Procédures sévères

Tués à l'issue de mesures que le porteur décrit comme trop invasives pour permettre un réveil, 1 960 rats vont être utilisés dans ce projet, dont 1 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent sous anesthésie une substance qui provoque une hypertension pulmonaire, puis un traitement quotidien pendant cinq semaines, parfois par pompe implantée sous la peau, deux séances d'imagerie cardiaque et une chirurgie de mesure de pression dans le cœur et l'artère pulmonaire. Le porteur indique que la maladie induite peut réduire l'activité, l'appétit et la prise de boisson jusqu'à une perte de poids. Il affirme que les tests sur cellules isolées ne permettent pas d'étudier les effets d'un médicament sur le cœur et les poumons, qualifie de "nécessaire" le recours au rat, et précise que l'âge des animaux sera choisi selon la sévérité recherchée du modèle.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester de nouveaux médicaments destinés au traitement d’une maladie grave des poumons appelée hypertension pulmonaire artérielle. Cette maladie entraîne une augmentation de la pression dans les vaisseaux des poumons, ce qui fatigue progressivement le cœur et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Elle peut apparaître sans cause connue, être liée à des facteurs familiaux, ou être associée à d’autres maladies ou à certains médicaments. Bien que des traitements existent déjà pour soulager les symptômes, leur efficacité reste limitée et variable selon les patients. Le but de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle animal, afin de mieux comprendre leur potentiel avant une éventuelle utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le modèle utilisé dans ce projet reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie étudiée, en particulier les atteintes des vaisseaux des poumons et du cœur. Chez les animaux, l’augmentation progressive de la pression dans les poumons entraîne des modifications du cœur similaires à celles observées chez les patients atteints de cette maladie. L’utilisation de ce modèle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer l’effet de nouveaux médicaments dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’être humain. Les résultats obtenus permettront d’identifier les futurs molécules thérapeutiques les plus prometteuses, qui pourraient ensuite être étudiés chez l’homme dans le cadre d’essais cliniques, avec pour objectif d’améliorer la prise en charge future des patients.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés afin d’injecter la substance induisant une augmentation de la pression artérielle dans les petits vaisseaux sanguins localisés dans les poumons c'est-à-dire l'hypertension artérielle pulmonaire (durée de l’intervention : 6-8 min). Durant les 5 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés par différentes voies d'administration selon les objectifs de l’étude (durée de 1 à 5 minutes selon la voie choisie). Le traitement pourra également être administré via des pompes diffusant les composés, implantées sous anesthésie et analgésie. Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés afin de réaliser une imagerie cardiaque (environ 20 min) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques à tester. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocole (environ 20 min), puis une chirurgie sera effectuée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le cœur et dans l'artère pulmonaire (environ 20 min). Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours du protocole sur animaux vigiles ou anesthésiés (environ 5 minutes par prélèvement), ou en fin de protocole après les mesures de pression et avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une substance destinée à provoquer la maladie étudiée. Cette administration est réalisée sous anesthésie générale et peut entraîner une gêne passagère, notamment au niveau respiratoire ainsi qu'une gêne au niveau du site d'injection (démangeaisons, sensation de brûlure). Avec le développement de la maladie, les animaux peuvent présenter une diminution de l’activité, une baisse de l’appétit et de la prise de boisson, pouvant conduire à une perte de poids. Une intervention chirurgicale pourra être réalisée pour implanter un dispositif diffusant le traitement. Cette intervention implique une ouverture de la peau et peut entraîner une douleur ou une gêne temporaire liée à la présence du dispositif. L’administration répétée de médicaments peut générer du stress, car elle nécessite une manipulation et une contention des animaux. Certains effets indésirables liés aux médicaments testés ou aux gestes techniques peuvent survenir, en particulier avec de nouvelles molécules. Des prises de sang et des examens d’imagerie cardiaque seront réalisés sous anesthésie ou avec contention, ce qui peut entraîner un inconfort temporaire, du stress ou une douleur légère. En fin de protocole, des mesures complémentaires seront effectuées sous anesthésie générale.

Devenir

Afin de caractériser l'effet des traitements testés, notamment l'effet biologique, nous devons faire des mesures qui sont trop invasives pour permettre le réveil de l’animal, et il est indispensable de récupérer le cœur et les poumons en fin d'expérience pour évaluer l’efficacité des traitements

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans un organisme vivant. Les tests réalisés sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas d’étudier les effets globaux du médicament sur le cœur et les poumons. L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour mieux comprendre ces effets et le comportement du médicament dans le corps.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données précédemment acquises dans notre laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, de l'imagerie est utilisée pour permettre de suivre plusieurs paramètres dans le temps sur le même animal.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Une grille de score est établie afin de faire un suivi clinique des animaux, avec la mise en place de mesures adaptées en fonction du score et des critères d’arrêt de souffrance. Des enrichissements multiples leur sont proposés en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Lorsqu’une chirurgie avec réveil sera nécessaire, elle sera réalisée en conditions propres (sans microbes) et les animaux auront un suivi post-opératoire intensif pendant au moins 3 jours. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus approprié pour cette étude car la maladie peut y être reproduite de façon fiable et ses effets sur le cœur sont comparables à ceux observés chez les patients. Sa taille permet également de réaliser des prises de sang répétées pour mieux suivre l’action du médicament dans l’organisme. Des rats entre 4 et 8 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. L’âge des animaux impactant la sévérité du modèle, ces paramètres seront choisis selon les objectifs de l’étude.

Sur 48 souris, seize sont classées en souffrance sévère pour une douleur que le porteur dit ne pas pouvoir soulager, faute d'antalgique sans effet anti-inflammatoire. Toutes vont être utilisées dans des procédures allant du niveau modéré au niveau sévère, puis tuées pour analyser leurs articulations. Le projet induit une polyarthrite par trois modèles expérimentaux, avec des injections sous anesthésie ou sur animal vigile. Il s'annonce comme une "preuve de concept" du ciblage d'un récepteur, le CCR3, comme piste thérapeutique.

Objectifs

Ce projet de recherche est une preuve de concept de l'intérêt thérapeutique potentiel du ciblage d'un récepteur à travers un objectif simple qui est d'étudier les conséquences d'une invalidation de ce récepteur (souris déficientes) sur la sévérité d'une polyarthrite expérimentale à travers 3 modèles expérimentaux complementaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des polyarthrites rhumatoïdes qui sont réfractaires aux traitements actuels avec l'identification d'une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

Certains animaux recevront des injections intradermiques sous anesthésie générale d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris. Les autres interventions seront des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles de moins d'une minute. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. Au cours de la procédure, les animaux seront pesés et l'oedème des pattes arrières évalué par mesure du volume. 48 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale dans le modèle arthrite au collagène. Nuisance n°2 Développement de l'arthrite. Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par l'arthrite. La douleur considérée comme sévére pour le modèle arthriet au collagène et modérée pour le modèle arthrite aux anticorps, ne peut être prise en charge pharmacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire.

Devenir

Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.

Remplacement

La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris mâles sont les modèles de référence pour la polyarthrite rhumatoide. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur la compréhension de ce récepteur. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude , le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.

Réduction

Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Ce nombre est basé sur l'expérience de notre unité, et des autres unité de recherche utilisant ce modèle expérimental. Le projet est divisé en deux groupes : groupe composé d'animaux sauvages et groupe composé d'animaux invalidés pour le récepteur. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Sur la base des études in vitro/in vivo antérieures, un effectif de n=8 animaux/groupe d’étude devrait être suffisant pour révéler des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

Les modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Pour les modèles longs (n'est pas concerné l'oedème à la carraghénine car développé sur 7h): Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi- hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère , l'utilisation de tunnel permettra de diminuer la manutention et le stress provoqué par ce changement de litière. Pour les 3 modèles, des grilles d'évaluation validées pour la surveillance sont utilisées avec un point limite associé, conduisant à la mise à mort de l'animal si le score est trop elevé. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-erection, cachexie) ou des troubles du mouvement pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure à 25% par rapport à J0 étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utilisons des souris déficientes pour le récepteur et leurs contrôles sauvages pour ce gène. Il n'existe pas d'autres espèces permettant ce type d'analyse par invalidation génique. Les animaux utilisés seront agés de 7/8semaines car totalement développés d'un point de vue immunologique.

Rendues gravement immunodéficientes pour accueillir des tumeurs humaines, donc sensibles à de nombreux agents pathogènes, 522 souris vont être utilisées, dont 360 en souffrance sévère, dans des procédures les tuant toutes à l'issue. Elles subissent une greffe de tumeur mammaire sous anesthésie, une irradiation ciblée, puis un candidat médicament administré par injections répétées, gavage ou voie intraveineuse pendant deux semaines. Le porteur revendique des modèles reproductibles tout en reconnaissant qu'ils demandent à être améliorés et ne reproduisent que certains aspects de la maladie humaine. Toutes sont mises à mort pour analyser les tumeurs et évaluer la toxicité des traitements.

Objectifs

Malgré les progrès de la médecine, le cancer du sein est le cancer le plus frequemment observé et reste actuellement la première cause de décès par cancer chez les femmes en France. Le cancer de sein développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé, notamment lorsque que des métastases apparaissent. La mise en oeuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité d’un candidat médicament en combinaison avec de la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité de la combinaison radiothérapie et médicament sur le développement tumoral en nous appuyant sur des résultats obtenus in vitro et sur des modèles précliniques mammaires dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

L’ensemble des animaux devront être transplantés par chirurgie sous anesthésie (1x15min). Le suivi du développement tumoral sera effectué bihebdomadairement par une mesure au pied à coulisse (contention de 2 min). Les actes de pesées de poids corporel seront réalisés à minima bihebdomadaires et dureront quelques secondes. 360 souris du projet seront également anesthésiées par une administration intrapéritonéale lors de l’irradiation de la tumeur (1x45min) et recevront une irradiation ciblée de la tumeur (1 à 2 min). Ces 360 animaux recevront également l’administration d’un candidat médicament soit par voie intrapéritonéale (douleur d’une aiguille/1-2min, maximum 2 injections par jour pendant 2 semaines), par voie intraveineuse (douleur d’une aiguille/1-2min, maximum 3 injections par semaine pendant 2 semaines), par gavage (douleur de la canule/1-2min, maximum 1 injection par jour pendant 2 semaines) ou en sous-cutanée (douleur d’une aiguille/1-2min, maximum 2 injections par jour pendant 2 semaines).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour cette étude, étant gravement immunodéficientes, sont sensibles à l’infection par un large éventail d’agents pathogènes normaux, d’agents pathogènes opportunistes et d’organismes commensaux. De plus, pour toutes les souches de souris, la greffe de cellules tumorales peut engendrer des douleurs, une perte de poids ainsi qu’un risque d’infection au site d’incision. Le développement d’une tumeur mammaire pourrait s’accompagner d’une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer et plus rarement d’une perte de poids. Les actes réguliers de pesée du poids corporel, de manipulation lors des mesures du volume tumoral et d’anesthésies associées aux chirurgies et à l’irradiation seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L’administration d’un traitement ainsi que l’irradiation de la tumeur et les effets indésirables associés pourront engendrer un stress de courte durée, une perte de poids et une déshydratation.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de nos traitements, notament l’effet biologique, nous récupérons en fin d’expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous réaliserons pour cela une mise à mort de l’ensemble des animaux du projet. L’étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti-tumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Notre projet, avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de prélèvements tumoraux, de cultures de cellules ou d’organoides/tumoroides. Ces expériences permettent de sélectionner les traitements les plus prometteurs. Une telle approche permettra de réduire significativement le nombre d’animaux que nous utiliserons réellement. Cependant, le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeuthique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine.

Réduction

Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux tout en permettant un effet statistique robuste et significatif, nous avons réalisé un calcul d’effectif en utilisant d’anciennes données afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles et la transplantation sera réalisée au niveau des deux glandes mammaires n°4 afin de diviser par 2 le nombre d’animaux.

Raffinement

Tout au long de cette étude, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées ainsi qu’une pesée à minima bihebdomadaire seront effectuées par du personnel compétent afin de détecter le plus précocement possible toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action la plus appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. De plus, afin de respecter leur instinct grégaire et d'assurer une absence de peur et d'anxiété, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi. Les procédures chirurgicales et l’irradiation seront réalisées sur tapis chauffant et sous anesthésie (gazeuse ou fixe) avec, dans le cas de la chirurgie, une analgésie pré- et post-opératoire pour une meilleure prise en compte de la douleur et réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif (mesures au pied à coulisse).

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Pour cette étude, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propes études pour ce type de modèle de greffe de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes », âgées de 6 à 10 semaines au moment de la greffe.

Injectées chaque jour pendant vingt jours dès les premiers jours de vie, puis soumises à des tests moteurs deux fois par semaine, 864 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié en souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Ce volet complète sur un second établissement l'étude d'une origine développementale de la sclérose latérale amyotrophique. Le modèle conduit à une perte de poids jusqu'à 40 %, une paralysie progressive et une mort prématurée vers 140 jours. Les souris transgéniques sont tuées avant la paralysie complète, les autres au même âge comme témoins.

Objectifs

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs. La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie grave qui touche les cellules nerveuses responsables des mouvements. Elle entraîne une paralysie progressive, car ces cellules disparaissent peu à peu dans le cerveau et la moelle épinière. Après l’apparition des premiers symptômes, la maladie conduit au décès en quelques années et il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Dans environ 10 % des cas, la maladie est liée à des anomalies génétiques identifiées. Ces formes familiales ont permis de développer des souris modèles qui présentent des symptômes proches de ceux observés chez les patients. Comme pour d’autres maladies similaires, la SLA pourrait avoir une origine très précoce, liée au développement. En effet, certaines formes rares apparaissent dès l’adolescence, à un moment où le système nerveux n’est pas encore totalement mature. De plus, chez les souris modèles, des anomalies sont observées très tôt, dès les premières étapes du développement. L’hypothèse principale de ce projet est que la SLA pourrait débuter pendant le développement, et qu’une intervention réalisée à un moment clé pourrait empêcher l’apparition ultérieure de la maladie. Dans notre laboratoire, nous avons observé par le passé qu’une infection intestinale survenant autour de la naissance, associée à un traitement antiparasitaire appelé ivermectine, permettait d’empêcher complètement l’apparition de la maladie chez les souris. En revanche, le traitement seul n’a pas d’effet protecteur. L’objectif du projet est donc de déterminer si certaines substances produites naturellement par l’organisme lors d’une réaction de défense contre une infection sont responsables de cet effet bénéfique, et de comprendre comment elles agissent. Ces travaux permettront de mieux identifier une possible origine précoce de la SLA et de définir à quel moment du développement une intervention médicamenteuse aurait le plus de chances d’être efficace.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. Ce traitement est faiblement efficace puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématuré du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer encore les traitements actuels.

Procédures

Les animaux subiront une injection quotidienne en sous-cutané (20 µL). Cette injection durera quelques minutes tous les jours pendant 20 jours (EU1). A partir de 60 jours d’âge jusqu’à 120 jours, certains animaux subiront 15 minutes de test moteur deux fois par semaine pendant 8 semaines. De même, ces animaux subiront un test d’opposition de gravité (test de comportement) sur la même tranche d’âge, 9 minutes, deux fois par semaine pendant 8 semaines (EU1).

Impact sur les animaux

Cinq types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- Le développement d’atteintes motrices et d’une mort précoce, typiques de la SLA avec une perte de poids qui débute aux alentours de 80 jours et qui peut atteindre 40% au cours du temps, des symptômes moteurs qui apparaissent aux alentours de 100 jours par des problèmes d’extension des pattes arrière, suivis d’une paralysie progressive qui touche les pattes arrière puis les pattes avant, qui évolue vers une paralysie totale et une mort prématurée aux alentours de 140 jours. 2- Un traitement pharmacologique de souris modèles de SLA dont la barrière hématoencéphalique est possiblement altérée pourrait créer une somnolence et des désordres des mouvements. 3- L’injection sous-cutanée peut entraîner localement une douleur transitoire et être ressentie comme gênante voire stressante. 4- L’injection sous-cutanée sur des juvéniles peut entrainer un stress de séparation pour la mère et ses petits. 5- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux, par le biais de tests de locomotion, et test de force motrice, peut s’avérer fatiguant et stressant pour des animaux développant une faiblesse musculaire voire une paralysie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. Les animaux transgéniques développant des symptômes moteurs seront mis à mort avant paralysie complète, selon les points limites établis, et les animaux non-transgéniques seront mis à mort aux mêmes âges que les animaux transgéniques pour servir de contrôles aux expériences de biologie moléculaire et d’histologie prévues.

Remplacement

Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale, et s’il existe une fenêtre optimale d’intervention thérapeutique. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in silico permettant de modéliser la maladie et donc d’éviter l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les lots ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques et de données préétablies. De plus, le projet comporte une première partie préliminaire qui déterminera si la suite du projet sera réalisée ou non. Les deux sexes étant produit, l’étude sera faite de sorte de vérifier si un effet sexe est visible. Enfin, une connaissance approfondie des techniques d’élevage des animaux permettra de ne produire que le strict nécessaire à l’accomplissement de ce projet.

Raffinement

Le milieu des cages sera enrichi et amélioré à mesure que la maladie se développe chez les individus afin de leur permettre de se nourrir et de se désaltérer malgré la perte de mobilité. De même, un maximum de coton sera mis à la disposition des individus présentant les signes de la maladie, dont la fonte musculaire. Ainsi cela leur permettra de se maintenir au chaud malgré celle-ci. Pour finir, une grille de scoring éprouvée depuis plusieurs années permet de déterminer avec précision les seuils à ne pas dépasser, afin d'éviter tout risque de détresse inutile.

Choix des espèces

La souris présente des niveaux de complexité du cerveau et de la moelle épinière proche de l’homme. Cela permet à notre souris d’être un modèle particulièrement fidèle à ce que les hommes atteints de SLA peuvent subir. Les traitements seront faits de P0 à P20 soit pendant toute « l’enfance » de l’animal. Les tests de comportement et le suivi pondéral sera fait avant l’apparition des premiers symptômes et jusqu’à un stade avancé de la maladie (P60 à P140). Enfin l’électrophysiologie sera faite à un stade très précoce (P4, P12 et P20) tandis que les prélèvements en vue d’analyses ex-vivo seront fait à des stade présymptomatique précoce et tardif (P80 et P120).

Les souris qui développent la paralysie sont tuées avant qu'elle devienne complète. 864 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié en souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le modèle reproduit une sclérose latérale amyotrophique : perte de poids pouvant atteindre 40 %, atteinte motrice des pattes puis paralysie, avec des tests de locomotion deux fois par semaine décrits comme fatigants pour des animaux déjà affaiblis. Les souris non malades servent de témoins et sont tuées aux mêmes âges.

Objectifs

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs. La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie grave qui touche les cellules nerveuses responsables des mouvements. Elle entraîne une paralysie progressive, car ces cellules disparaissent peu à peu dans le cerveau et la moelle épinière. Après l’apparition des premiers symptômes, la maladie conduit au décès en quelques années et il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Dans environ 10 % des cas, la maladie est liée à des anomalies génétiques identifiées. Ces formes familiales ont permis de développer des souris modèles qui présentent des symptômes proches de ceux observés chez les patients. Comme pour d’autres maladies similaires, la SLA pourrait avoir une origine très précoce, liée au développement. En effet, certaines formes rares apparaissent dès l’adolescence, à un moment où le système nerveux n’est pas encore totalement mature. De plus, chez les souris modèles, des anomalies sont observées très tôt, dès les premières étapes du développement. L’hypothèse principale de ce projet est que la SLA pourrait débuter pendant le développement, et qu’une intervention réalisée à un moment clé pourrait empêcher l’apparition ultérieure de la maladie. Dans notre laboratoire, nous avons observé par le passé qu’une infection intestinale survenant autour de la naissance, associée à un traitement antiparasitaire appelé ivermectine, permettait d’empêcher complètement l’apparition de la maladie chez les souris. En revanche, le traitement seul n’a pas d’effet protecteur. L’objectif du projet est donc de déterminer si certaines substances produites naturellement par l’organisme lors d’une réaction de défense contre une infection sont responsables de cet effet bénéfique, et de comprendre comment elles agissent. Ces travaux permettront de mieux identifier une possible origine précoce de la SLA et de définir à quel moment du développement une intervention médicamenteuse aurait le plus de chances d’être efficace.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. Ce traitement est faiblement efficace puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématuré du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer encore les traitements actuels.

Procédures

Les animaux subiront une injection quotidienne en sous-cutané (20 µL). Cette injection durera quelques minutes tous les jours pendant 20 jours (EU1). A partir de 60 jours d’âge jusqu’à 120 jours, certains animaux subiront 15 minutes de test moteur deux fois par semaine pendant 8 semaines. De même, ces animaux subiront un test d’opposition de gravité (test de comportement) sur la même tranche d’âge, 9 minutes, deux fois par semaine pendant 8 semaines (EU1).

Impact sur les animaux

Cinq types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- Le développement d’atteintes motrices et d’une mort précoce, typiques de la SLA avec une perte de poids qui débute aux alentours de 80 jours et qui peut atteindre 40% au cours du temps, des symptômes moteurs qui apparaissent aux alentours de 100 jours par des problèmes d’extension des pattes arrière, suivis d’une paralysie progressive qui touche les pattes arrière puis les pattes avant, qui évolue vers une paralysie totale et une mort prématurée aux alentours de 140 jours. 2- Un traitement pharmacologique de souris modèles de SLA dont la barrière hématoencéphalique est possiblement altérée pourrait créer une somnolence et des désordres des mouvements. 3- L’injection sous-cutanée peut entraîner localement une douleur transitoire et être ressentie comme gênante voire stressante. 4- L’injection sous-cutanée sur des juvéniles peut entrainer un stress de séparation pour la mère et ses petits. 5- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux, par le biais de tests de locomotion, et test de force motrice, peut s’avérer fatiguant et stressant pour des animaux développant une faiblesse musculaire voire une paralysie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. Les animaux transgéniques développant des symptômes moteurs seront mis à mort avant paralysie complète, selon les points limites établis, et les animaux non-transgéniques seront mis à mort aux mêmes âges que les animaux transgéniques pour servir de contrôles aux expériences de biologie moléculaire et d’histologie prévues.

Remplacement

Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale, et s’il existe une fenêtre optimale d’intervention thérapeutique. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in silico permettant de modéliser la maladie et donc d’éviter l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les lots ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques et de données préétablies. De plus, le projet comporte une première partie préliminaire qui déterminera si la suite du projet sera réalisée ou non. Les deux sexes étant produit, l’étude sera faite de sorte de vérifier si un effet sexe est visible. Enfin, une connaissance approfondie des techniques d’élevage des animaux permettra de ne produire que le strict nécessaire à l’accomplissement de ce projet.

Raffinement

Le milieu des cages sera enrichi et amélioré à mesure que la maladie se développe chez les individus afin de leur permettre de se nourrir et de se désaltérer malgré la perte de mobilité. De même, un maximum de coton sera mis à la disposition des individus présentant les signes de la maladie, dont la fonte musculaire. Ainsi cela leur permettra de se maintenir au chaud malgré celle-ci. Pour finir, une grille de scoring éprouvée depuis plusieurs années permet de déterminer avec précision les seuils à ne pas dépasser, afin d'éviter tout risque de détresse inutile.

Choix des espèces

La souris présente des niveaux de complexité du cerveau et de la moelle épinière proche de l’homme. Cela permet à notre souris d’être un modèle particulièrement fidèle à ce que les hommes atteints de SLA peuvent subir. Les traitements seront faits de P0 à P20 soit pendant toute « l’enfance » de l’animal. Les tests de comportement et le suivi pondéral sera fait avant l’apparition des premiers symptômes et jusqu’à un stade avancé de la maladie (P60 à P140). Enfin l’électrophysiologie sera faite à un stade très précoce (P4, P12 et P20) tandis que les prélèvements en vue d’analyses ex-vivo seront fait à des stade présymptomatique précoce et tardif (P80 et P120).

Laparotomie, puis ligature et perforation de l'intestin pour déclencher un choc septique, mise à mort vingt-quatre heures après: 60 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le choc provoque fièvre, frissons, hyperventilation et accélération du rythme cardiaque. Une partie reçoit ensuite des nanoparticules mimant les HDL, censées protéger de l'inflammation. Sang, bile et organes sont prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Le sepsis est défini comme la réponse systémique à l’agression de micro-organismes et/ou toxines correspondant à un syndrome clinique complexe de réponse de l’hôte à l’infection. Il est caractérisé par l’activation de la réponse immunitaire qui est responsable de dommages endothéliaux et de dysfonctions d’organes impliquant divers médiateurs de l’inflammation tels que les cytokines, les polynucléaires neutrophiles, les prostaglandines, les leucotriènes, les espèces radicalaires de l’oxygène ou encore le monoxyde d’azote. Les HDL sont une association d’apolipoprotéines, majoritairement l’ApoA1 avec des phospholipides et leur principale fonction est le transport inverse du cholestérol, c’est-à-dire des organes vers le foie. De nombreuses études ont largement décrit une relation inverse entre taux de HDL chez l’homme et l’incidence d’évènements cardiovasculaires tels que le syndrome coronarien ou l’accident vasculaire cérébral, leur conférant ainsi un statut de protecteur cardiovasculaire. En plus de ces propriétés majeures, des études plus récentes ont révélé des effets anti-inflammatoires, anti-apoptotiques, anti-thrombotiques et anti-oxydants des HDL. Au cours du sepsis, plusieurs études fondamentales ou cliniques se sont intéressées à l’interaction entre HDL et les acteurs mis en jeu au cours du sepsis. Par exemple, certains auteurs ont démontré que les HDL ont la capacité de neutraliser le LPS (LipoPolySaccharide) qui est incriminé dans le développement du choc septique. Certains auteurs ont également montré que des peptides mimétiques de l’apoA1 pouvaient prévenir la dysfonction vasculaire et augmenter la survie dans un modèle de choc septique chez le rat. Une étude chez l’homme et chez le cochon a montrée la capacité des nanoparticules HDL mimétiques les CER001®, à réduire l’orage cytokinique associés au sepsis. Cette diminution des taux de cytokines pro-inflammatoire était conjointe à une augmentation de l’élimination du LPS vers la bile ainsi qu’un meilleur taux de survie.

Bénéfices attendus

Ce projet présente un fort potentiel dans la compréhension des mécanismes protecteurs des nanoparticules HDL mimétiques (CER001®) dans le sepsis, d’un point de vue fondamentale : explorer l’impact du sepsis sur la modification des lipoprotéines endogènes, et comprendre comment interviennent les CER001® sur ces modifications. D’un point de vue thérapeutiques elle pourrait fournir des éléments menant à des piste d’amélioration de ces nanoparticules.

Procédures

Toutes les souris subiront toutes une laparatomie, un prélèvement sanguin et seront mise à mort. Les souris des groupes contrôle et traitement subiront en plus la ligature et une ponction du caecum en plus, et développeront un choc spetique avec tous les symptômes associés. La mise à mort interviendra 24h après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Les souris vont subir le protocole CLP qui consiste dans un premier temp en une laparotomie ainsi qu’une ligature et perforation du caecum, ce qui va engendrer une péritonite et tous symptômes caractéristiques d’un choc septique, un état fébrile, une sensation de malaise, de la fièvre, des confusions, des frissons, une hyperventilation, une augmentation du rythme cardiaque etc. Les souris recevront ensuite une injection de CER001® en intraveineuse dans la veine caudale.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort. Les organes, le sang et la bile des souris seront prélévé pour analyses. De l'immunohistofluorescence est prévue sur des coupes d'organes à la recheche des HDL endogènes ainsi que les HDL recombinantes, et des dosages des oxylipines seront réalisé dans le sang et la bile. La mise à mort des animaux est alors nécessaire y compris pour les groupe sham et contrôle.

Remplacement

Le sepsis est un syndrome aigu complexe impliquant tous les organes qu’il est impossible de modéliser in vitro. Il existe plusieurs modèles de sepsis expérimentaux. Néanmoins, le modèle de CLP est un modèle de péritonite dont la physiopathologie se rapproche le plus de celui de l’homme. En effet, ce modèle respecte un certain nombre de conditions similaires à celles chez l’homme, à savoir le timing entre la perforation et la survenue d’un tableau de sepsis ; le caractère pluri-microbien de l’infection à des concentrations élévées et la co-infection bactérienne associant des bactéries Gram négatives, positives et par d'autres organismes tels que les levures. (Rittirsch et al. nature protocole. 2009)

Réduction

Le nombre total d’animaux prévu est de 65 souris C57BL/6J mâle et femelle. Ce chiffre correspond au nombre maximal et a été défini de manière à garantir la robustesse statistique tout en limitant l’utilisation au strict nécessaire. - Souris groupe SHAM + sérum physiologique= les souris vont subir une laparotomie puis seront refermée (n=20, 10 mâles et 10 femelles) nous voulons évaluer la réponse inflammatoire induites par le sepsis, notamment la composante lipidique, il est nécessaire d'être capable de discriminer la petite inflammation induite par la chirurgie de celle induite par la mise en place du sepsis, ce groupe sham fera office de contrôle négatif. - Souris groupe sepsis + sérum physiologique = groupe contrôle : les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de sérum physiologique (n=20, 10 mâles et 10 femelles). - Souris groupe sepsis + HDL recombinantes = les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de HDL recombinantes (n=20, 10 mâles et 10 femelles). Nous utiliserons 5 souris pour entraînement sur le modèle CLP. Un calcul d’effectif a été réalisé pour une comparaison entre deux groupes indépendants par test t bilatéral, avec un seuil α de 0,05 et une puissance de 80 %. En considérant une variabilité attendue de 25 % du critère principal, un effectif de 20 animaux par groupe permet de détecter une différence minimale d’environ 22 % entre les groupes. Cet effectif a donc été retenu pour mettre en évidence un effet biologiquement pertinent tout en limitant l’utilisation d’animaux. Ce nombre a déjà été utilisé dans d'autres études antérieur (Reconstituted High-density Lipoprotein Therapy Improves Survival in Mouse Models of Sepsis) Tanaka et al.

Raffinement

La semaine avant la chirurgie les animaux seront habitués aux conditions expérimentales et à la pièce d'expérimentation afin de diminuer le stress. Dès le début de l’acte chirurgical, l’administration d’un analgésique permettra de prévenir la douleur per et post-opératoire et de faciliter le réveil. Les animaux seront placés dans des cages individuelles sur des plateaux chauffants en post chirurgie. Pendant l’heure qui suit la chirurgie, l’animal sera observé : son comportement, son activité (s’il est isolé, passif), sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), les mouvements qu’il effectue. En cas de signe de souffrance nous augmenterons la dose d’analgésique. Si le traitement ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris représente une espèce validée dans ce modèle de sepsis expérimental. La petite taille des souris permet l’injection de quantités limitées de produits thérapeutiques. Des souris C57BL/6J adultes de 10 semaines seront utilisées, pesant environ 25-30 grammes. La CLP est une procédure de classe sévère et il est nécessaire que les souris soit adulte mais pas trop âgées pour pouvoir supporter la chirurgie.

Jusqu'à trente-six prélèvements sanguins par animal et quatre mois de régime gras à volonté: 664 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent une protéine testée seule ou avec des traitements existants, par injection ou pompe implantée sous anesthésie. Le porteur indique que l'obésité induite peut entraîner des troubles cardiovasculaires et un diabète. Les organes sont prélevés après la mise à mort.

Objectifs

Nous avons découvert une protéine naturellement présente chez les mammifères, dont le rôle principal connu concerne l’organisation du cytosquelette des cellules, notamment dans les muscles et le coeur. Elle participe aussi à certains mécanismes de sécrétion cellulaire, comme la libération d’insuline ou de neuromédiateurs. Il existe une forme circulante de cette protéine dans le sang, mais ses fonctions restent encore mal comprises. Nos travaux, menés dans des modèles murins d’obésité et de diabète, ont montré qu’après chirurgie bariatrique, l’expression de cette protéine est fortement modifiée au niveau intestinal. Par ailleurs, sa concentration sanguine est diminuée chez les patients atteints de diabète de type 2. Nos résultats expérimentaux indiquent que son administration augmente la sécrétion d’insuline de manière dépendante du glucose, améliore la glycémie chez des souris diabétiques, et potentialise l’effet de certaines molécules. L’objectif du projet est donc de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans la régulation de la glycémie et de la sécrétion d’insuline, seule ou en association avec des traitements déjà utilisés dans le diabète, et d’évaluer son intérêt potentiel dans une perspective thérapeutique pour le diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 2 est une maladie chronique en forte progression dans le monde. On estime qu’il touche plus de 500 millions de personnes à l’échelle mondiale et plusieurs millions en France. Sa fréquence augmente avec le vieillissement de la population et la progression de l’obésité. Cette maladie expose à de nombreuses complications graves, notamment cardiovasculaires, rénales, neurologiques et ophtalmologiques. Elle représente un coût sociétal majeur, lié aux soins médicaux, aux hospitalisations, aux traitements au long cours et à la perte de productivité. À l’échelle mondiale, le coût du diabète est estimé à plusieurs centaines de milliards d’euros par an. Sur le plan scientifique, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui régulent la glycémie, en particulier le rôle d’une protéine encore peu étudiée dans ce contexte. Mieux comprendre ces mécanismes est essentiel pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et améliorer les connaissances fondamentales sur la régulation du métabolisme. Pour l’être humain, les résultats attendus pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Si nos résultats confirment son rôle bénéfique sur la sécrétion d’insuline et le contrôle de la glycémie, cette protéine pourrait, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements, seule ou en association avec des médicaments déjà utilisés dans le diabète de type 2. L’objectif final est d’améliorer la prise en charge des patients, de limiter les complications et d’alléger le poids humain et économique de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en gras à volonté pendant la durée du projet, soit 4 mois maximum par prise spontanée. Des challenges métaboliques seront effectués : un test de tolérance au glucose (animal vigile, 3 fois maximum, 2 heures) et un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 3 fois maximum, 2 heures). Chaque test nécessitera une administration (animal vigile, 6 fois maximum sur l'ensemble du projet, quelques secondes). Ces tests nécessiteront aussi des prélèvements sanguins de faible volume répétés (animal vigile, 36 micro prélèvements maximum au total répartis ainsi : 6 sur une journée puis 6 une semaine après et cela répété 3 fois sur la durée du projet, l'acte dure quelques secondes). Pour certains animaux, 4 prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour effectuer un dosage (animal vigile, l’acte dure quelques secondes). Des traitements seront administrés par injection unique (animal vigile, 1 minute) ou par pompe de diffusion (animal vigile, 7 jours ou 28 jours). L’implantation de la pompe sera réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes). Enfin, certains animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, 45 minutes). Enfin, la composition corporelle (taux de gras, de muscle et d'eau) des animaux sera évaluée de manière non invasive (animal vigile, 1 fois par semaine soit 6 fois maximum, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux (4 mois maximum). 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires et du diabète (toute la durée du projet soit 4 mois maximum). 3) Les différentes administrations peuvent induire une douleur, une infection ou une gêne légère de courte durée (1 minute par geste). 4) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures (durée de 2h par test). Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun (6 ou 12h maximum). 5) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux, une infection ainsi qu’un risque d’hématome (quelques secondes par prélèvements). 6) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids (28 jours maximum de délivrance). 7) Les mesures de la composition corporelle peuvent induire un stress léger chez les animaux dû à l'immobilisation nécessaire pour réaliser la mesure (5 minutes). 8) L'anesthésie peut induire une hypothermie et un risque cardiovasculaire (45 minutes maximum). 9) Enfin, les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoires comme des douleurs et une mauvaise cicatrisation (période de surveillance renforcée post-opératoire de 7 jours).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever des organes pour analyses. Ces analyses sont indispensables pour comprendre précisément les effets des traitements étudiés.

Remplacement

Des approches in vitro ont déjà été mises en œuvre en amont du projet, notamment l’étude d’îlots pancréatiques, c’est-à-dire des groupes de cellules du pancréas responsables de la production d’insuline, incubés avec la protéine étudiée afin d’analyser certains mécanismes cellulaires. Ces travaux ont permis d’explorer des effets directs au niveau des cellules. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’évaluer les effets à l’échelle de l’organisme entier, ni d’étudier l’impact d’une chirurgie bariatrique ou d’une administration prolongée de la protéine dans un contexte pathologique complexe comme le diabète de type 2. Les phénomènes étudiés reposent en effet sur des interactions étroites entre plusieurs organes, notamment l’intestin, le pancréas, le foie, le tissu adipeux et le muscle, impliquant des régulations hormonales, nerveuses et circulatoires intégrées. À ce jour, aucun modèle in vitro ou méthode alternative ne permet de reproduire de manière fiable cette régulation systémique. Au regard des connaissances scientifiques actuelles et des objectifs translationnels du projet, le recours au modèle animal ne peut donc pas être remplacé. L’utilisation du modèle murin constitue une étape nécessaire et scientifiquement justifiée pour répondre aux questions posées.

Réduction

Cette étude nécessitera 664 souris maximum. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude tout en prenant en compte les risques liés aux procédures expérimentales. Par ailleurs, plusieurs mesures contribuent à la réduction du nombre d’animaux : 1) Les mêmes animaux pourront être suivis longitudinalement lorsque cela est scientifiquement pertinent, afin d’obtenir plusieurs paramètres sur un même individu. 2) Les données issues d’études préliminaires et de la littérature ont été utilisées pour affiner les hypothèses et éviter des groupes exploratoires inutiles. 3) Les expérimentations in vitro ont été réalisées en amont pour limiter les investigations in vivo aux questions nécessitant impérativement un modèle animal. Ainsi, le nombre d’animaux a été strictement ajusté au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation. Des temps de récupération sont toujours respectés entre les différents actes techniques. Les chirurgies sont toujours réalisées sous analgésie et anesthésie. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie et les yeux sont protégés du désèchement grâce à un gel ophtalmique. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. Elle est largement utilisée dans l’étude de l’obésité et du diabète de type 2 et permet d’obtenir des résultats fiables grâce à l’homogénéité génétique des lignées. De nombreuses données de référence existent dans ce modèle, ce qui facilite l’analyse et la comparaison des résultats. Toutes les techniques nécessaires au projet sont déjà développées et maîtrisées chez la souris. Cette expertise garantit la faisabilité du projet, limite les complications et optimise l’utilisation des animaux. Enfin, les mécanismes de régulation de la glycémie chez la souris sont proches de ceux de l’homme, ce qui confère à ce modèle une forte pertinence dans une perspective translationnelle. Les animaux sont utilisés à partir de 8-10 semaines de vie. Cet âge correspond à l'âge optimal de la maturation métabolique.