Procédures sévères

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'échantillons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Atteintes d'une myopathie qui les affaiblit dès l'âge de quatre semaines, elles reçoivent quatre injections de composés puis trois injections d'anesthésiques, sous contention manuelle et mécanique, pour une mesure de la force musculaire que le porteur annonce par "différents tests" sans les nommer. Les retombées annoncées pour les malades restent au conditionnel, le projet devant fournir la seule preuve qu'une protéine ciblée peut améliorer le phénotype musculaire des souris. Le porteur affirme avoir déjà démontré l'efficacité de ce type de traitement dans un autre modèle murin, et conclut néanmoins qu'un modèle in vivo est "essentiel" et la souris "indispensable".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares touchant le muscle squelettique, et les personnes affectées souffrent d’une faiblesse musculaire générale et souvent fatale. L' objectif sera de cibler et diminuer spécifiquement l’expression du géne resposable dela maladie. En effet, notre équipe a préalablement démontré l’efficacité de ce type de traitement dans un autre modèle murin. Cependant, chez les patients, des effets toxiques ont été observés ,avec certaines molécules de composition chimique différente. C est pourquoi, nous voulons développer dans ce projet une nouvelle génération de molécules pour obtenir un traitement efficace sans effet toxique. Il s'agit d' une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules avant l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement ( en mesurant la force musculaire des souris par différents tests) et ainsi guérir (ou du moins atténuer) la myopathie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux comprendre le développement des CNMs et de fournir la preuve de concept que la réduction d'une protéine ciblée peut améliorer le phénotype musculaire des sourisCNM. Ce travail pourra conduire au développement d'approches thérapeutiques pour les patients CNM qui restent à ce jour incurrables.

Procédures

Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) 4 injections de composés chimiques - durée : moins d 'une minute. 2) 3 injections pour les mesures de la force musculaire - durée: 20 minutes.

Impact sur les animaux

Ces souris présentent un phénotype sévère de faiblesse musculaire qui nécessite une surveillance dès l âge de 4 semaines où les premiers signes apparaissent. Cette faiblesse musculaire devient observable et quantifiable lors de tests de force générale et spécifique. L injection de morpholinos peut induire une nuisance chez les animaux ainsi que l injection d 'anesthesiques (lors de la mesure de force musculaire) peut causer des nuisances. Il y aura aussi une contention manuelle lors de l injection d anesthésiques ) et une contention mécanique ( lors de l injection des morpholinos) Nous proposons donc une procédure de suivi en tenant compte de tous ces critères .

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d 'échantillons.

Remplacement

Ce projet vise à étudier et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction et la structure musculaire. Pour ces raisons, un modèle in vivo est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la physiopathologie des CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé (pour les 4 groupes étudiés) Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Nous avaluerons la douleur à 'l aide d 'un tableau de détection de la douleur chez la souris: dans chacune des catégories de la table, un système d’évaluation avec indices de 0 (signe absent) à 2 (signe évident de douleur) sera utilisé. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré ) et l’étude sera prématurément arrêtée. Lors de la procédure de mesure de la force in situ, les souris seront anesthésiées par trois injections afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l' expérience. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur chaleur corporelle. Nous surveillerons également la sècheresse oculaire et rajouterons de l ocrygel si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant en myologie. son systéme musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. Par ailleurs, notre équipe dispose de plusieurs modèles murins de myopathies centronucléaires sur lesquels nous avons publié de nombreux articles. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, ces souris présentent des phénotypes comparables aux patients humains, qui en font des modèles appropriés pour comprendre la maladie et développer des traitements. Les souris seront injectées à partir de 4 semaines d 'âge ce qui correspond au début de l apparition des symptômes.

À sept jours de vie, des souriceaux reçoivent une incision du cuir chevelu puis un poids lâché sur le crâne, avant que la plaie soit refermée à la colle biologique, le tout en moins de deux minutes sous anesthésie. 1 072 souris vont être utilisées ainsi, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce une mortalité inférieure à 4 %, liée à l'anesthésie ou au traumatisme lui-même, et des troubles du comportement, anxiété et déficits sociaux, mesurés au quarante-cinquième jour de vie. Il indique ne disposer d'aucune donnée comportementale sur des animaux plus jeunes, et ne précise pas quels tests seront employés.

Objectifs

Le traumatisme crânien (TC) est un problème mondial majeur, affectant particulièrement les enfants et les jeunes, avec environ 69 millions de cas par an. Il ne s'agit pas seulement du choc initial (lésion primaire), mais surtout de l'inflammation qui s'ensuit (lésions secondaires et tertiaires). Si cette inflammation persiste, elle endommage le cerveau à long terme, entraînant des problèmes moteurs, cognitifs et émotionnels. Pour briser ce cercle vicieux, il faut comprendre précisément qui est aux commandes de cette inflammation chronique. Dans le cerveau, nous avons deux types de cellules impliqué dans l’inflammation. Les astrocytes sont des cellules en forme d'étoile qui, normalement, jouent un rôle vital de soutien et de réparation. Après un traumatisme chez l'enfant, ces astrocytes peuvent devenir hyper-actifs. Au lieu de réparer, ils forment parfois une cicatrice trop rigide qui empêche la guérison, ou alors ils libèrent des signaux qui alimentent l'inflammation pendant des mois, causant des lésions à long terme. Notre connaissance de ce que font les astrocytes chez l'enfant est très limitée. Notre étude a donc pour objectif de comprendre le rôle précis de l'astrocyte dans ces dégâts post-traumatiques chez les jeunes enfants.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de comprendre quand et pourquoi ces cellules, qui sont normalement les "architectes" de la réparation, se mettent à former une cicatrice trop rigide ou à relâcher des signaux qui continuent d'abîmer le cerveau de l'enfant. En identifiant le moment exact où l'astrocyte bascule de protecteur à destructeur, nous pourrons intervenir pour le maintenir dans son rôle de guérisseur. Cela permettrait de limiter l'inflammation chronique qui est responsable des problèmes de mémoire, de concentration, et des troubles du comportement qui apparaissent des mois ou des années après l’accident. Jusqu’à présent, les traitements anti-inflammatoires sont souvent trop généraux. L’avantage de notre recherche est qu’elle isole une cible cellulaire très précise : l'astrocyte. En étudiant le comportement de cette cellule clé dans le cerveau en développement, notre projet vise à offrir une meilleure qualité de vie aux enfants victimes de traumatisme crânien.

Procédures

Des souriceaux subiront un traumatisme crânien à 7 jours de vie sous anesthésie générale : une incision cutanée suivie d’un lâcher de poids et d’une fermeture cutanée par de la colle biologique. Cette procédure est réalisée en moins de 2 minutes. Les groupes contrôles subiront la même procédure sans le traumatisme crânien.

Impact sur les animaux

La mortalité est de moins de 4% (principalement due à l’anesthésie générale ou au traumatisme crânien lui-même). Le fait de manipuler les souriceaux quotidiennement n’entraîne pas de rejet par la mère lors de la remise au nid car les souris utilisées ne sont pas perturbées par cela. Une irritation/inflammation au niveau de la cicatrice peut arriver de façon rarissime. Les animaux peuvent présenter des modifications du comportement (anxiété, déficits sociaux) qui seront analysées à P45 (45e jour de vie post natale). Nous n’avons pas de données comportementales sur des animaux plus jeunes. Une attention particulière sera apportée pour limiter le stress lors des différents tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à différents temps avec prélèvement du cerveau et analyse.

Remplacement

L’impact du traumatisme crânien ne peut être envisagée que dans des conditions « in vivo », c’est-à-dire dans un organisme vivant. Aucune solution alternative n’est possible pour conduire ce projet de recherche. Il est impossible d’évaluer les conséquences sur le fonctionnement cérébral d’un traumatisme crânien sur un modèle de cellules en culture ou sur des modélisations informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques pour ce type d’étude ont été réalisé. En effet, des études antérieures sur ce modèle permettent d’évaluer la mortalité et ainsi d’avoir le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats statistiquement corrects. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés pour les tests comportementaux seront également utilisés pour des tests sur des coupes de cerveaux.

Raffinement

La procédure chirurgicale de traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale inhalatoire. Les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera que l’adoption par la mère se fait bien. Des arbres décisionnels seront proposés en fonction de l’âge des animaux, déterminant ainsi des points limites prédictifs : on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront euthanasiés. À distance du traumatisme crânien, on réalisera une surveillance hebdomadaire de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress. Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Le personnel technique de l’animalerie réalise aussi un suivi clinique quotidienne des animaux et de leurs conditions d’hébergement (nourriture, eau, température de la pièce, taux d’humidité) et nous alerte en cas de problème.

Choix des espèces

Les études chez l’animal permettent d’étudier les conséquences d’un traumatisme crânien modéré localisé sur l’ensemble du cerveau et de mimer au mieux la pathologie humaine. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de lésions du cerveau et notamment le traumatisme crânien. De plus, ce modèle de souris présente l’avantage de ne pas rejeter les petits après une séparation de courte durée. Les souris seront utilisées de 7 jours de vie à 45 jours de vie au maximum en fonction des groupes. Le traumatisme crânien sera fait à 7 jours de vie, pour mimer la survenue d’un traumatisme crânien chez le jeune enfant humain. Le rôle de l’astrocyte sera analysé à plusieurs temps (45 jours de vie pour voir les effets à la phase tardive), car l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps.

Faire entrer un candidat médicament en essai clinique en satisfaisant aux exigences réglementaires d'efficacité et de tolérance, 1 158 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 748 d'entre elles et sévère pour 410. Trois cent cinquante animaux subissent une chirurgie du nerf sciatique, 760 une incision du derme et du muscle, 48 une injection inflammatoire dans la patte, avant de recevoir de une à quatre administrations du composé testé. Le porteur reconnaît que ces modèles lésionnels "vont entrainer des douleurs", puis mesure la sensibilité des pattes avec des filaments qu'il qualifie de non douloureux. La dernière expérience porte le nombre d'injections à vingt-huit par animal, sans que le dossier explique ce qui justifie ce passage de quatre à vingt-huit.

Objectifs

Les douleurs neuropathiques sont un problème majeur dans notre société actuelle : plus d'un adulte sur cinq souffre de douleurs chroniques. Les causes des douleurs neuropathiques peuvent être diverses : lésion d'un nerf, les conséquences de médicaments anticancéreux ou le diabète. Même si les symptômes sont souvent similaires comme l'apparition d'une allodynie mécanique (sensibilité accrue au toucher), les mécanismes moléculaires mis en place lors de ces différents types de douleurs neuropathiques peuvent diverger. Ainsi, un traitement pour un type de douleur peut s'avérer inefficace sur un autre type de douleur neuropathique. De plus, les molécules permettant de diminuer ces symptômes ne sont malheureusement pas toujours efficaces et présentent le plus souvent une accommodation les rendant au cours du temps inefficaces. L'identification de nouvelles molécules pourrait à terme améliorer le confort de patients atteints de douleurs neuropathiques. Nous avons identifié un nouveau candidat médicament pour le traitement de la douleur. Cependant, avant de pouvoir lancer les essais cliniques chez l’Homme, il nous est indispensable de réaliser un certain nombre d'expériences d'efficacité et de tolérance.

Bénéfices attendus

L’objectif final de cette demande est de répondre aux attentes règlementaires (efficacité, tolérance, interaction médicamenteuse) pour que notre composé rentre en phases cliniques, et puisse peut-être un jour, diminuer les douleurs chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sur le nerf sciatique (350 animaux) ou le derme/muscle (760 animaux), ou bien à une injection intra-plantaire d’un composé inflammatoire (48 animaux). Pour les chirurgies, l’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. Ces chirurgies seront réalisées rapidement (en moins de 15 minutes) et un suivi régulier sera réalisé. Les animaux recevront ensuite une dose de notre candidat médicament ou de contrôles positifs (médicaments utilisés actuellement en clinique) et négatifs (placebo) par voie sous-cutanée, intraveineuse ou orale. Les animaux recevront entre 1 et 4 injections, à l’exception de la dernière expérience nécessitant 28 injections. L’efficacité de ces composés sera réalisée à l’aide de mesures de sensibilité au niveau des pattes grâce à des filaments exerçant une pression donnée (non douloureux). Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles car nous voulons tester l’efficacité de notre composé X.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à recevoir l’administration du composé X via différentes voies d’administration (sous-cutanée, orale ou intraveineuse). Nos résultats préliminaires suggèrent qu’il n’y aura aucun effet indésirable dû à l’injection de ce composé. Les autres composés (morphine, prégabaline…) sont injectés à des doses n’engendrant aucun effet secondaire. Cependant, la contention et l’injection peut générer un stress chez les animaux. Les différents modèles lésionnels mimant une lésion neuropathique, post-opératoire ou inflammatoire vont entrainer des douleurs. Un suivi chirurgical approprié permettra de diminuer au maximum les nuisances. Enfin, le test mesurant la sensibilité des animaux pourrait engendrer un léger stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser les nuisances provoquées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, dès la fin de la procédure, car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait des chirurgies qu’ils auront subies. De plus, pour une partie des animaux, nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés, tout en permettant de diminuer le nombre d'animaux à utiliser. En effet, ces analyses sont indispensables pour comprendre les mécanismes de la douleur et notamment comment agit notre composé.

Remplacement

L’objectif principal de ce projet étant de réaliser les expériences pré-cliniques, il nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non animales. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l’utilisation subséquente d’animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l’étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Nous prenons en considération différents critères (variabilité liée au traitement, variabilité liée aux tests comportementaux, nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable...etc.) nous permettant de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques nous permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Aussi, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Les expérimentateurs ont été formés et maitrisent les méthodes utilisées (chirurgie, injection, tests comportementaux…). De plus, les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) permettant de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences ; b) administration adéquat d'anesthésique/analgésique lors des soins pré-, per- et post-opératoires ; c) établissement des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique est effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation sont mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’Homme justifie l’utilisation de rongeurs. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. De plus, il est aisé de réaliser les différents tests comportementaux sur ces rongeurs. Toutes les expériences seront menées aussi bien sur des mâles que sur des femelles afin d’appréhender les futurs essais cliniques qui se feront chez les hommes et les femmes. Il est clairement admis et recommandé par la communauté scientifique que les expériences de comportement doivent être réalisées sur des individus ayant atteint leur maturité sexuelle, soit des individus âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences. Ainsi, les animaux auront été commandés à 6 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie.

Pour produire des anticorps commandés par des entreprises clientes, 1 118 souris et 22 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sévère pour 18 souris. Les immunisations vont de quatre à sept par animal, suivies d'un à deux prélèvements sanguins puis d'un prélèvement terminal, tous les individus étant tués pour récupérer sang, rate et ganglions. Le porteur affirme que les anticorps d'origine animale restent "indispensables" pour certains usages diagnostiques et thérapeutiques, tout en écrivant proposer d'abord à ses clients des options sans animaux. L'activité relève de la sous-traitance, le nombre d'animaux utilisés dépendant des commandes reçues, à raison de trois à cinq souris ou deux rats par cible demandée.

Objectifs

Nous utilisons des animaux dans le cadre de prestations en sous-traitance pour d’autres entreprises/partenaires qui utilisent les anticorps (1) dans leurs activités de recherche (2) pour le développement de tests de diagnostic, (3) pour la thérapeutique. Notre société utilise donc des animaux si nécessaire afin d’isoler et produire lesdits anticorps indispensables à la réalisation des demandes de nos clients en l’absence d’alternative satisfaisante (les options de remplacement ne faisant pas appel à l’animal disponibles leur étant proposées).

Bénéfices attendus

Bien que nous nous inscrivions dans une démarche de transition progressive, l’utilisation d’animaux pour la production d’anticorps reste indispensable pour certains cas spécifiques en l’état actuel de la technologie. Les besoins en anticorps d’origine animale ont des raisons bien précises, par exemple : -pour la production d’anticorps présents dans des médicaments sous AMM (autorisation de mise sur le marché) ou ATU (autorisation temporaire d’utilisation) en l’absence d’alternative satisfaisante. -Lorsque les anticorps utilisés pour des produits diagnostiques n’ont pas encore put être remplacées par des anticorps produits par des méthodes ne faisant pas appel à l’animal. -Les anticorps à façon utilisés en recherche restent indispensables par leurs spécificités, les immunisations sont en effet dirigées contre des cibles complexes où l’on n’a pas encore trouvé de substitution satisfaisante à l’utilisation d’animaux. Ce projet a pour objectif la production d’anticorps d’intérêt pour nos clients, lorsque ceux-ci ne sont pas disponibles par d’autres méthodes que l’immunisation initiale d’animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements (1 à 2 prélèvements de sang (durée inférieure à 1 min) en cours de manipulation et un prélèvement terminal (durée inférieure à 1 min), tous avec anesthésie générale gazeuse) et à des injections (de 4 à 7 immunisations de 30 secondes chacune).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être sujets à du stress lors des manipulations, à de possibles petites protubérances aux sites d’injection sous-cutané (possibles mais jamais observés avec les doses utilisés) et à une fatigue à la deuxième injection (réponse immunitaire forte). Ainsi que des douleurs légères lors des injections (piqure d'aiguille). Les additifs utilisés (dans les volumes et concentrations utilisés) ne présentent pas d’effets secondaires décelables. Les prélèvements de sang se font sous anesthésie générale et sont de courte durée (inférieur à 1 minute). Le temps de récupération des animaux entre les différentes étapes d’immunisation et de prélèvement nous impose un suivi au plus proche de l’animal selon comment celui-ci va répondre à l’expérimentation. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole pour prélèvements de sang et d’organes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort, car nous avons besoin de récupérer un maximum de sang ainsi que divers organes afin de garantir une efficacité maximale de nos expérimentations.

Remplacement

Des méthodes alternatives n’utilisant pas l’animal sont proposées aux clients en première intention cependant lorsqu’elles s’avèrent inadaptées et/ou trop peu efficaces alors les modèles rongeurs s’avèrent particulièrement bien adaptés aux demandes spécifiques de nos clients.

Réduction

Il n’est utilisé que le nombre d’animaux strictement nécessaire par projet afin de pallier les risques : 1-d’une réponse immunitaire trop faible des individus immunisés 2-du décès d’animaux en cours de protocole ce qui compromettrai le projet. Cela se traduit en pratique par l’utilisation de 3 à 5 souris (selon la spécificité de l’immunisation) ou 2 rats par cible. Le modèle animal n’étant utilisé que lorsque cela se justifie scientifiquement.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés lorsque cela est nécessaire et euthanasiés si les points limites (définis dans chacune des procédures) sont atteints. Si les doses injectées se révèlent trop agressives alors celles-ci sont diminuées. A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés, la rate et/ou les ganglions des individus dont la réponse immunitaire est jugée la meilleure sont alors prélevés. Les animaux seront soignés et surveillés de manière fréquente par le personnel compétent.

Choix des espèces

Le développement d’anticorps est classiquement réalisé à partir de souris immunisées. Dans certains cas, l’utilisation de rats peut être préférable, notamment dans le cas où la cible ne fonctionnera pas chez souris. L'immunité des systèmes complexes présents chez les animaux ne pouvant pas toujours être remplacé par des systèmes autres. Les anticorps monoclonaux constituent un outil scientifique de choix pour mener à bien des projets R&D. La production d’anticorps nécessite l’utilisation d’animaux en l’absence d’alternative satisfaisante. Les animaux sont utilisés à l’âge de 7 à 9 semaines en début d’expérimentation, lorsque leur système immunitaire est le plus à même de répondre.

Les souris de ce projet portent une mutation du gène Dnm2 qui leur inflige une faiblesse musculaire généralisée, une atrophie et une perte de poids, dans une forme sévère de la maladie. 348 d'entre elles vont être utilisées, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 108 un niveau modéré. Dès le sevrage, elles reçoivent sous anesthésie des injections intramusculaires, intraveineuses et intrapéritonéales d'un vecteur viral, puis passent chaque semaine un test de suspension, un test d'agrippement et une mesure de force, la pose d'électrodes sous la peau pouvant enflammer le muscle tibial antérieur et l'injection rétro-orbitale entraîner des troubles de la vision. Le porteur écrit qu'à sa connaissance le phénotype myopathique n'est associé à aucune douleur, et toutes les souris seront tuées sous anesthésie pour la collecte de leurs organes.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients atteints, et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en évaluant une approche thérapeutique génique en à l’aide de vecteur viraux qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades).

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires.

Procédures

Une injection intramusculaire et intraveineuse, d’une durée maximale de 30 secondes, sous anesthésie, sera réalisée une fois chez l’animal sevré (3 ou 4 semaines d’âge). Une injection intrapéritonéale d’une durée maximale de 30 secondes sera réalisée une seule fois chez l’animal. Des tests de comportement peu invasifs, qui permettront d’évaluer les performances et les capacités motrices de l’animal (test de suspension, test d’agrippement, test de mesure de force in vivo), ainsi que des pesées de l’animal, seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant, dès le sevrage.

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de la mutation présentent une perte de poids, une faiblesse musculaire généralisée et une atrophie musculaire par rapport à des animaux contrôles. À notre connaissance, il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. Les approches thérapeutiques par modulation génique visent à augmenter la force musculaire des animaux. Mais des effets secondaires indésirables peuvent être attendus. En revanche, lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable pendant l’analyse. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intramusculaire peuvent provoquer une inflammation du muscle tibial antérieur. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur dans la cavité péritonéale. L’injection rétro-orbitale peut entraîner des difficultés de vision.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures, car notre projet nécessite la collecte d’organes afin de compléter l’analyse histologique et moléculaire.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture, car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe, et encore moins celle d’un organisme entier. En effet, seul le modèle animal permet d’étudier, d’une part, la maladie dans sa globalité et, d’autre part, l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de la thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Une étape préalable permettra de sélectionner uniquement les molécules les plus efficaces et les moins toxiques, évitant ainsi de tester des candidats non pertinents chez l’animal. Le protocole est conçu pour réduire le nombre d’animaux grâce à une étude pilote qui permet de sélectionner le meilleur candidat avant l’étude principale. De plus, plusieurs mesures seront réalisées sur les mêmes animaux au cours du temps, ce qui évite la création de groupes supplémentaires. Enfin, les prélèvements réalisés en fin d’expérience permettent de regrouper les analyses et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion surviennent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal lors de ses déplacements. Une session de familiarisation précédera chaque test pour réduire le stress. Toutes les immobilisations utiliseront une anesthésie gazeuse rapide. La zone d'injection sera surveillée pendant 3 jours pour observer sa couleur et son gonflement, afin de prévenir toute infection. Pour la mesure de la force musculaire, les souris seront sous anesthésie générale profonde afin de les immobiliser et de prévenir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Cet acte est sans réveil. Durant la procédure, les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et seront monitorées en permanence. Des points limites ont été définis et seront appliqués au cours de l’étude.

Choix des espèces

Le projet vise à évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans un modèle murin de myopathie centronucléaire. Des expériences sont réalisées chez la souris, ce modèle présentant de fortes similitudes avec la pathologie humaine au niveau musculaire, tant sur le plan structurel que fonctionnel et moléculaire. Nous utilisons des modèles murins déjà développés au laboratoire, reproduisant les principales caractéristiques de la myopathie centronucléaire, notamment une forme sévère de la maladie. Ces animaux présentent une faiblesse musculaire et des anomalies histologiques comparables à celles observées chez les patients. L’utilisation de ces modèles, déjà caractérisés et publiés par notre équipe, garantit la continuité et la reproductibilité scientifique du projet. Deux approches thérapeutiques seront étudiées. Dans le cadre d’une stratégie dite de « réversion », le traitement sera administré à partir de 3 à 4 semaines d’âge, après le sevrage. À cet âge, le phénotype myopathique est déjà établi, permettant d’évaluer la capacité du traitement à améliorer une pathologie installée. Les injections seront réalisées par voie intramusculaire ou intraveineuse. Dans le cadre d’une stratégie de « prévention », le traitement sera administré très précocement, entre 1 et 2 jours après la naissance (P1–P2), par voie intrapéritonéale. Les myopathies centronucléaires étant des pathologies congénitales, une intervention précoce pourrait limiter, voire prévenir, l’installation des anomalies musculaires. Les animaux traités seront suivis jusqu’à l’âge de 8 semaines afin d’évaluer la fonction musculaire, le poids corporel et les caractéristiques histologiques du muscle. Pour certaines cohortes traitées par voie intraveineuse, un suivi prolongé jusqu’à 52 semaines sera réalisé afin d’étudier la stabilité et le maintien de l’effet thérapeutique dans le temps.

Les tests de douleur comportent une limite d'arrêt qui permet de les interrompre même si l'animal ne réagit pas, afin de lui éviter une lésion. 2 550 souris et 2 550 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. On leur injecte dans la patte de la formaline, de la capsaïcine, du venin d'abeille, du carraghénane, du zymosan, de l'adjuvant de Freund ou des chimiothérapies, ce qui provoque une douleur persistante et un œdème suivis jusqu'à deux semaines, durée dont le porteur fait lui-même la justification du classement en sévère. Chaque animal peut subir jusqu'à 30 tests thermiques ou mécaniques et 38 prélèvements sanguins, pour évaluer des composés antidouleur candidats.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d’évaluer l'efficacité de potentiels composés thérapeutiques dans la modulation de la douleur chez des modèles de rongeurs, en se concentrant sur trois axes principaux : la détection des stimuli douloureux, la douleur liée aux atteintes des nerfs et la douleur liée aux inflammations. ces deux dernière catégories sont induites par divers agents afin de reproduire des mécanismes proches de ceux observés dans les pathologies humaines alors que l’étude de la détection des stimuli douloureux se fait sur des animaux naïfs, afin de caractériser les effets des composés sur la sensibilité normale aux stimuli douloureux. En effet, un composé peut présenter une activité antidouleur en conditions physiologiques, tout en étant inefficace dans un contexte de douleur pathologique, d’où l’importance de distinguer ces deux niveaux d’évaluation. Actuellement les principales catégories de molécules utilisées dans le traitement de la douleur sont les opioïdes, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les antidépresseurs et les anticonvulsivants. Toutes ces molécules utilisées seules ou en combinaison présentent des effets secondaires parfois importants. Les opioïdes, bien que largement utilisés dans la gestion de la douleur chronique, comportent des risques significatifs, notamment des effets secondaires graves et des risques de dépendance. De plus ce projet inclut des objectifs secondaires comme : - L’évaluation de la pharmacodynamique des composés dans des modèles de douleur liée aux atteintes des nerfs et aux inflammations. - La comparaison de l'efficacité des traitements pour chaque type de douleur à différents dosages et fréquences d’administration. - L’étude des mécanismes d’action des composés, en particulier les voies biologiques impliquées dans la douleur aux atteintes des nerfs et aux inflammations. - La validation de marqueurs communs ou spécifiques aux types de douleurs étudiées.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet a pour objectif de participer au développement de nouvelles molécules pour le traitement des douleurs. Il devrait aussi permettre de développer des molécules qui permettent de remplacer les opioïdes actuels qui sont responsables de dépendance et dont l’utilisation détournée est un problème majeur. En proposant de nouveaux composés thérapeutiques plus ciblés et plus sûrs, ce projet pourrait contribuer à réduire l'usage des opioïdes dans le traitement de la douleur neuropathique et inflammatoire, offrant ainsi une alternative plus sûre pour des millions de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 1 peuvent être amenés à réaliser au maximum 30 tests thermique et/ou mécanique répartis sur 2 seamines (5 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et des prélèvements sang peuvent être réalisé sans dépasser les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 2 peuvent être amenés à réaliser au maximum 7 tests thermique et/ou mécanique (5 test-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations et un maximum de 5 prélèvements sanguins sur la période de 24 heures en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Concernant la procédure 3 peuvent être amenés à réaliser au maximum 30tests thermique et/ou mécanique (5test-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et un maximum de 38 prélèvements sanguins sur la période de 2 semaines en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection dure environ 5 min. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont corrélés à la sévérité et aux spécificités de chaque procédure expérimentale : • Dans le cadre de la Procédure 1 : Les nuisances sont principalement liées aux manipulations régulières et à la contention douce lors des tests comportementaux, pouvant induire un stress transitoire. Les administrations et les prélèvements sanguins optionnels peuvent occasionner une douleur passagère ou une irritation locale aux sites d'injection. • Dans le cadre de la Procédure 2: En plus du stress de manipulation et des désagréments liés aux administrations, l'injection intra-plantaire d'agents irritants ou inflammatoires (formaline, capsaïcine, venin d'abeille, carraghénane ou zymosan) provoque une douleur locale immédiate et un œdème de courte durée, limitée à une période maximale de 5 heures après l'induction. • Dans le cadre de la Procédure 3 : Cette procédure engendre les nuisances pendant plus longtemps. L'injection intra-plantaire d'agents d'induction (CFA, MIA ou chimiothérapies) induit une douleur locale persistante ainsi qu'un œdème, suivis sur une période allant jusqu'à 2 semaines. La durée de cette douleur pathologique justifie le classement en sévère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car ne sommes pas en mesure de garantir les dispositions de l'article R214-112 du code rural et de la pêche maritime permettant le placement.

Remplacement

La nociception et la douleur sont des phénomènes complexes impliquant des mécanismes neuronaux, immunitaires et comportementaux qui ne peuvent être reproduits par des modèles in vitro. Les tests comportementaux et les réponses systémiques nécessitent l'utilisation de modèles animaux pour évaluer l'efficacité des composés antalgiques dans des conditions réalistes. Pour toutes ces raisons, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. Quand, chaque animal peut être utilisé comme son propre contrôle, les animaux non induits ne sont pas mis en œuvre. Des analyses statistiques finales sont réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation (minimum 6 jours) à l’arrivée des animaux sur site avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux avec des enrichissements propres à chaque espèce. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les expérimentations, la mise à mort et les prélèvements sont effectués dans des pièces dédiées différentes des pièces d’hébergement. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Certaines administrations, la mesure du volume des pattes et les prélèvements de sang sont effectuées sous anesthésie générale . Les tests induisant de la douleur sont tout assorti d’une limite d’arrêt permettant de mettre fin au test même si l’animal ne réagit pas afin de le protéger de l’apparition de lésion. De plus, nous avons établi des points limites spécifiques et les plus précoces possibles afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats ou souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet nous favorisons l’utilisation de jeunes adultes (200-250g chez le rat et 25g chez la souris). Nous avons fixé cet âge car les mécanismes que nous étudions ne sont pas dépendants de l’âge et que d’après nos études antérieures ces animaux répondent de façon reproductible et robuste au protocole.