminuait de fa?on significative la progression des l?sions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d?action de cette prot?ine sur la progression de ces l?sions, nous allons ?valuer son impact sur l?inflammation et la fonction de l?endoth?lium (cellules qui tapissent l?int?rieur d?un vaisseau sanguin) gr?ce ? des mod?les pr?cliniques d?infection (sepsis), d?inflammation et de thrombose (activation de l?endoth?lium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).

Bénéfices attendus

Ces exp?riences permettront d??valuer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la prot?ine ?tudi?e sur la formation de caillots sanguins et l?inflammation, ce qui ne peut pas ?tre reproduit en laboratoire sur des cellules isol?es. Elles aideront ?galement ? d?terminer si cette prot?ine pourrait repr?senter une cible int?ressante pour d?velopper de nouvelles approches th?rapeutiques visant ? prot?ger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements li?s ? des processus inflammatoires ou thrombotiques.

Procédures

Trois types d?interventions seront r?alis?es sur des lots diff?rents d?animaux : 1- Dans le premier ou deuxi?me ?tablissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une irradiation suivie d?une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisi?me ?tablissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une infection bact?rienne. Une seule prise de sang sera r?alis?e sur chaque lot ? differents temps (au plus tard 96h apres le d?but de l?infection). Pour cela les souris seront sous anesth?sie g?n?rale profonde (m?lange de Til?tamine, Zolaz?pam et Xylazine), et seront ensuite euthanasi?es. 3- Dans un quatri?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront h?berg?s pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinqui?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesth?sie profonde, ? un mod?le de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d?inflammation (activation des cellules du vaisseau par une mol?cule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesth?sie tout au long de l?exp?rience et sont euthanasi? ? la fin des exp?rimentations qui durent respectivement 4 heures pour ?tudier la thrombose et 7 Heures pour ?tudier l?inflammation locale. Pour ?tudier la thrombose veineuse, des lots diff?rents d?animaux seront expos?s ? une chirurgie sous anesth?sie avec ligation d?un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures apr?s la chirurgie les animaux sont euthanasi?s.

Impact sur les animaux

- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d?une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets ind?sirables possibles sont une l?g?re baisse de l'alimentation avec l?g?re perte de poids. Les animaux peuvent avoir un l?ger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte dur?ee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Apr?s l?induction d?une infection (l?g?re ? mod?r?e), les effets ind?sirables attendus dans ce mod?le incluent une perte de poids, une diminution de l?activit? et de la vitalit?. Les souris seront ensuite euthanasi?es au plus tard 96h apres le d?but de l?infection. D?autres exp?rimentations (mod?les de thrombose et d?inflammation) sont conduites sans r?veil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesth?sie g?n?rale pendant toute la dur?e des proc?dures exp?rimentales. ? l?issue des exp?rimentations, les animaux sont euthanasi?s sans reprise de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analys?s. Les animaux seront ?galement euthanasi?s si l'un des points limites ?tait atteint.

Remplacement

Le recours au mod?le murin est irrempla?able pour le d?roulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexit? des m?canismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique int?gr? non mod?lisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la prot?ine d?interet inactive. Ainsi, l?utilisation d?animaux vivants constitue une ?tape n?cessaire pour r?pondre aux objectifs du projet, aucun mod?le de remplacement pertinent n??tant actuellement disponible.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annonc? a ?t? calcul? au plus juste ? l'aide d'outils statistiques. Cependant si une diff?rence significative est obtenue entre deux groupes exp?rimentaux avant la r?alisation de la totalit? du lot, nous ne r?aliserons pas d'exp?rimentations suppl?mentaires. Dans les exp?rimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou mol?cules seront visualis?s dans les m?mes animaux.

Raffinement

Les souris sont h?berg?es en groupes de cinq individus, dans des cages ventil?es, avec un acc?s ad libitum ? l?eau et ? la nourriture. Si une diminution de l?activit? est observ?e, de l?aliment hydrat? sera mis ? disposition dans la cage afin de faciliter l?acc?s ? la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront ?galement rajout?s comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d?exploration, contribuant ainsi ? r?duire le stress et ? am?liorer le bien-?tre des animaux. Une p?riode d?acclimatation de sept jours est respect?e avant le d?but des exp?rimentations afin de limiter le stress li? ? l?environnement. Les transferts entre deux ?tablissements seront r?alis?s par un transporteur agr??. Les animaux b?n?ficient d?une p?riode d?acclimatation d?une semaine avant toute proc?dure exp?rimentale dans l??tablissement d?accueil.

Choix des espèces

Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliquant une prot?ine kinase dans l?inflammation, la thrombose et la dysfonction endoth?liale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le syst?me immunitaire, s?inscrivant dans une r?ponse physiopathologique int?gr?e qui ne peut ?tre reproduite de mani?re pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours ? l?exp?rimentation animale constitue donc l?unique approche permettant d??tudier ces m?canismes dans leur globalit?. Le mod?le murin est largement reconnu comme le mod?le de r?f?rence pour les ?tudes pr?cliniques de la thrombose et de l?inflammation, en raison de fortes similitudes avec l?Homme, tant au niveau des cellules impliqu?es que des voies mol?culaires mises en jeu. Par ailleurs, l?utilisation de souris g?n?tiquement modifi?es ciblant sp?cifiquement la prot?ine kinase, sans ph?notype dommageable en conditions basales, permet une analyse m?canistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 ? 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 ? 25 semaines pour les exp?rimentations (?ge adulte, syst?me cardiovasculaire mature).

Dix-huit semaines d'applications de substances destinées à faire pousser des tumeurs sur la peau du dos pour une première procédure, dix pour une seconde : 714 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les tumeurs cutanées provoquent des rougeurs, un épaississement de la peau, des croûtes, parfois une ulcération ou une infection locale, et peuvent devenir assez volumineuses pour gêner les déplacements. Il s'agit de savoir si le blocage de certains fibroblastes du voisinage de la tumeur ralentit la maladie et rend les immunothérapies plus efficaces. Le porteur justifie le choix de la souris par son statut de référence dans l'étude des cancers de la peau et par son système immunitaire intact, qu'il présente comme la condition pour étudier les réponses aux immunothérapies.

Objectifs

Ce projet vise ? mieux comprendre pourquoi certains cancers de la peau r?sistent aux traitements, notamment aux immunoth?rapies, qui stimulent les d?fenses naturelles de l'organisme contre les cellules canc?reuses. Nous ?tudierons, chez la souris, le r?le de cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Ces cellules participent ? l'organisation et au fonctionnement du tissu tumoral. Nos travaux sugg?rent que certaines favorisent la croissance de la tumeur en cr?ant un environnement protecteur autour des cellules canc?reuses, tandis que d'autres limitent l'action des cellules immunitaires charg?es de d?truire la tumeur. L'objectif est de d?terminer comment ces diff?rentes populations de fibroblastes contribuent ? la r?sistance des cancers de la peau aux traitements, qu'il s'agisse des immunoth?rapies ou des chimioth?rapies. Une meilleure compr?hension de ces m?canismes pourrait permettre, ? terme, de d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques afin d'am?liorer l'efficacit? des traitements chez les patients atteints de cancer de la peau.

Bénéfices attendus

Les cancers de la peau peuvent ?tre trait?s par des immunoth?rapies, qui stimulent le syst?me immunitaire pour ?liminer les cellules canc?reuses. Cependant, ces traitements ne sont efficaces que chez une partie des patients. Il est donc essentiel de comprendre pourquoi certaines tumeurs r?sistent aux traitements afin de d?velopper des approches plus efficaces. Ce projet a pour objectif d'?tudier le r?le de certaines cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Nos travaux sugg?rent que ces cellules contribuent ? la croissance du cancer et prot?gent les cellules canc?reuses contre les traitements. En utilisant un mod?le de cancer de la peau chez la souris, nous ?valuerons si le blocage de l'activit? de ces fibroblastes permet de ralentir la progression de la maladie et d'am?liorer l'efficacit? des traitements, notamment des immunoth?rapies. Les r?sultats attendus pourraient ouvrir la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques visant ? rendre les traitements actuels plus efficaces et ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancer de la peau.

Procédures

Les animaux recevront, pendant l'?tude, des applications r?guli?res de substances sur la peau du dos afin de provoquer le d?veloppement de tumeurs cutan?es. Ils recevront ?galement des traitements exp?rimentaux administr?s par injection dans l'abdomen et par voie orale, selon un calendrier d?fini, afin d'?valuer leur efficacit? contre ces tumeurs. La dur?e totale des traitements sera de 18 semaines pour une premi?re proc?dure et de 10 semaines pour une seconde.

Impact sur les animaux

Au cours de l'?tude, les animaux seront manipul?s r?guli?rement pour l'administration des traitements, ce qui peut provoquer un stress l?ger et de courte dur?e. Le d?veloppement progressif des tumeurs cutan?es entra?nera des modifications de la peau, telles que des rougeurs, un ?paississement de la peau, des cro?tes ou une irritation. ? mesure que les tumeurs se d?veloppent, certains animaux pourront pr?senter un inconfort, une sensibilit? de la peau ou des d?mangeaisons. Dans les stades plus avanc?s, les tumeurs pourront devenir volumineuses et entra?ner une g?ne dans les d?placements, une diminution de l'activit? ou une perte de poids. Dans certains cas, des complications telles qu'une ulc?ration ou une infection locale pourront appara?tre. Les animaux seront examin?s tr?s r?guli?rement tout au long de l'?tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d'arr?t pr?d?finis seront appliqu?s afin de limiter au maximum les douleurs et les atteintes au bien-?tre des animaux.

Devenir

? l'issue de l'?tude, tous les animaux seront euthanasi?s de mani?re r?glementaire afin de permettre le pr?l?vement des tumeurs et des diff?rents organes n?cessaires aux analyses biologiques. Ces pr?l?vements sont indispensables pour comprendre les m?canismes de progression du cancer, ?valuer l'efficacit? des traitements test?s et r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne peuvent pas ?tre r?utilis?s dans d'autres ?tudes, car les traitements administr?s et le d?veloppement des tumeurs modifient durablement leur ?tat de sant?.

Remplacement

Ce projet ne peut pas ?tre r?alis? sans l?utilisation d?animaux vivants, car il est n?cessaire d??tudier simultan?ment le d?veloppement des tumeurs, les interactions entre les cellules de la tumeur et leur environnement, ainsi que la r?ponse globale de l?organisme aux traitements. Ces ph?nom?nes complexes ne peuvent pas ?tre reproduits de mani?re fiable avec des mod?les cellulaires ou informatiques seuls. Le mod?le murin de cancer cutan? est largement utilis? et bien caract?ris?. Il permet de reproduire des ?tapes essentielles de la maladie humaine et d??valuer l?efficacit? de traitements dans un contexte biologique complet, incluant le syst?me immunitaire. Lorsque cela est possible, des approches alternatives sont utilis?es en amont ou en compl?ment des exp?riences chez l?animal, afin de limiter leur nombre et de r?duire leur utilisation au strict n?cessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.

Réduction

Le nombre d?animaux utilis? sera r?duit au minimum n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement fiables. Une planification statistique des exp?riences sera r?alis?e afin d??viter toute utilisation excessive d?animaux et de garantir une puissance suffisante pour l?analyse des r?sultats. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses seront effectu?es sur les m?mes animaux, notamment ? partir des m?mes tissus pr?lev?s, afin de limiter le nombre total d?animaux requis pour le projet. Les exp?riences seront ?galement organis?es de mani?re ? optimiser chaque groupe exp?rimental et ? ?viter les r?p?titions inutiles. Enfin, les donn?es d?j? disponibles dans la litt?rature et issues d??tudes ant?rieures seront prises en compte afin de r?duire au maximum le recours ? de nouveaux animaux.

Raffinement

Toutes les proc?dures seront mises en ?uvre de mani?re ? limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?, selon des techniques standardis?es et valid?es. Une surveillance r?guli?re sera assur?e tout au long de l??tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d?observation pr?cis permettront d?intervenir rapidement si n?cessaire, notamment par une prise en charge adapt?e ou une euthanasie anticip?e lorsque le bien-?tre de l?animal est compromis. Des mesures de confort seront mises en place, incluant l?adaptation des conditions d?h?bergement, la limitation des manipulations au strict n?cessaire et l?utilisation de proc?dures anesth?siques ou analg?siques lorsque cela est pertinent. L?ensemble du protocole est con?u afin de respecter les principes ?thiques et de r?duire au maximum l?impact sur le bien-?tre animal.

Choix des espèces

La souris a ?t? choisie car elle constitue un mod?le de r?f?rence pour l??tude des cancers de la peau. Elle permet de reproduire de mani?re fiable les ?tapes de d?veloppement tumoral observ?es chez l?humain, tout en offrant un cadre exp?rimental contr?l?. Ce mod?le pr?sente ?galement l?avantage de disposer d?un syst?me immunitaire fonctionnel, indispensable pour ?tudier les interactions entre les cellules tumorales, leur environnement et les r?ponses aux immunoth?rapies. Les animaux seront utilis?s ? un stade adulte, lorsque leur d?veloppement est complet. Ce choix permet de garantir des r?sultats biologiquement pertinents tout en ?vitant d?interf?rer avec des processus de croissance ou de d?veloppement pr?coce.