Procédures sévères

Toutes tuées pour prélèvement d'organes à la fin de chaque procédure, 1 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, une administration transdermique ou intragastrique de tamoxifène, et pour certaines une chirurgie d'injection dans la rate. Le porteur indique que l'injection intraveineuse disperse les cellules tumorales dans tout l'organisme, ce qui peut faire pousser des tumeurs dans le foie ou le cerveau, ou paralyser la souris par atteinte de la moelle osseuse. La grille de score règle la suite, un score léger n'entraînant aucune mesure, ce que le porteur présente comme témoignant de l'absence de souffrance, un score modéré donnant lieu à de la nourriture gélifiée et à une surveillance accrue, un score sévère à la mise à mort.

Objectifs

Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les immunothérapies ont révolutionné le traitement des cancers mais leur efficacité reste hétérogène et de nombreux patients meurent encore de cancers. Il est donc important d'améliorer l'efficacité et la compréhension des immunothérapies, afin d’en augmenter le taux de succès et donc d’allonger significativement l'espérance de vie des patients. Notre projet apportera des clés importantes pour comprendre à court terme le mécanisme d'épuisement des cellules NK en condition tumorale, le rôle des DCs dans ce processus, et ouvrira à plus long terme des nouvelles pistes d’amélioration des traitements basées sur nos résultats.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique de cellules tumorales dans la veine caudale, d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris lors des pesées ou de la contention entraînera un stress de courte durée. Les animaux inclus dans les différentes procédures recevront au maximum cinq injections intrapéritonéales de courte durée, ou une administration par voie transdermique ou intragastrique, également réalisée en quelques secondes. Ils pourront également subir une intervention chirurgicale unique, sous anesthésie de courte durée, permettant l’injection intrasplénique de cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. La technique d’administration de substance par voie intragastique peut être modérément douloureuse, le temps de l’intervention, si le geste n’est pas maitrisé. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration). Enfin, l’injection intrasplénique, nécessitant une chirurgie, peut entraîner une douleur post-opératoire, du stress, ainsi qu’un risque de saignement, d’infection et de complications liées à l’anesthésie, que nous limiterons par l’utilisation d’antibiotiques et d’anti-inflammatoires, ainsi que par une surveillance accrue.

Devenir

A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles.

Remplacement

Ce projet nécessite la comparaison de différents modèles murin pour réaliser des mesures de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours du développement tumoral. De plus, dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome

Réduction

Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. La stratégie expérimentale a été conçue afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse des résultats. Une approche progressive est mise en place, avec des phases d’optimisation en amont (procédures 1 à 4) permettant de définir précisément les conditions expérimentales (modalités de déplétion, doses, cinétiques), afin d’éviter la répétition d’expériences in vivo inutiles. De plus, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet. Enfin, la procédure 7 permettra d’évaluer une méthode alternative d’injection des cellules RMA-KR, visant à limiter la variabilité interindividuelle et à éviter les décès liés à la dissémination dans les organes vitaux observée avec l’injection intraveineuse, ce qui contribuerait à réduire le nombre de souris nécessaires pour de futurs expériences.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Pour les animaux provenant de fournisseurs, une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera observée avant leur inclusion dans les procédures. Le poids, l’apparence et l’activité de l’animal seront observés quotidiennement. Des points limites définis et spécifiques ont été mis en place selon une grille de score. Si le score cumulé est considéré comme léger, aucune mesure ne sera prise témoignant de l’absence de souffrance. Si le score cumulé est considéré comme modéré alors des mesures correctives seront prises et seront adaptées à la situation (introduction d’enrichissement, surveillance accrue, mise à disposition de nourriture humidifiée ou gélifiée). Enfin, si le score cumulé est considéré comme sévère alors les animaux seront mis à mort. Pour l’administration du tamoxifène, nous privilégierons des méthodes douces, notamment l’administration transdermique. En cas d’échec, une administration par voie intragastrique sera effectuée par du personnel formé, dans le but de minimiser le stress pour les animaux. De même pour les injections intrapéritonéales, dans la veine caudale et l’injection intrasplénique.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids ou dont le score de douleur dépasse 1,5 sont mises à mort. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour, indique le porteur, ne pas laisser une souffrance méconnue perdurer. Selon les groupes, elles subissent une injection intrapéritonéale de toxine bactérienne, une instillation pulmonaire, une injection intracérébrale ou une chirurgie d'infection digestive, puis des injections quotidiennes pendant sept à dix jours, la pose d'un cathéter et des séances d'imagerie de trente minutes sous anesthésie. Les groupes chirurgicaux peuvent perdre jusqu'à 15 % de leur poids et présenter des difficultés respiratoires. Le choix des lignées suit l'effet recherché, des souris SWISS pour l'inflammation généralisée et l'infection digestive, des C57BL6/J mâles pour l'inflammation pulmonaire, les femelles étant décrites comme protégées de cette inflammation.

Objectifs

Le choc septique représente le stade ultime d'une infection aiguë, et est responsable d'environ 11 millions de décès chaque année dans le monde. A ce jour, les infections respiratoires restent la première cause de choc septique. Parmi ces patients, la dysfonction cérébrale aiguë (encéphalopathie) apparaît dans environ 40% des cas et s'associe défavorablement au pronostic. Néanmoins, à ce jour, les facteurs tant prédictifs que pronostics sont encore largement méconnus, et le diagnostic de l'encéphalopathie repose sur des échelles cliniques pouvant être prises en défaut (utilisation de médicaments sédatifs...). Afin de visualiser la neuroinflammation, il est possible d'utiliser l'IRM ou l'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite) après injection de particules dirigées contre des marqueurs d'inflammation. Lors d'une inflammation, la perméabilité des vaisseaux sanguins change par le niveau d'expression d'une molécule appelée PLVAP. Nous souhaitons donc utiliser une approche utilisant des particules ciblant PLVAP afin de mettre en évidence l'inflammation et la perméabilité de l'axe poumon-cerveau dans différents modèles d'infection chez la souris, afin d'offrir une caractérisation non invasive de l'encéphalopathie. Ceci permettrait de valider la possibilité de diagnostiquer et de suivre la survenue d'une encéphalopathie au cours du sepsis par une imagerie non invasive chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La survenue d'une encéphalopathie au cours d'un séjour en réanimation est un évènement pronostic majeur, bien que les éléments diagnostiques soient peu spécifiques et sujets à des facteurs confondants, au premier rang desquels l'utilisation de médicaments sédatifs. L'utilisation d'une technique d'imagerie avec l'observation d'éléments objectifs permettrait de s'affranchir de ces limites, de diagnostiquer plus rapidement l'encéphalopathie et de proposer une prise en charge rapide, permettant probablement de limiter les séquelles ultérieures. Par ailleurs, l'utilisation d'une technique basée sur la reconnaissance de changements vasculaires permettra une meilleure compréhension des phénomènes à l'origine de l'encéphalopathie chez ces patients, et d'offrir ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'un modèle d'inflammation systémique aiguë par injection intrapéritonéale unique (30 secondes), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire par instillation (2 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation cérébrale par injection intracérébrale unique (30 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 10 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire non infectieuse par instillation unique (30 secondes) et modulation thérapeutique par injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle chirurgical d'infection digestive (10 minutes), pesées quotidiennes (inférieur à 5 minutes), pose d'un cathéter pour l'administration de produit de contraste sous anesthésie (environ 10 minutes), réalisation d'examens d'imagerie sous anesthésie (environ 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle de d'inflammation généralisée par injection de toxine bactérienne est susceptible d'occasionner une perte de poids chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience, la perte de poids est attendue inférieure à 10% et de courte durée (3 jours environ). Les modèles par instillation intra-nasale ou injection intracérébrale occasionnent une perte de poids plus modérée. Les modèles chirurgicaux d'infection digestive et par instillation sont susceptibles d'entraîner une perte de poids importante jusqu'à 15%, un inconfort et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours), ainsi que des difficultés respiratoires.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer la spécificité du produit de contraste sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins. Ils ont permis de confirmer la surexpression de PLVAP au cours de l'inflammation, et la possibilité pour notre produit de contraste de se lier à sa cible in vitro. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier le produit de contraste à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles, ainsi que des données de la littérature. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu, le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge. La douleur sera évaluée par l'utilisation d'échelles adaptées. Les animaux seront pesés quotidiennement. Les animaux des groupes chirurgicaux bénéficieront de compléments alimentaires humidifiés pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture à volonté. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 15% ; le score moyen l'échelle est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant les imageries ou chirurgies, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une souffrance ne correspondant pas à un point limite recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale et une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies septiques. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude de de la réponse au sepsis dans des conditions mimant ce qui est retrouvé chez l'Homme en soins critiques. Dans le modèle d'inflammation systémique, d'inflammation par injection intracérébrale, et d'infection digestive chirurgicale, les animaux utilisés seront des souris SWISS âgées de 8 semaines. Dans le modèle d'infection pulmonaire par instillation intranasale et d'inflammation pulmonaire non infectieuse, les animaux seront des souris C57BL6/J de 8 semaines, mâles car les femelles sont protégées de l'inflammation pulmonaire. Le modèle d'inflammation cérébrale par vascularite fera appel à des souris C57BL6/J de 8 semaines.

Une ouverture de la peau du cou pour injecter un agent inflammatoire directement dans la trachée, jusqu'à cinq injections par semaine, et une nécrose possible de la queue après les injections répétées de bléomycine : 1 868 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Dans les protocoles longs, elles développent une fibrose pulmonaire, des difficultés respiratoires et une perte de poids importante, tout en recevant un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines et un prélèvement sanguin hebdomadaire sur animal vigile. Le projet teste des molécules censées bloquer l'installation de l'inflammation, présentées comme une réponse à la résistance qui apparaît chez 30 % des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique après six mois de traitement. Le calcul annoncé porte sur vingt-deux souris par groupe, sans que le total de 1 868 souris soit rapporté au nombre de groupes prévus.

Objectifs

Les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) ont une incidence en constante augmentation ce qui en fait la 3eme cause de mortalité dans le monde. Les BPCO sont caractérisées par une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires associée à une réponse inflammatoire chronique. Elles sont à l’origine d’obstruction des voies respiratoires et d’emphysème. Les traitements actuels ne peuvent que ralentir l’évolution de la maladie à l’aide d’une prise en charge multidisciplinaire (arrêt tabac, réhabilitation respiratoire) associée à des molécules non-spécifiques. Ces dernières années, de gros progrès ont été faits dans la compréhension de la réponse immunitaire et il est évident aujourd’hui que le système immunitaire, qui est le principal acteur dans les maladies inflammatoires, est une cible prometteuse. Les nouvelles stratégies d’immunothérapies cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. Ces approches vont cibler des populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de fibroses pulmonaires

Bénéfices attendus

Les traitements actuels utilisés contre les Fibroses Pulmonaires Idiopathiques font appel à des traitements de type anti-fibrotique limitant l’installation de la fibrose pulmonaire et ralentissant le déclin respiratoire. Une résistance à ces traitements apparait chez 30% des patients au bout de 6 mois de traitements. De plus le changement de traitement par un nouvel anti-fibrotique n’améliore pas la survie de ces patients, montrant une désensibilisation des patients à ce type de traitements. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules diminuent l’installation de l’inflammation et permettraient potentiellement de ralentir l’installation de la fibrose et d’améliorer les fonctions respiratoires. Chez l’animal nous espérons diminuer l’infiltration pulmonaire aux temps précoce et diminuer l’installation de fibrose au temps tardif du modèle. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.

Procédures

Les agents inducteurs seront injectés sur animaux anesthésiés et analgésiés, allant d'une injection à 5 injections par semaine par différentes voies d'administrations . Les traitements seront administrés 3 fois par semaines sur une durée de 3 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole).

Impact sur les animaux

L’injection intratrachéale induira de la douleur chez l’animal dû à l’ouverture de la peau du cou puis à l’injection d’un agent inflammatoire dans la trachée. Dépendant du modèle, l’inflammation pulmonaire sera de courte durée (24h) où de longue durée (J28) avec pour les modèles longs des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire ainsi qu’une perte de poids significative mais contrôlé. L’injection en intraveineuse de bléomycine (Ajout) ou de cellules humaines sur animaux vigiles engendrera une douleur modérée lors de l’injection ainsi qu’une nécrose possible de la queue à la suite des injections répétées de bleomycine sur ce site. Ce modèle induira une perte de poids ainsi que des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton

Choix des espèces

Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

Les souris peuvent développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité, et leur respiration ralentit après l'induction de la maladie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et en réaliser des coupes colorées. Le porteur écrit pourtant que les souris "ne subiront que très peu de contraintes" et résume les perturbations attendues à une douleur d'injection et à la gêne de la contention. L'objet du projet est de départager le rôle de deux molécules inflammatoires, désignées A et B, dans les lésions cardiaques d'une maladie rare, et le bénéfice annoncé se limite à envisager un traitement plus personnalisé lors des crises.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre le rôle exact de deux molécules, appelées pour simplification A et B, dans la gravité des problèmes sanguins et des lésions au cœur dans une maladie rare. Cette maladie, causée par un manque d’une protéine spécifique, provoque la formation de petits caillots dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut bloquer la circulation et endommager des organes comme le cœur. Des recherches précédentes ont montré qu’un médicament qui bloque l’action à la fois de A et de B pouvait réduire les dommages au cœur et au cerveau dans un modèle de souris atteintes de cette maladie. Cela suggère que l’inflammation causée par A et B joue un rôle important dans les lésions observées. On sait aussi que A et B favorisent la libération de substances impliquées dans la formation des caillots et peuvent aggraver les baisses de cellules sanguines. Cependant, on ne sait pas encore précisément quel rôle joue chacune de ces deux molécules A et B. L’objectif du projet est donc de tester, chez la souris, l’efficacité de traitements qui ciblent spécifiquement A ou B ou une molécule liée l’apparition de A et B, pour prévenir les dommages dans le cœur au cours de cette maladie. À ce jour, aucune étude n’a encore permis de déterminer clairement le rôle respectif de A et de B dans cette maladie et les données de ce projet pourront permettre à termes, une thérapie plus précise pour les patients atteints de cette maladie qui souffrent souvent de complications cardio-vasculaires.

Bénéfices attendus

Si nous constatons que A ou B est impliqué préférentiellement dans cette pathologie, nous pourrons envisager un traitement plus personnalisé aux patients lorsqu’ils développent des crises de cette pathologie.

Procédures

Les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Ils seront soumis à de la contention et à des injections pouvant leur occasionner un stress et une douleur minime. La douleur est contrôlée par l’utilisation de gouttes analgésiques et d’injection d’analgésique si besoin, en fonction d’une grille de douleur établie préalablement et sur laquelle nous nous appuyons. Les imageries seront d'une durée maximale de 30minutes. A la fin du protocole, les animaux recoivent une anesthésie profonde et constatée et un prélèvement est réalisé afin de récupérer le sang des souris. Ces gestes durent 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection et de la gêne par la contention. Les animaux peuvent également développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité. Lors de l'induction de la pathologie, la respiration des animaux est un peu plus lente et revient en moins de 5 minute à la normale. L’imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress, ainsi qu'une hypothermie. Les

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, quelle qu'elle soit, afin de récupérer les organes des animaux et réaliser de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes

Remplacement

La réalisation de ce projet est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum après calcul du nombre de sujet nécessaire pour démontrer un effet des traitements. Le calcul du nombre d'animaux est défini grâce à un logiciel de statistique.

Raffinement

Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésiques. Tous les gestes pratiqués sur les animaux sont réalisés sous anesthésie. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles tous les jours et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Cette grille est précise et permet de définir la douleur de l'animal grâce à des critères établis au préalable et reconnus par les vétérinaires. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les salles sont spécialement conçues dans une animalerie agréée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune adulte. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.

Sélectionner entre quatre et huit molécules candidates parmi des analogues d'une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine : 686 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit soit une injection unique, soit des injections quotidiennes pendant six semaines, soit un dispositif implanté sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, et suit un régime alimentaire particulier qui peut lui faire perdre du poids. Les prélèvements sanguins ont lieu deux à trois fois sous anesthésie, complétés par des tests d'activité de dix à quinze minutes une à deux fois par semaine, sans que le porteur précise lesquels. Il indique qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la sécurité et la toxicité à long terme de ces molécules sans animal, "car seule l'étude sur un organisme entier permet d'observer leurs effets sur différents tissus et fonctions".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la suite de travaux ayant permis de découvrir une molécule, associée à un régime alimentaire spécifique, capable de ralentir la croissance de certaines tumeurs. L’objectif est de tester des versions améliorées de cette molécule, toujours associées à ce régime, afin d’identifier entre 4 et 8 candidats finaux présentant le meilleur compromis entre efficacité et tolérance. Pour cela, la dose optimale, la manière dont ces traitements agissent dans le temps, ainsi que leurs éventuels effets indésirables seront étudiés, afin de mieux comprendre leurs effets bénéfiques et secondaires. Les résultats aideront à sélectionner le candidat le plus prometteur pour le développement de futurs traitements chez l’Homme.

Bénéfices attendus

L’objectif est de déterminer une dose adaptée et sûre d’utilisation. Si les résultats sont satisfaisants, ils permettront de poursuivre le développement de ce traitement dans des études plus avancées. À terme, ce projet pourrait contribuer à la mise au point d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du cancer du pancréas chez l’Homme.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique ou des injections quotidiennes (hors week-end) pendant 6 semaines, réalisées sur animaux vigiles. Dans certains cas, un petit dispositif sera placé sous la peau lors d’une intervention chirurgicale mineure (environ 15 minutes) sous anesthésie, afin d’administrer le traitement de façon continue. Des tests simples d’activité (quelques minutes à 10–15 minutes, 1 à 2 fois par semaine) seront réalisés sur animaux vigiles. Les prélèvements sanguins (2 à 3 fois) seront effectués sous anesthésie, en plus des prélèvements réalisés en fin de procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées pour limiter le stress et l’inconfort.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire spécifique peut entraîner une légère perte de poids. Les animaux recevront soit des injections, soit un petit dispositif sous la peau, pouvant provoquer une gêne locale temporaire, prise en charge par des traitements contre la douleur. Les interventions sous anesthésie peuvent entraîner une sécheresse des yeux ou une baisse de température, prévenues par des mesures adaptées. Un isolement temporaire peut être nécessaire après chirurgie pour la surveillance et la protection du site opératoire. Les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées afin de limiter le stress et assurer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude ou plus tôt en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole. Certains animaux satellites pourront également être utilisés à des temps définis pour des analyses biologiques, biochimiques et anatomopathologiques. Ces derniers permettent d’évaluer l’exposition au traitement, la pharmacocinétique et la toxicité précoce, sans affecter le suivi des autres animaux de l’étude. La mise à mort sera réalisée selon des méthodes réglementaires sous anesthésie générale, afin de limiter toute douleur et stress, et permettra la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses scientifiques. Cette organisation permet de concilier le bien-être animal et les objectifs scientifiques de l’étude.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux ayant identifié une molécule prometteuse associée à un régime alimentaire spécifique. L’objectif est maintenant de tester des molécules proches afin d’identifier celle qui est la mieux tolérée par l’organisme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer complètement la sécurité, la toxicité et les effets secondaires à long terme de ces molécules sans utiliser l’animal, car seule l’étude sur un organisme entier permet d’observer leurs effets sur différents tissus et fonctions. Ces études sont donc nécessaires pour vérifier la sécurité globale avant un éventuel passage chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. L’étude est réalisée de manière progressive, en commençant avec un nombre restreint d’animaux, puis en élargissant uniquement si nécessaire. Les animaux sont surveillés en continu afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d’adapter ou arrêter l’étude si besoin. Cette organisation permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter au maximum les effets indésirables liés aux manipulations et aux procédures expérimentales. Le bien‑être des animaux sera évalué quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant toute intervention, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours, avec des séances de familiarisation pour les habituer progressivement au contact humain et réduire le stress. Toutes les interventions seront réalisées dans un environnement calme, par du personnel qualifié et formé, afin de limiter la durée des manipulations et les réactions de stress. La douleur ou l’inconfort sera surveillé chaque jour. En fonction du niveau de douleur observé, un traitement adapté sera administré. Si la douleur ne peut pas être soulagée ou si la situation l’exige, l’animal sera immédiatement mis à mort afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6J constituent un modèle de référence pour les études précliniques de tolérance et sont largement documentées dans la littérature. Cette souche présente un fond génétique stable et homogène, ce qui réduit la variabilité interindividuelle dans les paramètres essentiels évalués en toxicologie (poids, marqueurs biochimiques, analyses histologiques, comportement). Par ailleurs, leur utilisation étendue en pharmacologie, en toxicologie et en neurosciences offre un important historique de données comparables et reproductibles, renforçant la pertinence scientifique de leur choix pour cette étude. Les souris seront accueillies dans l’établissement utilisateur entre 6 et 8 semaines de vie et début des procédures entre 7 et 9 semaines de vie, comme décrit majoritairement dans la bibliographie.

Injection de cellules leucémiques, implantation de tissus sous la peau, prélèvements de sang ou de moelle osseuse chaque semaine jusqu'à la fin, jusqu'à six séances de microscopie pouvant durer deux heures, et jusqu'à vingt et un jours d'isolement en cage individuelle. 4 296 souris, en partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique qu'à un stade avancé de la maladie les souris peuvent perdre leur tonicité, avoir des difficultés de locomotion et voir leur état général s'altérer. Le résumé ne nomme aucun des "différents traitements" administrés, n'avance aucun chiffre à l'appui d'un effectif calculé selon lui "à l'aide d'outils statistiques", et tient l'exposé du devenir de ces 4 296 souris en une seule phrase.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment certains cancers du sang, comme les leucémies, interagissent avec les vaisseaux sanguins dans leur tissu. L’objectif est d’identifier les anomalies présentes dans cet environnement lors du développement de la maladie. En utilisant des modèles de souris et des outils d’imagerie avancés, on veut repérer les mécanismes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et tester de nouvelles approches pour les bloquer. Le projet sera réalisé dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet pourraient permettre d’améliorer l’efficacité des traitements contre certaines leucémies, en ciblant l’environnement tumoral. Comprendre comment l'environnement vasculaire influence la progression de la maladie pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées et mieux tolérées par les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules leucémiques (1 fois, duree:

Impact sur les animaux

Les seances d'imagerie répétées peuvent entraîner un stress modéré chez les animaux, notamment en raison des manipulations et du transport associés aux séances d’imagerie. L’implantation des systèmes utilisés pour l’imagerie peut gêner légèrement le comportement de l’animal, sans toutefois compromettre sa mobilité ou son alimentation. L'hébergement individuel pendant une durée maximale de trois semaines peut induire un stress lié à l’isolement. À un stade avancé de la maladie, les animaux peuvent présenter des signes de souffrance (perte de tonicité, difficultés de locomotion, altération de l’état général). Les injections en sous-cutané, intra-vein, intra-peritoné peuvent cause une gene legere aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement

Remplacement

Pour « Remplacer », nous avons mis en place un système de culture 3D qui reproduit le tissu leucemique humain et permet certaines expériences sans utiliser d’animaux. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous veillons à ce que toutes les expériences possiblement réalisables in vitro sur système de culture 3D le soient. Cependant, celui-ci ne mimant que les interactions locales et pas systemiques, le développement de modèle in vivo reste nécessaire.

Réduction

L’étude directe des tumeurs humaines étant très limitée, nous utilisons des souris immunodéficientes pour mieux comprendre les leucémies humaines. Ce modèle est aujourd’hui le seul qui permette d’étudier ces maladies de manière fiable. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des modèles d’organoïdes de leucémie humaine greffés chez ces souris. Ces greffes sont plus efficaces et plus reproductibles que les méthodes classiques, ce qui permet d’utiliser moins de souris par expérience. Nous utilisons également des techniques d’imagerie qui permettent de suivre l’évolution de la leucémie au cours du temps chez un même animal. Cela évite de devoir euthanasier les souris à chaque étape de l’étude. Les expériences sont réalisées avec des souris mâles et femelles, car le sexe n’influence pas le développement de la leucémie dans nos modèles. Enfin, le nombre de souris nécessaires est calculé à l’avance à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Pour éviter toute souffrance, les procédures d’imagerie et l’implantation d’organoïdes se feront sous anesthésie générale et avec administration d’analgésique. De plus, afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, leur état fera l’objet d’une surveillance continue. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées, incluant des éléments d’enrichissement appropriés. Enfin des points limites spécifiques ont été mis en place. Une dérogation à l’hébergement en groupe est demandée pour certains animaux. Cette dérogation est scientifiquement justifiée par la nécessité d’éviter toute blessure ou stress. Des mesures compensatoires seront mises en œuvre pour limiter l’impact de l’isolement sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour les expériences menées pour la recherche en oncologie thérapeutique du cancer. En effet, la connaissance complète du génome de la souris permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt, ainsi qu’un grand nombre de modèles de cancers. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes de 6-12 semaines. Cela représente l’âge permettant une bonne prise de greffe, et qui laisse le temps a la maladie de se développer sans que la souris vieillisse.

352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes mises à mort pour prélever leur cerveau et leurs intestins. Chacune est maintenue trois minutes par jour dans un dispositif de contention pour recevoir de la lumière rouge puis infrarouge sur l'abdomen, quatre à huit semaines pour les souris exposées au pesticide, cinq jours par semaine pendant seize mois pour les souris transgéniques. Une pompe implantée sous la peau du dos délivre la roténone, les souris sont mises à jeun jusqu'à douze heures, isolées jusqu'à huit heures sans eau ni nourriture pour la collecte des selles, gavées si elles refusent de boire les solutions de test, et les transgéniques développent à partir de douze mois une réduction locomotrice pouvant aller jusqu'à la paralysie. Le porteur annonce trois tests moteurs et des tests olfactifs sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative touchant 270 000 personnes en France. Elle se caractérise par la mort progressive et irréversible de certains neurones. Cette perte entraîne l’apparition de troubles moteurs (tremblements, lenteur des mouvements, rigidité musculaire) et non-moteurs (constipation, perte d’odorat, troubles du sommeil), invalidant progressivement les personnes atteintes jusqu’à conduire à leur décès. A ce jour aucun traitement curatif n’existe. La photobiomodulation (PBM) est un traitement innovant qui repose sur l’exposition des tissus à une lumière rouge et/ou proche infra-rouge. Des études précliniques sur la MP ont montré que l’application de la PBM à l’intérieur du cerveau permet une protection des neurones et une préservation des fonctions motrices. Cependant, cette technique est invasive et limite son application en clinique pour tous les patients. Des études récentes, ont montré l’importance de l’axe intestin-cerveau dans la MP, car des dysfonctionnements intestinaux (inflammation, déséquilibres de la flore intestinale et constipation) apparaissent souvent plusieurs années avant les symptômes moteurs et pourraient contribuer au déclenchement et la propagation de la maladie. L’objectif de ce projet est de déterminer si la PBM administrée au niveau de l’abdomen, influence la flore intestinale de manière à prévenir et ralentir la MP. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 modèles de souris de la MP : 1) Un modèle induit par l’exposition à un pesticide, la roténone, qui reproduit des caractéristiques majeures de la MP, telles que l’apparition de troubles moteurs et la dégénérescence de certains neurones tout en induisant des perturbations intestinales. Il permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de la PBM abdominale administrée précocement pour prévenir ou limiter les altérations de la MP induites par des facteurs environnementaux. 2) Un modèle génétiquement modifié, exprimant une des mutations génétiques humaines présente dans une forme familiale de la MP. Ce modèle présente un avantage majeur pour l’étude des stades précoces (avant l’apparition des symptômes moteurs) de la maladie. Sa cinétique lente offre un cadre privilégié pour tester l’efficacité préventive de la PBM abdominale, visant à moduler la flore intestinale dans le but de retarder ou empêcher l’installation de la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de la flore intestinale dans le développement de la maladie de Parkinson, d’identifier d’éventuels effets secondaires de la photobiomodulation et d’optimiser la fenêtre thérapeutique avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Ces travaux permettront à la fois de renforcer nos connaissances sur la maladie de Parkinson tout en favorisant l’émergence d’un nouveau traitement pour les patients.

Procédures

Toutes les souris seront entraînées progressivement à entrer et rester pendant 3 minutes dans un système de contention en vue d’être traitées par photobiomodulation. L’abdomen des souris qui recevront le traitement, sera exposé pendant 3 minutes à une lumière rouge puis infrarouge de faible intensité tous les jours pendant 4 semaines minimum et 8 semaines maximum pour le modèle exposé à un pesticide et 5 jours par semaine pendant 16 mois pour le modèle génétique. Pour exposer les souris au pesticide, celles-ci seront opérées sous anesthésie générale avec administration d’antalgique afin de placer sous la peau de leur dos, une mini-pompe qui délivrera le produit en faible quantité sur 4 semaines. Les fonctions motrices des souris seront évaluées à l’aide de 3 tests moteurs avant et pendant l’exposition au pesticide et tous les mois à partir de l’âge d’apparition des troubles moteurs (11 mois) pour le modèle génétique. Des tests olfactifs pourront être effectués tous les 6 mois pour le modèle génétique. Afin de déterminer si les souris présentent des troubles gastrointestinaux, elles seront entraînées pendant 3 jours à boire volontairement différentes substances. Dans le cas où cette procédure échouerait, l’administration se fera par gavage. Avant chaque test gastrointestinal, les souris pourront être mises à jeun pendant 4h. Pour évaluer le temps de transit, elles boiront un mélange contenant un pigment rouge et seront ensuite isolées dans des cages jusqu’à l’apparition d’une selle rouge ou pour une durée maximum de 8h. Pour évaluer la perméabilité intestinale, les souris boiront un mélange contenant une substance fluorescente. Quelques heures plus tard, un prélèvement sanguin (maximum 5 minutes) sera effectué soit en vigile dans un système de contention soit sous anesthésie générale. Pour récolter les selles et évaluer la constipation, les souris seront placées dans des cages individuelles sans eau ni nourriture pendant 1h. Les tests gastrointestinaux seront réalisés deux fois avant la chirurgie puis toutes les semaines après la chirurgie pour le modèle utilisant le pesticide ; et tous les 3 mois pour le modèle génétique. Une IRM d’une durée d’une heure pourra être réalisée une fois sous anesthésie générale pour toutes les souris. Pour évaluer la vidange gastrique, les souris seront mises à jeun une fois pendant 12h puis placées dans des cages individuelles avant d’être replacées dans leur cage d’origine avec leurs congénères.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont les suivants : • Le placement des souris dans un système de contention pendant 3 minutes peut provoquer un stress aigu ce qui pourra affecter temporairement leur bien-être physiologique et comportemental. • L’anesthésie des animaux peut entraîner du stress et des effets physiologiques transitoires notamment lors de l’induction et du réveil. • Pour les animaux opérés, l’implantation d’une pompe en sous-cutanée peut engendrer du stress, un inconfort, une faible perte de poids, de la douleur temporaire et un risque d’infection et d’inflammation au site d’incision. • Les tests gastrointestinaux nécessiteront l’isolement des animaux (8h maximum), des restrictions alimentaires pouvant aller jusqu’à 12h, et une administration de substances par boisson volontaire qui pourront entraîner du stress, des modifications physiologiques et comportementales chez les souris. Dans le cas où les souris refuseraient de boire volontairement les substances proposées, elles seront gavées ce qui pourra provoquer du stress, de l’inconfort, et occasionner des douleurs et blessures. • Le prélèvement sanguin peut provoquer une douleur aiguë mais brève ainsi qu’un stress transitoire principalement lié à la contention et à la manipulation. • Les tests de comportement pourront induire un stress transitoire lié à la manipulation et à l’exposition à un environnement nouveau. • Concernant les souris transgéniques, les animaux développeront progressivement, à partir de l’âge de 12 mois, une réduction des fonctions locomotrices pouvant conduire à une paralysie.

Devenir

Afin de déterminer l’efficacité de la photobiomodulation au niveau cellulaire, notamment pour évaluer l’effet protecteur du traitement sur les neurones et les changements induits sur le microbiote intestinale, toutes les souris seront mises à mort en fin d’expérience afin de prélever en post mortem leur cerveau et leurs intestins.

Remplacement

Les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire sont essentielles pour étudier la photobiomodulation (l'utilisation de la lumière à des fins thérapeutiques). Elles permettent de contrôler précisément différents paramètres, comme la couleur de la lumière, son intensité, la durée d'exposition ou encore le type de cellules étudiées. Cela permet d'observer directement les effets de la lumière sur les cellules, sans les nombreuses influences qui existent dans un organisme vivant. Des études précédentes réalisées sur des cellules intestinales et des bactéries du microbiote intestinal ont permis de déterminer les réglages de lumière les plus efficaces pour réduire l'inflammation et aider le microbiote à mieux résister au stress. Ces travaux ont également amélioré notre compréhension des interactions entre les cellules de l'intestin et les bactéries qui y vivent. Dans notre étude, qui s'intéresse aux liens entre l'intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson, l'utilisation de modèles animaux est nécessaire. En effet, ils permettent d'étudier les échanges complexes entre le cerveau et le microbiote intestinal, qui ne peuvent pas être reproduits avec de simples cultures cellulaires. Grâce aux connaissances obtenues lors des études en laboratoire, les modèles animaux permettront d'évaluer si les effets de la photobiomodulation sur l'intestin et le microbiote peuvent aussi avoir un impact sur le comportement, les capacités motrices, le fonctionnement du cerveau et la santé intestinale dans le contexte de la maladie de Parkinson. À l'heure actuelle, les modèles animaux restent les seuls outils permettant d'évaluer de manière globale l'efficacité d'un traitement sur les symptômes moteurs et non moteurs d'une maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un logiciel de statistique afin qu’il soit réduit au minimum tout en permettant de pouvoir observer un effet significatif du traitement.

Raffinement

Afin de réduire le stress lié au maintien des animaux dans un système de contention pour le traitement par photobiomodulation, les animaux seront habitués progressivement sur une semaine à entrer et rester de plus en plus longtemps, jusqu’à 3 minutes maximum, dans le système de contention. Pour l’implantation de la pompe, les animaux recevront un antalgique avant l’anesthésie générale. Pour prévenir toute baisse de température, les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et ce jusqu’au réveil sous une surveillance continue. Les animaux seront surveillés étroitement pendant 3 jours suivant la chirurgie et l’état général des animaux sera évalué selon une grille de score. Le traitement antalgique pourra être prolongé si besoin. Pour les tests de comportement, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation et à la pièce d’expérimentation afin de réduire au maximum tout stress occasionné. L’administration de substances guidée par micropipette sera précédée d’une période d’entraînement sur 3 jours afin que les souris apprennent à boire volontairement les solutions proposées pour les tests gastrointestinaux. Pendant les restrictions alimentaires et l’isolement des animaux, une surveillance attentive des animaux sera effectuée. Avant la mise à mort des souris, celles-ci recevront un antalgique puis seront soumises à une anesthésie générale. Les traitements antalgique et anesthésique se feront dans une pièce différente de la salle d’hébergement et d’euthanasie pour réduire et éviter la transmission d’un stress aux autres animaux. Un mois avant l’apparition des troubles moteurs, soit à partir de l’âge de 11 mois, l’état clinique des souris transgéniques sera évalué toutes les semaines à l’aide d’une grille de score afin de prévenir toutes souffrances.

Choix des espèces

La souris a une grande proximité génétique et biologique avec l’être humain, notamment au niveau des circuits nerveux impliqués dans la maladie de Parkinson. Environ 85 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, ce qui permet de reproduire certaines mutations responsables de la pathologie et d’observer leurs effets sur le cerveau. Les modèles de souris, qu’ils soient génétiques ou induits par des toxiques, reproduisent des caractéristiques essentielles de la maladie, notamment la dégénérescence de certains neurones et les troubles moteurs et non-moteurs. Par ailleurs, la souris est particulièrement adaptée à l’étude du microbiote intestinal, car sa flore intestinale peut être contrôlée, modifiée ou même remplacée, ce qui permet d’analyser précisément l’influence du microbiote sur l’inflammation et la communication entre l’intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson. Pour le modèle avec le pesticide, les souris utilisées seront adultes et auront entre 2 et 5 mois. La maladie de Parkinson touchant uniquement les adultes, l’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour reproduire les mécanismes de la maladie liés à l’âge et évaluer l’efficacité ainsi que la tolérance de la photobiomodulation dans un contexte biologique comparable à celui des patients. Les souris transgéniques seront utilisées entre l’âge de 1 et 17 mois car elles développent des troubles gastrointestinaux dès l’âge de 2 mois et le traitement par photobiomodulation doit commencer au moins un mois avant l’apparition des troubles gastrointestinaux pour pouvoir évaluer son effet préventif.