Procédures sévères
TOLPREG : Etude de tolérance chez la ratte gestante.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
15 000 rattes gestantes vont être utilisées, chacune gavée quotidiennement pendant seize jours de gestation, avec jusqu'à six microprélèvements sanguins en 24 heures puis un prélèvement pouvant atteindre 15 % de son volume sanguin total. Les substances testées ne l'ont jamais été sur des animaux gestants, à des doses montant jusqu'à 1 000 mg/kg/jour, et le porteur prévient que les effets toxiques attendus sur les mères peuvent être sévères, avec convulsions, prostration, tremblements et pertes de poids. Sur ces 15 000 rattes, 800 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 800 d'un niveau modéré et 13 400 d'un niveau léger. Toutes sont tuées au vingt et unième jour de gestation pour prélèvement des organes et des fœtus, et les fœtus vivants sont tués aussi, le RNT indiquant qu'ils ne pourraient pas survivre sans leur mère.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir les toutes premières informations in vivo sur le potentiel embryo-foeto-toxique d’une substance chimique au début de son développement, afin de : - Sélectionner au sein d’une famille chimique les molécules les moins risquées. - Identifier et abandonner rapidement les molécules à potentiel embryo-foeto-toxique pour éviter des tests inutiles à plus grande échelle. - Définir la dose maximale tolérée par la femelle gestante et sa progéniture afin de réaliser les études suivantes (études préliminaires et définitives) sans causer de souffrance excessive aux animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet dont le design est basé sur les lignes directrices des études qui seront réalisées par la suite lors du développement du produit mais sont allégées et utilisent un nombre inférieur d’animaux par groupe, permet de sélectionner au sein d’une famille chimique une molécule d’intérêt et de déterminer la dose maximale tolérée par la ratte gestante. Cette étude très précoce permet de mettre en évidence avec une procédure allégée le profil embryo-foeto-toxique du produit afin de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes de toxicité sur la reproduction et le développement et ainsi éviter des études plus importantes avec plus d'animaux.
Procédures
Les femelles gestantes vigiles seront gavées journalièrement à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille et âge, pendant maximum 16 jours (généralement du jour 6 au jour 20 ou 21 de la gestation). Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes. Durant la fin de la période de gestation (entre GD17 et GD21), des prélèvements sanguins, pourront être réalisés sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique. Chaque femelle pourra faire l’objet d’un maximum de six micro-prélèvements sanguins (50 µL chacun) en 24h. Un prélèvement sanguin plus important, correspondant à un volume maximal de 15 % du volume sanguin total, pourra être réalisé au jour 20 ou 21 de la gestation. Tous ces prélèvements de sang seront réalisés sur une période d’une durée inférieure à 2 minutes. Pour les prélèvements d’organes et de fœtus, les femelles sont mises à mort (jour 21 de la gestation). Par la suite, les fœtus sont endormis puis à mort pour les examens ultérieurs.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des femelles gestantes. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h sur animaux vigiles par ponction à la veine saphène. Des prélèvements peuvent aussi être faits en fin de gestation après anesthésie par ponction à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Les effets toxiques attendus sur les femelles gestantes peuvent être sévères car les molécules n’ont jamais été testées au préalable sur des animaux gestants et aux doses choisies (maximum requis par la législation 1000 mg/kg/jour). Les signes de toxicité pouvant apparaître en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, convulsion, prostration, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblements ou impact sur la température corporelle.
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la gestation et le développement des fœtus, toutes les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvements d’organes et de fœtus. Les fœtus vivants sont également mis à mort car même s’ils sont viables ils ne pourraient pas survivre sans leur mère.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude sur le modèle animal, de nombreux essais in vitro (C. Elegans reprotox assay, Cell line compendium, devTox quick Predict assay, Reprotracker) ou in silico sont utilisés pour prédire le potentiel embryo-foeto-toxiques d’une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, conduisant ou pas à l’induction d’effets embryo-foeto-toxiques, ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. Différents paramètres doivent donc être mesurés chez l’animal. L’étude décrite dans ce projet sert à préparer la réalisation de l’étude préliminaire de choix de doses et l’étude règlementaire de toxicologie du développement, indispensable à l’homologation de substances.
Réduction
Ce projet est réalisé dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux basé sur l’expérience du laboratoire: 4 femelles accouplées par groupe, en comparaison 8 femelles gestantes par groupe sont utilisées dans les études préliminaires de choix de doses. Plusieurs substances sont testées au sein d’une même étude afin de n’avoir qu’un seul groupe témoin et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif reste également de ne tester chez l’animal que des molécules sélectionnées comme non dangereuses par des méthodes alternatives et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le processus de recherche et développement. Cette étude n’est réalisée que sur certains types de molécules, en fonction des effets embryo-foeto toxiques connus ou suspectés de la famille chimique. Si la substance testée montre une capacité à induire de la mortalité intra utérine et/ou des malformations chez le fœtus, le développement de la substance est immédiatement suspendu afin de ne pas réaliser les études préliminaires de choix de doses et les études réglementaires réalisées avec plus de 20 femelles gestantes par groupe.
Raffinement
Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux femelles rattes gestantes (matériel de nidifcation), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Les femelles gestantes sont observées quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière le 1er jour de traitement (au moins 4 observations dans la journée). Elles sont pesées à intervalles réguliers pendant la gestation pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptés aux femelles gestantes seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort les femelles gestantes sont déplacées dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de sa courte durée de gestation, de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisies (Rat Wistar). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des jeunes rattes accouplées (âgées de 8-12 semaines au début de l’étude) seront utilisées dans ce projet comme dans les futures études de toxicologie du développement conformément aux recommandations des guidelines internationales (OECD 414). Ces études visent à étudier le potentiel toxique d’une substance sur le développement et seront réalisées pendant la gestation puisque l’objet de l’étude porte sur le développement de l’embryon et du fœtus lors d’une exposition in utero.
Gestion de la production d’animaux génétiquement modifiés pour l’étude des myopathies associées aux mutations STAC3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Nées avec une hypotonie, atteintes d'une faiblesse musculaire qui s'aggrave, exposées à un risque de mort peu après la naissance, les souris porteuses de deux copies altérées du gène STAC3 font partie des 840 souris de ce projet d'élevage, classé au niveau de souffrance sévère. Les interventions se limitent à la reproduction, huit couples par an et par lignée, six portées au maximum par femelle avant qu'elle ne soit tuée par dislocation cervicale ou réaffectée à un projet de phénotypage. Les souris entièrement privées de la protéine peuvent devenir paralysées et présenter des difficultés respiratoires, et un stress suffit à déclencher chez les mutantes une réaction dangereuse à la chaleur. Le tri des excédents intervient à trois semaines, dès le génotype connu, les animaux jugés inutiles étant tués et les autres transférés vers une autre autorisation où le phénotypage invasif est prévu.
Objectifs
Ce projet a pour objet le maintien, la reproduction contrôlée et la surveillance des lignées murines génétiquement modifiées, dont certains génotypes peuvent développer un phénotype musculaire sévère incluant une faiblesse marquée, une altération du couplage excitation-contraction et une atteinte histologique du muscle squelettique. La surveillance et la gestion de ces animaux à phénotype dommageable relèvent du cadre réglementaire de l’expérimentation animale. Ce projet garanti la disponibilité d’animaux reproducteurs porteurs des allèles d’intérêt pour les projets de recherche et de phénotypage rattachés à d’autres DAP.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet de maintien de lignée sont multiples. Il permet tout d’abord de préserver des modèles murins uniques dont la génération a été longue et complexe, évitant ainsi de devoir les régénérer et de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Ce maintien garantit également une disponibilité continue de reproducteurs et de descendants pour les projets de phénotypage et de recherche thérapeutique, ce qui assure la continuité et la planification des études sur les myopathies associées à ce gène. En optimisant les schémas de croisement et en limitant la production d’animaux excédentaires, le projet contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en améliorant la qualité et la reproductibilité des données obtenues. Enfin, ces modèles sont essentiels pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies rares et développer des stratégies thérapeutiques innovantes, tout en permettant le partage avec la communauté scientifique et en évitant la duplication de la génération de modèles.
Procédures
Les souris de cette lignée ne subissent que des interventions liées à la reproduction : mise en cohabitation contrôlée (à partir de 7 semaines d’âge, environ 8 couples maximum par an et par lignée, maximum 6 mois par femelle) et surveillance quotidienne rapide des portées (moins de 5 minutes par cage). Absence d’interventions invasives. Aucune opération chirurgicale, aucun prélèvement ni manipulation invasive n’est pratiqué. Les animaux utilisés pour la reproduction sont ensuite réaffectés à une autre autorisation d’expérimentation distincte. Les signes de la maladie (faiblesse musculaire sévère, difficultés respiratoires, posture anormale) apparaissent spontanément chez les souriceaux porteurs de deux copies altérées du gène de la souche de souris génétiquement modifiée modélisant la myopathie humaine dès la phase néonatale, juste après la naissance. Cela survient aussi chez les souris complètement absentes de la protéine ciblée.
Impact sur les animaux
1. Souris porteuses de la mutation responsable de la maladie humaine: Ces souris reproduisent les symptômes observés chez les patients atteints de la myopathie : elles naissent avec une hypotonie, développent une faiblesse musculaire qui s'aggrave progressivement, et peuvent présenter un retard de croissance avec perte de poids. On observe également des signes de mal-être général comme une prostration, des tremblements et une diminution des mouvements. Sous l'effet d'un stress, ces souris peuvent développer une réaction dangereuse à la chaleur. Un risque de décès peu après la naissance est possible. 2. Souris totalement privées de la protéine étudiée: Chez ces souris, l'absence complète de la protéine empêche le muscle de recevoir correctement l'ordre de se contracter envoyé par les nerfs. Cela peut provoquer une paralysie et, dans le cas où cette absence est déclenchée de façon ciblée et contrôlée après la naissance, des difficultés respiratoires peuvent apparaître.
Devenir
1) Reproducteurs hétérozygotes (asymptomatiques) : Maintenus jusqu'à infertilité/âge max (6 mois, 6 portées) puis mis à mort (dislocation cervicale) ou réaffectés à des DAP de phénotypage si aptes. 2) Excédents des contrôles et des mutants (souris porteuses de deux copies altérées du gène): Réaffectés à des DAP de phénotypage (DAP distincte: 60188) ou mis à mort immédiatement si non utilisés.
Remplacement
Aucune alternative non animale disponible ne permet de reproduire fidèlement le phénotype de cette myopathie. Les modèles cellulaires ou in silico ne recréent ni l’architecture musculaire complexe ni la réponse systémique observée chez l’animal vivant. Le recours au modèle murin est donc indispensable pour étudier la physiopathologie et développer des thérapies géniques. Ce projet s’inscrit dans un domaine où le remplacement n’est pas encore réalisable.
Réduction
Le nombre d’animaux est minimisé par l’optimisation des schémas de croisement, qui repose sur des calculs génétiques permettant de limiter la production d’animaux excédentaires, ainsi que par le maintien d’un nombre de reproducteurs suffisant mais restreint (12 reproducteurs par lignée). Les animaux non reproducteurs sont, lorsque cela est possible, utilisés comme contrôles dans d’autres projets, et ceux qui ne sont pas nécessaires (sexes ou génotypes sans intérêt) sont mis à mort rapidement selon les méthodes préconisées.
Raffinement
Une surveillance quotidienne est assurée dès la naissance pour les portées et tout au long de la vie des reproducteurs. Le nombre de portées est limité à 6 portées maximum par femelle pour éviter l’épuisement, avec un tri précoce des excédents à 3 semaines regroupant les animaux par cohorte de même portée. Les manipulations sont minimales et non invasives, avec des points limites précoces. Le personnel formé reconnaît les signes de douleur ou de stress, et le phénotypage invasif est exclu de cette DAP (procédures couvertes par DAP distincte).
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour l’étude des myopathies congénitales et du couplage excitation-contraction en raison de la conservation fonctionnelle des gènes et protéines impliquées entre l’homme et la souris. Les modèles murins reproduisent fidèlement les défauts musculaires, la faiblesse, l’hypotonie et la susceptibilité à l’hyperthermie maligne observées chez les patients, contrairement aux modèles non mammifères ou systèmes cellulaires. La souris offre une génétique bien caractérisée et un phénotypage fonctionnel (force in vivo/in situ, locomotion) compatible avec les objectifs. Les animaux sont utilisés jusqu’au stade adulte reproducteur (6 mois maximum). Au sevrage (4 semaines), les animaux contrôles et mutants (souris porteuses de deux copies altérées du gène) sont réaffectés à des projets de phénotypage ou mis à mort si excédentaires (dès connaissance du génotype) ; les souris porteuses d'une seule copie altérée du gène sont mis en accouplement dès 7 semaines pour optimiser la production d’allèles d’intérêt, ou mis à mort si excédentaires.
Evaluation de traitements dans un modèle de pause respiratoire suivant une crise d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Exposées à un son fort pendant soixante secondes, trois jours de suite puis un à deux jours de tests, les souris déclenchent des crises tonico-cloniques suivies d'une pause respiratoire pour laquelle elles sont placées deux minutes sous assistance respiratoire. 2 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, entre 21 et 41 jours de vie, âge auquel le porteur les dit les plus sensibles aux crises audiogènes. Il décrit un inconfort ou des douleurs "comparables à des crampes musculaires" et une pause respiratoire "généralement limitée à quelques secondes", tout en classant l'ensemble du projet en gravité sévère. Toutes seront tuées, le porteur indiquant que les crises répétées et les pauses respiratoires "ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments capables de prévenir ou réduire les pauses respiratoires induites par des crises épileptiques. Ces pauses respiratoires constituent un facteur majeur impliqué dans la mort subite inattendue en épilepsie (SUDEP), qui représente la cause la plus fréquente de décès directement liée à l’épilepsie. Les crises épileptiques généralisées de type tonico-clonique résultent de décharges électriques anormales et synchronisées au niveau cérébral, impliquant les deux hémisphères. Elles se caractérisent par deux phases principales : une phase tonique (contraction musculaire soutenue entraînant un raidissement du corps et des membres), suivie d’une phase clonique (secousses musculaires rythmiques et incontrôlées). Ces manifestations motrices peuvent s’accompagner de perturbations des fonctions vitales, notamment respiratoires. Bien que des traitements antiépileptiques permettent aujourd’hui de contrôler les crises chez une proportion importante de patients, environ 30 % des personnes atteintes d’épilepsie présentent une forme pharmaco-résistante, caractérisée par une absence de réponse satisfaisante aux traitements médicamenteux disponibles. Chez ces patients, le risque de SUDEP est significativement plus élevé, en particulier en présence de crises tonico-cloniques généralisées récurrentes. Dans ce contexte, le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à limiter les altérations respiratoires associées aux crises représente un enjeu majeur. Le présent projet vise ainsi à identifier et caractériser de nouveaux candidats médicaments susceptibles de prévenir les pauses respiratoires induites par les crises épileptiques, dans l’objectif à terme de réduire l’incidence de la mort subite inattendue en épilepsie et d’améliorer l’espérance de vie des patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent l’identification et le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à prévenir ou limiter les pauses respiratoires associées aux crises épileptiques généralisées. Ces altérations respiratoires sont considérées comme un facteur majeur impliqué dans la mort subite inattendue en épilepsie, principale cause de mortalité directement liée à cette pathologie. Malgré la disponibilité de plusieurs traitements antiépileptiques, environ 30 % des patients présentent une épilepsie pharmaco-résistante et continuent à développer des crises généralisées récurrentes, ce qui augmente significativement leur risque de complications graves, dont la SUDEP. Dans ce contexte, l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques constitue un enjeu important pour améliorer la prise en charge de ces patients et augmenter leur chance de survie. Les modèles expérimentaux reproduisant les pauses respiratoires consécutives à des crises généralisées représentent des outils précliniques pertinents pour étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués et pour évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments avant leur développement clinique. Ainsi, les résultats obtenus dans ce projet pourraient contribuer à identifier de nouveaux traitements capables de réduire les complications respiratoires associées aux crises épileptiques et, à terme, diminuer le risque de mortalité chez les patients atteints d’épilepsie pharmaco-résistante.
Procédures
Les candidats médicaments seront administrés par une injection rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (e.g. 1/jour x 10 jours max), en fonction des spécificités du candidat traitement. Les rongeurs seront soumis à un stimulus sonore d'une durée maximale de 60 secondes chez la souris pendant 3 jours (sensibilisation) puis 1 à 2 jours supplémentaires (tests). En cas de pause respiratoire, les animaux seront placés sous assistance respiratoire pendant 120 secondes jusqu'à la reprise naturelle de la respiration. Un prélèvement de sang pourra être réalisé sous anesthésie (durée de quelques secondes), en général juste avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l’induction de crises par un stimulus sonore peut générer un stress physique et physiologique chez les rongeurs, comparable à celui observé chez les patients lors de la survenue d’une crise épileptique. Les crises tonico-cloniques induisent des mouvements musculaires involontaires et un raidissement du corps et des membres pouvant s’accompagner d’inconfort ou de douleurs transitoires comparables à des crampes musculaires. La survenue de ces crises peut également provoquer une pause respiratoire de courte durée, généralement limitée à quelques secondes. Après la crise, les animaux peuvent présenter une phase transitoire caractérisée par une désorientation, une diminution temporaire de l’activité ou une fatigue passagère. L’administration des candidats médicaments ainsi que les prélèvements sanguins, lorsque ceux-ci sont réalisés, peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et une légère douleur comparable à celle associée à l’introduction d’une aiguille, conformément aux pratiques vétérinaires standard. Une gêne locale au site d’injection ou des effets indésirables transitoires liés aux composés testés (par exemple sédation ou modification de l’activité) peuvent également survenir.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience car ils auront été soumis à plusieurs stimulations sonores et plusieurs crises épileptiques suivies d'une pause respiratoire. Ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.
Remplacement
Des approches alternatives, notamment in silico et in vitro, sont utilisées en amont afin de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et ainsi limiter le recours à l’expérimentation animale. Les méthodes in vitro, telles que les cultures primaires de neurones ou l’utilisation de tranches cérébrales, permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’activité épileptique et d’évaluer les effets pharmacologiques préliminaires de nouveaux composés. Ces stratégies sont mises en œuvre dans les phases précoces du développement afin de présélectionner les composés présentant le meilleur potentiel thérapeutique et de réduire ainsi le nombre de molécules évaluées in vivo, contribuant à limiter le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces approches alternatives ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions physiologiques observées à l’échelle de l’organisme entier. Dans le contexte de ce projet, l’évaluation de nouveaux traitements nécessite l’étude de phénomènes intégrant simultanément l’activité cérébrale, la régulation respiratoire et les réponses comportementales associées aux crises épileptiques. Les modèles animaux restent donc indispensables pour caractériser les effets des candidats médicaments sur ces paramètres physiologiques intégrés, notamment la survenue et la résolution des pauses respiratoires consécutives à une crise.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est déterminé de manière à obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux. Les effectifs expérimentaux sont définis sur la base d’analyses statistiques adaptées au type de données recueillies et à la variabilité attendue dans ce modèle expérimental. La conception expérimentale vise également à optimiser l’utilisation des animaux. Lorsque cela est possible, plusieurs candidats médicaments et différentes doses peuvent être évalués au cours d’une même étude. Cette stratégie permet notamment de mutualiser les groupes contrôles et les groupes recevant un traitement de référence, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont été optimisées afin de limiter autant que possible la douleur, la souffrance et la détresse des animaux. La phase de sensibilisation au stimulus sonore, nécessaire à l’établissement du modèle expérimental, est réduite au strict minimum (suite à un précédent projet dans lequel une phase de mise en place avait permis de réduire cette durée de sensibilisation). Sur la base des données disponibles et de l’expérience acquise avec ce modèle, cette phase sera limitée à trois jours de stimulation afin de restreindre le nombre d’expositions nécessaires et de réduire les nuisances potentielles pour les animaux. Les animaux seront étroitement surveillés pendant les procédures expérimentales afin d’identifier rapidement l’apparition d’une pause respiratoire consécutive à la crise. Lorsqu’une pause respiratoire est observée, une assistance respiratoire adaptée sera mise en place dans les secondes suivant son apparition afin de favoriser une reprise rapide de la ventilation et de limiter les conséquences physiologiques associées. Les manipulations et administrations de traitements seront réalisées par du personnel formé et expérimenté afin de réduire le stress lié à la contention et d’optimiser les techniques d’administration. Les volumes et les voies d’administration seront adaptés aux recommandations en vigueur pour limiter l’inconfort des animaux. Lorsque des prélèvements sanguins sont réalisés, les animaux seront anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse appropriée. Dans le cas de procédures terminales telles qu’un prélèvement d'une grande quantité de sang, l’intervention sera réalisée sous anesthésie profonde, avec administration d’analgésiques si nécessaire, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Enfin, des points limites stricts et spécifiques ont été définis pour chaque procédure et l’état général des animaux sera régulièrement évalué tout au long de l’étude afin de détecter précocement tout signe de détresse ou d’altération du bien-être, permettant la mise en œuvre de mesures appropriées si nécessaire.
Choix des espèces
Les modèles de pauses respiratoires consécutives à des crises épileptiques sont largement étudiés chez la souris, espèce présentant une organisation neuronale et des mécanismes cardiorespiratoires pertinents pour l’étude des crises généralisées et pauses respiratoires associées. Les crises peuvent être induites de manière reproductible chez des souches sensibles aux stimulations sonores de forte intensité ou observées spontanément chez certaines lignées transgéniques, reproduisant des altérations respiratoires comparables à celles observées chez les patients. La souris constitue ainsi un modèle expérimental validé pour évaluer les effets de candidats médicaments sur la survenue et la résolution des pauses respiratoires associées aux crises épileptiques. Les animaux seront utilisés immédiatement après le sevrage, entre 21 et 41 jours après la naissance. Cette période correspond à une phase du développement au cours de laquelle les souris présentent une sensibilité élevée aux crises épileptiques et aux crises audiogènes, ce qui permet une induction reproductible des crises dans les modèles expérimentaux utilisés. Dans les modèles audiogènes, la susceptibilité aux crises est particulièrement marquée chez les jeunes animaux, alors qu’elle diminue progressivement à l’âge adulte. L’utilisation de souris dans cette fenêtre d’âge permet donc d’obtenir un phénotype stable et reproductible tout en limitant le nombre de stimulations nécessaires pour induire les crises. Par ailleurs, dans certains modèles génétiques d’épilepsie, notamment les lignées présentant des crises spontanées, les premiers événements épileptiques apparaissent également au cours de cette période juvénile. L’utilisation d’animaux dans cette tranche d’âge permet ainsi d’étudier les crises et les altérations respiratoires associées dans une phase précoce de la maladie.
Diagnostic du botulisme, titrage des toxines botuliques et anticorps neutralisants ces toxines
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
15 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection d'un échantillon susceptible de contenir de la toxine botulique, qui peut la paralyser et lui provoquer des difficultés respiratoires, et une partie reçoit des doses croissantes de toxine jusqu'à établir celle qui tue la moitié du groupe. Le porteur indique que les effets de la toxine sont irréversibles, ce qui interdit toute réutilisation, tout replacement et toute adoption. Il décrit plusieurs méthodes sans animaux, jugées trop peu sensibles, et inscrit leur mise en œuvre parmi les bénéfices attendus "à long terme" du projet.
Objectifs
Ce projet vise à réaliser le diagnostic du botulisme qui est une maladie grave causée par une toxine puissante, pouvant entraîner des paralysies sévères chez l'homme et l'animal et potentiellement mortelle. Actuellement, la méthode la plus fiable pour confirmer cette maladie repose sur des tests utilisant des souris, car aucune alternative aussi sensible n'existe pour détecter d'infimes quantités de toxine. Les objectifs principaux sont dans un premier temps, de détecter la présence de toxine : des échantillons (sérum, selles, aliments) de patients ou animaux suspects sont injectés à des souris. Leur observation permet de confirmer la présence de toxine si des signes de paralysie apparaissent. Dans un second temps, de mesurer la puissance de la toxine : des souris reçoivent différentes doses de toxine pour déterminer la quantité provoquant la mort de 50 pourcents d'entre elles. Cette mesure permet d'évaluer la dangerosité des préparations de toxine. Enfin, d’identifier le type de toxine : des sérums spécifiques (obtenus à partir de lapins immunisés) sont utilisés pour neutraliser et identifier le type de toxine présent dans les échantillons.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : diagnostic fiable du botulisme, qui est une affection neurologique sévère, le plus souvent d’origine alimentaire. Importance de ce diagnostic : bénéfice individuel pour le patient permettant la mise en place d’un traitement adapté de manière rapide. Bénéfice collectif : effectuer des retraits de lots de manière rapide en cas de transmission par des aliments identifiés grâce à ce diagnostic. Bénéfices à long terme : mise en œuvre de méthodes diagnostiques alternatives et réduction de l’utilisation des souris.
Procédures
Les souris recevront une injection d’échantillon à tester qui peut provoquer une douleur légère, réversible et de courte durée (une seule injection par souris, durée de l’acte inférieure à 30 s). Les souris seront mises à mort par une méthode réglementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir une douleur légère de courte durée ponctuelle et réversible lors de l’injection (une injection par souris, durée de l’acte inférieure à 30 s). L’injection de toxine via l’échantillon biologique à tester (potentiellement contaminé) peut induire une paralysie de l’animal et des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils seront injectés avec des échantillons biologiques contenant potentiellement des toxines. Les effets des toxines étant irréversibles, les animaux ne peuvent donc ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Plusieurs techniques de laboratoire sans recours aux animaux ont été développées pour détecter les toxines responsables de cette maladie grave. Ces méthodes présentent cependant des limitations majeures qui les rendent actuellement inadaptées pour répondre aux besoins spécifiques de ce projet. Les tests immunologiques, bien que rapides, standardisés et sans utilisation d’animaux, ont une sensibilité insuffisante pour détecter les très faibles concentrations de toxine présentes dans les prélèvements cliniques. De plus, certains sous-types de toxine échappent à la détection, et ils ne permettent pas de différencier la toxine active de résidus de toxine. Une technique déjà identifiée est rapide et n’utilise pas d’animaux mais la sensibilité est insuffisante pour détecter les très faibles concentrations de toxine présentes dans les prélèvements cliniques. Les méthodes de biologie moléculaire sont très spécifiques et sensibles pour certains types de toxine, mais ne détectent que la présence du matériel génétique, pas l'activité biologique de la toxine. De plus, certains variants ne sont pas identifiables et ils nécessitent la présence de la bactérie (inadaptée sur échantillons de sérum). Malgré ces avancées technologiques, aucune méthode alternative ne permet actuellement de détecter l'ensemble des variants de toxine avec une sensibilité suffisante ni d’évaluer l'activité biologique réelle de la toxine. De ce fait, aucune méthode alternative permet de garantir la sécurité des diagnostics pour les patients Dans l'état actuel des connaissances scientifiques, le recours aux animaux reste donc indispensable pour garantir la fiabilité des diagnostics, assurer la sécurité des patients, développer des traitements efficaces et maintenir la surveillance épidémiologique.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus pour ce projet est lié au nombre d’échantillons reçus pour suspicion d’intoxination annuellement. Pour chaque demande, une fiche de renseignements cliniques est fournie par le prescripteur. Une revue de la pertinence de la prescription est réalisée et les demandes non justifiées sont annulées par le biologiste. Le laboratoire travaille en collaboration avec d’autres équipes à la fois au niveau national et international pour utiliser une méthode alternative à l’expérimentation animale pour faire ce diagnostic, sans compromettre la prise en charge des patients et la prévention en cas d’identification d’un nouveau foyer.
Raffinement
Avant de débuter le projet, les souris seront acclimatées pendant une semaine en conditions standard d’animalerie. Des critères d’arrêt ou points limites spécifiques et précoces ont été déterminés pour chaque procédure expérimentale, avec gel nutritif et renforcement de l’enrichissement dès l’apparition d’un signe clinique afin d’éviter la souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
La méthode de référence pour le diagnostic du botulisme est le test d’inoculation à la souris, espèce qui est sensible à tous les sous-types connus de toxines botuliques. Des animaux adultes de 4 à 8 semaines seront utilisés dans ce projet : la sensibilité des souris aux toxines dépend de leur âge et de leur poids ; nous avons acquis une longue expérience et de nombreuses données avec les animaux de cet âge pour lequel les résultats sont reproductibles.
Approche préventive par nanoparticules pour réduire les infections pulmonaires dans un modèle de granulomatose chronique septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Infectées par Pseudomonas aeruginosa, les souris peuvent perdre du poids, cesser de s'alimenter, respirer difficilement et mourir dans les jours qui suivent. 509 souris génétiquement modifiées pour reproduire une granulomatose septique chronique vont être utilisées, 373 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 136 dans des procédures d'un niveau sévère, avec jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie et une tonte du ventre. Le porteur décrit des interventions "brèves, espacées dans le temps" destinées à limiter la contrainte, tout en indiquant que la souffrance liée à l'infection reste "un aspect inévitable du modèle". 248 souris seront réutilisées comme support de formation technique pour entraîner du personnel aux gestes, les autres tuées pour des prélèvements post-mortem, celles qui ont survécu à une dose d'infection tuant un quart des animaux étant écartées de cette réutilisation.
Objectifs
La granulomatose septique chronique est une maladie génétique rare qui affaiblit les défenses naturelles de l’organisme contre les infections. Les personnes atteintes souffrent d’infections graves et répétées, surtout au niveau des poumons, pouvant entraîner un décès plus précoce que la normale. Une bactérie particulièrement dangereuse dans ce contexte est Pseudomonas aeruginosa, responsable d’infections pulmonaires sévères. Les traitements actuels reposent surtout sur les antibiotiques et la prévention des infections. Ils ne sont pas toujours efficaces, notamment en raison de la faiblesse du système immunitaire et de l’apparition de bactéries résistantes. Certaines options plus lourdes, comme la greffe de moelle osseuse, ne peuvent pas être proposées à tous les patients, et les nouveaux traitements sont encore en cours de développement. Dans ce contexte, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal reproduisant une forte sensibilité aux infections pulmonaires, afin de pouvoir étudier de manière pertinente l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet consiste à tester une approche basée sur des nanoparticules destinées à renforcer les défenses naturelles des poumons contre les infections dans ce modèle. L’objectif est de vérifier si cette stratégie permet de réduire la gravité des infections pulmonaires et de fournir des informations utiles pour le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
À court terme, l’objectif est de démontrer, dans un modèle animal pertinent, qu’il est possible de limiter efficacement une infection pulmonaire aiguë par Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste. Cette approche repose sur des liposomes transportant des protéines capables de rétablir l’activité microbicide des macrophages alvéolaires, restaurer la production d’espèces réactives de l’oxygène et renforcer la réponse immunitaire locale. À long terme, cette stratégie pourrait devenir une nouvelle thérapie innovante pour l’Homme, améliorant la qualité de vie et l’espérance de vie des patients immunodéficients, tout en réduisant la dépendance aux antibiotiques et en limitant le risque de résistances.
Procédures
Les souris seront soumises à un nombre limité d’interventions réalisées sous anesthésie. Selon le schéma expérimental, chaque animal subira une à deux administrations (l’une pour le produit testé, l’autre pour les bactéries) et jusqu’à six séances d’imagerie, chacune durant environ 5 minutes. Ces imageries permettront soit de suivre la distribution du produit (6 séances), soit de suivre l’évolution de l’infection (3 séances). Chaque anesthésie durera au maximum une dizaine de minutes pour les administrations, et environ 5 minutes pour les imageries. Entre deux séances d’imagerie, les délais seront de 3, 18 ou 24 heures, selon les besoins du suivi longitudinal. Une tonte du pelage, localisée au niveau ventral, sera nécessaire pour les prises de clichés et sera réalisée pendant l’anesthésie. Toutes les interventions sont brèves, espacées dans le temps et réalisées sous anesthésie pour limiter au maximum la contrainte pour les animaux.
Impact sur les animaux
Les interventions sur les souris peuvent provoquer des gênes de courte ou moyenne durée et d’intensité variable. La contention nécessaire pour l’anesthésie provoque un stress très bref, inférieur à une minute, suivi d’une anesthésie courte (5 à 10 minutes). Le réveil peut entraîner une légère perturbation de la respiration ou des mouvements pendant quelques minutes, mais les animaux récupèrent rapidement. En revanche, l’infection bactérienne peut entraîner des effets sévères, apparaissant généralement dans les 24 à 48 heures et durant plusieurs jours : perte de poids importante, baisse marquée de l’activité et de l’appétit, posture voûtée, poils hérissés et respiration rapide ou difficile. Ces effets peuvent évoluer rapidement et entraîner la mort de certains animaux. La surveillance est constante pour suivre l’évolution de chaque animal et limiter au maximum sa détresse. La sévérité globale des interventions dépend surtout de la puissance de l’infection et de la répétition des anesthésies. Toutes les mesures possibles sont prises pour réduire la gêne liée aux manipulations, mais la souffrance liée à l’infection elle-même reste un aspect inévitable du modèle.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront soit réutilisés pour des activités d’enseignement lorsque cela est possible, soit euthanasiés lorsque l’expérience l’exige. En particulier, certains pourront, si l’occasion se présente, participer à des séances de formation technique (tutorat) destinées à former le personnel à des gestes maîtrisés sous la supervision d’un tuteur agréé. Les animaux ayant survécu à une infection par Pseudomonas aeruginosa à une dose induisant 25 % de mortalité ne pourront pas être réutilisés. Enfin, certains seront euthanasiés en fin de protocole pour des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, la production de nanoparticules lipidiques actives et non toxiques, ainsi que leur efficacité, ont d’abord été évaluée in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant, aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet actuellement de reproduire la complexité physiopathologique d’un organisme vivant, ni d’évaluer la tolérance systémique et les réponses immunitaires globales. Le recours à un modèle murin ici est donc nécessaire pour évaluer l’efficacité et la sécurité d’une stratégie préventive avant toute transposition clinique.
Réduction
Les procédures ont été conçues pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Le suivi des mêmes animaux à différents moments permet d’obtenir de nombreuses données, tout en réduisant leur nombre total nécessaire. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de données déjà connues dans la littérature ainsi que de résultats issus du laboratoire, évitant ainsi de multiplier les essais préliminaires. L’organisation progressive du projet, où chaque étape repose sur les résultats de la précédente, maximise également les informations obtenues pour chaque animal et contribue à réduire leur utilisation.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours. L’enrichissement sera adapté tout au long de l’étude pour garantir leur confort, leur thermorégulation et le maintien de relations sociales normales. Elles seront logées par petits groupes homogènes afin de préserver les interactions entre congénères tout en respectant les normes sanitaires. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié et, lorsqu’une anesthésie adaptée est nécessaire, elle sera toujours appliquée au préalable pour réduire le stress et la douleur. Après infection, des croquettes et de l’eau gélifiée seront placées au fond de la cage, en plus des sources habituelles, afin de limiter les efforts des animaux et prévenir toute déshydratation. Un suivi clinique quotidien permettra de détecter tout signe de souffrance, et en cas de détection, des actions visant à la supprimer seront réalisées sans délai. Ces mesures garantissent le respect du principe de raffinement, réduisant au maximum le stress et la douleur des animaux et limitant la durée ainsi que l’intensité des interventions, tout en permettant la collecte des données scientifiques nécessaires.
Choix des espèces
Pour étudier la granulomatose septique chronique ou l’infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa, nous utiliserons des souris spécialement modifiées pour reproduire fidèlement les signes observés chez l’humain, tels que l’inflammation, la perte de poids et, dans certains cas, la mortalité. Les animaux choisis sont jeunes adultes, afin que leur système immunitaire soit mature et représentatif pour l’étude.
Etude de l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’insuffisance cardiaque induite par l’isoprotérénol chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 1225
Un produit qui stimule fortement le cœur leur est injecté jusqu'à ce que le muscle s'épaississe et perde sa souplesse. 2 450 rongeurs vont être utilisés à parts égales, 1 225 souris et 1 225 rats, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un traitement quotidien, parfois par une pompe implantée sous la peau, des prélèvements de sang sur animal éveillé et plusieurs séances d'imagerie cardiaque sous anesthésie, avant une chirurgie finale de mesure des pressions dans l'artère et le cœur. Le porteur indique que ces mesures sont trop invasives pour permettre le réveil de l'animal et qu'il est "indispensable" de récupérer le cœur en fin d'expérience.
Objectifs
Ce projet utilise l’isoprotérénol, une substance qui stimule fortement le cœur. Administré plusieurs jours chez le rat ou la souris, il entraîne une atteinte cardiaque progressive similaire à certaines formes d’insuffisance cardiaque humaine. Le cœur s’épaissit, devient moins souple et sa fonction diminue. L’objectif est d’évaluer de nouveaux traitements capables de prévenir ou d’améliorer cette atteinte cardiaque. Les médicaments seront testés soit avant l’apparition des signes, soit une fois la maladie installée. Les évaluations porteront sur la fonction cardiaque, le remodelage, la fibrose, l’inflammation et différents marqueurs biologiques. Ce modèle permet d’obtenir des informations essentielles pour développer de nouvelles thérapies contre l’insuffisance cardiaque. Toutes les procédures seront réalisées en limitant au maximum la douleur et le stress des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de l’insuffisance cardiaque et à tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le modèle utilisé reproduit plusieurs anomalies observées chez les patients, comme l’épaississement du muscle cardiaque, la fibrose, l’inflammation et la diminution progressive de la fonction de pompage du cœur. Cela permet d’étudier l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet de différents traitements. Les travaux devraient aider à identifier des médicaments ou stratégies capables de ralentir ou d’améliorer ces altérations cardiaques, et à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. À terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de nouvelles options thérapeutiques pour une maladie fréquente et grave. Les bénéfices attendus concernent donc à la fois l’avancée des connaissances et l’amélioration future de la prise en charge médicale.
Procédures
Lors de l’administration de l’isoprotérénol, les animaux sont endormis et l’injection est réalisée rapidement (6 à 8 minutes). Pendant le protocole, ils reçoivent tous les jours un traitement, administré par plusieurs voies possibles, chaque administration durant 1 à 6 minutes. Des prélèvements sanguins sont effectués sur animaux éveillés : au niveau d’une veine de la mâchoire ou de la patte chez la souris, et de la veine de la queue chez le rat. Les animaux sont également anesthésiés à plusieurs reprises pour réaliser des imageries cardiaques intermédiaires (environ 20 minutes), permettant de suivre l’évolution de la pathologie et l’effet des traitements. Une imagerie finale est réalisée en fin de protocole. Une chirurgie terminale est ensuite réalisée sur animal endormi aec prise en charge de la douleur pour mesurer les pressions dans une artère et le cœur, suivie d’un prélèvement de sang par prélèvement cardiaque avant la mise à mort (environ 15 minutes). Certains animaux peuvent aussi subir un prélèvement sanguin supplémentaire sous anesthésie par ponction de la veine du cou (5 à 10 minutes). Enfin, une intervention peut être réalisée sur animal endormi pour implanter une pompe sous‑cutanée permettant l’administration continue d’un traitement (15 à 25min).
Impact sur les animaux
Les animaux reçoivent un produit qui rend leur cœur malade pour permettre d’étudier l’insuffisance cardiaque. Cette injection se fait sous anesthésie générale et peut parfois irriter la peau. Avec le temps, le produit peut aussi provoquer une fatigue générale, une baisse d’appétit et une perte de poids. Une petite chirurgie peut être réalisée pour placer une pompe sous la peau afin d’administrer un traitement. Cela peut causer une gêne ou une douleur temporaire. Les traitements sont donnés régulièrement, ce qui nécessite de tenir l’animal quelques instants. Cela peut être stressant pour lui et provoquer une légère inflammation au point d’injection. Certains médicaments peuvent aussi avoir des effets secondaires. Des prises de sang sont faites soit sous anesthésie (ponction dans la veine du cou), soit sur animal éveillé maintenu en douceur. Cela peut provoquer une douleur brève, un peu de stress et un léger saignement. Pour suivre l’évolution de la maladie, des imageries cardiaques sont réalisées sous anesthésie à plusieurs moments du protocole. À la fin de l’étude, les animaux sont anesthésiés profondément pour mesurer la circulation du sang dans une artère et le cœur, puis un dernier prélèvement sanguin est effectué.
Devenir
Afin de caractériser l'effet des traitements testés, notamment l'effet biologique, nous devons faire des mesures qui sont trop invasives pour permettre le réveil de l’animal, et il est indispensable de récupérer le cœur en fin d'expérience pour évaluer l’efficacité des traitements.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité́ de nouveaux composés in vivo. Le modèle animal est nécessaire afin d’évaluer l’effet de candidat médicament sur les mesures d'imagerie, de pression sanguine et d'analyse des tissus cardiaques. En effet, le modèle cellulaire ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions intégrées au niveau cardiaque et de la pression corporelle, ni d’évaluer le devenir du candidat médicament dans l’organisme ainsi que l’évolution des biomarqueurs de la pathologie.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, de l'imagerie est utilisée pour permettre de suivre plusieurs paramètres dans le temps sur le même animal.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Une grille de score est établie afin de faire un suivi clinique des animaux, avec la mise en place de mesures adaptées en fonction du score et des critères d’arrêt de souffrance. Des enrichissements multiples leur sont proposes en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalises sous anesthésie et/ou analgésie. Lorsqu’une chirurgue avec réveil sera nécessaire, elle sera réalisée en conditions stériles et les animaux auront un suivi post-opératoire intensif pendant au moins 3 jours. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rongeur est le modèle animal le plus approprié pour cette étude car la maladie peut y être reproduite de façon fiable et ses effets sur le coeur sont comparables à ceux observés chez les patients. Ce modèle permet également de réaliser des prises de sang répétées pour mieux suivre l’action du médicament dans l’organisme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes d'au moins 6 semaines, car avant cet âge leur système cardiovasculaire est encore en développement.
Recherche préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques contre la calcification vasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 750 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une alimentation supplémentée en adénine et en phosphate leur provoque une insuffisance rénale, condition pour obtenir la calcification des artères que le porteur veut étudier, et les composés testés sont administrés par gavage jusqu'à deux fois par jour, ou par voie intrapéritonéale, ou sous la peau, pendant douze semaines. S'y ajoutent six prélèvements de sang, trois séjours de huit heures en cage à métabolisme, trois poses de capteur sur un dos rasé et épilé, et trois injections dans la veine derrière l'œil. Le porteur annonce une douleur pouvant être persistante et modérée, décrit une formation au "tickling" pour améliorer le contact avec les rats, et qualifie d'"indispensable" le recours à l'animal faute de méthode alternative reproduisant l'ensemble des mécanismes.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde. Parmi elles, la calcification vasculaire est une complication fréquente du vieillissement, de l’insuffisance rénale chronique, du diabète et de l’hypertension artérielle. Elle se caractérise par un dépôt pathologique de calcium dans la paroi des vaisseaux, entraînant une augmentation de la rigidité artérielle et du risque d’événements cardiovasculaires graves. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, il n’existe actuellement aucun traitement spécifique capable de prévenir ou de limiter efficacement la progression de cette pathologie. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles expérimentaux de calcification aortique chez le rat par induction nutritionnelle à la caséine/adénine et au phosphate, afin de reproduire les principales caractéristiques de la pathologie humaine. Le principe du modèle est d’induire une insuffisance rénale avec la supplémentation en adénine dans la diète. L’insuffisance rénale entraine un déséquilibre de la balance ionique et une perte de masse osseuse, ce qui a pour conséquence une augmentation des taux de phosphate et calcium circulant. Ce sont ces taux élevés qui à terme favorisent la calcification vasculaire. Ce modèle permettra ensuite d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques susceptibles de prévenir ou limiter la calcification vasculaire. Seules les molécules ayant démontré un potentiel thérapeutique prometteur lors des études in vitro préalables et ayant de bonnes propriétés phamaco-cinétiques seront évaluées dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n’existe pas de traitement spécifique pour la calcification vasculaire. Le bénéfice de ce projet sera de caractériser de nouvelles molécules pour élargir l’offre thérapeutique et permettre de proposer des nouvelles approches thérapeutiques aux patients atteints de cette pathologie.
Procédures
Prélèvement sanguin : un prélèvement sanguin pourra être réalisé au niveau de la veine saphène médiale ou caudale en moins d’une minute au maximum une fois toutes les 2 semaines (soit maximum 6 prélèvements). Un micro prélèvement pourra être réalisé en quelques seconde sur rat vigile (1 à 3 ponction sur 24h) une seule fois dans l’étude. Prélèvement d’urine après mise en diurèse en cage à métabolisme pendant 8 heures (eau de boisson ad libitum), maximum 3 fois pendant l’étude. Pose du dispositif de mesure de la filtration rénale sur la peau (méthode non invasive) pendant 1h, les animaux sont rasés et épilés, mise en place d’un petit capteur (1 cm2) sur la peau du dos, maximum 3 fois pendant l’étude. Injection par voie veineuse rétro-orbitaire en moins de 5 secondes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois pendant l’étude. Les composés et leurs solvants seront administrés soit par gavage (maximum deux fois par jour), par voie intrapéritonéale (maximum trois fois par semaine) ou injection sous cutanée (maximum deux fois par jour) pendant 12 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Ce modèle de calcification vasculaire est basé sur le modèle de fibrose tubulo-interstitiel et d’atrophie tubulaire rénale induit par diète supplémentée en caséine/adénine et en phosphate. La calcification vasculaire étant une maladie silencieuse, les effets indésirables sont principalement ceux induits par l’insuffisance rénale. On peut observer une perte de poids et une baisse de l’état général, une diminution de la prise alimentaire / anorexie partielle ainsi qu’une douleur pouvant être persistante et modérée. En plus de la mise sous diète spécifique, la mise en cage métabolique pour les diurèses, les prélèvements sanguins répétés ainsi que la pose sur la peau du dos du système non invasif de mesure de la fonction rénale peuvent engendrer un inconfort et un stress passager chez l’animal. Les traitements et prélèvements pourront être également susceptibles de créer de l’inconfort passager.
Devenir
En fin de procédure expérimentale ou en cas d’atteinte des points limites éthiques, les animaux seront mis à mort de façon éthique et des analyses sur les organes, nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées, seront réalisées.
Remplacement
Les composés candidats seront d’abord sélectionnés sur la base de données bibliographiques, d’études in vitro et d’évaluations pharmacologiques préalables. Les modèles cellulaires permettent notamment d’étudier certains mécanismes impliqués dans la calcification vasculaire, tels que la transdifférenciation des cellules musculaires lisses vasculaires. Seules les molécules présentant un potentiel thérapeutique prometteur seront ensuite évaluées chez l’animal. Le recours à l’animal reste néanmoins indispensable, car la calcification vasculaire résulte d’interactions complexes entre les systèmes cardiovasculaire, rénal et métabolique qui ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives. Les modèles animaux permettent d’étudier de manière intégrée l’altération de la fonction rénale, le développement de la calcification vasculaire et l’efficacité des traitements testés. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire l’ensemble de ces mécanismes physiopathologiques.
Réduction
Le nombre de rats utilisés par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05.
Raffinement
Afin de minimiser le stress des animaux tout au long de l’étude, une période d’acclimatation d’au minimum 4 jours sera mise en place. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu, avec une régulation stricte de la température, de l’humidité, de la pression, du renouvellement d’air et une alternance jour/nuit conforme aux recommandations. Ce système sera relié à une alarme pour garantir un suivi constant. Les conditions d’hébergement, y compris la qualité de la nourriture et de l’eau de boisson, feront l’objet d’une surveillance quotidienne. La densité animale en cage respectera les normes en vigueur, et les groupes formés lors de l’acclimatation resteront stables durant toute l’étude pour limiter le stress social. L’environnement des cages sera enrichi dès l’arrivée des animaux et durant toute la durée de l’expérience (igloos, matériaux à ronger, tunnels, sizzle pads), favorisant ainsi un comportement naturel. Une manipulation low stress (main ou tunnel) sera privilégiée lors de la manipulation des animaux pour réduire l’anxiété liée aux manipulations. De plus, les techniciens travaillant chez le rat auront tous reçu une formation « tickling » visant à améliorer le contact avec l’animal. Enfin, des critères d’arrêt stricts sont établis : si les signes de détresse ou de souffrance atteignent les limites prédéfinies, les animaux seront mis à mort de manière anticipée pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans le cadre de ces recherches est le rat. Le modèle a été sélectionné sur la base de la littérature existante et de notre expertise. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés pour évaluer les composés d’intérêt.
Suite de la mise au point d’un nouveau modèle d’ischémie cérébrale par l’utilisation de microparticules d’oxydes de fer couplées à de la thrombine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Mettre au point un modèle d'AVC moins invasif que ceux utilisés aujourd'hui : cet objectif soumet 182 souris à des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le cerveau ou la moelle épinière. Des microparticules d'oxyde de fer leur sont injectées dans une veine puis attirées par un aimant posé sur le crâne jusqu'à former un caillot, sous des anesthésies de 1 h 25 à 2 h 25 selon le protocole. Une application secondaire provoque un infarctus de la moelle épinière. Le porteur annonce une sévérité "nettement réduite" par rapport aux modèles existants et affirme que l'étude pilote n'a montré aucun signe clinique pire que le modèle habituel du laboratoire, alors que les 182 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
L'Accident Vasculaire Cérébral, ou AVC, est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 15 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 33 % avec une incapacité permanente, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. L'ambition principale de ce projet est de développer un nouveau modèle in vivo pour mimer l'AVC de manière moins invasive (couches physiologiques préservées sans abimer l'endothélium), par une technique plus simplifiée (donc moins d'animaux utilisés pour l'entrainement) que les modèles qui existent aujourd'hui et qui s'avèrent sévères ou moins représentatif des AVC humains : modèles filament, thromboembolique par injection de thrombine dans l'artère cérébale moyenne, modèle photothrombotique par exemple. En effet, ce dernier modèle ne produit pas de phénomène embolique naturel, forme des microthrombi diffus et l'endothélium est atteint par la lumière et ne permet pas de recanalisation. Ici, l'objectif est d'injecter par voir veineuse des microparticules d'oxyde de fer qui seront migrées grâce à un aimant placé au niveau de l'artère à travers l'os pour que leur accumulation forme un caillot. Son atout scientifique supplémentaire est qu'il préservera la pression intracrannienne et les méninges pour étudier les phénomènes se rapprochant de la clinique ainsi que l'étude de la recanalisation et sensibilité à la thrombolyse. Ce projet s'intègre à la suite d'une étude pilote prometteuse qui a permis de répondre à quelques questions mais en ouvre d'autres pour optimiser le modèle. Après sa phase complète de développement, celui-ci serait bien moins invasif que le modèle reconnu utilisé pour l'étude des thrombolytiques : ischémie par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne après incisions de la peau, du muscle masseter et craniotomie, (modèle développé en 2007) utilisé couramment au laboratoire. A terme, seront testées de nouvelles molécules ou existantes mais améliorées, afin d'optimiser l'efficacité thrombolytique sur une pathologie davantage représentative aux évènements cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement de ce nouveau modèle devrait permettre d'utiliser des animaux à des fins scientifiques dans cette thématique d'intérêt publique majeure avec une sévérité nettement réduite de la procédure d'induction de l'Accident Vasculaire Cérébral, ou AVC, comparé à ceux qui existent aujourd'hui. Cela reflètera davantage la physiopathologie de l'Homme (par une préservation de la pression intracrannienne et des méninges tout en étant sensible aux thrombolytiques) pour continuer d'optimiser les résultats des patients victimes d'un AVC traités par le traitement de référence et augmenter la fenêtre de temps thérapeutique. Cela augmenterait donc le nombre de patients victimes d'un AVC qui pourraient bénéficier de ce traitement. De plus, simplifier la technique d'induction d'AVC réduira le nombre d'animaux avec lequel nous devons nous entrainer pour obtenir des résultats reproductibles.
Procédures
Tous les animaux seront anesthésiés (en plus d'être analgésiés) et subiront des actes chirurgicaux. Temps d'anesthésies : Modèle ischémique permanente : 1h25. Modèle ischémique transitoire : 1h55 pour le groupe avec l'aimant positionné 30 min et 2h25 pour le groupe avec l'aimant positionné 1h. Etude avec traitement de référence utilisé en clinique : 1h25. Application secondaire : infarctus de la moelle : 1h30. IRM : 14 minutes + 5 min pour induction et placement dans le berceau. Récupération des tissus pour études histologiques : 10 min d'induction+analgésie effective + 10 min de geste chirurgical.
Impact sur les animaux
L'étude pilote n'a montré aucun signe clinique différent ou pire comparé au modèle utilisé couramment au laboratoire (modèle thromboembolique par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne) car moins d'actes invasifs sont effectués et l'injection de particules n'affecte rien en particulier. Ce projet n'a pas pour but d'aggraver quoi que ce soit par les réponses positives de l'étude pilote. A partir de l'étape finale lors d'un essai d'un protocole avec la vérification d'un traitement de référence, les animaux pourraient commencer à être réveillés et certains pourraient montrer des signes d'affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans les premiers jours après l'AVC. L'infarctus de la moelle épinière pourrait prédire un déplacement moins équilibré : la dose sera choisie pour ne pas compromettre le bien-être de l'animal, s'alimentant correctement et exprimant son répertoire comportemental naturel.
Devenir
Il y aura récupération des tissus cérébraux (n=172+10) et moelle (pour les animaux de l'application secondaire, n=10) pour analyses complémentaires (colorations, immunohistochimie).
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature mais aussi en fonction de la part d'inconnu avec laquelle nous souhaitons mettre au point un nouveau modèle animal. Le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction des observations/résultats récoltés à chaque étape du développement. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement à ce nouveau modèle et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des sous-étapes de techniques in vitro déjà validées pourront également compléter et vérifier le passage de la prochaine étape vivo. Pour la détermination des effectifs des animaux, nous avons effectué des tests statistiques de comparaison des deux moyennes indépendantes avec le logiciel G*Power en prenant les données des précédentes expérimentations réalisées au sein de l'unité avec un risque alpha à 0,05 et la puissance à 0,8. Pour les étapes où nous continuons dans l'inconnu, nous avons déterminé le nombre selon le nombre d'animaux utilisés dans l'étude pilote qui nous a permis de conclure aux questions.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de raffiner la modélisation de l'ischémie/reperfusion cérébrale par une approche moins invasive que les modèles utilisés actuellement. De plus, simplifier la technique d'induction d'AVC réduira le nombre d'animaux avec lequel nous devons nous entrainer pour obtenir des résultats reproductibles. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum et une période d'une semaine d'acclimatation sera respectée. Des carrés de cotons, du papier kraft et des bâtons de bois seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux (acclimatation, observation, médication, réveil dans enceinte chauffée, croquettes mouillées) pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant tout le projet jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7-9 à 9-11 semaines (9 semaines à leur arrivée à l'animalerie, suivie d'une semaine d'acclimatation, et 11 semaines à la fin du protocole) et auront un poids de 35 g environ. Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes (crâne fin pour l'imagerie fUS) afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Recherche de nouveaux traitements pour traiter la fibrose pulmonaire dans un modèle murin reproduisant cette pathologie
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Une fibrose pulmonaire est déclenchée par activation d'un gène, puis les souris reçoivent jusqu'à vingt injections en trente jours et boivent une solution sucrée pendant un mois. 584 souris vont être utilisées, dont 496 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur annonce un stress de préhension, un stress d'isolement, des lésions pulmonaires et une perte de poids, sans décrire ce que devient la respiration d'un animal dont le poumon se fibrose pendant un mois. Toutes sont tuées à l'issue, au plus tard deux mois après le début de l'expérience, pour prélever les tissus.
Objectifs
Nous étudions une protéine qui est exprimée sur les membranes des cellules et qui permet un échange de sels entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule. Cette protéine est impliquée dans l’établissement des fibroses pulmonaires. Nous avons montré qu’un modulateur positif de cette protéine inhibe la fibrose pulmonaire induite par un agent chimique. Dans ce projet, nous souhaitons étendre nos observations à un autre modèle de fibrose pulmonaire qui mime plus fidèlement les mécanismes d’induction de la fibrose chez l’Homme. Sur ce modèle, nous allons tester l’effet de molécules anti fibrosantes combinées aux modulateurs de notre protéine d’intérêt et caractériserons leurs mécanismes d’action dans la résorption de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
Les pathologies fibrosantes du poumon sont aujourd’hui incurables. Au mieux les traitements actuels permettent de ralentir leur progression. Ces expériences pré-cliniques nous permettront de caractériser de nouvelles options thérapeutiques sur un modèle murin qui mime le développement de la fibrose pulmonaire chez l’homme. A terme, ce projet pourrait inciter les cliniciens à tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques dans des essais cliniques pour les patients présentant des pathologies fibrosantes du poumon.
Procédures
- Les souris boiront une solution sucrée à volonté pendant 30j. - Injections : 10 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 30j. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, au maximum 5 pesées par semaines pour 4 semaines. - Anesthésie, 1 fois. -Traitement anti douleur pré anesthésie.
Impact sur les animaux
- Stress à la préhension. - Stress à l’isolement dans un espace restreint Lésions. - pulmonaires liées à l’induction d'un gène. - Perte de poids liée à la progression de lésions pulmonaires. – Stress liés aux l’injections .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées in vitro ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. Cependant à ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules, modèles invertébrés, intelligence artificielle) qui permettent de caractériser chez les mammifères les interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle que la fibrose pulmonaire. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.
Réduction
Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Nous adopterons une technique qui nous permettra de tester plusieurs combinaisons thérapeutiques à partir d'un seul poumon malade. Nous utiliserons une approche non invasive pour caractériser la progression de la fibrose ainsi que l’efficacité des traitements sur animaux vivants. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Dès que nos hypothèses scientifiques seront validées, nous mettrons fin à nos expériences, même si cela signifie utiliser moins d’animaux que prévu initialement. Notre objectif est de limiter au maximum leur utilisation, tout en garantissant la rigueur et la fiabilité de nos résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés et stériles et sont surveillées quotidiennement. Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vivants. Nous utilisons des méthodes non invasives pour étudier les capacités respiratoires des animaux. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être. Les drogues seront administrées par injection en rotation sur différents points, pour limiter les effets locaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement altéré que nous utiliserons est bien caractérisé dans la littérature. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de fibrose pulmonaire après l’expression de la forme active d'une protéine pro fibrosante. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 2 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.
Plasticité cérébrale induite par l’entrainement en endurance et cognitif chez le rat sain jeune et âgé
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois séances de tapis roulant par semaine pendant six semaines, des tests d'effort, et pour une partie des animaux une chirurgie du crâne avec pose d'implants permanents, lentilles d'imagerie ou électrodes. 806 rats jeunes et vieillissants vont être utilisés ainsi, dont 662 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le porteur veut établir que le lactate produit par les muscles pendant l'effort agit sur la mémoire et l'apprentissage, qu'il mesure notamment au labyrinthe de Barnes. Il décrit les lésions des pattes et des ongles avec saignements comme "légers, réversibles et de courte durée" et qualifie les tests comportementaux de non aversifs, dans un projet où il classe quatre animaux sur cinq en souffrance sévère.
Objectifs
La relation entre l’exercice physique et les fonctions cognitives suscite un intérêt croissant au sein de la population générale. La pratique régulière d’une activité physique est associée à une amélioration des capacités de mémoire et d’apprentissage tout au long de la vie. Elle est aujourd’hui considérée comme un moyen de prévention des troubles cognitifs liés au vieillissement et de certaines maladies neurologiques. Dans un contexte marqué par l’augmentation de la sédentarité et des maladies chroniques, il est essentiel de mieux comprendre comment l’exercice agit sur le cerveau. Parmi les mécanismes impliqués, le lactate, une molécule produite par les muscles pendant l’effort, pourrait jouer un rôle important dans le fonctionnement cérébral. Ce projet vise à mieux comprendre comment le lactate influence l’activité du cerveau et les capacités cognitives. Pour cela, nous étudierons les effets de deux types d’entraînement physique : un entraînement continu d’intensité modérée et un entraînement par intervalles de haute intensité. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les effets bénéfiques de l’exercice sur le cerveau et pourraient contribuer à l’amélioration des stratégies de prévention des troubles cognitifs liés à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter des preuves directes mécanistiques des bénéfices induit par l’exercice au travers du lactate libéré pendant l’exercice ce qui manque encore de preuves directes. L’idée est de préciser les bénéfices préventifs de l’exercice sur le fonctionnement cérébrale selon l’âge et le sexe des animaux. Pour cela, les mécanismes de plasticité cérébrale induit par ces exercices physiques seront étudiés du niveau comportemental au niveau fonctionnel (étage cellulaire) en passant par les mesures moléculaires post mortem.
Procédures
Les animaux seront soumis : - à des séances d’entraînement sur tapis roulant réalisées 3 fois par semaine pendant 6 semaines, pour une durée d’environ 30 à 60 minutes par séance selon le protocole ; - à des tests d’effort réalisés avant, pendant et après la période d’entraînement ; - à des tests comportementaux évaluant les capacités de mémoire et d’apprentissage au cours des deux dernières semaines du protocole ; - à des prélèvements sanguins de faible volume réalisés à différents temps expérimentaux ; - pour certains animaux, à une chirurgie réalisée sous anesthésie générale afin de permettre l’étude de l’activité cérébrale. - À l’issue du protocole, les animaux seront anesthésiés profondément avant la réalisation des prélèvements biologiques terminaux.
Impact sur les animaux
Les animaux inclus dans ce projet pourront présenter différents effets indésirables liés aux procédures expérimentales. Pour les animaux soumis à une chirurgie intracrânienne, les effets attendus incluent principalement une douleur post-opératoire transitoire, une gêne locale liée à l’incision et à la présence de l’implant, ainsi qu’un risque limité d’inflammation ou d’infection locale. Ces effets sont principalement observés dans les jours suivant l’intervention chirurgicale. Les séances d’entraînement et les tests d’effort peuvent induire une fatigue musculaire transitoire. De manière occasionnelle, de légères lésions superficielles au niveau des pattes ou des ongles peuvent apparaître et s’accompagner de petits saignements. Ces effets restent généralement légers, réversibles et de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress transitoire lié à la contention ainsi qu’une douleur brève liée à la ponction. Dans de rares cas, une mauvaise tolérance au prélèvement sanguin peut être observée. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont non aversifs et n’induisent pas de douleur. Ils peuvent néanmoins être associés à un stress léger et transitoire lié à la nouveauté de l’environnement ou aux manipulations. En fin de protocole, les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde avant la réalisation des prélèvements terminaux, sans perception de douleur.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, les animaux ne seront pas réutilisés dans d’autres projets et seront mis à mort de manière réglementaire. Pour les animaux inclus dans la procédure 1 (tests comportementaux, entraînement, prélèvements sanguins), la mise à mort est justifiée par la nécessité de réaliser des prélèvements biologiques terminaux (cerveau, sang intracardiaque, muscles squelettiques), indispensables aux analyses prévues dans le cadre du projet et ne pouvant être obtenus chez des animaux vivants. Pour les animaux inclus dans la procédure 2, ayant subi des interventions chirurgicales intracrâniennes avec implantation (injection d’AAV, lentilles d’imagerie ou électrodes), la mise à mort est justifiée par le caractère invasif et irréversible de ces procédures, par la présence d’implants intracrâniens permanents, ainsi que par la nécessité de réaliser des prélèvements terminaux du tissu cérébral pour des analyses histologiques et moléculaires post-mortem. La réutilisation ou la remise en vie des animaux n’est pas envisagée, car elle serait incompatible avec les exigences scientifiques du projet et pourrait compromettre le bien-être animal. Dans tous les cas, la mise à mort sera réalisée conformément à la réglementation en vigueur, sous anesthésie générale profonde, et selon des méthodes visant à éviter toute douleur ou souffrance. Les animaux atteignant un point limite au cours des procédures seront euthanasiés sans délai, conformément aux critères prédéfinis.
Remplacement
Le principe de remplacement a été soigneusement évalué lors de la conception de ce projet. À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée les effets de l’entraînement physique sur les fonctions cognitives et la plasticité cérébrale dans un organisme vivant. Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre l’exercice physique, le métabolisme systémique (notamment le lactate), l’activité cérébrale et les performances cognitives. En particulier, l’étude conjointe des adaptations comportementales, métaboliques et neurophysiologiques induites par différents types d’entraînement nécessite un modèle intégrant à la fois les systèmes musculaire, cardiovasculaire et nerveux central. Le rat constitue à ce titre un modèle biologique pertinent et largement validé pour l’étude des mécanismes de neuroplasticité dépendants de l’exercice, en raison de la similarité de ses réponses physiologiques et cognitives avec celles observées chez l’humain, ainsi que de la possibilité d’y réaliser des mesures fonctionnelles in vivo longitudinales. En l’absence de modèle de substitution permettant de répondre aux objectifs scientifiques du projet, le recours à l’animal est donc scientifiquement et méthodologiquement justifié.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, tout en garantissant la robustesse statistique des analyses. La taille des effectifs a été définie afin de prendre en compte les variables biologiques majeures que sont le sexe, l’âge et le type d’entraînement, sans multiplier artificiellement les groupes expérimentaux. Les animaux sont répartis en deux procédures regroupant l’ensemble des manipulations réalisées sur un même individu. Cette organisation permet d’éviter le double comptage des animaux et de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Le protocole expérimental repose sur une approche longitudinale, permettant la réalisation de plusieurs mesures comportementales, physiologiques et biologiques chez un même animal au cours du temps, incluant des mesures intermédiaires et terminales. Cette stratégie réduit significativement le nombre d’animaux nécessaires par rapport à des plans expérimentaux indépendants à chaque temps. Les animaux sont randomisés entre les différentes conditions expérimentales afin d’homogénéiser les groupes et de limiter la variabilité interindividuelle. Les comparaisons statistiques sont réalisées en utilisant des méthodes adaptées à la structure des données, incluant des analyses à mesures répétées pour les suivis longitudinaux, ainsi que des comparaisons intergroupes lorsque cela est pertinent. Enfin, les différentes modalités expérimentales in vivo (stratégies virales ou électrophysiologie) reposent sur des principes techniques communs et sont regroupées au sein des mêmes procédures, ce qui permet de maximiser l’information obtenue par animal et de limiter le recours à des groupes supplémentaires.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation de 7 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations (cf. plus bas les points limites détaillés). Les animaux seront hébergés par 2 ou 3 par cage selon leur poids (jamais seuls, pas d’isolement social). Des enrichissements multiples leur sont proposés (Tunnel buchette diamond twist), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par les expérimentateurs ainsi qu’aux environnements nouveaux (outils de mesure, donc tapis roulant, comportement, plateforme du Barnes Maze). afin de réduire le stress. Après les poses de fenêtres intracraniennes et électrodes d’enregistrement d’électrophysiologie, les animaux seront surveillés (1 à 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant les 4 premiers jours par les expérimentateurs et animaliers. La nourriture sera à disposition de l'animal directement dans la cage. Concernant les points limites, si le rat est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés (voir plus bas les points limites détaillés), il sera euthanasié par le responsable du projet. Avant les prélèvements du cortex et de l’hippocampe, les rats seront anesthésiés sous isoflurane (induction uniquement 4-5 %) avant d’être anesthésié avec de la Zoletil (tiletamine + zolazépam) 40 mg/kg + Domitor (médétomidine) 0,3-0,4 mg/kg. Les tissus cérébraux seront prélevés après décapitation. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’analgésiques, de sérum physiologique, seront réalisés selon les recommandations éthiques [doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration, i.e., voie intrapéritonéale (i.p.), voie sous-cutanée (s.c.) ou voie intraveineuse (i.v.)]. Toutes les interventions chirurgicales se feront également sous analgésie systémique (buprénorphine : 0,05 mg/kg max), y compris avant la perfusion intracardique. Pour chaque anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et seront maintenus à une température comprise entre 36,5 et 37,5°C, et du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux.
Choix des espèces
Afin d’étudier les conséquences cérébrales de l'entrainement d'endurance, il est nécessaire d'utiliser des animaux qui soient capables de réaliser ces tâches locomotrices et cognitives. Pour étudier les effets d'une stratégie d'entrainement, le recours à l'animal est donc incontournable, surtout lorsque l’on veut proposer des entrainements transférables à l’Homme. Pour cela, nous allons nous baser sur des repères physiologiques (commun à l’humain et le rat tel que le seuil lactique) pour déterminer les vitesses d’entrainement. Les procédures expérimentales décrites plus bas ne pourront pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d’information. Les mesures utilisées (moléculaires et in vivo à l’étage cellulaire) ne trouvent pas d’équivalent chez l’humain. Des rats âgés de P60 (entre 180-300g) à 12 mois seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids (du jeune adulte à l’animal vieillissant).
Caractérisation des atteintes neuromusculaires spinales dans des modèles murins de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
500 souris mâles vont être utilisées, chacune opérée pour recevoir un traceur dans le muscle de la patte arrière, puis rendue septique. 240 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec une seconde chirurgie de l'abdomen, et le porteur annonce pour celles-là des effets plus marqués, moins d'activité, une perte de poids, des déplacements difficiles, une baisse de température et une douleur post-opératoire supplémentaire. Le bénéfice avancé reste de mieux comprendre pourquoi les patients qui survivent à un sepsis restent faibles, les pistes de prévention étant renvoyées au long terme. Toutes sont tuées pour récupérer la moelle épinière et les muscles.
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave provoquée par une réponse excessive de l’organisme à une infection. Il peut entraîner des atteintes de plusieurs organes, mais aussi une faiblesse musculaire importante. Cette faiblesse gêne la récupération des patients, mais ses causes restent encore mal connues. Dans notre laboratoire, nous avons observé, chez la souris, que deux modèles expérimentaux de sepsis entraînent des troubles neuromusculaires associés à la présence de structures inflammatoires appelées « pièges extracellulaires » dans la moelle épinière. Ces structures pourraient participer aux anomalies observées, mais leur rôle exact reste à préciser. L’objectif de ce projet est d’étudier plus précisément les cellules nerveuses de la moelle épinière qui commandent un muscle de la patte arrière, le muscle gastrocnémien et de mieux comprendre comment le sepsis altère la commande nerveuse des muscles et quel rôle jouent les pièges extracellulaires dans ces atteintes.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette faiblesse musculaire, en particulier au niveau des cellules nerveuses qui commandent les muscles. L’étude portera plus précisément sur les neurones qui contrôlent le muscle gastrocnémien, situé dans la patte arrière. La comparaison entre deux modèles de sepsis chez la souris permettra de déterminer ce qui est commun aux deux situations et ce qui leur est propre. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou réduire les complications neuromusculaires du sepsis et ainsi améliorer la récupération des patients.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie (chirurgie durant environ 15 min) consistant en une incision de la peau d’une des pattes arrière afin d’injecter le muscle gastrocnémien avec un traceur permettant d’identifier les motoneurones de la moelle épinière qui innervent ce muscle. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une injection d’un composé permettant d’induire une inflammation systémique (durée pour réalser l’injection : 2 minutes). Une autre partie des animaux recevront la même chirurgie d’injection de traceur dans le muscle gastrocnémien. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une deuxième chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 20 minutes), permettant de créer le modèle de choc septique, afin de mimer la pathologie humaine. Juste avant la fin de l’expérience, une mesure fonctionnelle musculaire terminale non-invasive sera également réalisée pour évaluer la réponse neuromusculaire du muscle (évaluation durant environ 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir des effets passagers liés aux différentes étapes de l’étude. L’injection du traceur dans le muscle de la patte arrière nécessitera une petite intervention réalisée sous anesthésie. Elle pourra entraîner une gêne temporaire, une légère douleur après le réveil et un petit inconfort pour se déplacer pendant un court moment. Les modèles de sepsis utilisés dans cette étude pourront aussi provoquer une dégradation transitoire de l’état général des animaux. Ceux-ci pourront être moins actifs, perdre un peu de poids, se déplacer plus difficilement et présenter une baisse de température. Dans le modèle le plus sévère, qui nécessite une chirurgie abdominale, ces effets pourront être plus marqués et s’accompagner d’une douleur post-opératoire supplémentaire. Les animaux des groupes témoins pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à l’injection ou à la chirurgie contrôle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier en même temps les effets du sepsis sur l’inflammation, la moelle épinière, les cellules nerveuses qui commandent les muscles et le fonctionnement musculaire lui-même. Des méthodes réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité de ces phénomènes dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour comprendre comment ces différents mécanismes interagissent au cours du sepsis.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Le projet a été conçu à partir de l’expérience déjà acquise par le laboratoire avec ces modèles de sepsis et en tenant compte des analyses prévues en fin d’étude. Seuls quatre groupes seront étudiés, avec pour 2 groupes expérimentaux et leur groupe témoin respectivement, afin de répondre à la question posée en utilisant le moins d’animaux possible.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. L’injection du traceur dans le muscle sera réalisée sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur. Les interventions seront menées dans de bonnes conditions d’hygiène, avec du matériel approprié, afin de réduire au maximum l’inconfort et les effets liés au geste. Après chaque procédure, les animaux seront surveillés attentivement après chaque expérimentation jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés. Les animaux soumis aux modèles de sepsis bénéficieront d’un suivi renforcé. La chirurgie utilisée pour le modèle le plus invasif sera également réalisée sous anesthésie, avec prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel formé, afin de réduire autant que possible la douleur, le stress et la durée des manipulations.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est une espèce couramment utilisée en recherche biomédicale, bien connue et bien adaptée à ce type d’étude. Elle permet de travailler dans des conditions standardisées, ce qui aide à obtenir des résultats fiables et comparables. Sa petite taille et son cycle de vie court facilitent également le suivi des animaux dans de bonnes conditions. Cette espèce est particulièrement utile pour étudier les effets du sepsis sur les muscles, les nerfs et la moelle épinière. Les modèles utilisés dans ce projet sont déjà bien décrits chez la souris, ce qui permet de mieux interpréter les résultats et de les comparer à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques nécessaires ici, comme l’injection d’un traceur dans le muscle et l’analyse de la moelle épinière en fin d’étude. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés de 8 à 12 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance ou au vieillissement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi de se rapprocher davantage de la situation étudiée chez l’adulte humain.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de cellules CAR-T anti-GD3 sur des modèles murins de glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
612 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées dans le cadre d'études de survie. Chacune subit une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, ouverture du crâne comprise, deux injections intracérébrales et jusqu'à 32 séances d'imagerie sous anesthésie, une partie recevant en plus dix gavages ou quatre séances de radiothérapie. Le porteur indique que la tumeur provoque des lésions cérébrales, une perte d'appétit puis un amaigrissement, et que la radiothérapie peut entraîner des troubles moteurs. Il revendique la maîtrise de ces protocoles depuis plus de quinze ans pour justifier les effectifs, et écrit qu'évaluer ces cellules CAR-T contre le glioblastome "nécessite" une approche in vivo, faute de système capable de mimer la complexité de cette tumeur.
Objectifs
Notre projet vise à tester un nouveau type de traitement contre un cancer du cerveau très agressif appelé glioblastome. Ce traitement utilise des cellules du système immunitaire (CAR-T), modifiées en laboratoire pour reconnaître et attaquer spécifiquement les cellules cancéreuses. Ces cellules ont déjà montré qu’elles pouvaient ralentir la croissance des tumeurs en laboratoire. Nous voulons maintenant vérifier si elles sont aussi efficaces chez la souris, afin d’évaluer leur potentiel comme futur traitement chez l’humain.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est un cancer du cerveau très agressif, pour lequel les traitements actuels restent peu efficaces. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement permettant d’en guérir, et les patients survivent rarement plus d’un an après le diagnostic. Nous voulons tester une nouvelle approche utilisant des cellules du système immunitaire (CAR-T), modifiées pour reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. L’objectif est de voir si cette stratégie pourrait devenir une piste prometteuse pour mieux traiter ce cancer.
Procédures
Tous les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales (612 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). La greffe intracérébrale est une procédure chirurgicale. Tous les animaux recevront des injections intracérébrales de cellules CAR-T ou de leur solvant (612 animaux, intervention de 2 minutes environ, 2 interventions / animal). L’injection intracérébrale est une procédure chirurgicale. Des animaux recevront une administration orale d’agent anticancéreux ou de son solvant (216 animaux, intervention de 30 secondes environ sur animal vigile, 10 interventions animal). Des animaux recevront un traitement par radiothérapie (108 animaux, intervention de 30 minutes environ sur animal sous anesthésie, 4 interventions / animal). Tous les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) pour le suivi en imagerie de bioluminescence de la progression tumorale (612 animaux, intervention de 15 minutes environ, 32 interventions maximum/animal).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections intrapéritonéales, les injections d'anesthésiques répétées, les injections d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La craniotomie peut générer des douleurs post-opératoires. La radiothérapie est susceptible de provoquer des troubles moteurs. La progression tumorale provoque des lésions cérébrales. La progression tumorale provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids. Des souris seront traitées par gavage. Les souris NSG sont immunodéficientes.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie.
Remplacement
L'efficacité de nouvelles thérapies sur la croissance tumorale du glioblastome nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique du glioblastome. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro et ex vivo.
Réduction
Nous utilisons des protocoles que nous maitrisons depuis plus de 15 ans, et pour lesquels des études antérieures nous permettent de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement relevants. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée. Les animaux seront anesthésiés avant l’intervention chirurgicale. Avant chirurgie, une analgésie est prévue. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples. Un anesthésique local sera injecté sur le site d’incision et appliqué aux points de pression de l’appareil stéréotaxique. Du sérum physiologique préchauffé sera injecté pour hydrater et réchauffer l’animal. Un onguent ophtalmique sera appliqué sur les yeux durant la chirurgie pour assurer leur hydratation. L’imagerie de bioluminescence et la radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des croquettes imbibées d’eau et de la gelée nutritive seront déposées dans la cage après la chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines. En effet, nous souhaitons réaliser l’étude sur de jeunes souris adultes. A cet âge optimal de 6 semaines, l’organisme de l’animal est parfaitement mature sur le plan métabolique, hormonal et tissulaire, ce qui assure une bonne vascularisation tumorale après la greffe ainsi qu’une croissance tumorale plus régulière et prévisible.