Procédures sévères

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 330 d'entre elles et sévère pour 90. Chacune subit une chirurgie de trente minutes sous anesthésie destinée à implanter un marqueur radio-opaque repérable au scanner, puis une irradiation de l'intestin grêle, en dose unique ou répartie sur trois séances, avec jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids, déshydratation et infection de la suture, et qu'un score de 2 sur l'échelle de suivi du poids et de la cicatrice déclenche la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme que l'évaluation du marqueur implanté exige une validation dans un "organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'ensemble de ces paramètres.

Objectifs

Selon l’Institut national du cancer (INCa), la radiothérapie concerne plus de 50% des patients atteints de cancer. Elle constitue donc un outil thérapeutique majeur et prometteur, au vu des techniques émergentes …). Les cliniciens cherchent à atteindre un équilibre optimal entre l’efficacité du contrôle tumoral et la limitation des lésions aux tissus sains environnants. Comprendre les mécanismes biologiques qui entrent en jeu à différentes échelles (organe, cellules, voies biomoléculaires) est central pour atteindre cet optimum. L’intestin est un organe à risque, car il est souvent situé dans le champ d’irradiation lors de la radiothérapie pour les cancers pelviens. Plusieurs études montrent l’utilisation d’un modèle d’« anse extériorisée » pour une irradiation localisée de l’intestin grêle de rat et de souris : une chirurgie est réalisée, avec ouverture de l’abdomen pour extérioriser une partie de l’intestin, l’irradier, puis replacer l’intestin dans l’abdomen et suturer la peau. Cette approche ne permet pas la réalisation d’irradiations fractionnées, car elle impliquerait de répéter l’intervention chirurgicale à chaque séance d’irradiation, ce qui n’est pas compatible avec le bien-être animal. Or, la radiothérapie en clinique se caractérise par un fractionnement de la dose sur plusieurs séances. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre au point un protocole d’irradiation fractionnée et localisée de l’intestin grêle de souris afin de se rapprocher au maximum des conditions en clinique, et d’accéder à une meilleure compréhension des effets secondaires de la radiothérapie sur l’intestin. Le ciblage de l’intestin est réalisé grâce à l’implantation d’un petit marqueur radio-opaque (visible au scanner), permettant de repérer précisément la zone à irradier lors de chaque séance. Ce projet permettra également d’améliorer les conditions dans lesquelles ce type de chirurgie est réalisé (conditions de stérilité notamment).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre et caractériser comment l’intestin répond à la radiothérapie réalisée en plusieurs séances (fractionnée), comme c’est le cas chez des patients atteints de cancer. Les connaissances acquises pourraient permettre de développer, sur le long terme, des cibles thérapeutiques afin de réduire les effets secondaires intestinaux de la radiothérapie et d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Pour tous les animaux : o Chirurgie (sous anesthésie, 1 fois, durée 30 minutes) o Pesées et examen clinique (en vigile, 2 fois par semaine, durée 1 minute) Selon le groupe expérimental : o Irradiation locale en dose unique (sous anesthésie, 1 fois, durée 15 minutes) o Irradiation locale en dose fractionnée (sous anesthésie, 3 fois, durée 10 minutes) o Imagerie (sous anesthésie, 3 fois maximum, durée 10 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles peuvent survenir à différents moments du projet : • La chirurgie peut engendrer, pendant quelques jours, de la douleur, une perte de poids, une déshydratation, un risque d’infection au niveau de la suture et une diminution de la mobilité, chez certaines souris. Ces effets, notamment la perte de poids, la diminution de la mobilité, et l’infection, que l’on peut directement observer voire mesurer, disparaissent dans la majorité des cas 2 à 3 jours après la chirurgie. • La greffe du matériau radio-opaque peut entraîner une inflammation localisée à l’emplacement de la greffe. Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. L’analyse de ces effets est au cœur du projet.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.

Remplacement

Le développement des séquelles digestives radio-induites nécessite l’interaction entre les différents compartiments cellulaires de l’organisme. Même s’il est possible aujourd’hui de créer des modèles in vitro qui intègrent les différentes cellules du colon, ces modèles prometteurs ne permettent pas encore de remplacer entièrement à l’expérimentation animale : il est donc important de conserver la physiologie de l’organisme pour étudier les processus biomoléculaires des séquelles des radiothérapies pelviennes. De plus, l’évaluation du matériau radio-opaque implanté nécessite une validation dans un organisme entier pour analyser sa tolérance locale, sa stabilité dans le temps, la précision de sa localisation lors des irradiations fractionnées, et les effets biologiques associés à l’irradiation fractionnée. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire l’ensemble de ces paramètres physiologiques et radiobiologiques. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes.

Réduction

Les modèles pour l’étude des lésions intestinales radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques significatives sur les paramètres d’étude, le nombre choisi est le nombre minimum nécessaire de souris, soit 10 souris par groupe. En fonction de la structure des jeux de données obtenus suite aux analyses, différents tests statistiques seront utilisés.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées de manière à limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Analgésie et anesthésie • administration d’analgésiques en préopératoire et post-opératoire; • anesthésie lors des chirurgies, irradiations et imageries). Conditions chirurgicales et soins post-opératoires Les interventions seront réalisées dans des conditions d’asepsie strictes avec du matériel stérile. La température corporelle sera maintenue à 37 °C à l’aide d’un tapis chauffant et d’un dispositif de maintien au chaud pendant la phase post-opératoire. Les animaux seront réhydratés pendant la chirurgie et en post-opératoire. Suivi clinique et définition des points limites Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier incluant l’évaluation de l’aspect général, de la prise alimentaire et du poids corporel. La cicatrice chirurgicale sera surveillée et désinfectée si nécessaire. Un système de scoring (de 0 à 2) sera appliqué pour le poids et l’évolution de la cicatrice. Lorsqu’un score de 2 est atteint, les souris seront euthanasiées. Des soins supplémentaires pourront être mis en place en concertation avec le vétérinaire et le personnel de l’animalerie si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental bien caractérisé dans la littérature scientifique et fréquemment utilisé dans les études précliniques portant sur les effets de la radiothérapie. En effet, la physiologie intestinale de la souris présente beaucoup de similarités avec celle de l’Homme, notamment en termes de renouvellement de l’épithélium, d’organisation tissulaire et de réponse aux irradiations. Ces caractéristiques en font un modèle pertinent pour l’étude des lésions intestinales radio-induites. Une irradiation pelvienne en dose unique sur la souris permet de reproduire des lésions intestinales comparables à celles observées chez certains patients présentant des séquelles sévères de la radiothérapie. Les effets d’une irradiation en dose unique ont déjà été décrits dans la littérature et constituent une base pour l’étude proposée. L’impact d’une irradiation fractionnée reste cependant peu caractérisé et représente l’un des objectifs du projet. Le modèle murin apparaît donc comme le modèle in vivo le plus adapté pour répondre aux objectifs scientifiques de cette étude. Afin de reproduire au mieux les caractéristiques de la pathologie étudiée (lésions intestinales et fibrose), les animaux devront être au stade jeune adulte (8 à 10 semaines) lors de leur arrivée à l’animalerie (donc une semaine de plus en prenant en compte la phase d’acclimatation à l’animalerie). Cette tranche d’âge est classiquement utilisée dans les modèles expérimentaux d’irradiation localisée.

Des souris de fond génétique pur, choisies pour leur faible variabilité, et des lignées génétiquement modifiées pour supprimer une population de cellules immunitaires portent ce projet sur la grippe. 2 370 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le virus leur est administré goutte à goutte dans le nez sous anesthésie, et selon les groupes s'ajoutent une irradiation de neuf minutes, des injections de cellules par voie intraveineuse et des injections de toxine dans l'abdomen sur animal vigile, avec pelage ébouriffé, respiration saccadée et perte de poids annoncés. Les souris qui survivent aux procédures sévères sont tuées elles aussi, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.

Objectifs

Les cellules du système immunitaire sont nécessaires pour combattre les virus. Lorsqu’elles réconnaissent les cellules infectées par le virus, elles produisent des molécules, dites cytokines, qui orchestrent la défense contre le virus et son élimination. Ces cytokines sont indispensables pour la résistance aux infections virales, mais, lorsque leur production est trop prolongée ou excessive, elle devient délétère pour l’hôte. En effet, elles provoquent une inflammation et des lésions pulmonaires parfois fatales pour l’hôte, comme observé dans les poumons des individus infectés par le virus responsable de la pandémie du COVID-19 ou le virus de la grippe. Nous étudions une population de cellules immunitaires qui, lorsqu’elles détectent un virus, produisent en grande quantité ces cytokines à effet double tranchant. Ces cellules sont ainsi réputées essentielles pour l’immunité anti-virale. Cependant, lorsqu’elles sont absentes ou incapables de produire ces cytokines, cela n’affecte pas la résistance à la majorité des infections virales qui est assurée par d’autres cellules immunitaires. En absence de nos cellules d’étude, les souris tolèrent même mieux l’infection par le virus de la grippe et développent une forme moins sévère, en montrant que nos cellules et leurs cytokines sont en réalité délétères. Eliminer spécifiquement les cellules que nous étudions ou inhiber leurs fonctions permettrait donc de reduire la sévérité de la pathologie pulmonaire induite par l’infection par le virus de la grippe. Nous déterminerons quel est le temps le plus tardif auquel on observe un effet délétère des cellules en étude chez les souris infectées par le virus de la grippe. Nous définirons le temps optimal pour administrer des médicaments qui inhibent les fonctions délétères des cellules étudiées. Nous identifierons aussi les cellules ciblées par les cytokines produites par les cellules étudiées et étudierons leurs fonctions délétères. Nous utiliserons deux souches de virus de la grippe choisies comme les plus fréquentes dans les épidemies grippales. Nos résultats permettront d’envisager le développement de nouveaux médicaments pour soigner les patients développant de formes sévères de pathologie pulmonaire induite par des virus respiratoires, comme celui de la grippe.

Bénéfices attendus

Lors d’infection par des virus respiratoires, tels que celui de la grippe ou le Covid-19, les cellules immunitaires, intervenues pour contrôler l’infection, peuvent provoquer une inflammation pulmonaire sévère, si activées de manière excessive et prolongée. Cela dépend en particulier de molécules produites par ces cellules, dites cytokines. Ces cytokines sont nécessaires pour éliminer le virus, mais, lorsque produites en quantité excessive ou sur un temps trop long, elles provoquent des lésions pulmonaires et affectent la capacité respiratoire. Actuellement, la majorité des médicaments administrés pour limiter cette pathologie des poumons rend l’hôte plus vulnerable à l’infection par de nombreux autres pathogènes. Nous avons identifié une population de cellules immunitaires qui est une source délétère de ces cytokines, mais qui n’est pas requise pour éliminer le virus. Nos travaux visent à comprendre quand et comment les cellules que nous étudions et les cytokines qu’elles produisent favorisent les lésions des poumons chez les souris infectées par le virus de la grippe. Pouvoir éliminer au temps le plus opportun uniquement ces cellules ou inhiber leur production de cytokines permettrait de limiter les lesions des poumons sans altérer la capacité de l’hôte à se defendre contre d’autres pathogènes. Cela representerait une avancée majeure pour développer de nouveaux médicaments pour soigner les patients qui développent des pathologies pulmonaires sévères sans compromettre leurs défénses immunitaires.

Procédures

Dans toutes les Procédures Infection une fois sous anesthésie en administrant goutte à goutte dans le nez la solution contenant le virus (durée 30 secondes). Si desydratation, injection une fois dans l’abdomen d’une solution saline. Les gestes suivants seront réalisés uniquement dans les Procédures indiquées Procédure 1 Injection une fois dans l’abdomen d’une toxine sur 80 souris vigiles ou par voie gastrique d’un produit(durée 1 minute). Injection une fois dans l’abdomen sur 60 souris vigiles de médicaments (durée 1 minute). Procédure 3 Irradiation pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveineuse, une fois sous anesthésie ; Procédure 5 Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie, 260 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 6 Infection en administrant goutte à goutte dans le nez, deux fois à 35 jours d’interval sous anesthésie, 20 souris, (durée 30 secondes). Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang, une fois sous anesthésie, 240 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 7 Irradiation une fois sous anesthésie pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveinuese. Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie générale, 240 souris, durée 1 minute. Administration d’une solution goutte à goutte dans la gorge une fois sur souris anesthésiées durée 1 minute. Procédure 8 Injection intraveineuse de cellules une fois sous anesthésie, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

L’infection par le virus de la grippe s’effectue par instillation dans les narines et sous anesthesie, ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’infection peut induire des changements de l’aspect (pelage ébouriffé, réduction du toilettage), du comportement (réduction de la mobilité et de l’activité) et du rythme de la respiration (respiration lente ou saccadée), une perte d’appetit et de poids que nous monitorerons de façon très précise pour détecter le plus précocément une aggravation de l’état des souris si elle a lieu. L’administration par injection dans l’abdomen de la toxine par voie intraperitoneale sur souris vigiles induit un stress et une douleur legère et transitoire. L’administration de reactif par voie gastrique sur souris vigiles induit un stress et une douleur de courte durée. L’administration des inhibiteurs sera effectuée par injection dans l’abdomen sur souris vigiles, ce qui comporte un stress et une douleur legère et transitoire. Avant irradiation, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen L’administration d’anticorps et les prélèvements de sang seront effectués sur souris anesthesiées ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’injection de cellules sera effectuée par voie intraveineuse sous anesthésie générale, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure moderée pour effectuer les prelevements et les expérimentations prévus. Mise à mort de tous les animaux survivants à la fin de chaque procédure sévère car les animaux ne peuvent pas être reutilisés dans d'autres procédures.

Remplacement

Ce projet nécessite d’étudier la réponse immunitaire et la réparation des tissus pulmonaires au cours d’une immunopathologie suite à l’infection par le virus de la grippe. La complexité des interactions établies entre les cellules ne peut pas être reproduite in vitro dans son intégralité et nécessite donc l’utilisation de modèles d’étude vivants. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité. La souris répresente le modèle d’étude optimale car elle permet de générer et utiliser de modèles génétiquement modifiés ciblant les cellules et/ou les molécules en étude. De plus, les similitudes entre système immunitaires murin et humain ont déjà permis le développement de nombreux traitements de maladies chez l’homme. Dans le cas spécifique de ce projet, nous nous attendons à obtenir des indications médicales pour limiter et inhiber les effets néfastes de l’immunopathologie pulmonaire chez les patients souffrant de formes sévères d’infection grippale.

Réduction

Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 10 souris (5 x2 réplicats) par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans des expériences effectuées précedemment par notre équipe, comme suffisantes pour produire des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques). Les conditions d’hébergement sont contrôlées et régulées. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, le comportement, la mobilité et la respiration seront suivis quotidiennement dès le début de chaque traitement. En cas d’affaiblissement des souris, de la nourriture sous forme de paté et de l’eau sous forme de gélée seront mises à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès. Si nécessaire, les souris seront réhydratées par injection dans l’abdomen d’une solution saline. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites la douleur sera scrupuleusement mésurée pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, de manière à mettre en place le plus précocement possible des mesures pour réduire au maximum la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.

Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau de souris sous anesthésie, puis quatre examens d'imagerie hebdomadaires suivent la croissance de la tumeur pendant trois à quatre semaines. 1 550 animaux non-humains sont utilisés, 1 409 souris et 141 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur ne retient pourtant, parmi les effets néfastes, qu'une gêne ou une douleur possibles et deux nuisances qu'il qualifie de légères, le stress de la contention et celui de l'anesthésie. La mise à mort sert à prélever organes et fluides et à mesurer la radioactivité fixée, le porteur écrivant que chaque animal sera "exploité au maximum" afin de réduire le nombre total.

Objectifs

Les mutations de certains gènes favorisent la progression tumorale. Ce projet a pour objectif d’évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie médicale permettant d’identifier ces mutations.

Bénéfices attendus

L’objectif ultime étant d’offrir un nouvel outil d’identification des tumeurs pour une médecine de précision.

Procédures

- 1 injection de cellules sous-cutanée (

Impact sur les animaux

La croissance tumorale sous cutanée pourrait entrainer une gêne ou une douleur. De même, la croissance tumorale intracérébrale pourrait entrainer l’apparition de signes cliniques neurologiques. Le stress modéré lors de l’injection de la molécule radioactive dans un appareil de contention, réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuisance légère). Le stress léger dû à l’induction de l’anesthésie (nuisance légère).

Devenir

À l'issue de chaque procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort par une personne compétente et habilitée, conformément à la réglementation en vigueur. Cette étape est indispensable pour permettre le prélèvement des tissus et des organes d'intérêt. Les échantillons seront ensuite utilisés pour réaliser des analyses ex vivo, notamment des mesures de radioactivité (comptage radioactif) afin de quantifier précisément la biodistribution du radiotraceur, ainsi que des analyses histologiques et immunohistochimiques destinées à caractériser l'expression des biomarqueurs et à corréler ces résultats avec les données obtenues par imagerie in vivo. Ces analyses nécessitent l'intégrité des tissus et ne peuvent pas être réalisées chez l'animal vivant.

Remplacement

Malgré la pré-sélection des radiotraceurs lors d’études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. La pharmacocinétique d’un radiotraceur est dépendant de la physiologie globale de l’individu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant (fixation aspécifique du traceur dans un autre tissu, métabolisation hépatique…)

Réduction

Les études préliminaires d’évaluation des radiotraceurs in vitro permettent de présélectionner les molécules prometteuses et de réduire ainsi le nombre d’animaux engagé dans les études précliniques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les lots de biodistribution, les animaux des lots imagerie seront utilisés pour réaliser le dernier point d’évaluation ex vivo. Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Pour les études d’évaluation d’un radiotraceur in vivo, n=4/ groupe est un nombre suffisant généralement utilisé. Chaque animal sera exploité au maximum (prélèvements organes et fluides) afin d’optimiser l’information obtenue et réduire le nombre total nécessaire.

Raffinement

Une habituation sera réalisée pour faciliter l’entrée des animaux dans l’appareil de contention pour les intra-veineuses. Le personnel pratiquant les iv est un personnel expérimenté ce qui permet de limiter la contention vigile à moins de 2 minutes (associé à l’habituation cela limite le stress de l’animal). Des méthodes de préhension douces seront utilisées pour les animaux. Les animaux des lots imagerie seront leurs propres contrôles et serviront de point terminal pour les études de biodistribution. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d’antalgiques avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection, aspect de la tumeur…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle. Le modèle rat est classiquement utilisé pour les études sur les gliomes mais la croissance tumorale peut être moindre chez ces animaux. Aussi nous envisageons (en alternative) la possibilité de réaliser l’étude sur le modèle de gliome implanté chez la souris selon les études in vitro et les molécules candidates sélectionnées.

Nourris par une sonde introduite par la bouche jusqu'à l'estomac, matin et soir du 3e au 7e jour de vie, avec un lait contenant une substance qui provoque une inflammation intestinale, 432 souriceaux subissent aussi trois passages quotidiens de dix minutes dans une chambre où l'oxygène est abaissé de 21 à 5 %. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, avec douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l'état général et décès parmi les effets attendus. Certains reçoivent au 6e jour une insufflation de dioxyde de carbone dans l'abdomen, que le porteur décrit comme réalisée sous anesthésie générale afin qu'ils ne ressentent aucune douleur, tout en signalant une perforation d'organe suivie du décès et une perforation possible de l'œsophage lors du passage de la sonde. Des tests comportementaux sont annoncés au 30e et au 45e jour de vie, sans que le document précise lesquels. Tous sont tués, à 8 jours pour prélever intestins, cerveaux, sang, foie et rate, à 50 jours pour prélever les cerveaux.

Objectifs

L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l'intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.

Bénéfices attendus

Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : - Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu'à l'estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. - Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. - Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. - Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : - A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. - A l'âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.

Remplacement

Les effets de cette maladie sur le cerveau et sur le système de défense du corps ne peuvent pas être étudiés correctement sans utiliser un animal entier. Il n’est pas possible de tester cette approche uniquement sur des cellules en laboratoire ou à l’aide d’un logiciel, car ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. La souris est un animal souvent utilisé en recherche médicale pour les modèles d'entérocolite. Elle permet d’étudier cette maladie de manière fiable, car son organisme réagit d’une façon comparable et adaptée à ce type d’étude.

Réduction

Le modèle de maladie utilisé a été mis au point pour provoquer des lésions de l’intestin tout en limitant la gravité de l’état des jeunes souris, permettant de limiter la souffrance et de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Une surveillance au minimum quotidienne est mise en place afin d’apprécier l’état des souriceaux. Plusieurs examens sont réalisés sur les mêmes animaux au cours de l’étude, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total de souris nécessaires. Le nombre de souris est réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats fiables.

Raffinement

Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et autorisé. Cela concerne notamment l’alimentation des jeunes souris à l’aide de la sonde, l’anesthésie, les insufflations dans l’abdomen. Les animaux sont hébergées dans des conditions adaptées à leur bien-être : alternance jour/nuit régulière, température stable, eau et nourriture à volonté. Les cages contiennent du papier doux pour leur permettre de construire un nid. Les mères et leurs petits ne sont pas dérangés avant le troisième jour de vie. Lors des manipulations, la séparation est la plus courte possible et les petits sont maintenus au chaud avant d’être replacés auprès de leur mère. Pendant la période où la maladie est provoquée, les animaux sont observés deux fois par jour (poids, comportement, état général). Des règles précises sont suivies pour décider si un animal doit être euthanasié plus tôt afin d’éviter toute souffrance inutile. L’administration du gaz dans l'abdomen est réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Le matériel utilisé permet de délivrer une pression très faible, adaptée à la taille des jeunes souris. Les animaux sont surveillés en permanence pendant et après l’anesthésie. Les tests de comportement sont réalisés dans une salle calme. Les animaux sont d’abord habitués à l’environnement et sont manipulés avec douceur.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.

3 060 souris sont utilisées en un an, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent en intraveineuse ou en intramusculaire des agents chimiques de transfection et des acides nucléiques, avec un risque de thrombose, de réaction inflammatoire et de troubles du comportement, et le prélèvement sanguin peut provoquer une lésion oculaire avec opacification de la cornée. Le commanditaire est une société de biotechnologie dont le porteur teste la tolérance des produits, l'étude de toxicité aiguë suivant une ligne directrice de l'OCDE où deux à quatre étapes s'enchaînent selon la mortalité et l'état moribond des souris. Le porteur écrit que cette procédure "utilise très peu d'animaux" et qu'elle "ne vise pas le calcul d'une valeur précise de la dose léthale dans 50% des animaux", sur un projet qui engage 3 060 souris en douze mois.

Objectifs

Notre partenaire est une société de biotechnologie qui soutient la thérapie génique et cellulaire, la fabrication de produits biologiques et la recherche en sciences de la vie grâce à des solutions innovantes de transfection de l'acide nucléique. La mission consiste ainsi à mettre au point des technologies d'administration de pointe pour permettre aux scientifiques de développer des thérapies révolutionnaires à base d'acides nucléiques afin d'améliorer la santé humaine à chaque étape du processus, de la science fondamentale à la clinique. L'administration d'acides nucléiques doit être efficace, fiable et accessible, dans le développement de thérapies à base d'acides nucléiques pour répondre à des besoins médicaux non satisfaits. L'objectif est ainsi de fournir en permanence des produits de référence en termes de qualité, d'efficacité et de sécurité. Ces réactifs qui permettent la délivrance d'acides nucléiques in vitro et in vivo sont utilisés pour un large éventail d'applications, notamment l'expression génétique, la production de protéines et de virus, l'édition du génome et l'interférence ARN, et ce dans un nombre croissant d'essais cliniques à base d'acide nucléique dans le monde entier dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination. Dans le cadre du développement de nouvelles formulations, plusieurs objectifs ont été définis pour ce projet: 1) Evaluer si les systèmes de vectorisation seront transférables à des applications thérapeutiques; 2) Evaluer la tolérance d’agents chimiques pour la transfection in vivo d’acides nucléiques (ARN et ADN) et déterminer des signes de toxicité éventuelles; 3) Evaluer la tolérance d’acides nucléiques pour la transfection in vivo et déterminer des signes de toxicité éventuelles.

Bénéfices attendus

Si les agents de vectorisations et les acides nucléiques testés sont toléres par la souris, ils pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système n’ayant aucun impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront une injection des composés de transfection par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes) ou par voie intramusculaire (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant la mise à mort en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem. MODIFICATION. on réalisera un ou plusieurs prélèvements sanguins.

Impact sur les animaux

Une potentielle toxicité pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement. Par ailleurs, dans de très rares cas, le prélèvement sanguin peut entrainer une lésion oculaire avec opacification de la cornée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures expérimentales en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant des acides nucléiques. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Les protocoles d’études seront réalisés en incorporant le juste nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions. Nous utiliserons 4 males et 4 femelles pour chaque condition utilisée dans l'étude de toxicité (pour chaque réactif à évaluer et selon le délai entre l'administration du produit et les analyses sanguines et histologiques). Cet effectif est réduit au maximum, mais suffisant pour assurer une analyse statistique fiable et reproductible. Dans l'étude de toxicité aigue, nous suivrons la ligne directrice de l'Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE), qui consiste en un processus séquentiel, en utilisant 3 femelles par dose. Suivant la mortalité et/ou l’état moribond des animaux, deux à quatre étapes sont en moyenne nécessaires pour évaluer la toxicité aiguë de la substance d’essai. Cette procédure est reproductible et utilise très peu d’animaux. La méthode ne vise pas le calcul d’une valeur précise de la dose léthale dans 50% des animaux, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation des animaux.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance. En cas d’observation de la moindre douleur, les animaux seront mis à mort pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés avant et après administration des composés et observés toutes les jours, notamment l'apparence physique (toilettage, pelage, posture, pupilles), les modifications du comportement (hyperactivité ou mobilité réduite, léthargie, immbolité) ou le comportement après stimulation (prostration, hyperactivité, agressivité, tremblements, convulsions).

Choix des espèces

Le systèmes de vectorisation évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, à partir de 6 semaines, age qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection