Procédures sévères

Anesthésiées par hypothermie sur la glace, puis soumises à une électroporation du cerveau pour y faire naître une tumeur, 410 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent quatre injections de composés dérivés du GDC-0152 pour tester leur effet sur le glioblastome. La tumeur provoque perte d'appétit et perte de poids avant la fin. Le porteur justifie ces essais par un "besoin médical non pourvu" depuis 2005, faute d'innovation thérapeutique.

Objectifs

Le glioblastome est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie de seulement 15 mois pour les patients, malgré des traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Aucun nouveau médicament testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques intéressants, en partie en raison de modèles animaux utilisés en recherche qui reflètent mal la complexité du glioblastome humain. L’objectif ici est de tester in vivo l'efficacité de nouveaux composés anticancéreux sur la progression de la tumeur, sur des souris portant des tumeurs particulièrement similaires aux tumeurs humaines. La validation in vivo de l'efficacité de ces composés pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le glioblastome.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle animal de glioblastome pertinent et de tester l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés anticancéreux. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement de cette tumeur cérébrale qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une électroporation intracérébrale (410 animaux, une seule intervention de 1 minute maximum). L’électroporation du cerveau est une procédure chirurgicale. Elle consiste à modifier des cellules normales du cerveau afin de générer une tumeur. Tous les animaux recevront des injections intraveineuses rétro-orbitaires de composés ou du solvant (410 animaux, intervention de 1 minute maximum, 4 interventions / animal). Tous les animaux seront anesthésiés par hypothermie sur la glace pour la procédure d’électroporation du cerveau (410 animaux, une seule intervention de 15 minutes environ). Tous les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) pour les traitements rétro-orbitaires (410 animaux, intervention de 4 minutes environ, 4 interventions /animal).

Impact sur les animaux

La manipulation, la contention et les injections sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études d'efficacité, ou pour les analyses de marqueurs biologiques.

Remplacement

L'efficacité thérapeutique des composés sur la croissance de tumeurs cérébrales nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique de ces tumeurs. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé en nous appuyant sur notre expérience de plus de 15 ans et sur des tests statistiques appropriés adaptés aux petits échantillons. Cela nous permet de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement relevants.

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose, de dômes autoclavables et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Les souriceaux d'une portée seront élevés tous ensemble avec leur mère. Au-delà de 3 semaines, les mâles et les femelles seront séparés et placés dans de nouvelles cages (par groupes de 5) avec enrichissement (coton, cylindre en carton…). Ils ne seront jamais isolés. Les animaux seront sous observation quotidienne. L'évaluation clinique sera effectuée au moyen de grilles de scores. En fonction des scores obtenus, des mesures appropriées seront mises en place pour éviter et atténuer leur souffrance.

Choix des espèces

Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. Il a été démontré que le modèle animal de tumeur utilisé ici (obtenu par éléctroporation de nouveaux-nés), était des plus pertinents pour tester l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments, car il mime les différentes caractéristiques biologiques des tumeurs humaines.

Les souris dont la faiblesse musculaire évolue vers la paralysie ou la détresse respiratoire sont mises à mort. 540 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, porteuses de mutations reproduisant une myopathie humaine sans traitement existant. Le porteur reconnaît un risque de mortalité potentiellement élevé et des défauts respiratoires. Toutes sont tuées pour prélever muscles et organes et corréler les mesures fonctionnelles aux analyses des tissus.

Objectifs

Le projet vise à caractériser in vivo les conséquences fonctionnelles et moléculaires d’une mutation associée à une myopathie tubulaire chez l’Homme, à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés. À ce jour, aucun modèle animal spécifique de cette maladie n’existe, ce qui limite la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement de thérapies ciblées. Cette myopathie est caractérisée, chez l’Homme, par une faiblesse musculaire progressive, une fatigue importante, une difficulté à marcher, une instabilité posturale et, dans les formes plus sévères, une atteinte respiratoire et une limitation majeure des activités de la vie quotidienne, rendant la maladie fortement invalidante. Trois modèles murins sont utilisés dans cette étude. Le premier reproduit fidèlement la mutation génétique la plus fréquemment observée chez les patients, ce qui lui confère une forte pertinence translationnelle. Le deuxième est un modèle dans lequel le gène est modifié soit dans l'ensemble de l'organisme, soit exclusivement dans le muscle, permettant de comparer les effets selon l'étendue de la modification. Le troisième est un modèle inductible dans le muscle squelettique, dans lequel la modification génétique est activée de manière ciblée à 4 semaines d'âge, afin d'évaluer les conséquences d'une perte complète de la fonction du gène sur la fonction musculaire. Les données obtenues devraient contribuer à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette myopathie et à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour le développement de stratégies thérapeutiques. Ce modèle animal unique, qui reproduit la forme génétique humaine la plus fréquemment observée, constituerait ainsi un outil essentiel pour la recherche translationnelle et l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la myopathie tubulaire associée à cette mutation, en identifiant les mécanismes moléculaires et fonctionnels qui sous‑tendent la faiblesse musculaire et l’invalidité. Il conduira à la mise au point d’un premier modèle animal pertinent de cette maladie, reproduisant la forme génétique humaine la plus fréquemment observée et comblant un vide majeur dans la recherche préclinique sur cette pathologie rare. Ce modèle servira également à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie et évaluer l’efficacité de traitements potentiels. Il permettra de valider ou d’invalider des cibles thérapeutiques et de tester des approches pharmacologiques ou géniques dans un contexte proche de la situation humaine, avant tout essai clinique. À terme, ce travail ouvrira la voie à de futures stratégies thérapeutiques capables de ralentir la progression de la maladie, d’améliorer la force musculaire et la qualité de vie des patients, et de réduire l’invalidité liée à cette myopathie. Enfin, les connaissances acquises pourront également enrichir la compréhension des myopathies tubulaires et des troubles de la signalisation calcique musculaire, avec un impact potentiel sur d’autres pathologies musculaires rares partageant des mécanismes communs.

Procédures

Le phénotypage comportemental est réalisé chez l'animal vigile, sans anesthésie. L'enregistrement de l'activité locomotrice spontanée est effectué pendant un maximum de 22 h, période au cours de laquelle les animaux sont hébergés individuellement sans isolement sensoriel (ni olfactif ni auditif), toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de coordination motrice (durée maximale de 4 minutes par essai) et d'endurance (durée maximale de 2 minutes par essai) sont réalisés toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de force musculaire sont réalisés toutes les semaines à partir de 4 semaines, avec une durée maximale de 1 minute par essai. Ces tests sont répétés jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in vivo consistent en l'enregistrement de la production de force des muscles antérieurs sous anesthésie profonde par inhalation d'un mélange gazeux continu. Chaque séance dure au maximum 15 minutes et est réalisée toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines, jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in situ impliquent une intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde associée à une analgésie, dont l'administration ne dépasse pas 5 secondes. Chaque séance dure au maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 ou 16 semaines). L'induction génétique consiste en l'administration d'un agent inducteur, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, chez des souris âgées de 4 semaines, avec une durée de manipulation d'environ une minute par jour. Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l'analyse moléculaire et histologique.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales, à l'induction génétique et au phénotypage musculaire, et restent compatibles avec un niveau de souffrance modéré contrôlé. D'une part, les souris porteuses de la mutation ciblée développeront une faiblesse musculaire progressive, une fatigue accrue et une diminution de la force de préhension et de la performance locomotrice, en lien avec la myopathie tubulaire modélisée. D'autre part, dans les cas les plus sévères, des défauts de couplage excitation-contraction avec paralysie et difficultés respiratoires pourraient apparaître. Les risques de mortalité sont potentiellement élevés, justifiant les stratégies alternatives et un suivi clinique strict. Ces signes se traduiront par une mobilité réduite, une difficulté à marcher ou à maintenir l'équilibre lors des tests de coordination motrice et d'endurance, ainsi que par une perte de masse musculaire progressive chez les animaux les plus sévèrement atteints. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur non invasif induiront un stress temporaire lié à la manipulation et au changement d'environnement, mais sans douleur ni lésion tissulaire. L'activité locomotrice spontanée de l'animal sera mesurée, ce qui impliquera un hébergement individuel pendant une durée maximale de 22 heures, sans isolement sensoriel (maintien du contact olfactif et auditif avec les congénères), afin de limiter au maximum le stress lié à la solitude. L'induction génétique à 4 semaines, ainsi que les procédures d'anesthésie générale à 8 ou 16 semaines, s'accompagneront d'un stress lié à la contention de l'animal (d'une durée de 15 secondes maximum) et au point de ponction, mais ces procédures seront réalisées de manière rapide et standardisée, avec une manipulation douce et une formation du personnel visant à minimiser l'anxiété. Des effets indésirables transitoires tels qu'une baisse d'appétit, une léthargie ou des troubles digestifs mineurs peuvent survenir après l'induction génétique

Devenir

Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.

Remplacement

Aucun modèle non animal ne permet actuellement de reproduire de manière satisfaisante la physiopathologie d’une myopathie tubulaire liée à cette mutation, ni de rendre compte de la complexité de la fonction musculaire in vivo, de la locomotion, de la fatigue et des interactions tissulaires. Les modèles cellulaires (cultures de myoblastes, lignées musculaires) ou les approches in silico ne permettent pas d’étudier l’ensemble du phénotype fonctionnel, ni la dynamique de la maladie au cours du temps dans un organisme entier. L’utilisation de souris génétiquement modifiées reste donc indispensable pour comprendre les mécanismes moléculaires de la pathologie, valider la pertinence de cibles thérapeutiques et tester des approches précliniques. Le modèle animal développé reproduit génétiquement la forme humaine de la maladie la plus fréquemment observée, ce qui renforce sa pertinence translationnelle et limite, à l’avenir, le recours à d’autres modèles animaux moins ciblés ou moins représentatifs. En ce sens, le choix de ce modèle murin répond à une nécessité scientifique forte et constitue une application rigoureuse de la règle de remplacement, dans la mesure où aucun système non animal ne peut aujourd’hui remplacer l’animal dans ce contexte spécifique.

Réduction

Le plan expérimental repose sur une répartition optimisée des lots (un lot par stratégie de recombinaison) avec un effectif par génotype (contrôles, hétérozygotes, homozygotes) calculé pour détecter des différences biologiquement significatives dans la force musculaire, la locomotion et la morphologie, sans surdimensionnement inutile. Les procédures de phénotypage non invasif et les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont regroupées autant que possible sur les mêmes animaux, afin d'obtenir un maximum d'informations fonctionnelles par individu. Les prélèvements terminaux de muscles et d'organes sont réalisés sur chaque animal à la fin de la période de traitement ou de survie, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Enfin, le recours à un modèle animal unique, reproduisant génétiquement la forme humaine la plus fréquemment observée, évite le développement de plusieurs modèles redondants. Cette approche limite, à l'avenir, le besoin d'animaux supplémentaires pour des études précliniques ultérieures.

Raffinement

Le bien être des nouveaux nés est surveillé quotidiennement par observation clinique (état général, activité, présence d'une poche de lait, interaction avec la mère et les congénères) et par pesée régulière afin de détecter précocement tout signe de détresse, de retard de croissance ou de souffrance. Au sevrage vers 4 semaines, les animaux sont pesés 2 à 3 fois par semaine afin de surveiller leur état général ; en cas de perte de poids, la pesée est effectuée quotidiennement pour suivre l'évolution et adapter rapidement la prise en charge. En cas de difficultés de locomotion ou de prise alimentaire, de la nourriture en gel est ajoutée dans les cages pour faciliter l'accès à la nourriture et prévenir la dénutrition. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur sont non invasives et réalisées chez l'animal vigile, avec une durée de test strictement limitée et une fréquence régulée pour éviter la fatigue et le stress cumulatif. Les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont réalisées sous anesthésie générale profonde et anti douleur, avec une durée d'anesthésie minimale, une surveillance respiratoire continue et un maintien de la température corporelle afin de préserver le bien être de l'animal. Les injections sont réalisées avec une contention douce et une manipulation rapide. L'isolement des animaux pour la mesure de l'activité locomotrice spontanée est limité à 22 heures maximum et réalisé sans isolement sensoriel (contact olfactif et auditif maintenu avec les congénères). Enfin, la mise à mort en fin de procédure, suivie de prélèvements terminaux, évite la poursuite de l'expérience au delà d'un stade où la progression de la myopathie pourrait entraîner une détérioration importante de l'état des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à mieux comprendre une maladie musculaire héréditaire en utilisant des souris comme modèle. Les souris sont choisies car elles permettent de reproduire de façon fiable les anomalies musculaires observées chez l’homme, notamment la forme génétique la plus fréquente de cette maladie, tout en offrant un contrôle génétique précis grâce à des outils modernes de modification du génome. Ce modèle pourrait également servir de base pour évaluer de futures approches thérapeutiques visant à corriger ou atténuer les effets de cette maladie. Les souris seront utilisées uniquement après le sevrage, à partir de 4 semaines d’âge, puis suivies jusqu’à 16 semaines. Ces stades correspondent à des animaux jeunes puis adultes, ce qui permet d’étudier à la fois l’apparition et l’évolution de la maladie dans le temps. Des tests fonctionnels, des analyses musculaires et des examens histologiques seront réalisés pour caractériser précisément les effets de la mutation étudiée sur la force et la structure des muscles.

Implantées dans le cerveau avec des cellules cancéreuses, 140 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. L'étude cherche où agit une protéine du glioblastome et teste un anticorps la ciblant, seul ou avec une immunothérapie. La tumeur peut provoquer douleurs, céphalées et perte de poids, et des points limites déclenchent la mise à mort des souris dont l'état se dégrade. Les animaux sans tumeur sont eux aussi tués pour éviter tout développement tardif.

Objectifs

Les chercheurs ont identifié une protéine qui joue un rôle important dans le développement et la résistance du glioblastome, un cancer du cerveau particulièrement agressif. Cette étude vise à comprendre où et comment cette protéine agit dans la tumeur, afin de mieux expliquer l’apparition de la maladie. Elle permettra également d’évaluer l’efficacité d’un traitement innovant, basé sur un anticorps ciblant cette protéine, utilisé seul ou en association avec une immunothérapie, et d’en mesurer l’impact sur les défenses immunitaires du cerveau.

Bénéfices attendus

Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeur originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 12-18 mois. Cette étude évaluerait l’efficacité d’un nouveau traitement.

Procédures

Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées (3x/semaine

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations (pesées, traitements) peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie et des imageries. Les nuisances liées à une procédure chirurgicale (douleurs au niveau de la plaie, céphalées).

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter différents organes et/ou les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.

Remplacement

La protéine d’intérêt étudiée est impliquée dans plusieurs mécanismes associés aux tumeurs qui nécessitent donc la présence de multiples populations cellulaires en interactions complexes. Les cancers du cerveau se caractérisent par la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer. Les tests précliniques sont aussi indispensables pour valider la capacité d’un nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur au niveau du cerveau (organe protégé par une multitude de barrières physiologiques), et vérifier son efficacité seul ou en combinaison avec des traitements anti-cancéreux existant comme l’immunothérapie pour élaborer de nouvelles stratégies de traitement.

Réduction

Le nombre de groupe et l’effectif de chaque groupe d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques, notamment pour caractériser l’expression spatiale de la protéine d’intérêt au niveau du cerveau des souris.

Raffinement

Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’implantation intracrânienne, les injections et le suivi de croissance tumorale sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et antidouleurs adaptés.

Choix des espèces

La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des mâles et femelles à 8 semaines pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.

2 700 souris, toutes classées en souffrance sévère et toutes tuées à l'issue, vont être infectées par le virus respiratoire syncytial puis traitées par des molécules candidates administrées par voie orale, nasale, intraveineuse ou dans le muscle. Les manipulations répétées incluent gavages, injections et prélèvements sanguins, le gavage comportant un risque d'étouffement en cas de fausse route. Les fonctions respiratoires sont mesurées sur l'animal éveillé, et les organes prélevés après la mise à mort. Le porteur justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité des réponses immunitaires d'un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre les infections causées par le virus respiratoire syncytial (VRS), un virus responsable notamment de bronchiolites chez les nourrissons, et de développer de nouveaux traitements ou moyens de prévention. Pour cela, nous utilisons des modèles chez la souris qui permettent de reproduire la maladie observée chez l’être humain. Nous étudions comment le virus se développe dans l’organisme, comment il se propage et comment la maladie évolue au fil du temps. Nous analysons aussi la manière dont le corps réagit face à l’infection, en particulier au niveau des poumons, mais aussi dans d’autres organes. Cela nous aide à comprendre pourquoi certaines personnes développent des formes plus graves ou plus longues de la maladie. Le projet permet également de tester de nouveaux traitements et des vaccins potentiels afin de vérifier s’ils peuvent diminuer la gravité de l’infection, réduire les symptômes et éviter les complications. Enfin, nous appliquons les principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), qui visent à limiter l’utilisation des animaux et à réduire leur inconfort. Avant toute étude chez l’animal, les traitements sont d’abord testés en laboratoire sur des cellules. Nous adaptons également nos méthodes pour utiliser le moins d’animaux possible et assurer leur bien-être.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les VRS et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.

Procédures

Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : -Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, -Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par le muscle, -Par le nez, -Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques. Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. - Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. Dans ce cas l’animal sera placé en position verticale et frictionné afin de dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate sera réalisée. - Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. - Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. Une compression douce suite à l’injection est exercée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome. - Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. Si une détresse respiratoire ou une fausse route surviennent l’animal sera placé en position verticale et frictionné pour dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate est réalisée. - Equipement d'analyse des fonctions respiratoires : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. Afin de limiter cet inconfort une période d’entrainement préalable est mise en place : par une habituation une à deux fois pendant 30 minutes, dans un délai de deux à trois jours avant les mesures. - Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève, une compression douce et immédiate est alors appliquée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome.

Devenir

Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.

Remplacement

À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Les lignées murines utilisées dans ce projet incluent des animaux génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de certaines mutations sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les mécanismes de la réponse immunitaire. Ces modifications génétiques sont utilisées exclusivement dans un objectif de compréhension fonctionnelle des voies impliquées dans l’infection et la pathologie respiratoire. Il est important de préciser que ces lignées ne présentent pas, en conditions d’élevage standard, de phénotype dommageable spontané associé à la modification génétique. Elles possèdent un système immunitaire globalement fonctionnel et ne développent pas d’altération physiologique ou comportementale en dehors du contexte expérimental. L’utilisation de ces modèles permet néanmoins de reproduire ou de moduler spécifiquement des voies biologiques d’intérêt (par exemple des récepteurs ou voies de signalisation impliquée dans l’entrée virale ou la réponse immunitaire), afin d’évaluer leur rôle dans la susceptibilité à l’infection et dans la sévérité de la maladie. Ces approches sont indispensables pour établir un lien causal entre une fonction génique donnée et la réponse à l’infection. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées sont utilisées non pas en raison d’un phénotype dommageable intrinsèque, mais comme outils expérimentaux permettant de disséquer les mécanismes de l’infection virale et de la réponse de l’hôte. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature.

Dix-huit rats rendus diabétiques subissent deux chirurgies pour créer une plaie chronique sur le dos, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur peau. Le pansement est changé deux fois par semaine sous anesthésie et les rats restent isolés en cage jusqu'à cicatrisation. Le projet teste un patch libérant du monoxyde d'azote, déjà essayé sur des plaies aiguës, avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur écarte tout remplacement, la cicatrisation mettant en jeu des mécanismes qu'il juge impossibles à reproduire en laboratoire.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec, en France, près de 500 000 patients concernés dont les pathologies principales sont des ulcères de jambe, des plaies du pied chez les diabétiques et des escarres. Une plaie est considérée comme chronique si elle n'a pas cicatrisé après 4 à 8 semaines malgré un traitement adapté. Ces plaies entraînent des impacts négatifs sur la qualité de vie du patient, et leur prise en charge induit des coûts importants. Il est connu que le monoxyde d’azote, molécule naturellement présente dans l’organisme, joue un rôle essentiel dans la cicatrisation. Aucun patch cicatrisant libérant du monoxyde d’azote n’est actuellement disponible sur le marché car sa mise en place est complexe. Pour répondre à cette problématique, un nouveau matériau a été développé. Afin d'être représentatif de la réalité clinique, ce projet consiste à tester ce patch sur un modèle animal de plaie chronique, avant d’envisager une évaluation clinique chez l’humain. Les objectifs sont donc d'abord d'évaluer la sécurité et l’efficacité des patchs libérateurs de monoxyde d’azote sur la cicatrisation d’une plaie chronique sur un modèle animal, puis par la suite d'évaluer les effets sur les cellules de la peau.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies est un processus naturel qui permet à la peau de se réparer mais une plaie mal soignée peut entraîner des complications (par exemple les plaies chirurgicales ou les ulcères du pied chez les personnes diabétiques). Ces plaies augmentent aussi le risque de mortalité des patients, pouvant atteindre jusqu’à 20 % selon les cas. Pour améliorer leur prise en charge, il est essentiel de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements et dispositifs médicaux. Les travaux menés dans le cadre de cette demande d'autorisation de projet viendront renforcer les résultats et les données de sécurité déjà obtenues sur l’efficacité et la sécurité des patchs développés dans le cas de plaies aigues. Ces données permettront d’initier une démarche pour aboutir à la mise en place d’une étude chez l'humain sur la plaie chronique du diabétique et l’escarre. A terme, ces dispositifs pourraient être utilisés chez l’Homme pour aider à guérir des plaies chroniques difficiles à cicatriser.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale évaluées à 30 minutes maximum chacune, pour l’induction d’une plaie cutanée au niveau du dos. Puis le pansement sera changé deux fois par semaine sous anesthésie générale (15 min environ). Un prélèvement sanguin par semaine (30 secondes) sera réalisé lors de cette anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cages individuelles juste après l'intervention et jusqu'à la cicatrisation, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement et surtout les patchs placés dans les plaies cutanées, ce qui pourra conduire à un stress à cause de la limitation des interactions sociales directes. Par ailleurs, la plaie elle-même pourra entraîner une douleur, qui nécessitera un traitement antidouleur injectable. La répétition de l'ensemble des gestes pour changer le pansement et réaliser les prélèvements pourra altérer légèrement le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être gardés vivants car des prélèvements de peau seront réalisés à la fin de la procédure, pour étudier les effets des patchs au niveau microscopique. C'est pourquoi tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le processus de cicatrisation met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire en laboratoire (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être évalué que sur un organisme vivant et entier. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles autres pour réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée. Le remplacement de ce modèle par des méthodes alternatives n'est donc pas envisageable dans le cadre de cette étude.

Réduction

Le choix de 6 rats par groupe, soit un total de 18 animaux répartis en trois groupes, repose sur les recommandations usuelles pour ce type d'étude. Ce nombre permet de disposer d’un effectif suffisant pour une évaluation descriptive de l’efficacité et de la sécurité du patch libérateur de monoxyde d’azote, tout en respectant le principe éthique de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux utilisés sont des rats diabétiques, ce qui peut entraîner une plus grande production d’urine et une soif augmentée. Pour garantir leur confort, leur habitat sera particulièrement surveillé : beaucoup de litière pour absorber l’urine, litière changée au moins trois fois par semaine (ou plus si besoin), et biberons renouvelés aussi trois fois par semaine. Chaque jour leur état général, leur comportement et leur poids seront attentivement surveillés et ces informations seront notées sur une fiche de suivi. Après l'intervention chirurgicale, chaque rat sera placé seul dans une cage pour éviter l'arrachement du pansement par ses congénères. Cependant, pour qu’il garde un contact social, les cages seront transparentes et ouvertes, permettant de voir, sentir et entendre les autres animaux. Toutes les interventions (création de la plaie, changement des pansements, prélèvements) seront réalisées sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Un médicament antidouleur sera donné avant la création de la plaie, puis régulièrement après si nécessaire. Les opérations seront courtes, réalisées dans un environnement propre, et la température corporelle des animaux sera surveillée. Les plaies seront protégées par un pansement, et leur cicatrisation sera suivie grâce à un système de notation. Si certains signes inquiétants apparaissent (comme une perte de poids importante ou une infection), les mesures prévues dans la fiche de suivi seront appliquées, pouvant aller jusqu’à l’euthanasie pour éviter toute souffrance supplémentaire.

Choix des espèces

Le rat est souvent utilisé dans les études sur la cicatrisation, car c’est un modèle fiable et bien connu. Dans ce projet, on utilise des rats diabétiques,car leur maladie entraîne deux problèmes qui ralentissent la guérison des plaies : une mauvaise circulation sanguine (comme chez les patients diabétiques) et un manque d’apport en oxygène dans les tissus, comme dans le cas des escarres. Cela permet donc d’étudier un modèle de plaie qui ressemble réellement à une plaie chronique chez l’être humain. De plus, un précédent test du patch a déjà été réalisé chez le rat dans un modèle de plaie aiguë, ce qui rend pertinent d’utiliser la même espèce pour pouvoir comparer les résultats. Les animaux choisis auront environ 10 semaines au début de l’étude. À cet âge, ils présentent déjà une glycémie élevée et stable, ce qui reproduit assez fidèlement le métabolisme d’une personne diabétique. C’est aussi un moment où la cicatrisation de la peau commence à être ralentie, sans que la santé générale du rat ne soit trop affectée. Ce choix permet donc d’étudier les mécanismes qui retardent la guérison des plaies et de tester des traitements dans des conditions réalistes, tout en garantissant des résultats fiables et comparables.