Procédures sévères
Surveillance et prise en charge du phénotype dommageable chez une lignée de souris génétiquement modifiées modélisant une myopathie centronucléaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Porteuses d'une mutation qui provoque une faiblesse musculaire progressive, 1266 souris sont utilisées dans un élevage de maintien de lignée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur écrit qu'elles "ne subissent aucune intervention invasive", et indique plus loin qu'environ 25 % des souriceaux hétérozygotes meurent avant leur vingtième jour, la sévérité précoce de la myopathie les empêchant de téter. Les femelles sont mises en cohabitation dès sept semaines, pour six portées au maximum et huit mois de reproduction. Le champ structuré déclare les 1266 souris réutilisées et aucune mise à mort, alors que la narration précise que les souris surnuméraires, de sexe ou de génotype sans intérêt, sont tuées dès le sevrage à quatre semaines.
Objectifs
L’objectif du projet de maintien de lignée est de conserver et produire de manière stable un modèle murins génétiquement modifiés afin de garantir leur disponibilité pour les projets de phénotypage fonctionnel et le développement de thérapies. Ce maintien préserve des lignées uniques, évite leur régénération coûteuse et fournit des animaux bien caractérisés tout en respectant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce maintien garantit une disponibilité continue de reproducteurs et de descendants pour les projets de recherche thérapeutique, assurant la continuité et la planification des études sur les maladies musculaires rares. En optimisant les schémas de croisement entre des souris normales avec des souris porteuses de la mutation, nous utilisons le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats solides et reproductibles. Enfin, ce modèle unique aide à décrypter les mécanismes des maladies rares, à inventer de nouveaux traitements, à partager avec d’autres laboratoires et à éviter de tout recommencer à zéro.
Procédures
Les animaux ne subissent aucune intervention invasive (pas de chirurgie, prélèvements ou manipulations douloureuses). Seules des mises en cohabitation contrôlées pour reproduction (dès 7 semaines ; max 6 cages : 1 mâle × 2 femelles ; 8 mois max/femelle) et une surveillance quotidienne des portées (vérification rapide
Impact sur les animaux
Les souris mutantes développent une faiblesse musculaire progressive : difficultés à grimper ou sauter, fatigue plus rapide lors d'activité, et légère diminution de la masse musculaire (atrophie). Chez les animaux survivants, ces symptômes causent une souffrance modérée, sans douleur intense ni paralysie, et les animaux continuent de manger, boire et se déplacer normalement au quotidien. Cependant, environ 25 % des souriceaux hétérozygotes ne survivent pas jusqu'à P20 : la sévérité précoce du phénotype myopathique compromet leur capacité à téter et à s'alimenter de manière autonome, entraînant une dégradation rapide de leur état général et leur mort. Ces animaux sont donc associés à une souffrance sévère. Une surveillance quotidienne permet d'intervenir rapidement, notamment par la mise à disposition de nourriture adaptée (gel alimentaire), afin d'assurer le confort des animaux survivants, et par l'application des points limites définis conduisant à une mise à mort si nécessaire.
Devenir
Le maintien de cette lignée vise à garantir la disponibilité continue d’animaux reproducteurs porteurs de la mutation génétique afin d’assurer la poursuite des projets de phénotypage et de recherche thérapeutique de l’équipe. Le cas échéant, certains animaux pourront être réutilisés dans d’autres DAP, conformément aux dispositions réglementaires applicables et sous réserve de leur état clinique et sanitaire. Les animaux sont hébergés en cages ventilées enrichies (nids, tunnels, gel alimentaire mis à disposition en cas de difficultés locomotrices). Une surveillance quotidienne est assurée dès la naissance et tout au long de la vie des animaux, portant sur le comportement, la prise de poids et l'état général. Le nombre de portées est limité à 6 par femelle afin de prévenir la fatigue reproductrice. Les animaux excédentaires sont triés dès le sevrage à 4 semaines et regroupés par âge et par sexe. Les manipulations sont réduites au strict nécessaire et réalisées avec soin. Chez les animaux en croissance, tout ralentissement ou arrêt de la prise de poids déclenche une surveillance renforcée ; chez l'adulte, toute perte de poids avérée constitue un indicateur d'alerte. Dans tous les cas, l'évaluation de l'animal est réalisée à l'aide de la grille de suivi clinique de Morton & Griffiths, dont les critères et seuils d'intervention sont détaillés en annexe, et conduit à une mise à mort si le seuil défini est atteint.
Remplacement
Aucune méthode sans animaux (cellules en labo ou simulations ordinateur) ne peut reproduire fidèlement les symptômes musculaires de cette maladie rare. Seules les souris vivantes montrent la structure musculaire complète et les effets sur tout le corps. Ce modèle est donc indispensable pour comprendre la maladie et tester des traitements génétiques. Dans ce domaine, remplacer les animaux n’est pas encore possible.
Réduction
Le nombre d’animaux est minimisé par l’optimisation des schémas de croisement, qui repose sur des calculs génétiques permettant de limiter la production d’animaux excédentaires, ainsi que par le maintien d’un nombre de reproducteurs suffisant mais restreint (12 reproducteurs). Les animaux issus de ces croisements feront l'objet d'étude de phénotpage. Les animaux surnuméraires, de sexes ou de génotypes sans intérêt sont mis à mort rapidement selon les méthodes préconisées.
Raffinement
Les souris vivent dans des cages aérées et enrichies (nids, tunnels, gel alimentaire si elles ont du mal à se déplacer). Une surveillance quotidienne est faite dès la naissance et tout au long de leur vie. On limite à 6 portées maximum par femelle pour éviter la fatigue, avec un tri rapide des animaux en trop dès le sevrage (4 semaines) pour les regrouper par âge. Les manipulations sont rares et douces. En cas de signes de souffrance, on applique d’abord la grille de suivi clinique (Morton & Griffiths), des soins palliatifs (analgésie), et seulement en dernier recours la mise à mort si l’état ne s’améliore pas. Les tests invasifs sont faits dans une autre autorisation. le recours exclusif à des croisements hétérozygotes × sauvages constitue en soi une mesure de raffinement majeure, en excluant la production d'animaux homozygotes létaux et en limitant ainsi la sévérité globale du phénotype au sein de l’élevage.
Choix des espèces
La souris est l’espèce idéale pour étudier cette maladie musculaire rare car ses muscles fonctionnent comme ceux des humains. Nos souris mutantes reproduisent fidèlement la faiblesse musculaire progressive et les difficultés de mouvement observées chez les patients, contrairement aux vers ou aux cellules en boîte de culture. Les animaux sont utilisés jusqu’à 8 mois maximum (âge adulte reproducteur). Dès le sevrage (3 semaines), après identification génétique (7-10 jours), les souris normales et mutantes sont : • envoyées vers d’autres études de tests musculaires, • utilisées comme parents reproducteurs, • ou mis à mort si en trop (dès connaissance du profil génétique). Les souris mutantes commencent à se reproduire dès 7 semaines pour produire efficacement d’autres animaux de la même souche.
Effets de la radioth?rapie sur le remodelage stromal et neuro-immunitaire dans un mod?le murin de cancer de la t?te et du cou
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Faire pousser une tumeur dans la bouche de souris pour observer ce que la radiothérapie change autour d'elle : 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales sont injectées dans leur muqueuse jugale, puis viennent six à douze séances d'imagerie, six à quinze injections intrapéritonéales et une séance d'irradiation localisée. Le porteur décrit une inflammation de la joue ou de la langue, un bourgeon tumoral pouvant s'ulcérer, des saignements, une infection locale et des difficultés à s'alimenter, sur une durée maximale de quatre à cinq semaines par souris, avec prostration et réduction des interactions sociales. Ce que le projet promet en retour reste au conditionnel et au long terme : de nouvelles cibles thérapeutiques, des biomarqueurs prédictifs de réponse à la radiothérapie, une meilleure stratification des patients.
Objectifs
Les cancers de la cavit? orale repr?sentent un probl?me de sant? publique majeur. Malgr? les progr?s de la m?decine et l'utilisation combin?e de la chirurgie, de la chimioth?rapie et de la radioth?rapie, de nombreux patients font face ? des r?cidives ou ? une r?sistance aux traitements. Actuellement, seul un patient sur deux survit au-del? de cinq ans apr?s le diagnostic. Il est donc indispensable de comprendre pourquoi les traitements actuels ?chouent afin de proposer de nouvelles solutions th?rapeutiques. Une tumeur n'est pas seulement constitu?e de cellules canc?reuses ; c'est un ?cosyst?me complexe qui d?tourne ? son profit des cellules normales de l'organisme, appel?es cellules de soutien (ou cellules stromales), pour se prot?ger des attaques du syst?me immunitaire et r?sister aux traitements. De plus, des ?tudes r?centes sugg?rent que les nerfs situ?s autour de la tumeur jouent ?galement un r?le actif en favorisant la progression de la maladie. Ce projet de recherche poursuit trois objectifs principaux : Comprendre la r?sistance aux traitements : Nous voulons observer comment la radioth?rapie modifie l'environnement de la tumeur. L'objectif est de comprendre si certaines cellules de soutien ou les fibres nerveuses environnantes aident la tumeur ? se "r?parer" ou ? se cacher du syst?me immunitaire apr?s le traitement. ?tudier le r?le des cellules de soutien sp?cifiques : Nous ?tudierons les relations entre les cellules stromales, les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaires. Identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques : En analysant finement les interactions entre le cancer, les nerfs et les cellules de soutien, nous esp?rons identifier des signaux de communication que nous pourrions bloquer par de nouveaux m?dicaments. ? terme, les b?n?fices attendus de ce projet sont de fournir des bases scientifiques pour le d?veloppement de th?rapies innovantes qui pourraient ?tre combin?es ? la radioth?rapie classique ou ? l?immunoth?rapie, afin d'augmenter les chances de gu?rison des patients atteints de cancers de la t?te et du cou.
Bénéfices attendus
Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliqu?s dans la progression des carcinomes ?pidermo?des de la cavit? orale et dans leur r?ponse ? la radioth?rapie, pathologies pour lesquelles les options th?rapeutiques restent limit?es et les taux de r?cidive ?lev?s. Progr?s des connaissances scientifiques (Court et moyen terme) : Ce projet permettra d?acqu?rir de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales, le stroma tumoral et les structures nerveuses dans un mod?le murin immunocomp?tent. L?utilisation d?un mod?le orthotopique associ? ? des techniques d?imagerie in vivo permettra une analyse dynamique et non invasive de la croissance tumorale et de sa r?ponse au traitement. L??tude des effets pr?coces et tardifs de la radioth?rapie permettra notamment : ? de mieux caract?riser les modifications du microenvironnement tumoral induites par l?irradiation, ? d?identifier les m?canismes impliqu?s dans la r?ponse ou la r?sistance au traitement, ? d??valuer le r?le des cellules stromales et immunitaires dans ces processus. L?administration de mol?cules modulant le microenvironnement tumoral (agonistes, antagonistes ou anticorps monoclonaux) permettra ?galement d?explorer de mani?re fonctionnelle les voies biologiques impliqu?es. B?n?fices pour la sant? humaine (Long terme) : Les r?sultats issus de ce projet pourraient contribuer ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancers de la cavit? orale, par : ? l?identification de nouvelles cibles th?rapeutiques, en particulier au sein du microenvironnement tumoral, ? le d?veloppement de strat?gies associant radioth?rapie et modulation du stroma ou du syst?me immunitaire, ? l?identification de biomarqueurs pr?dictifs de r?ponse ? la radioth?rapie, permettant une meilleure stratification des patients. Ces avanc?es pourraient, ? terme, contribuer ? am?liorer l?efficacit? des traitements, ? r?duire les risques de r?cidive et ? limiter l?exposition ? des traitements inefficaces. B?n?fices pour la communaut? scientifique : Ce projet contribuera ?galement ? : ? valider un mod?le pr?clinique pertinent de cancer oral int?grant les interactions avec le microenvironnement, ? promouvoir l?utilisation de techniques d?imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal des tumeurs, ? g?n?rer des donn?es qui pourront ?tre partag?es avec la communaut? scientifique via des publications et des communications.
Procédures
Implantation tumorale : Une injection de cellules tumorales sera r?alis?e une seule fois (J0), sous anesth?sie g?n?rale Nombre : 1 injection par animal Dur?e : 2 ? 5 minutes (anesth?sie incluse : environ 5 ? 10 minutes) Imagerie: Le suivi tumoral sera r?alis? par imagerie non invasive apr?s injection de produit d?imagerie. Fr?quence : 2 ? 3 fois par semaine Nombre total : environ 6 ? 12 s?ances par animal selon la dur?e de suivi Dur?e : 5 ? 10 minutes d?acquisition (dur?e totale avec anesth?sie : environ 15 ? 20 minutes par s?ance) Injections de traitements et de substances d?imagerie Les animaux recevront des injections intrap?riton?ales r?p?t?es. Nombre : variable selon les groupes (environ 6 ? 15 injections au total par animal) Dur?e : quelques secondes par injection (< 1 minute), sans anesth?sie ou sous anesth?sie l?g?re si n?cessaire Radioth?rapie : Une irradiation localis?e sera r?alis?e chez les animaux des groupes concern?s. Nombre : 1 s?ance par animal Dur?e : 5 ? 15 minutes (dur?e totale incluant anesth?sie : environ 20 ? 30 minutes)
Impact sur les animaux
Le protocole exp?rimental est susceptible d?induire plusieurs types de nuisances et effets ind?sirables chez les animaux, principalement li?s ? l?implantation tumorale, ? la croissance de la tumeur, aux proc?dures exp?rimentales r?p?t?es et au traitement par radioth?rapie. Douleur, l?sions et maladies : L?injection de cellules tumorales dans la muqueuse jugale entra?ne une douleur aigu?, br?ve (quelques secondes) li?e ? l?introduction de l?aiguille fine. Le d?veloppement tumoral dans la cavit? orale est susceptible d?induire, ? partir de quelques jours apr?s l?injection et jusqu?? la mise ? mort : ? une inflammation locale (joue et/ou langue), ? l?apparition d?un bourgeon tumoral, pouvant ?voluer vers une ulc?ration de la muqueuse, ? des saignements, ? une infection locale. Ces l?sions peuvent entra?ner des cons?quences fonctionnelles, notamment des difficult?s alimentaires, avec un risque de perte de poids. Les injections peuvent induire une douleur de quelques secondes lors de l?introduction de l?aiguille et une g?ne de quelques minutes au point de ponction. La radioth?rapie localis?e est indolore dans les suites imm?diates mais peut induire des effets secondaires locaux quelques jours apr?s la s?ance jusqu?? la fin de l?exp?rience d?intensit? mod?r?e, comprenant : ? une inflammation de la muqueuse buccale, ? une irritation locale, ? une majoration des troubles alimentaires. Stress physique et effets li?s aux proc?dures : Les animaux seront soumis ? des manipulations r?p?t?es (contention, imagerie, injections intrap?riton?ales, irradiation), susceptibles d?induire un stress l?ger ? mod?r?. Comportement, peur et d?tresse : L?ensemble des proc?dures et la progression tumorale peuvent induire des modifications comportementales, telles que : ? une diminution de l?activit?, ? une r?duction de l?exploration, ? une prostration, ? une alt?ration des interactions sociales. Ces signes traduisent un ?tat de stress ou d?inconfort mod?r?. Dur?e et intensit? des nuisances Les nuisances d?crites sont d?intensit? s?v?re avec un risque d?aggravation li? ? la progression tumorale. Elles s??tendent sur une dur?e maximale de 4 ? 5 semaines par animal, correspondant ? la p?riode de croissance tumorale et de suivi post-traitement.
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de chaque proc?dure car ils ne peuvent ?tre ni r?utilis?s, ni replac?s, ni adopt?s car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des r?percussions sur leur bien-?tre si pas de mise ? mort.
Remplacement
L??tude des m?canismes de r?sistance aux traitements dans les cancers de la cavit? orale repose sur des interactions complexes entre diff?rents compartiments cellulaires et tissulaires. Des m?thodes alternatives non animales existent, mais elles pr?sentent des limites importantes au regard des objectifs de ce projet. Alternatives non animales disponibles et leurs limites : Des approches in vitro, telles que les cultures cellulaires en deux dimensions ou les mod?les tridimensionnels de type organo?des, permettent d??tudier certains aspects sp?cifiques de la biologie tumorale, notamment la prolif?ration cellulaire ou la r?ponse directe ? des traitements (radioth?rapie, agents pharmacologiques). Ces mod?les sont utiles pour des analyses m?canistiques cibl?es. Cependant, ces syst?mes ne permettent pas de reproduire la complexit? du microenvironnement tumoral in vivo. En particulier, ils ne permettent pas d?int?grer simultan?ment : ? les interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules stromales et cellules immunitaires, ? la vascularisation et les ph?nom?nes de perfusion tissulaire, ? la r?ponse inflammatoire syst?mique, ? ni les interactions avec le syst?me nerveux p?riph?rique. Or, ces param?tres sont essentiels dans l??tude des effets de la radioth?rapie et des m?canismes de r?sistance tumorale. Les mod?les in silico (mod?lisation informatique) constituent ?galement des outils compl?mentaires, mais leur capacit? pr?dictive reste limit?e par l?insuffisance de donn?es biologiques int?gr?es, notamment concernant le r?le du microenvironnement stromal et nerveux dans les cancers de la cavit? orale. Justification de l'utilisation d'animaux vivants : ? ce jour, l?utilisation d?animaux vivants reste indispensable pour r?pondre aux objectifs du projet. Seul un mod?le in vivo permet de conserver l?int?grit? de l?architecture tissulaire, de la vascularisation et du syst?me immunitaire, ainsi que les interactions dynamiques entre ces diff?rents compartiments. Le mod?le murin utilis? permet en particulier : ? l??tude de la r?ponse tumorale dans un organisme immunocomp?tent, ? l?analyse des effets locaux et syst?miques de la radioth?rapie, ? et l?exploration des interactions entre la tumeur, le stroma et le syst?me nerveux dans un contexte physiologique. Ces ?l?ments sont essentiels pour obtenir des donn?es biologiques pertinentes et transposables ? la pathologie humaine.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis?s dans ce projet a ?t? d?termin? de mani?re ? ?tre le plus faible possible tout en garantissant la robustesse statistique et la validit? scientifique des r?sultats. D?termination du nombre d'animaux : Le nombre de souris par groupe exp?rimental a ?t? estim? ? partir d?une analyse de puissance statistique, bas?e sur des donn?es issues de la litt?rature et de r?sultats pr?liminaires obtenus dans des mod?les comparables. Ce calcul conduit ? un effectif de 15 animaux par groupe, en tenant compte de la variabilit? biologique et des pertes potentielles (?chec de prise tumorale, exclusion selon les crit?res exp?rimentaux ou atteinte de points limites). Mesures prises pour limiter l'utilisation d'animaux : Plusieurs strat?gies sont appliqu?es afin de limiter le nombre d?animaux utilis?s : ? Suivi longitudinal par imagerie non invasive : L?utilisation de l?imagerie permet de suivre la croissance tumorale au cours du temps chez un m?me animal, ?vitant ainsi la constitution de groupes distincts pour chaque point temporel. ? Optimisation du design exp?rimental : Les groupes exp?rimentaux ont ?t? limit?s au strict n?cessaire (contr?le, effet pr?coce, effet tardif), permettant de r?pondre aux objectifs scientifiques sans multiplication des conditions. ? Standardisation des proc?dures : L?utilisation de lign?es cellulaires bien caract?ris?es et d?un mod?le murin homog?ne permet de r?duire la variabilit? interindividuelle et donc le nombre d?animaux n?cessaires pour atteindre une significativit? statistique. ? Mutualisation des pr?l?vements : Les tissus collect?s ? la fin des exp?riences seront utilis?s pour plusieurs types d?analyses (histologie, immunofluorescence, cytom?trie en flux, analyses mol?culaires), permettant de maximiser les donn?es obtenues ? partir de chaque animal. ? Partage des ?chantillons biologiques : Les tissus non utilis?s pour les analyses principales pourront ?tre conserv?s et mis ? disposition d?autres projets de recherche, contribuant ainsi ? limiter le recours ? de nouveaux animaux. M?thodes statistiques Les donn?es seront analys?es ? l?aide de tests statistiques adapt?s, notamment : ? comparaisons de moyennes entre groupes (tests param?triques ou non param?triques selon la distribution des donn?es), ? analyses de croissance tumorale (mod?les longitudinaux ou analyses de variance pour mesures r?p?t?es), ? analyses de survie si applicable
Raffinement
Toutes les proc?dures potentiellement douloureuses sont r?alis?es sous anesth?sie adapt?e : ? anesth?sie par isoflurane pour l?injection tumorale, les injections d?anticorps monoclonaux et les examens d?imagerie, ? anesth?sie g?n?rale pour la radioth?rapie, garantissant une immobilit? compl?te. Une analg?sie syst?matique par morphine ou d?riv? est instaur?e de mani?re pr?ventive d?s l?apparition d?une tumeur palpable et poursuivie jusqu?? la fin de l?exp?rience. Elle pourra ?tre adapt?e en fonction de l??valuation clinique (fr?quence et dose ajust?es si signes d?inconfort). Les injections intrap?riton?ales sont r?alis?es avec : ? utilisation d?aiguilles de petit calibre, ? respect des volumes recommand?s, ? contention douce et rapide. Une surveillance clinique rapproch?e est mise en place tout au long de l??tude : ? suivi quotidien de l??tat g?n?ral, ? pes?e r?guli?re (au minimum 2 ? 3 fois par semaine, voire quotidienne en phase critique), ? ?valuation du comportement (activit?, posture, interactions), ? surveillance de la prise alimentaire et hydrique, ? suivi de la taille tumorale et de son aspect (ulc?ration, n?crose, saignement, infection). Compte tenu de la localisation tumorale dans la cavit? orale, des mesures sp?cifiques sont mises en place de mani?re pr?coce : ? alimentation enrichie et ramollie (gel nutritif, p?t?e) d?s l?apparition de la tumeur, ? acc?s facilit? ? l?eau (biberons adapt?s, gels hydratants), ? r?hydratation sous-cutan?e si n?cessaire, ? adaptation de l?environnement avec une liti?re douce ? base de cellulose pour limiter les irritations et les risques de plaies. Ces mesures visent ? maintenir un ?tat nutritionnel et hydrique satisfaisant et ? limiter la douleur li?e ? la mastication. Une d?marche d?am?lioration continue est mise en place pendant toute la dur?e du projet : ? ?changes r?guliers avec le v?t?rinaire r?f?rent et la structure de bien-?tre animal, ? r??valuation des protocoles en fonction des observations cliniques, ? veille scientifique et technique pour identifier des m?thodes moins invasives ou plus efficaces en termes de raffinement. Toute am?lioration valid?e (optimisation de l?analg?sie, ajustement des points limites, am?lioration des conditions d?h?bergement ou des techniques exp?rimentales) sera int?gr?e en cours de projet, dans le respect des objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est l?esp?ce la plus appropri?e pour r?pondre aux objectifs de ce projet. Mod?le largement utilis? et valid? en canc?rologie, elle permet l??tude du d?veloppement tumoral dans un organisme immunocomp?tent. Les souris poss?dent un syst?me immunitaire bien caract?ris?, comparable dans ses grands principes ? celui de l??tre humain, permettant d?analyser les interactions entre cellules tumorales, microenvironnement stromal et r?ponse immunitaire. Des mod?les tumoraux adapt?s ? ces souris assurent une bonne reproductibilit?. Aucune autre esp?ce ne permet actuellement de reproduire de mani?re aussi fiable ces interactions complexes tout en limitant les nuisances. La souris est par ailleurs adapt?e aux proc?dures pr?vues (imagerie in vivo, injections, radioth?rapie), r?alisables sous anesth?sie avec un bon niveau de ma?trise. Sa robustesse et sa tol?rance aux manipulations permettent un suivi pr?cis. Ainsi, son utilisation repr?sente le meilleur compromis entre pertinence scientifique et bien-?tre animal. Les animaux utilis?s dans ce projet sont des souris au stade adulte, ?g?es de 8 ? 12 semaines au d?but des proc?dures exp?rimentales. L'utilisation d'animaux adultes est scientifiquement indispensable pour plusieurs raisons : 1. Maturit? des syst?mes : ? cet ?ge, le syst?me immunitaire et le syst?me nerveux p?riph?rique sont pleinement d?velopp?s et fonctionnels. Comme notre ?tude porte sur les interactions complexes entre les nerfs, les cellules immunitaires de l'organisme et les cellules de soutien de la tumeur, il est crucial d'?tudier un organisme dont les fonctions biologiques sont stabilis?es et comparables ? celles d'un patient humain adulte. 2. R?ponse aux traitements : La r?action des tissus ? la radioth?rapie est influenc?e par la maturit? cellulaire. L'utilisation de souris adultes permet de mod?liser fid?lement la r?ponse clinique observ?e chez les patients atteints de cancers de la bouche et de la gorge. 3. Tol?rance aux interventions : Les souris adultes pr?sentent une meilleure tol?rance physiologique aux anesth?sies r?p?t?es n?cessaires pour le traitement et l'imagerie, ce qui participe au raffinement des proc?dures en limitant les risques de complications pr?coces.
Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie pour le traitement de l’endométriose
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Toutes les souris subissent un prélèvement de tissu à la queue sous anesthésie gazeuse, puis 219 d'entre elles une laparoscopie pour greffe orthotopique de lésions d'endométriose, un suivi hebdomadaire en imagerie et une prise de sang toutes les deux semaines. De la troisième à la huitième semaine, huit souris sont tuées chaque semaine pour observer la croissance des cellules, et 195 autres reçoivent une greffe suivie de gavages et d'injections à différentes posologies. 1 146 souris sont utilisées au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, modéré et sévère, toutes tuées par cohortes pour prélever utérus, estomac, foie et poumons. Le médicament testé a d'abord été mis au point contre des tumeurs cancéreuses, le porteur espérant "pouvoir traiter d'autres pathologie grâce à notre traitement", et le résumé n'explique nulle part comment il aboutit à l'effectif de 1 146 souris.
Objectifs
L’endométriose est une maladie chronique qui se caractérise par la présence de tissu semblable à l’endomètre en dehors de l’utérus, notamment sur les ovaires, les trompes ou le péritoine. Ce tissu réagit aux variations hormonales du cycle menstruel, ce qui peut provoquer des inflammations, des douleurs pelviennes intenses, des règles très douloureuses, de la fatigue et parfois des difficultés à concevoir. Souvent mal diagnostiquée en raison de la diversité et de la banalisation de ses symptômes, l’endométriose peut pourtant avoir un impact important sur la qualité de vie. Cette maladie touche environ 10 % des femmes et personnes menstruées en âge de procréer, ce qui représente environ 190 millions de personnes à l’échelle mondiale selon l’OMS. En France, la maladie concerne environ 1,5 à 2,5 millions de femmes en âge de procréer, soit près d’une femme sur dix. Il n’existe pas encore de traitement curatif de l’endométriose, seulement plusieurs options permettant de soulager les symptômes, ralentir l’évolution et améliorer la qualité de vie. Les options sont les traitements hormonaux visant à bloquer ou diminuer les règles, car les lésions d’endométriose réagissent aux hormones, les traitements antidouleur ou la chirurgie. Nous avons mis au point plusieurs médicaments qui ciblent directement un marqueur de surface surexprimé par les cellules des lésions d’endométriose. Nous voulons apporter la preuve que ce médicament peut diminuer via le système immunitaire les lésions, voir les éliminer totalement et maintenir ensuite une stabilité normale de l’endomètre..
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle approche thérapeutique qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales du cancer. Les lésions d’endométrioses surexpriment le marqueur ciblé par notre médicament. Nous espérons donc pouvoir traiter d’autres pathologie grâce à notre traitement. Cette nouvelle thérapie pourra aider toutes les patientes atteintes d’endométriose et qui n’ont actuellement aucun traitement de disponible.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèvent de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie. 219 animaux vont avoir une injection intrapéritonéale. Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 195 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal. 219 animaux vont avoir une laparoscopie pour la greffe orthotopique. Parmi, ces animaux chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 195 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les gestes de chirurgie entraînent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Un léger stress sera observé sur les animaux sur la durée de la contention comme lors des gavages. Un léger stress sera observé lors des prélèvements sanguins sous anesthésie à l’isoflurane (induction à 3% puis maintien à 1,5%) ainsi que lors de l’anesthésie pour les observations en échographie où lors de l’implantation de l’implant hormonal avec légère douleur sur la zone d’implantation pendant quelques heures.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (uterus,estomac, foie, poumon…) pour observer la présence de cellules au niveau de ces organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau des lésions mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments
Remplacement
Les tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement (reconnaissance du marqueur, recrutement et activation des cellules immunes par notre molécule, induction de la mort cellulaire tumorale) cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire des lésions d’endométriose est primordial et la voie d’administration sur la biodistribution de notre molécule. En effet, le traitement testé a besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement aux lésions d’endométriose.).
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les procédures 2 et 3 permettront de déterminer la vitesse de croissance et le temps nécessaire pour une greffe orthotopique de cellules de lésions d’endométriose. Ces procédures nous permettront de limiter le nombre d’animaux dans la procédure tout en garantissant que ceux greffés et sélectionnés correspondent aux critères de l’étude et donc seront analysables à la fin de la procédure..
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimation à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations de l’afstal 2025 avec une anesthésie stable et contrôlée en isoflurane (3% induction puis maintien à 1,5%) avec prise en charge multimodale de l’analgésie avec buprénorphine, alpha2 agoniste et anesthésie locale. L’asepsie sera la plus importante possible. La gestion de l’analgésie post-opératoire sera stricte et suivie pour éviter toute douleur aux animaux. Un échange sera fait avec l'équipe de soigneur pour optimiser les soins en post-opératoire (éviter tout mouvement ou changement de cage aux animaux durant cette période, apport d'eau et nourriture gélifiée, augmentation des enrichissements de type nid pour conserver sa température). Tout au long des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique de cyclosporine sera appliqué. L'apport de l'imagerie optique par bioluminescence dans le suivi du développement tumoral permet aussi de s'inscrire dans une démarche de raffinement puisque cet outil permet de réaliser un suivi de paramètres intrinsèques de manière très peu invasive pour les animaux. Durant toute la procédure, les animaux seront étroitement surveillés en applicant le suivis des points limites grâce à la grille de score mise en place pour ce projet.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux seront greffés entre 2 mois et demi et 4 mois car ces animaux possèdent un système immunitaire déficient qui peut se réactiver avec l’âge (supérieur à 6 mois) entrainant une prise de tumeur impossible.
Gestion du ph?notype dommageable d?inflammation chronique de l?intestin lors de l’?levage de lign?es murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Produire des souris qui développent avec l'âge une inflammation chronique de l'intestin, telle est la finalité de cet élevage, qui porte sur 2 560 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La seule intervention décrite est un poinçonnage de l'oreille sur souris vigile, en moins de trente secondes, pour génotyper une partie des reproductrices. La souffrance vient de la lignée elle-même : le porteur annonce de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante en cas de forme sévère, avec une mobilité et un pelage altérés. Le devenir déclaré compte les 2 560 souris comme mises à mort, alors que le résumé indique qu'une partie est expédiée vers un autre établissement utilisateur avant l'expression du "phénotype dommageable", celles gardées pour la reproduction étant tuées avant 24 semaines.
Objectifs
Ce projet d?crit une proc?dure de l'?levage avec la prise en charge des animaux d?une lign?e de souris d?veloppant progressivement une inflammation chronique de l?intestin (colite). Ces souris sont un mod?le des Maladies Inflammatoires Chroniques de l?Intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn et la colite h?morragique qui sont caus?es par un m?lange de facteurs g?n?tiques, environnementaux et li?s aux microbes pr?sents dans l?intestin. Normalement, le corps produit des substances qui aident ? limiter l?inflammation dans l?intestin. Dans notre mod?le de souris, cette mol?cule est absente, ce qui entra?ne une r?action excessive du syst?me immunitaire et une inflammation chronique du c?lon. De plus, des ?l?ments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques peuvent aggraver cette inflammation en modifiant les microbes intestinaux. L?objectif de cet ?levage est de produire des animaux reproduisant la maladie observ?e chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilis?s dans des projets de recherche afin d'?tudier les maladies inflammatoires de l?intestin et, ? terme, aider ? la recherche sur ces maladies chez l?homme.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre ? l'?quipe de recherche et ? leurs partenaires d?avoir les souris n?cessaires pour mener leurs ?tudes sur les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI). A long terme, ces souris aideront les chercheurs ? : mieux comprendre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles fa?ons de traiter ces maladies, tester de nouveaux m?dicaments anti-inflammatoires et d??valuer leur efficacit? par rapport aux traitements d?j? disponibles pour les patients atteints de MICI.
Procédures
Afin de r?aliser le g?notypage, un poin?onnage de l?oreille sera effectu? apr?s l??ge de 14 jours. Cette m?thode consiste ? pr?lever sur animaux vigiles un petit ?chantillon de tissu sur la p?riph?rie du pavillon de l?oreille o? le tissu est le plus mince, ? l?aide d?un poin?on. Cette intervention n?est r?alis?e qu?une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilis?s pour les croisements seront g?notyp?s.
Impact sur les animaux
Une partie des souris dans ce projet peuvent commencer ? d?velopper progressivement avec l??ge une inflammation de l?intestin. En cas de forme s?v?re, cela peut entra?ner de fortes diarrh?es, des saignements rectaux, une d?shydratation et une perte de poids importante. La mobilit? ainsi que l?apparence du pelage peuvent ?tre alt?r?es. Les souris reproductrices pourraient ressentir une l?g?re nuisance due au pr?l?vement effectu? pour le g?notypage (douleur l?g?re de courte dur?e).
Devenir
Une partie des animaux sera exp?di?e en d?but ou avant l?expression du ph?notype dommageable et utilis?e dans des projets de l??quipe de recherche dans un autre ?tablissement utilisateur. Une autre partie des animaux sera utilis?e pour l??levage dans notre ?tablissement. Les animaux utilis?s pour l??levage seront mis ? mort avant 24 semaines, pour limiter l??volution du ph?notype dommageable avec l??ge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d??valuation du bien-?tre animal seront mis ? mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entiers est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI) sont tr?s complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le syst?me immunitaire, les microbes intestinaux, la g?n?tique et l?environnement. Ces maladies affectent non seulement l?intestin mais aussi d?autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l?environnement et les microbes interagissent avec l?organisme, les souris sont le mod?le le plus adapt?. ? ce jour, il est impossible de recr?er ces interactions complexes en laboratoire par l'utilisation de m?thodes alternatives (par exemple, mod?les cellulaires), d?o? la n?cessit? d??tudier ces maladies sur des animaux vivants.
Réduction
Un nombre total de 2560 animaux au ph?notype dommageable est n?cessaire et comprend les animaux pour l??levage et les animaux n?cessaires pour l?exp?rimentation pour les projets scientifiques associ?s. La production des animaux sera planifi?e et suivie par l?exp?rimentateur et les zootechniciens de l??tablissement utilisateur afin de limiter le nombre d?animaux g?n?r?s au strict n?cessaire pour les besoins exp?rimentaux et l??levage. Le nombre de reproducteurs et la dur?e d?accouplements seront d?finies en amont de la mise en place des croisements. Ces param?tres seront d?finis en fonction des objectifs et des diff?rentes caract?ristiques connues des lign?es (taille de port?es, viabilit?, ph?notype, etc.). L'?levage sera suivi via le fichier de l'?levage. En fin de projet exp?rimental, l??levage sera arr?t? et le mod?le restera disponible cryoarchiv? dans notre ?tablissement.
Raffinement
Les conditions de l?h?bergement, le seuil de l??ge d?utilisation, les crit?res du suivi et les points limites ont ?t? d?finis afin de minimiser les nuisances. Tous les animaux mut?s de mani?re homozygote pour la modification g?n?tique et susceptibles de d?velopper le ph?notype dommageable ? partir de 5-6 semaines seront suivis ? partir de 3-4 semaines (sevrage) et ce jusqu'? leur envoi avant 6 semaines vers l??tablissement o? sera r?alis?e l?exp?rimentation (ou leur mise ? mort) : une ?valuation du bien-?tre animal sera r?alis?e en prenant en compte la pr?sence de diarrh?e, la pr?sence de saignements rectaux, l?apparence et la mobilit? de l?animal. En fonction de l??tat de l?animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la v?t?rinaire et/ou la SBEA (disponibilit? de la nourriture directement dans la cage, mise ? disposition d?une solution de r?hydratation g?lifi?e, augmentation de la fr?quence du suivi avec la pes?e d?animaux). Les points limites pr?coces et sp?cifiques pour les signes cliniques de l?inflammation de l?intestin ont ?t? d?finis. Si, malgr? le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l?animal sera imm?diatement mis ? mort. Dans le cas o? les animaux homozygotes ne sont pas transf?r?s pour l?exp?rimentation, ces derniers seront utilis?s pour l??levage et mis ? mort avant 24 semaines (pour limiter les nuisances li?es ? la progression de la maladie avec l??ge).
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilis?es pour ?tudier les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l?alimentation, l?environnement, les microbes intestinaux et l?intestin lui-m?me. Dans ce projet, nous utilisons une lign?e de souris qui ne produit pas une prot?ine cl? entra?nant ainsi une inflammation intestinale ressemblant ? une colite h?morragique chez l?humain. Ce mod?le g?n?tique de la maladie n?existe que chez la souris. Les souris seront utilis?es pour les croisements d?s l??ge de 7-8 semaines (maturit? sexuelle) et ce jusqu?? 24 semaines, pour limiter l?expression du ph?notype dommageable qui progresse avec l??ge. Le ph?notype dommageable de colite est susceptible d'appara?tre ? partir de l'?ge de 5-6 semaines, mais dans l??levage de l?EU du chercheur seulement 5% d?animaux sont concern?s ? cet ?ge. Les animaux envoy?s pour exp?rimentation auront ainsi un ?ge de 4-6 semaines pour limiter et potentiellement ?viter l?expression du ph?notype dommageable avant l?envoi.
Rôle des gènes d’études dans le développement des myosites inflammatoires : analyse de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une posture inhabituelle, un poil hérissé, un dos voûté, le retrait et l'absence d'interaction avec les congénères déclenchent le retrait de l'étude et une mise à mort immédiate. 2400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées en fin de procédure pour des analyses de tissus. Toutes reçoivent cinq jours d'injections dans le péritoine pour inactiver les gènes étudiés dans le muscle, ainsi que jusqu'à trois prélèvements de sang, et 1600 d'entre elles des injections en quatre zones sous la peau qui provoquent des lésions musculaires, suivies d'un gavage quotidien de glucocorticoïde pendant une semaine. Le porteur présente les 2400 souris comme "une estimation haute", ce nombre devant être "ajusté à la baisse" en fonction des résultats intermédiaires.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle des gènes d’études dans l’homéostasie du muscle squelettique et dans le développement des myosites inflammatoires, à l’aide de modèles murins présentant une invalidation conditionnelle et spécifique du muscle squelettique. Plus précisément, il s’agit de comparer l’impact d’une délétion musculaire de ces gènes induite après une lésion musculaire aiguë par toxine et avant l’induction d’une myosite expérimentale, sur les paramètres cliniques, histologiques, moléculaires et immunologiques du muscle.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle précis des gènes d’études dans la physiopathologie des myosites inflammatoires et des myopathies inflammatoires idiopathiques, qui se caractérisent par une faiblesse musculaire proximale, une élévation des enzymes musculaires et une inflammation musculaire persistante. L’utilisation de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle, combinée à des modèles de myosite expérimentale, devrait permettre d’identifier des voies de signalisation et des populations cellulaires clés dans la transition entre lésion musculaire aiguë, régénération et inflammation chronique. À terme, ces données pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques orientées vers le muscle dans les myopathies inflammatoires, ou à l’optimisation des stratégies de prise en charge existantes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (2400) seront sujets à des traitements par injection intra-péritonéale pendant 5 jours pour induire l’inactivation des gènes d’étude au niveau des muscles (30 secondes maximum de contention par injection soit 2minutes et 30 secondes au maximum par animal). Tout animal de l’expérience pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum (30 secondes de contention par prélèvement) au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Les 1600 souris des procédures 2 et 3 seront injectés en 4 zones en sous-cutanée et sous anesthésie gazeuse afin d’induire les lésions musculaires (30 minutes de l’anesthésie au réveil par animal), suivi d’une administration quotidienne par gavage (30 secondes de contention par administration et par animal) d’un glucocorticoïde pendant 1 semaine.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Des effets indésirables liés aux injections sous anesthésie sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie prévu dans la grille de scoring. Les gavages peuvent entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux. Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).
Remplacement
Les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls. L’utilisation de modèles murins de myosite expérimentale est actuellement la seule approche permettant de reproduire l’ensemble des aspects cliniques, histologiques et immunologiques de ces pathologies et d’évaluer l’impact d’une invalidation musculaire conditionnelle des gènes étudiés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de manière à obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre de souris par groupe, en se basant sur les pratiques publiées en modèles murins de myosite et de lésion musculaire (10 animaux par groupe et par condition). Pour chaque lignée et par temps étudiés (1 ; 3 ;5 ;7 ;9 mois post-traitement), 10 souris sont prévues pour les analyses de rétro transcrits, 10 pour l’expression protéique, 10 pour les analyses FACS et 10 pour l’histologie, réparties entre transgéniques et contrôles. Ainsi, 40 souris transgéniques pour chacune des 3 lignées sont nécessaires, soit 120 souris transgéniques et 40 contrôles par temps d’études de chaque procédure expérimentale (soit (120+40)x5 temps x 3 procédures), au total 2400 animaux au maximum seront nécessaires pour cette étude. Lorsque cela est possible sans compromettre la qualité des analyses, plusieurs types de mesures seront combinés sur un même animal (par exemple tests fonctionnels, prélèvements sanguins et analyses moléculaires sur muscles distincts). Ce nombre constitue une estimation haute et sera ajusté à la baisse en fonction des résultats intermédiaires, notamment si certains temps expérimentaux précoces ou tardifs s’avèrent non pertinents.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid, bâtons de bois et des maisonnettes...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé, avec une sonde rigide de 20G, par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de noyade accidentelle au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est nécessaire pour l’étude des maladies musculaires et des myosites expérimentales, car les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls Les stades d’études vont de jeunes adultes à adultes, nous utiliserons donc des souris de 1, 3, 5,7 et 9 mois après le 1er traitement, les souris les plus âgées auront donc 11 mois.
Efficacité d’action des cellules CAR-VST restimulées par des cellules dendritiques dans un modèle de rechute leucémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules leucémiques humaines puis de cellules traitement dans la veine de la queue, 218 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Elles subissent une prise de sang par semaine pendant sept semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, après injection dans l'abdomen d'un produit qui rend les cellules leucémiques lumineuses. Le porteur décrit une maladie de type leucémie avec poils hérissés, perte de poids et, dans les cas extrêmes, un début de paralysie des pattes arrière, ainsi qu'une possible maladie du greffon contre l'hôte avec lésions cutanées et diarrhées. L'expérience s'arrête au 56e jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, les souris étant alors tuées.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse à partir des cellules du patient modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses (appelées CAR-T cells) permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. Nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous avons pu montrer que les cellules CAR-VST sont aussi efficaces que les CAR-T dans des modèles murins classiques. Ce projet s’attèle à montrer la supériorité des CAR-VST en termes de persistance antitumorale au long terme, grâce à la restimulation antivirale.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer avec certitude si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique persistant et supérieur au traitement de référence par CAR-T cells. Une fois cette preuve de concept démontrée, envisager leur production à plus grande échelle devient un projet plus réalisable.
Procédures
- Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) - Contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques - Pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (15min max) - A l’issue des 10min d’attente, imagerie du signal lumineux (30min maximum) - Arrêt de l’expérimentation par euthanasie des souris au dernier jour (56e jour) ou en cas de détection précoce de progression de la maladie
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée, réalisée sous anesthésie locale, et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Dans les semaines qui suivent l’injection des cellules d’intérêts (CAR T cells ou CAR VST), les souris peuvent présenter des signes de maladie de greffon contre l’hôte, caractérisés par une perte de poids, une altération de la fourrure avec lésions cutanées, un mal-être et des diarrhées. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. - Un prélèvement sanguin par semaine pendant 7 semaines au niveau de la veine caudale sera réalisé avec contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 56 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
La saisine est construite de manière séquentielle. Si les deux premiers objectifs ne sont pas atteints, il n’y aura pas d’intérêt de poursuivre les deux suivants, ce qui permettra de réduire in fine le nombre de souris utilisées. Le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir le minimum d’individus, sans aller au détriment des résultats.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être. L’utilisation d’anesthésique et la bonne organisation du plan d’expériences permet de réaliser les expériences dans un temps court afin de limiter le stress et les douleurs des souris.
Choix des espèces
Les souris utilisées, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
MODIFICATION Etude des mécanismes de sensibilisation nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de substance détruisant les neurones dopaminergiques est pratiquée sur des souriceaux de cinq jours : 6 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques. S'y ajoutent une chirurgie d'implantation de deux heures, cinq jours de restriction calorique à partir du 49e jour, puis trois à cinq heures d'imagerie et d'enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière au 53e jour. Le porteur attend une perte de poids et une hypothermie liées à l'injection, un risque d'infection lié aux implants, et un stress social qu'il rattache à l'hébergement individuel. Il situe l'âge adulte de la souris à 21 jours dans la description des procédures, et à plus de cinq semaines dans sa justification du choix de l'espèce.
Objectifs
Nous nous intéressons à la régulation de la nociception dans le cerveau et à ses effets sur l’intégration sensorielle dans la moelle épinière. La nociception est une douleur déclenchée par une agression de l'organisme elle est ensuite intégré par le système nerveux central et périphérique dont la moelle épinière. Nous étudions en particulier les dysfonctionnements cérébraux qui caractérisent certaines pathologies émotionnelles et psychiatriques et qui sont aussi responsables de douleurs. A ce titre, nous nous intéressons aux anomalies sensorielles fréquemment décrites en clinique dans des conditions d’anxiété pathologique, ou dans les troubles de l’attention et de l’hyperactivité, avec ou sans impulsivité (TDAH). Plus précisément, nous cherchons à comprendre le rôle de différents systèmes moléculaires dans l'activité de certaines régions corticales et dans le développement de la douleur et des symptômes du TDAH. Dans ce but, nous combinons des approches méthodologiques variées pour étudier les comportements et pour analyser l’activité des populations neuronales impliquées
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent le traitement de la douleur, et en particulier des douleurs associées à des pathologies anxieuses ou au TDAH. Au-delà d'un inconfort temporaire. la sensibilisation chronique à la douleur provoque une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Cette sensibilisation amplifie à son tour les symptômes du TDAH et de l'anxiété et contribue à la mise en place d'un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Nos études permettront de développer des traitements efficaces car ils empêcheront les interactions entre ces pathologies et les douleurs, et bloqueront l'aggravation mutuelle des symptômes. L’innovation consiste à étudier des circuits, ou des systèmes moléculaires, qui interviennent à la fois dans ces pathologies neuropsychiatriques et dans la douleur. Ce sont les mécanismes moléculaires partiellement communs aux douleurs et aux troubles neuropsychiatriques associés qui seront la cible des traitements à développer.
Procédures
Chirurgie et implantation à l’âge adulte à 21 jours (2heures), injection cérébrale et injection de substance qui induit la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souriceaux à 5 jours (30minutes), restriction calorique à 49 jours (pendant 5 jours), imagerie et enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière à la fin de la procédure à 53 jours (3-5heures),
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants et la CFA 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental 4/ un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection de la 6-OHDA. 5/ STRESS SOCIAL SUITE A L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus pour les analyses histologiques et la vérification des coorodonées des injections et l'histologie des tissus
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur. AFIN DE DIMINUER L’IMPACT DU STRESS SOCIAL SUITE À L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL, UN ENRICHISSEMENT ENVIRONNEMENTAL RICHE EST MIS EN PLACE. UN SUIVI COMPORTEMENTAL RENFORCÉ SERA AUSSI ASSURÉ POUR DÉTECTER PRÉCOCEMENT TOUT SIGNE DE DÉTRESSE. CE SUIVI INCLUT UNE OBSERVATION CLINIQUE SYSTÉMATIQUE TOUS LES JOURS(ACTIVITÉ, POSTURE, PELAGE, RÉACTIVITÉ). AUSSI DES MANIPULATIONS, RÉALISÉES DE MANIÈRE DOUCE ET RÉGULIÈRE POUR MAINTENIR LE CONTACT TACTILE ET OLFACTIF
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 semaines. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Impact de l’obésité et de l’hyper/hypo-charge mécanique sur les atteintes osseuses du myélome
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Des souris sont placées seules dans des cages aménagées pour les empêcher de poser leurs pattes arrière, quatorze jours durant, après avoir reçu une injection de cellules cancéreuses provoquant un myélome et un régime gras destiné à les rendre obèses. 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, avec des séances d'imagerie aux rayons X de trente minutes sous anesthésie et des prises de sang hebdomadaires à partir de la moitié de l'étude. Le résumé qualifie pourtant ces procédures de "gêne limitée" et parle d'un "inconfort temporaire, comme une mobilité réduite" d'un à deux jours, quand la gravité déclarée pour une partie d'entre elles est sévère. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde à la fin des quatorze jours de contrainte mécanique, pour prélever leurs os et leurs organes.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment l’obésité et les contraintes mécaniques sur les os (moins ou plus de charge) influencent la progression de la maladie osseuse liée au myélome multiple. Le myélome multiple est un cancer de la moelle osseuse qui perturbe le renouvellement de l’os. Environ 80 % des patients développent des atteintes osseuses douloureuses qui dégradent fortement leur qualité de vie. Les personnes en surpoids sont plus à risque de développer cette maladie, avec des formes plus graves et une moins bonne réponse aux traitements. Cependant, on comprend encore mal le rôle combiné de l’obésité et des contraintes mécaniques sur cette évolution. Pour répondre à cette question, nous étudierons des souris atteintes de myélome, avec ou sans obésité, soumises à différentes conditions mécaniques (moins ou plus de charge sur les os). Nous analyserons leurs os pour observer les changements structuraux et biologiques. L’objectif est de mieux comprendre comment l’obésité et les contraintes mécaniques influencent la santé osseuse dans cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la façon dont certaines cellules du skelette, appelées ostéocytes, réagissent aux contraintes mécaniques dans des situations d’obésité et de maladie. Ces cellules jouent un rôle central dans le maintien de l’équilibre de l’os. Les résultats permettront aussi de créer une base de données utile pour de futures recherches. À court terme, ce travail sera utile pour les chercheurs dans plusieurs domaines, comme les maladies du sang, le cancer, la physiologie de squelette, le métabolisme et l’étude des mécanismes qui régulent l’activité des gènes. Il servira également de référence pour mieux comprendre l’impact du manque d’activité physique, par exemple chez les patients alités, sur l’évolution du myélome multiple et des maladies osseuses associées, en particulier chez les personnes obèses. Il aidera aussi à mieux comprendre pourquoi les effets de l’exercice physique sur les os peuvent varier selon les patients. À moyen et long terme, cette étude pourra aider à adapter les traitements en fonction du profil des patients, notamment leur état métabolique, et à mieux ajuster les recommandations d’activité physique pour les personnes atteintes de myélome multiple.
Procédures
Nous utiliserons une technique d’imagerie aux rayons X pour observer les os des souris (le tibia et le fémur) directement sur des animaux vivants. Pour cela, les souris seront brièvement endormies puis placées dans l’appareil d’imagerie pendant environ 30 minutes. Plusieurs examens seront réalisés au cours de l’étude pour suivre l’évolution de leurs os. Après chaque examen, les souris seront réchauffées jusqu’à leur réveil, puis remises dans leur cage. L’exposition aux rayons X dans ces conditions est sans danger pour leur santé et n’affecte pas leurs os. À partir de la moitié de l’étude, de petites prises de sang seront réalisées chaque semaine sur des souris éveillées afin de suivre certains paramètres biologiques. À la fin de chaque procédure, les animaux seront placés sous anesthésie profonde afin de permettre un prélèvement final sans réveil.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir un stress modéré lié à l’isolement et aux manipulations, mais leur état de santé sera surveillé régulièrement et les procédures seront adaptées si nécessaire. Certaines manipulations peuvent entraîner une légère perte de poids temporaire. Cette perte est réversible et le poids des animaux sera suivi quotidiennement. Les différentes procédures peuvent provoquer une gêne limitée : les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie et ne sont pas douloureux ; les prises de sang entraînent une douleur minime ; et les injections dans l’os peuvent causer une gêne légère et passagère, avec prise en charge de la douleur si besoin. Les modèles expérimentaux peuvent aussi entraîner un inconfort temporaire, comme une mobilité réduite ou de légers troubles de l’alimentation pendant un à deux jours. Les animaux restent cependant surveillés en continu, avec un accès adapté à la nourriture et à l’eau pendant la contrainte mécanique. Tout au long de l’étude, l’état de santé des souris et l’évolution de la maladie seront suivis de près grâce à des observations, de l’imagerie et des analyses non invasives. Toutes les précautions seront prises pour limiter au maximum la douleur, la gêne et le stress, en respectant les règles éthiques en vigueur.
Devenir
Toute autres analyses et récoltes d'échantillons sera effectuée après la mise à mort sur toutes nos souris. Les mises à mort seront réalisées par une personne habilitée à la fin du protocole expérimental après les 14 jours de contrainte mécanique, par anesthésie profonde. Toutes les souris seront mis à mort pour prélèvement d'organes à des fins d'investigations moléculaires, histologiques, biochimiques et physiologiques.
Remplacement
Les modèles en laboratoire ou informatiques ne permettent pas de reproduire toute la complexité du squelette. Le squelette est un tissu vivant, où de nombreuses cellules interagissent entre elles et avec d’autres systèmes du corps. Les modèles actuels ne permettent pas de recréer correctement ces interactions, ni d’étudier des phénomènes complexes comme l’obésité ou les effets des contraintes mécaniques sur les os. Ces approches sont surtout utiles pour observer des mécanismes simples, mais elles ne permettent pas d’étudier le renouvellement de l’os ni l’évolution globale d’une maladie osseuse dans l’organisme. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est nécessaire. Les souris ont un fonctionnement osseux et un métabolisme proches de ceux de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier les maladies des os. Le modèle utilisé dans ce projet permet de reproduire la progression de la maladie au plus près de ce qui se passe chez l’humain, et d’étudier en même temps l’effet de l’obésité et des contraintes mécaniques sur les os.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été déterminé de manière rigoureuse à partir de précédentes expériences du laboratoire portant sur l’étude du squelette, afin de garantir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Lors de ces expériences, il a été observé qu’environ 20 % des souris ne développent pas de tumeur après injection des cellules cancérueses, et qu’environ 5 % ne deviennent pas obèses malgré un régime riche en graisses. Ces animaux ne peuvent pas être inclus dans l’analyse. Le protocole expérimental a été soigneusement conçu pour réduire au maximum la variabilité entre les groupes (conditions de vie identiques, suivi du poids, alimentation contrôlée, suivi dans le temps par imagerie). Cela permet d’obtenir des résultats solides avec le nombre minimum de souris nécessaire. Enfin, ce sujet étant encore peu étudié, il n’existe pas de données publiées équivalentes à ce jour.
Raffinement
Chaque souris est suivie attentivement par du personnel formé afin de garantir son bien-être tout au long de l’étude. Les conditions d’hébergement sont adaptées aux différentes procédures, conformément aux recommandations en vigueur. Dans le cas de la suspension, les souris sont placées seules dans des cages aménagées pour éviter qu’elles ne puissent poser leurs pattes arrière. L’environnement est simplifié progressivement pour les habituer, tout en laissant des éléments à ronger pour leur confort. Les animaux sont surveillés tous les jours, et même deux fois par jour lors des phases plus contraignantes. Leur état de santé général est suivi de près (poids, comportement, alimentation, hydratation), ainsi que tout signe de stress ou d’inconfort. Toutes les observations recueillies serviront à analyser les résultats de l’étude et à appuyer les conclusions scientifiques.
Choix des espèces
Les invertébrés ne peuvent pas être utilisés pour cette étude, car ils n’ont pas d’os mais un squelette externe. Chez les vertébrés, la souris est le modèle le plus adapté, à la fois pour des raisons scientifiques et pratiques. Elle permet d’étudier en détail le fonctionnement des os, le myélome multiple et les effets des contraintes mécaniques. La souris est particulièrement utile car elle permet de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps chez un même animal, grâce à des techniques d’imagerie. Elle permet aussi d’analyser précisément les tissus après l’étude. Nous utiliserons des souris adultes, afin d’éviter les biais liés à la croissance. Le régime alimentaire débutera à un jeune âge (8 semaines) pour induire une obésité stable avant le début de l’étude. Cela est important, car l’obésité est un élément central du projet. Les expériences commenceront une fois que les souris auront atteint un stade de maturité comparable à celui des patients adultes. Enfin, le modèle utilisé est bien établi et permet de reproduire de manière fiable la maladie observée chez l’humain, ce qui garantit la pertinence des résultats.
Deconditionnement et Reconditionnement musculaire de souris APC par stratégie d’administration de facteur angiogénique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Les souris Apc utilisées ici développent un cancer du côlon et une cachexie, perte de masse musculaire que le porteur décrit comme non totalement réversible par l'alimentation. 586 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus musculaires. Elles reçoivent un traitement puis subissent, pendant cinq à quatorze semaines, des mesures d'activité physique spontanée et de capacité contractile du muscle sous anesthésie générale, avec un contrôle des fèces à partir de la dixième semaine pour y détecter du sang. Le résumé donne une durée de vie moyenne de 23 semaines pour cette lignée et affirme qu'aucune souris ne sera utilisée au-delà de 20 semaines "afin de respecter le bien être animal".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser l’impact du développement de la cachexie sur la vascularisation musculaire et de déterminer la contribution de ces altérations à la perte de masse et de fonction musculaires dans un contexte de développement de cancer du colon. La cachexie est un état de perte progressive de masse corporelle, principalement musculaire, non volontaire et non totalement réversible par l’alimentation. Elle est fréquemment associée aux maladies chroniques comme le cancer. Ce projet vise également à évaluer le potentiel protecteur d’une stimulation de l’angiogenèse par le un facteur de croissance spécifique du tissu endothéliale sur la préservation de la masse et de la fonction musculaires dans un contexte de cachexie liée au cancer du colon.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à combler un manque de connaissances sur les altérations du compartiment vasculaire musculaire au cours de la cachexie associée au cancer, ainsi que sur leur contribution fonctionnelle à la perte de masse et de fonction musculaire. Bien que la cachexie soit principalement étudiée sous l’angle des déséquilibres protéiques et métaboliques, le rôle du réseau vasculaire musculaire dans la progression de cette pathologie reste encore peu caractérisé.
Procédures
Au total les animaux se verront administrer un traitement dont le bénéfice sera évalué pendant les 5 à 14 semaines suivantes grâce la mesure d'activité physique spontanée, de capacité contractile du muscle chez des souris sous anesthésie générale et analgésie puissante, ainsi que d'analyses tissulaires post mortem des tisses musculaires
Impact sur les animaux
Pour les souris de type sauvage utilisées comme contrôles, aucun effet indésirable n’est attendu. Les souris Apc présentant un phénotype dommageable associé à une durée de vie moyenne de 23 semaines . Cependant, notre parfaite connaissance de la lignée nous permet d'anticiper toute nuisance associée au phénotype grâce à un suivi journalier. Aucune souris ne sera utilisé à un âge supérieur à 20 semaines afin de respecter le bien être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour préocéder à des prélèvements tissulaires
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer met en jeu un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, réseau vasculaire, système immunitaire, système nerveux central...). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal peut reproduire la complexité du phénomène. Ce projet vise à comprendre le potentiel lien entre vascularisation et cachexie liée au cancer. Un modèle autre que in vivo ne peut être utilisé.
Réduction
En se basant sur les données de la littérature, 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certaines souris modèles de cancer du côlon, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe âgés de 15 semaines et des lots de 20 animaux par groupe âgés de 20 semaines. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats.
Raffinement
Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés en groupe social dans un local à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront au minimum de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Un contrôle des fèces sera réalisé à partir de la 10ème semaine de vie afin de déceler l'apparition de sang. Une mesure d'hématocrite réalisé à partir de la 1ère apparition de sang dans les fèces pour suivre l'évolution de l'anémie. Dans le cadre du raffinement des procédures expérimentales, la Structure Bien-Être Animal (SBEA) assurera un rôle central dans le suivi du projet, notamment pour le contrôle du respect des bonnes pratiques, l’évaluation du bien-être des animaux et l’application des points limites tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Un des objectifs principaux de notre activité de recherche est la compréhension des mécanismes de la cachexie associée au cancer et le développement de stratégies thérapeutiques permettant de prévenir ou de limiter le syndrome cachectique. Disposer d'un modèle murin de cachexie associée au cancer est donc indispensable à notre activité. Ce projet est réalisé chez des souris Apc à différents stades de progression de la cachexie : phase de développement (6 semaines), phase pré-cachectique (11 semaines), phase de cachexie modérée (15 semaines), phase de cachexie avancée (20 semaines). Des souris sauvages seront utilisées au même age pour comparaison.
Modèle murin de sepsis (ligature du caecum) pour le développement de thérapies innovantes immunomodulatrices et anti-infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 160
Soumis à une ligature et une ponction du cæcum qui déclenchent une septicémie polymicrobienne, 480 rongeurs, 320 souris et 160 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une douleur abdominale aiguë, une léthargie, une perte de poids rapide, une déshydratation, un choc septique et des défaillances d'organes dans les cas graves, ainsi qu'une mortalité partielle liée à la longueur de la ligature et au calibre de la perforation. Les composés testés sont administrés une à quatre fois par jour pendant dix jours au plus, avec pesée quotidienne et une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie. Tous seront tués à la fin de chaque procédure pour mesurer la charge microbienne et les paramètres inflammatoires dans leurs organes.
Objectifs
Le projet utilise le modèle de ligature et ponction du cæcum chez la souris pour évaluer l’efficacité de composés anti-infectieux et immunomodulateurs dans le contexte d’une d’une septicémie polymicrobienne d’origine abdominale. Les objectifs principaux de ce protocole sont : Evaluer l’efficacité thérapeutique des petites molécules, peptides, anticorps, vaccins ou immunomodulateurs pour réduire la charge bactérienne systémique. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire : modulation de l’inflammation, prévention du choc septique et restauration de l’homéostasie immunitaire. Mesurer la protection des organes et tissus face aux dommages induits par l’infection abdominale. Comparer différentes stratégies thérapeutiques en situation de septicémie abdominales pour identifier les interventions les plus efficaces. Valider un modèle préclinique représentatif des infections polymicrobienne d’origine abdominale humaines pour le développement de traitements innovants contre les bactéries résistantes et les infections graves. Ce protocole est particulièrement adapté pour tester des traitements dans un contexte de septicémie polymicrobienne, où les modèles cellulaires ou tissulaires classiques ne permettent pas d’évaluer simultanément l’efficacité anti-infectieuse et l’impact immunomodulateur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine et animale. Il permet de compréhension des mécanismes de l’infection systémique : le CLP reproduit la septicémie polymicrobienne humaine, permettant d’étudier comment les bactéries déclenchent l’inflammation, le choc septique et la dysfonction organique. Permet également d’évaluer la réponse immunitaire en mesurant les effets immunomodulateurs des nouvelles molécules, anticorps ou vaccins, d’identifier des biomarqueurs de gravité de l’infection ou de réponse thérapeutique. Permet de la validation préclinique de nouveaux composés anti-infectieux, optimisation des stratégies thérapeutiques en situation de septicémie sévère, infections localisées. A plus large échelle, il permettra d’améliorer la prise en charge des infections graves en prévenant de la mortalité liée à la septicémie et au renforcement du pipeline thérapeutique.
Procédures
Le projet implique une chirurgie pour ligaturer et ponctionner le caecum. Cette procédure est réalisée sous anesthésie chimique et analgésique. Les traitements avec les composés testés sont de 1 à 4 fois par jour pendant 10 jours maximum. Ce geste n'excède pas 10 secondes par animal. Pour l'ensemble des protocoles, des pesées journalières sont réalisées ; pour chaque souris, une contention de 20 secondes maximum est nécessaire pour cette mesure. Enfin, des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (pendant 1 minute) sont pratiqués pour la mesure des paramètres inflammatoires. En prenant en compte le temps de récupération des souris, le nombre maximum de prélèvement est de 1 fois par semaine pour l'ensemble des procédures. 1 minutes avant le prélèvement, un traitement avec un analgésique est pratiqué pour réduire la douleur .
Impact sur les animaux
Pour un projet utilisant le modèle de ligature et ponction du cæcum (CLP) les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux, sont les suivants : La chirurgie provoque une douleur abdominale aiguë et les infections induites peuvent entraîner douleur diffuse, malaise, léthargie et perte d’appétit. Les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que poils hérissés, posture recroquevillée ou mobilité réduite. Le sepsis peut provoquer un choc septique dans les cas sévères et défaillance organique possible. Une diarrhée, une perte de poids rapide et une déshydratation. Certains composés testés peuvent entraîner toxicité hépatique, rénale ou hématologique. Le CLP est un modèle de septicémie sévère ; une mortalité partielle est attendue en fonction de la longueur de la ligature et du calibre de la perforation.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires et des études d'histologie.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies infectieuses et inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies infectieuses et inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies infectieuses et inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés anti-infectieux et immunomodulateurs sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, comme les poumons, la vessie et les reins, permettant d’étudier la réponse des tissus aux infections et traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements contre les infections virales, bactériennes et fongiques. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées afin de déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure ; généralement la charge virale, bactérienne ou fongique dans les organes ciblés, analyse des signes cliniques, mesure de biomarqueurs (exemple: biomarqueur hépatique) et évaluation de l'inflammation (cytokines, chimiokines ou histologie).
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que la perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites (voir annexe) en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse, comme une perte de poids importante (plus de 20%) ou une diminution de l'activité. Des critères d'arrêt stricts et précoces sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqure...).
Choix des espèces
Le CLP est un modèle standardisé de septicémie polymicrobienne, largement validé dans la littérature. Les réponses physiopathologiques chez la souris et le rat (inflammation systémique, choc septique, dysfonction d’organes) reproduisent de manière fiable les principales caractéristiques de la septicémie humaine. La variabilité génétique contrôlée chez les souris permet une reproductibilité expérimentale élevée. Les souris sont suffisamment petites pour une manipulation chirurgicale délicate avec un minimum de matériel et de stress. Les rats, plus grands, permettent des prélèvements sanguins répétés, des mesures hémodynamiques et des interventions plus complexes sans compromettre leur survie. Les modèles murins et ratins permettent d’étudier simultanément la charge bactérienne systémique, la réponse immunitaire innée et adaptative et l’inflammation et lésions tissulaires dans différents organes. Aucun modèle in vitro ou tissulaire ne permet de reproduire cet ensemble d’événements physiopathologiques de manière intégrée. Les animaux utilisés dans le cadre des modèles de pathologies infectieuses sont des jeunes adultes, âgées de minimum de 6 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à une maturité immunologique, métabolique et physiologique optimale, ce qui en fait un modèle préclinique pertinent et standardisé pour l’étude des maladies infectieuses et inflammatoires humaines. A partir de la 6e semaine, les souris présentent un système immunitaire complet (réponses innée et adaptative), permettant une réponse fiable aux agents pathogènes étudiés (bactéries, virus, champignons). Les animaux sont sevrés, stabilisés, et moins sujets aux fluctuations hormonales ou de croissance rapides, ce qui renforce la reproductibilité expérimentale. La morphologie permet des manipulations techniques précises (voies d’infection, prélèvements sanguins, administration de traitements). La majorité des publications scientifiques et des recommandations réglementaires utilisent ce stade pour modéliser des infections polymicrobienne d'origine abdominale.
Rôle du système immunitaire dans la progression de la pathologie du foie dans un modèle de souris développant un foie gras
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Une souris qui fait plus de trois hypoglycémies au cours de la procédure est mise à mort. 152 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère, dont 80 rendues malades d'une glycogénose hépatique par cinq injections quotidiennes vers six à huit semaines. À sept jours, un morceau d'oreille d'un millimètre leur est prélevé pour génotypage, puis leur glycémie est suivie par mini-incision de la queue, avec trois à quatre prises de sang mensuelles. Le porteur compte 1 à 2 % de décès par hypoglycémie sévère, survenant en général la nuit. La moitié des souris est tuée pour le prélèvement du foie, du cerveau et des gonades, l'autre pendant une chirurgie de purification des cellules du foie, toutes entre trois et quatre mois après l'induction, avant l'apparition des tumeurs que le projet cherche à comprendre.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire est la forme la plus fréquente de cancer du foie. Dans la majorité des cas, ce cancer apparaît après plusieurs étapes de dégradation du foie : accumulation de graisse dans les cellules hépatiques (stéatose), inflammation chronique, fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) puis cirrhose. En effet, plus de 80 % des cancers du foie se développent sur un foie déjà cirrhotique. Cependant, certaines personnes développent un cancer du foie sans présenter de fibrose ou de cirrhose importantes. Cette situation est observée notamment chez les patients atteints de glycogénose de type 1a, une maladie génétique rare. Chez ces patients, une enzyme essentielle à la production de glucose est absente ou déficiente. L’organisme ne peut donc pas maintenir une glycémie normale pendant le jeûne, ce qui entraîne des hypoglycémies sévères. À long terme, 70 à 80 % des patients adultes développent des tumeurs du foie. Habituellement, l’excès de graisses dans le foie devient toxique pour les cellules hépatiques. Les cellules endommagées déclenchent alors une réaction inflammatoire impliquant différentes cellules immunitaires. Ces cellules produisent des molécules favorisant l’inflammation et la formation de fibrose. Fait surprenant, chez les patients atteints de glycogénose, les marqueurs de l’inflammation sont peu élevés et la fibrose est faible, voire absente, même lorsque des tumeurs sont présentes. Ces observations suggèrent que le cancer du foie se développe par des mécanismes différents de ceux décrits habituellement. L’objectif de ce projet est d’étudier les cellules immunitaires présentes dans le foie de souris modèles de glycogénose et de les comparer à celles de souris rendues obèses/diabétiques et développant une fibrose classique. Grâce à des analyses réalisées à l’échelle de la cellule unique, nous identifierons les populations de cellules du foie impliquées dès les premiers stades de la maladie. Ces travaux pourraient révéler de nouveaux mécanismes d’apparition des tumeurs hépatiques, ouvrant la voie à des stratégies thérapeutiques ciblées pour les patients atteints de glycogénose et, plus largement, pour les maladies métaboliques associées à un risque accru de tumeurs hépatiques.
Bénéfices attendus
À long terme, ce projet vise à mieux comprendre le rôle du système immunitaire et l'apparition de la fibrose dans le développement des maladies du foie et des tumeurs hépatiques. Les chercheurs s'intéressent à deux maladies métaboliques : la glycogénose de type 1, une maladie rare en comparaison avec le diabète associé à l'obésité, maladie considérée comme une épidémie Par cette approche, ils espèrent mieux comprendre comment les cancers du foie apparaissent dans des foies qui accumulent de la graisse (foie stéatosique), avec ou sans fibrose. En général, le cancer du foie se développe sur un foie très abîmé appelé foie cirrhotique. Cependant, des études récentes montrent que certaines tumeurs peuvent aussi apparaître chez des patients diabétiques dont le foie ne présente pas de fibrose importante. Ces travaux pourraient donc aider à identifier les mécanismes responsables de la formation des tumeurs dans différentes situations et, à terme, permettre une prise en charge plus adaptée à chaque patient selon l'évolution de sa maladie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité externe de l’oreille pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Les souris avec une glycogénose peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement ou lors d’anesthésie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Le suivi de leur glycémie pourra nécessiter une microgoutte de sang, prélevée à l’extrémité de la queue après une mini-incision, réalisée en quelques secondes. Les souris développent une stéatose (accumulation de lipides dans le foie) qui peut être associée à des atteintes hépatiques comme une fibrose, la perte de la fonction hépatique caractérisée par l’apparition d’un ictère (coloration jaunâtre des extrémités) ou le développement de tumeurs à plus long terme (>6 mois). Un prélèvement sanguin sera réalisé tous les mois pour suivre la progression de la maladie et durera environ 15 secondes (au total, 3 à 4 prélèvements/souris). Une partie des souris subiront une chirurgie afin de purifier les différentes cellules du foie. La chirurgie durera moins de 15 minutes et les animaux seront mis à mort. La deuxième partie des souris sera mise à jeun pendant 6h, en fin de protocole, avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Les hypoglycémies sévères, en dessous de 30-40 mg/dl, peuvent entrainer un mal-être important, voir un coma ou un décès. Les souris ayant des atteintes hépatiques peuvent présenter des signes de mal-être, généralement associés à une perte de poids. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress. La chirurgie peut entrainer de la douleur qui est réduite par une anesthésie et une analgésie adaptée et un risque d’hémorragie qui est limité par la maitrise de l’hémostase.
Devenir
La moitié des animaux sera mis à mort en fin d’expérimentation afin de prélever des tissus dont le foie, le cerveau et les testicules ou ovaires, pour réaliser des analyses au niveau structurel et moléculaire. La deuxième moitié des animaux subira une chirurgie pour purifier les cellules du foie et quantifier chaque sous-type de cellules immunitaires. Les animaux seront mis à mort pendant la chirurgie.
Remplacement
Aujourd’hui, les chercheurs savent fabriquer en laboratoire de petites versions simplifiées du foie, appelées organoïdes, à partir de plusieurs types de cellules du foie (les cellules qui fabriquent les substances du foie, celles qui transportent la bile, certaines cellules immunitaires du foie, etc.). Cependant, dans la glycogénose, le fonctionnement du foie ne dépend pas seulement de ces cellules locales. Il repose aussi sur des échanges complexes entre les cellules du foie et des cellules immunitaires qui arrivent par le sang. Les chercheurs ont également observé que certains changements observés dans le foie semblent être contrôlés en partie par un système hormonal, qui implique notamment le cerveau et l’hormone de croissance. Pour comprendre correctement tous ces mécanismes, il ne suffit donc pas d’étudier un foie isolé ou un organe fabriqué en laboratoire : il faut utiliser un modèle animal, qui permet de conserver les interactions naturelles entre plusieurs organes. Dans cette étude, plusieurs organes et tissus seront analysés en même temps — une région du cerveau (l’hypothalamus), l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang — afin de comprendre comment l’ensemble de l’organisme participe à la maladie. La souris est le modèle le plus adapté pour plusieurs raisons : -Un métabolisme proche de l’humain -Un modèle unique de la maladie hépatique obtenu par transgenèse : chez la souris atteinte de glycogénose hépatique, la maladie du foie reproduit fidèlement les principales caractéristiques observées chez les patients. Elle résulte d'une surcharge métabolique, un mécanisme également impliqué dans des maladies fréquentes comme le diabète. -Des outils scientifiques robustes : Les chercheurs disposent de nombreuses données et d’outils génétiques pour étudier précisément différents facteurs d’intérêt dans le foie.
Réduction
Pour obtenir des résultats fiables, il faut analyser un nombre suffisant d’échantillons afin de réaliser des analyses statistiques permettant de comparer les différents groupes analysés. Une méthode statistique robuste sera utilisée. La connaissance des modèles animaux et des approches moléculaires utilisées nous a permis de définir un nombre d’animaux minimum par groupe. Comme les souris atteintes de glycogénose ont un risque de décès lié aux possibles hypoglycémies, nous avons prévu d’augmenter le nombre de ces animaux pour ne pas compromettre les analyses statistiques. Les maladies métaboliques (comme le diabète) peuvent se développer différemment chez les mâles et les femelles. Il est donc essentiel d’inclure les deux sexes pour obtenir des résultats complets. Au total, 152 souris (mâles et femelles) seront étudiées, dont 80 souris atteintes de glycogénoses. Les reproductions seront arrêtées dès que ce nombre sera atteint, pour éviter d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Pour réduire la douleur, les prélèvements de tissus (biopsies) seront réalisés sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours, à un moment où leurs terminaisons nerveuses ne sont pas encore totalement développées. Afin d’éviter le stress dû à la séparation d’avec leur mère, les soigneurs manipuleront les petits en portant des gants imprégnés de la litière de leur cage, pour conserver leur odeur familière. Pour habituer les souris à être manipulées et réduire leur stress, elles seront régulièrement en contact avec les expérimentateurs et seront prises en main à l’aide d’un petit tunnel plutôt qu’attrapées directement. Les griffes des souris pourront être coupées si l’animal se gratte. Tous les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions réglementaires. La maladie est ciblée uniquement dans le foie à l’âge adulte, ce qui permet d’éviter un retard de croissance lié à la glycogénose; les animaux passent la période périnatale sans phénotype dommageable. Le personnel technique est formé à la reconnaissance des signes d’hypoglycémie et à la conduite à tenir. Les risques d’hypoglycémie sont contrôlés en réduisant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes au sol et des tétines des biberons longues). En cas d’hypoglycémie sévère, la souris sera injectée avec une solution de glucose et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. L’animal sera mis à mort s’il développe plus de 3 hypoglycémies au cours de la procédure. Lors des mises à jeun, les souris sont placées dans de grandes cages avec des maisons en plastique pour limiter l’agressivité et le stress. Pour assurer leur confort thermique, une partie des cages est placée sur une plaque chauffante. Grâce à la bonne connaissance de ce modèle animal, des critères précis ont été définis pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront euthanasiées précocement (entre 3 et 4 mois après l’induction de la maladie), avant que la maladie hépatique entraine l’apparition de tumeurs et de signes de mal-être. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté afin de limiter la souffrance de l’animal. La surveillance du bien-être des souris est basée sur le contrôle de leur poids, les taux de marqueurs sanguins d’atteintes hépatiques (transaminases), l’apparition d’un ictère et l’observation de leur comportement ; Des points limites et spécifiques du projet ont été définis.
Choix des espèces
Mus musculus. Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation du métabolisme similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Ce modèle de souris imite très fidèlement la maladie hépatique associée à la glycogénose, ce qui en fait un outil précieux pour mieux comprendre cette pathologie et développer de nouvelles approches. Au laboratoire, tous les outils nécessaires, comme des anticorps spécifiques à la souris, sont disponibles pour analyser les effets de la maladie et des traitements. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : une petite biopsie de l’oreille sera faite chez les bébés souris (entre 7 et 10 jours) pour vérifier leur patrimoine génétique. Ensuite, les expérimentations seront réalisées à l’âge de 3 à 4 mois, juste avant l’euthanasie des souris.
Etude des mécanismes d’autophagie neuronale après un traumatisme crânien sévère
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont subir une chirurgie de quarante-cinq minutes destinée à leur infliger un traumatisme crânien, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent ensuite une IRM anatomique à trois, sept, vingt et un et trente jours, puis une chirurgie sans réveil pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur attend une perte de poids, des douleurs postopératoires, des déficits fonctionnels ou cognitifs, et du stress lors de tests comportementaux qu'il ne nomme pas. Il écrit par ailleurs que les souris "se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine", et que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial, qui peut provoquer des dysfonctionnements immunitaires et métaboliques et une rupture de la barrière hémato-encéphalique. Cette étude vise à comprendre le rôle de l’autophagie neuronale dans les processus de mort cellulaire et d’inflammation à la suite d’un TC sévère.
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales sur l’autophagie neuronale visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens et présente un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie afin d’induire un traumatisme crânien (45 minutes) puis passeront une IRM anatomique (3 jours, 7 jours, 21 jours et 30 jours post-TC ; 20 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les deux jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.