Procédures sévères

Le cæcum ligaturé puis perforé au cours d'une chirurgie de 40 minutes, pour déclencher une septicémie, 1 875 souris et 1 875 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent ensuite des substances testées, parfois quotidiennement pendant quatre semaines, et jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine. Le porteur écrit que la douleur opératoire, la prostration, la perte de poids et le choc septique ne sont pas limités dans le temps, peuvent durer tout le projet et restent irréversibles en l'absence de traitement. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, améliorer la santé humaine, quand tous les animaux sont tués pour des analyses in vitro et ex vivo.

Objectifs

La septicémie (ou sepsis) est une maladie grave causée par une infection qui se propage dans tout l’organisme. La réaction du corps devient alors excessive et peut endommager les organes, ce qui peut entraîner la mort. Pour mieux comprendre cette maladie et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire d’étudier comment elle évolue dans l’organisme. Dans ce projet, nous utilisons un modèle expérimental appelé Cecal Ligation and Puncture (CLP). Ce modèle consiste à provoquer une infection contrôlée chez l’animal, permettant de reproduire les principales caractéristiques du sepsis observé chez l’humain. Ce modèle est largement utilisé car il permet d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques dans des conditions proches de celles observées chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’induire une pathologie afin de tester des substances sur ce modèle. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements à cette pathologie. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (première poche du gros intestin, située à la jonction avec l'intestin grêle). La durée de la chirurgie est de 40 minutes/animal. L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement du modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes pendant quatre semaines maximum. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, ou orale. Ces administrations sont de courtes durées (5 minutes maximum). Ces administrations sont réalisées sur les animaux vigiles sauf si ceux-ci présentent un stress, il sera alors possible réaliser une anesthésie gazeuse de courte durée (5 minutes maximum). Des prélèvements sanguins sont possibles en cours d’étude ceux-ci sont de courtes durée, 5 minutes maximum. Il y aura maximum 3 prélèvements sanguins par animal par semaine.

Impact sur les animaux

Le modèle d’induction du sepsis peut générer de la douleur per et post-opératoire lié à l’incision abdominale et à la perforation du caecum, un stress lié à l’anesthésie et à la chirurgie ainsi qu’un ralentissement du transit intestinal. Les signes cliniques peuvent se manifester par une prostration, une diminution de l’activité locomotrice, une perte de poids, une diminution de la prise alimentaire et hydrique ainsi qu’une hypo ou hyperthermie. L’évolution du modèle peut conduire à un état de choc septique et une détresse respiratoire. Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l’absence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses in vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Le modèle induit décrit dans ce projet est caractérisé par des signes cliniques physiques, tel qu’une perte de poids, de la fièvre un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque groupe est composé de 15 animaux maximum. Pour obtenir un effet statistique significatif, nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires. Il y aura environ 10 études par année.

Raffinement

De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. Le poids corporel des animaux sera enregistré une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée supplémentaire par jour peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement, 2 à 3 fois par jour et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) est mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour la chirurgie, une anesthésie générale sera réalisée. Pendant toute la durée de la procédure, les animaux sont placés sur tapis chauffants et endormis par une anesthésie générale fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée en pré-opératoire et en post-opératoire. L’analgésie est adaptée en fonction de l’observation des animaux. L’analgésie pré-opératoire est complétée par une analgésie locale. Le choix de l’anesthésie dépend du produit à tester et des possibles interactions médicamenteuses. Des points limites adaptés seront mis en place.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant des mécanismes biologiques similaires à ceux de l’Homme. Leur génotype est connu. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire ce modèle d'étude. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

3 750 souris et 3 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des cellules tumorales ou des agents cancérogènes, puis des substances testées quotidiennement pendant jusqu'à trois mois, sont hébergés seuls en cage métabolique et mis à jeun, dix d'entre eux subissant en plus une ablation des ovaires. Le porteur décrit des douleurs tumorales, des diarrhées sanglantes dans les modèles de colite et des tumeurs assez volumineuses pour limiter les déplacements, effets pouvant durer jusqu'à la fin de l'étude. Sur le remplacement, il écrit en trois phrases qu'il est "nécessaire" de tester une substance dans un organisme complexe, sans détailler les tests in vitro préalables.

Objectifs

Le projet vise à évaluer l’efficacité de traitements candidats anticancéreux dans des modèles expérimentaux. L’étude repose sur trois approches complémentaires : un modèle de tumeur implantée permettant l’analyse rapide de la réponse tumorale, un modèle de cancérogenèse colique et un modèle de cancérogenèse mammaire. L’objectif principal est d’identifier et de caractériser des composés présentant un potentiel thérapeutique, en analysant leur impact sur la croissance tumorale, l’incidence des tumeurs et leur progression. Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes d’action des traitements anticancéreux et à sélectionner les candidats les plus prometteurs pour un développement ultérieur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de substances candidates dans des modèles précliniques pertinents de cancer chez le rongeur. Ces études sont destinées à contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prise en charge des cancers chez l'Homme. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des administrations de cellules tumorales, d’agents carcinogènes ou de substances testées. Ces administrations seront réalisées en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement du modèle. Ces administrations seront quotidiennes pendant plusieurs semaines, avec une durée maximale de trois mois. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intranasale ou orale. Ces administrations sont de courte durée (2 minutes maximum) et sont réalisées sur animaux vigiles, sauf si un stress est observé, auquel cas une anesthésie gazeuse de courte durée peut être utilisée (5 à 10 minutes maximum). Dans les modèles de cancer mammaire et cancer colorectal, les animaux seront soumis à une administration d’un agent carcinogène suivie de cycles d’induction chimique. L’administration de l’agent carcinogène est réalisée une seule fois (2 minutes maximum). Les cycles d’induction sont réalisés via l’eau de boisson pendant des périodes de 5 à 7 jours. Une intervention chirurgicale (ovariectomie) sera réalisée une seule fois chez un groupe composé au maximum de 10 animaux. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La durée de la chirurgie est de 15 à 30 minutes par animal. Les animaux seront hébergés individuellement en cage métabolique afin de permettre la collecte des urines et des fèces. Cet hébergement implique un isolement des congénères et pourra être associé à une mise à jeun lorsque celle-ci est requise par le protocole expérimental, pour une durée de 4 à 24 heures maximum. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez l'ensemble des animaux en cours d'étude ou en fin de procédure afin d'évaluer les paramètres biologiques nécessaires à l'atteinte des objectifs scientifiques de l'étude (par exemple : suivi de l'activité de la substance test, dosage de biomarqueurs ou paramètres biochimiques). Ces prélèvements sont de courte durée (5 à 10 minutes maximum) et réalisés sous anesthésie si besoin. En fin d'étude, tous les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Sous anesthésie, les prélèvements et interventions nécessaires à l'obtention des échantillons biologiques requis pour les objectifs de l'étude seront réalisés, puis les animaux seront mis à mort sans réveil. Cette intervention dure au maximum 10 à 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux et inflammatoires peuvent générer une douleur liée au développement des tumeurs ou à l’inflammation induite, ainsi qu’un stress lié aux administrations répétées et aux manipulations. Les administrations de substances peuvent également entraîner des réactions locales au point d’injection (rougeur, irritation, inflammation). Les signes cliniques peuvent se manifester par une diminution de l’activité locomotrice, une perte de poids, une diminution de la prise alimentaire et hydrique, une altération de l’état général, ainsi que des modifications du pelage. Dans les modèles de colite, des diarrhées, parfois associées à la présence de sang, peuvent être observées. Le développement tumoral peut entraîner une gêne fonctionnelle en fonction de la localisation et de la taille des masses, pouvant aller jusqu’à une limitation des déplacements. Les interventions chirurgicales peuvent induire une douleur post-opératoire ainsi qu’un stress lié à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Ces effets peuvent apparaître progressivement au cours de l’étude et durer plusieurs jours à plusieurs semaines, voire jusqu’à la fin du projet. Une partie de ces effets est réversible avec l’arrêt des procédures ou avec la mise en place de traitements adaptés.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses biologiques/biochimiques qui permettront d’atteindre les objectifs du projet.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque groupe est composé de 10 animaux au maximum, conformément aux pratiques couramment décrites dans les modèles tumoraux précliniques et aux données historiques internes. Pour obtenir un effet statistique significatif, nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Certains modes d’administration des substances nécessiteront la mise en place d’une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière sera réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) sera mis en place chez les animaux présentant des signes cliniques susceptibles d'affecter leur mobilité ou leur état général, afin de renforcer le suivi du bien-être animal. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement sera réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites. Pour la chirurgie, une anesthésie générale sera réalisée. Pendant toute la durée de la procédure, les animaux sont placés sur des tapis chauffants et endormis par une anesthésie générale fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée en pré-opératoire et en post-opératoire. L’analgésie est adaptée en fonction de l’observation des animaux. L’analgésie pré-opératoire est complétée par une analgésie locale. Le choix de l’anesthésie dépend du produit à tester et des possibles interactions médicamenteuses. Des points limites adaptés seront mis en place.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un des mécanismes biologiques similaires à ceux de l’Homme. Leur génotype est connu. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire ce modèle d'étude. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

2 998 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont gavées trois fois à une semaine d'intervalle avec des salmonelles atténuées, puis une fois avec la souche sauvage, reçoivent des injections intrapéritonéales de bioparticules et des prises de sang, dont certaines par ponction rétro-orbitaire. Une partie voit ses pattes arrière irradiées sous kétamine et xylazine, le reste du corps protégé par un écran de plomb, avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur prévoit perte de poids, pelage hirsute, yeux larmoyants, posture voûtée, prostration et anorexie, et note qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable.

Objectifs

Salmonella enterica est une bactérie intracellulaire qui infecte les humains et les animaux et constitue une menace majeure pour la santé publique, étant l’une des principales causes de maladies d’origine alimentaire dans le monde. De la gastro-entérite auto-limitée à la bactériémie mortelle, chaque année elles touchent plus d’un milliard de personnes. L’augmentation des résistances aux antibiotiques souligne le besoin urgent de nouvelles stratégies, notamment de vaccins, dont il n’existe actuellement aucun pour les souches non typhiques. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules immunitaires innées reconnues pour leur rôle dans les réponses antivirales. Cependant, leur contribution à la défense contre les bactéries a été sous-estimée et reste peu comprise. Nos travaux récents montrent que Salmonella peut activer ces cellules et induire une inflammation. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin pour comprendre comment ces cellules contribuent à la défense contre Salmonella et comment elles peuvent participer à la réponse immunitaire après vaccination. Nous déterminerons d’abord leur fréquence, leur activation et leur statut métabolique lors de l’infection. Ensuite, nous évaluerons le rôle des pDC dans les réponses antibactériennes in vivo, présentant un déficit sélectif de ces cellules, ainsi que l’importance de certains récepteurs pour cette réponse. Nous utiliserons également deux plateformes vaccinales afin de comparer comment les pDC contribuent à l’immunité protectrice selon différents modes d’activation immunitaire, depuis la stimulation induite par le pathogène jusqu’à la délivrance d’antigènes via des micro-technologies.

Bénéfices attendus

Les infections bactériennes chroniques représentent un fardeau majeur pour la santé publique, avec des niveaux élevés de morbidité et de mortalité, ainsi que des impacts économiques et sociaux importants. L’absence de vaccins efficaces et la dépendance actuelle aux antibiotiques rendent le contrôle de ces maladies particulièrement difficile. Le développement de stratégies visant à stimuler la réponse immunitaire de l’hôte constitue une approche prometteuse pour améliorer la protection contre les infections, comme la salmonellose, tout en réduisant les effets secondaires et la durée des traitements antibiotiques. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux mécanismes et cibles pour développer des stratégies alternatives renforçant l’immunité contre les bactéries intracellulaires, avec pour objectif ultime de réduire l’infection et d’améliorer la santé publique. Salmonella sera utilisé comme pathogène modèle, avec la possibilité d’étendre cette approche à d’autres bactéries intracellulaires d’intérêt médical. Ces travaux ont des implications thérapeutiques importantes, notamment face à la hausse des souches bactériennes multirésistantes. En outre, considérant la salmonellose comme une maladie zoonotique, les résultats pourraient également être pertinents pour la médecine vétérinaire, s’inscrivant dans le concept One Health qui favorise une approche intégrée de la santé humaine et animale pour une meilleure prévention et prise en charge des maladies. Enfin, l’analyse fonctionnelle et phénotypique des pDC lors d’infections bactériennes intracellulaires est encore très limitée. Ce projet sera l’une des premières études à explorer le rôle des pDC murines au cours d’une infection bactérienne intestinale, avec un objectif mécanistique clair.

Procédures

Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris sera effectué avec les salmonelles selon le schéma expérimental suivant : pour l’immunisation avec les salmonelles atténuées, l’administration sera réalisée trois fois, à une semaine d’intervalle, tandis que le challenge avec la souche sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles. Les gavages seront pratiqués sur souris vigiles pour maintenir le réflexe de déglutition 2- L’injection intrapéritonéale des biopuces (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles. 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées, juste avant mise à mort, sur des animaux anesthésiés sous gaz (isoflurane). 4- Pour certains expériences, les pattes arrière des souris dépourvues de pDC sont irradiées, tandis que le reste du corps est protégé par un écran en plomb (« shield »). Les souris « shield » sont préalablement anesthésiées sous kétamine et xylazine afin d’éviter tout mouvement pendant l’irradiation. Une fois l’irradiation terminée, les souris sont immédiatement reconstituées par injection intraveineuse avec les cellules de moelle osseuse du donneur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies sous gaz nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Le procédé de génération de chimères de moelle osseuse est considéré comme présentant un niveau de douleur léger. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure et les tissus d’intérêt seront prélevés en vue d’analyses immunologiques (cytométrie en flux, mesure des cytokines et des anticorps), moléculaires (séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq)) et microbiologiques (charge bactérienne).

Remplacement

Des expériences in vitro utilisant des cellules immunitaires primaires sont systématiquement réalisées afin d’évaluer les mécanismes d’activation des pDC, ainsi que la cytotoxicité, l’activation cellulaire et les doses optimales des biopuces ICARO. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cependant, l’évaluation de l’efficacité protectrice et des corrélats immunitaires de cette stratégie vaccinale innovante, ainsi que l’étude de la dynamique des réponses des pDC lors d’une infection par Salmonella, nécessite l’utilisation d’un modèle murin entier, reproduisant fidèlement l’infection systémique et l’immunité de l’hôte observées chez l’homme (recherche préclinique). Des expériences in vitro supplémentaires avec des pDC humaines et des lignées cellulaires sont également développées au sein de notre équipe afin d’étudier la biologie des pDC et les mécanismes sous-jacents, ce qui réduira drastiquement le nombre de souris nécessaires dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Par exemple, chaque souris permet l’analyse de différents organes (par exemple : plaques de Peyer, lamina propria, ganglions lymphatiques mésentériques, rate, foie), maximisant ainsi les informations obtenues. De plus, Les procédures correspondant à l'étude des mécanismes moléculaires (génération de souris chimères SBMC et analyse de l'effet de la délétion de gènes candidats dans les pDC) ne sera réalisée que si les résultats des étapes précédentes sont positifs, pour l’analyse du rôle des pDC au cours de l’infection par Salmonella et lors des réponses immunitaires induites par un vaccin vivant atténué ou par des biopuces, évitant ainsi l’utilisation inutile d’animaux. L’utilisation de souris de fond génétique pur réduit la variabilité interindividuelle et permet de constituer des groupes expérimentaux de taille réduite comparé à des fonds génétiques mixtes. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut le regroupement d’échantillons pour les analyses transcriptomiques ainsi que la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.

Raffinement

Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Le score de souffrance animale sera calculé à l’aide d’une grille de scoring, en fonction des points limites des 4 catégories suivantes : apparence générale (absence de toilettage, poils hirsutes, dos rond, yeux mi-clos), prise alimentaire et poids corporel, détection de signes cliniques (difficulté respiratoire plus ou moins importante) et comportement général (mouvements ralentis, isolement, atonie, prostration). Les points limites ont été définis dans chaque procédure. De la nourriture en pâte sera aussi fournie directement dans la cage pour aider à l'alimentation des animaux affaiblis. Suivant les cas des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA et le vétérinaire référent. Tout le personnel impliqué sera formé et autorisé à la manipulation des animaux ainsi qu’au suivi de leur bien-être. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés préalablement caractérisés constitue une approche pertinente pour affiner les études animales, car elle permet d’éviter l’utilisation de médicaments destinés à bloquer un processus biologique susceptible d’entraîner des effets secondaires imprévus.

Choix des espèces

En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, le recours à un modèle organisme est indispensable pour approfondir nos connaissances des réponses des pDC. Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour évaluer le rôle fonctionnel des cellules immunitaires in vivo et leur impact sur l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet également d’étudier les réponses immunitaires spécifiques aux antigènes bactériens et modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d’analyser précisément les populations immunitaires et leur état d’activation, grâce au grand nombre d’anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge, les souris seront utilisés à l'âge adulte entre 6 et 8 semaines. Cet âge est suffisant pour que le système immunitaire soit mature et que les animaux soient de taille suffisamment grand pour faciliter les manipulations requises pour la procédure.

Rendues neutropéniques par deux injections intrapéritonéales, puis infectées par une bactérie multirésistante déposée dans leur nez sous anesthésie, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux heures après l'infection, elles passent dix à vingt minutes dans un nébuliseur, maintenues dans un tube de contention, pour recevoir l'un des deux peptides testés, la colistine ou du solvant. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de mesurer la charge bactérienne dans leur sang et leurs poumons. Le projet est classé en gravité sévère, mais le RNT décrit ces mêmes procédures comme entraînant des "nuisances modérées", une gêne "transitoire" et des douleurs "légères".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de deux nouveaux peptides administrés par nébulisation dans un modèle murin d’infection pulmonaire aiguë à Acinetobacter baumannii, en comparaison avec la colistine, antibiotique de référence utilisé dans le traitement des infections à bactéries multirésistantes. Acinetobacter baumannii est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients immunodéprimés ou hospitalisés en soins intensifs. L’augmentation des résistances aux antibiotiques rend nécessaire le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise à déterminer si les peptides testés permettent de réduire la charge bactérienne pulmonaire et systémique après infection pulmonaire chez la souris neutropénique.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances sur l’efficacité de nouveaux peptides antimicrobiens administrés par voie inhalée dans le traitement des infections pulmonaires bactériennes. Ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles alternatives thérapeutiques contre les infections à Acinetobacter baumannii, notamment dans un contexte de résistance croissante aux antibiotiques conventionnels. L’administration par nébulisation présente également un intérêt potentiel pour cibler directement le site de l’infection pulmonaire, limiter l’exposition systémique et réduire les effets indésirables associés aux traitements antibiotiques classiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales non chirurgicales au cours de l’étude. - Induction de l’immunosuppressiona neutropénie : 2 injections intra-péritonéale de 10 secondes - Une administration intranasale unique de la suspension bactérienne. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie légère àgazeuse l’isoflurane afin de limiter le stress et d’assurer une administration correcte de l’inoculum. La durée de la procédure sera d’environ de 5 à 10 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique et la récupération immédiate. - Deux heures après l’infection, une administration unique du traitement expérimental (peptides, colistine ou PBS) sera réalisée par nébulisation. La durée de l’exposition à la nébulisation sera d’environ 10 à 20 minutes selon les paramètres techniques utilisés pour l’aérosolisation, incluant la phase de préparation des animaux dans le nébuliseur, l’administration du composé et la récupération de l’animal. - Une anesthésie fixe par voie IP de 10 secondes - Un prélèvement intra cardiaque sous anesthésie fixe d’environ 1 minute et mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’entraîner des nuisances modérées : • Induction de neutropénie pouvant entraîner une fragilité immunitaire transitoire, l’administration peut provoquer une douleur légère transitoire au site d’injection. • Administration intranasale de la suspension bactérienne sous anesthésie • Développement d’une infection pulmonaire aiguë pouvant provoquer une altération de l’état général, une diminution de l’activité ou une gêne respiratoire ; surtout dans la phase pilote, ces effets ne sont pas recherchés pour la phase d’efficacité • Administration des traitements par nébulisation pourra provoquer une gène transitoire car la souris sera dans un tube de contention souple le temps de l’administration. • Prélèvements terminaux sanguins sous anesthésie pouvant provoquer une douleur légère au site d’injection

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans le sang et dans les poumons.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire dans ce projet car les interactions complexes entre l’hôte, le pathogène et le traitement administré par voie inhalée ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite notamment l’étude de la diffusion pulmonaire des composés, de la réponse à l’infection bactérienne et de la dissémination systémique, qui dépendent d’un organisme vivant entier. Toutefois, les données disponibles issues d’études préalables in vitro sur l’activité antibactérienne des peptides ont permis de sélectionner les candidats les plus pertinents avant le recours au modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été limité au minimum nécessaire permettant d’obtenir des résultats scientifiquement exploitables et statistiquement interprétables. Les effectifs ont été définis sur la base de l’expérience acquise avec ce type de modèle infectieux et du nombre de groupes nécessaires à la comparaison des traitements expérimentaux avec les groupes contrôle. Une phase pilote restreinte permettra d’optimiser l’inoculum bactérien avant l’étude principale, afin d’éviter la répétition d’expériences inutiles.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux par cage de 10 avec des frisottis ou des jeux et avec une surveillance quotidienne renforcée durant les phases critiques de l’étude. L’état clinique sera suivi régulièrement afin d’identifier précocement tout signe de souffrance. Des points limites seront appliqués et tout animal présentant une altération sévère de l’état général sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne en particulier dans les modèles d’infection pulmonaire déjà développés au sein du laboratoire. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 30-35g (même poids que pour les précédentes études).

7 720 souris et 2 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est provoquée chez chaque animal, avec perte de poids puis diarrhées et baisse d'activité, avant d'appliquer une lumière UV dans le colon, d'injecter des leurres apoptotiques synthétiques ou d'administrer des nanovecteurs. Aucun analgésique ne leur est donné, le porteur indiquant que les anti-inflammatoires modifieraient la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire étudiés. Les animaux dont le score clinique passe en sévère sortent de l'étude et sont mis à mort, une quantité importante de sang étant prélevée sur les autres au moment de leur propre mise à mort.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent un nombre croissant de patients en France et dans le monde. Elles ont un impact important sur la qualité de vie tant sur le plan physique que psychologique et social. L’apparition des MICI chez l’Homme est très souvent due à une dérégulation du système immunitaire. Lors d’une agression pathogène physique ou chimique, une inflammation va se créer au niveau de l’intestin. Dans certain cas, cette inflammation va persister et ainsi provoquer une inflammation chronique. L'objectif de ce projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ayant déjà montré un intérêt après évaluation dans des modèles simplifiés in vitro. Une première approche consiste à appliquer une lumière UV in situ au niveau de la lésion du colon. Cette exposition va permettre d’induire une mort cellulaire programmée, nommée apoptose, de certaines cellules sur le site de l’inflammation et ainsi de ré-engager la résolution de l’inflammation ainsi que la réparation tissulaire. Des premiers résultats encourageants montrent une amélioration du score clinique des animaux après traitement. Il est donc essentiel de continuer ces travaux pour comprendre afin d’améliorer, et rendre cette thérapie accessible aux patients. La deuxième approche consiste à appliquer des particules imitant les cellules en mort programmée pour ré-engager la résolution et la réparation tissulaire. Pour cela différentes formulations des leurres apoptotiques synthétiques devront être testées afin de se rapprocher au mieux de la cellule apoptotique physiologique. La troisième partie est orientée sur la formulation de substances actives pour en améliorer leur efficacité et leur tolérance. Pour cela, différents nanovecteurs seront développées afin de renforcer l’activité de l’actif thérapeutique par le biais d’un meilleur ciblage de la lésion inflammatoire permettant ainsi de pouvoir administrer des médicaments.

Bénéfices attendus

Les MICI touchent un nombre croissant de patient en France (+ de 300000 patients) et dans le monde. Aujourd’hui des traitements symptomatiques efficaces existent : anti-inflammatoires, corticoïdes, biothérapies. Malgré tout cet arsenal, 50% des patients doivent subir une chirurgie lourde à 10 ans. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour palier à ces pathologies. Dans ce projet, nous développons des thérapies qui visent, les symptômes de la maladie tout en en réduisant les effets secondaires, mais aussi les causes en venant moduler et rééduquer le système immunitaire. A échéance courte, ce projet permettra de proposer de nouvelles formes médicamenteuses spécifiques de ces maladies et apportera des connaissances cruciales quant aux mécanismes cellulaires et immunologiques responsables de la pathologie. Cela permettra de promouvoir de nouvelles stratégies thérapeutiques accessibles aux patients à plus long terme. De plus, ces traitements, que nous évaluons dans ces modèles de MICI, ne sont pas spécifiques de ces pathologies mais pourront ensuite être testés et adaptés à une grande majorité des maladies inflammatoires chroniques tels que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque…

Procédures

Les traitements seront administrés sous anesthésie. Pharmacocinétique : les prélèvements de sang se feront au niveau de la veine caudale grâce à un catheter.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les animaux vont développer différentes formes des maladies chroniques de l’intestin. Ces pathologies sont caractérisées et évaluées sur différents critères relevant des nuisances causées aux animaux. Un des premiers signes est la perte de poids. Ensuite apparaissent des diarrhées. L’activité des animaux va alors être impactée. Ces nuisances apparaissent généralement quelques jours après le début de l’induction.

Devenir

Une quantité impotante de sang sera prélévé au moment de la mise à mort et différents organes seront prélevés pour évaluer l'efficacité des traitements. Des analyses de biodistribution seront réalisées.

Remplacement

Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans les pathologies inflammatoires chroniques. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire ou celle des barrières épithéliales avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de détecter une différence de 20-30% sur les scores clinique, histologique et marquers de l'inflammation avec une puissance statistique de 80% et un risque alpha de 0,05 soit des des groupes de 6-10 individus pour les souris et 5-8 pour les rats. Ces paramètres ont été consolidés par le passé grâce à nos expériences réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages stériles pour les études impliquant une action directe sur le système immunitaire afin de ne pas entrainer de biais sur les expériences. Pour les études concernant la formulation d’actifs thérapeutiques, elles seront réalisées dans des cages non stériles. L’intensité de la pathologie est contrôlée lors de l’induction afin de ne pas induire une pathologie trop intense avec une trop grande souffrance des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. En cas de score estimé sévère sur l’état général de l’évaluation clinique, les animaux seront exclus de l’étude et mis à mort car l’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas envisageable en raison de la pathologie inflammatoire induite et des modifications induites sur la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire par les analgésiques. En cas de réduction d’activité, les animaux recevront de la nourriture et/ou de l’eau sous une forme plus accessible dans la cage.

Choix des espèces

La souris ainsi que le rat présentent un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Souris agées de 3 à 8 semaines seront utilisées Rats agés de 5-6 semaines

Placées dans un caisson hyperbare jusqu'à des pressions de 5 ou 6 atmosphères d'oxygène pur pendant deux heures au maximum, 156 souris vont subir des crises convulsives, dans des procédures classées au niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang et des tissus. Trois groupes reçoivent en plus une injection intrapéritonéale quotidienne pendant cinq jours, et l'ensemble des animaux passe par un prélèvement sanguin au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur classe le déclenchement de la crise convulsive en "gravité légère ?", point d'interrogation compris, en avançant que "l'expérience humaine nous apprend qu'elles sont indolores", alors que le projet entier est déclaré en gravité sévère. La finalité est militaire, permettre aux nageurs de combat de l'armée française de plonger à l'oxygène pur sans compromettre leur mission.

Objectifs

Dans le cadre de ses opérations, l’armée française demande à ses nageurs de combat d’effectuer des plongées à l’oxygène pur, or ce gaz lorsque respiré à une pression supérieure à 1.7 atmosphère peut provoquer des crises hyperoxiques susceptibles de compromettre la mission et faisant courir un risque de noyade au plongeur. Les effets neurologiques de l’oxygène hyperbare sont connus depuis la fin du XIX siècle et les travaux de Paul Bert ; ils se traduisent par l’apparition de convulsions similaires à celles observées lors de crises épileptiques. Ces crises, indolores, se résolvent rapidement si la pression d’oxygène est réduite. Elles ont été caractérisées chez l’homme et l’animal (sans que le mécanisme en soit clairement identifié) mais la question de l’acclimatement à de fortes pressions d’oxygène reste non étudiée. L‘hypothèse d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare a été suggérée dans quelques articles scientifiques sans qu’aucune étude n’ait encore permis de le confirmer. Si elle s’avérait fondée, elle pourrait constituer une avancée pour améliorer la sécurité des nageurs de combat. La présente étude a pour objectif de déterminer, chez la souris : 1- si un acclimatement à l’oxygène hyperbare est possible et 2- d’étudier les mécanismes physiologiques à l’origine des crises hyperoxiques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de vérifier l’existence d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la crise hyperoxique. Ces travaux pourront être bénéfiques pour les forces armées françaises dans le cadre opérationnel de la plongée à l’oxygène pur. Il aura aussi un intérêt en santé humaine dans le cadre de l’oxygénothérapie hyperbare utilisée en clinique humaine. L’oxygénothérapie hyperbare consiste à faire respirer de l’oxygène pur à un patient placé dans une chambre où la pression est supérieure à celle atmosphérique normale (généralement entre 2 et 3 ATA). Dans ces conditions, il existe un risque de déclenchement de crise hyperoxique chez le patient, or l’oxygénothérapie hyperbare est indiquée dans de nombreuses pathologies (intoxication au monoxyde de carbone, gangrène gazeuse, infections nécrosantes des tissus mous, ulcères et plaies rebêles à la cicatrisation, surdité idiopathique, prise de lambeaux de greffe …). Une meilleure compréhension du déclenchement de la crise hyperoxique permettrait une meilleure prise en charge de ces patients.

Procédures

Les souris seront contentionnées une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Dans le cadre de la procédure 2, deux semaines après, ils seront acclimatés à l’oxygène en étant placés dans le caisson hyperbare pour des durées de 30 à 110 minutes à des pressions partielles d’oxygène comprises entre 0.21 et 3.5 atmosphères selon les groupes expérimentaux. Dans le cadre de la procédure 4, trois groupes d’animaux seront injecté quotidiennement sur une période de 5 jours par voie intrapéritonéale (1 à 2 min). Les groupes de souris seront soumis à une plongée simulée en oxygène pur jusqu’à des pressions de 5 ou 6 atmosphères, pour une durée maximale de 120 minutes.

Impact sur les animaux

nces ou effets indésirables attendus sur les animaux Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée), (2) : le stress lié à la réalisation des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 1-2 minutes, réalisé 1 fois sur l’ensemble du projet à l’âge de 10 semaines) (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée simulée (acte de gravité légère, d’une durée totale maximale de 2h30 correspondant au temps de l’exposition hyperbare) (4) : le stress induit par le déclenchement d’une crise convulsive (gravité légère ? ces nuisances très brèves, moins de 1 minute, et l’expérience humaine nous apprend qu’elles sont indolores).

Devenir

Les 156 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des effets de fortes pressions partielles de gaz. Le manque de connaissances sur les mécanismes à l’origine de la crise hyperoxique et l’absence de marqueurs prédictifs de ces crises ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé en s’appuyant sur les données disponibles dans la littérature. Les effectifs de chaque groupe correspondent ainsi au nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Tout au long des procédures, le remplissage quotidien d’une grille de score et l’identification de points limites prédictifs et spécifiques au projet permettront de satisfaire au bien-être de l’animal. Toute la procédure expérimentale sera réalisée par des personnes formées et habituées à travailler sur des protocoles de plongée simulée chez la souris. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une grille de score adaptée. Le protocole utilisé limite au maximum la durée des crises hyperoxiques en décomprimant les animaux rapidement.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour l’étude des effets de l’oxygène hyperbare. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, nous permettant de cibler les pressions et temps d’exposition et ainsi de réduire le nombre de groupes utilisés. Nous possédons en outre des données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ces résultats. Le contexte de cette étude est le maintien opérationnel des nageurs de combat en condition de plongée à l’oxygène pur. Les plongeurs concernés sont de jeunes adultes. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.