Procédures sévères
Contrôle de la balance énergétique par l’incrétine GIP via le bulbe olfactif
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
940 souris vont être utilisées pour étudier une hormone intestinale et l'obésité, 600 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 340 modéré, toutes tuées par surdose d'anesthésique. La moitié est rendue obèse par un régime hypercalorique de trois à six mois, opérée pour implanter une canule dans le cerveau, puis isolée jusqu'à douze semaines. La queue est sectionnée aux ciseaux, un geste que le porteur classe comme douleur légère. L'isolement, qu'il reconnaît comme un stress en soi, sert à protéger les canules.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique en forte augmentation et constitue un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2, une maladie caractérisée par un excès de sucre dans le sang. Ce dérèglement est lié à une mauvaise régulation de l’insuline, une hormone essentielle produite par le pancréas. Dans ce projet, nous étudions une hormone intestinale, déjà utilisée dans le traitement du diabète, mais dont le rôle au niveau du cerveau reste encore mal compris. Nous nous intéressons plus particulièrement au bulbe olfactif, une région cérébrale impliquée dans la perception des odeurs. Des travaux récents suggèrent que le cerveau pourrait influencer très précocement la sécrétion d’insuline, dès la perception des signaux alimentaires. Nous faisons l’hypothèse que cette hormone intestinale agit dans le bulbe olfactif pour activer des circuits nerveux reliant le cerveau au pancréas. À l’aide de modèles animaux, nous étudierons les effets de cette hormone intestinale administrée directement dans le cerveau ou par voie intranasale, une méthode non invasive permettant d’atteindre le cerveau via le museau de l'animal.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les liens entre perception sensorielle, cerveau et métabolisme, et pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’obésité et le diabète.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : #1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 à 6 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. #2. Les animaux seront opérés pour placer une canule au niveau du cerveau permettant l’injection de molécules directement dans le cerveau. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. #3. Les animaux seront injectés avec des médicaments une fois par jour pendant 7 jours, par voie intranasale ou intrapéritonéale. #4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests métaboliques : quatre fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront toujours libres de leurs mouvements dans nos expériences. #5. Nous devrons isoler une partie des animaux (seul dans une cage) pendant 2 à 12 semaines, en fonction de nos expériences.
Impact sur les animaux
#1. Régime hypercalorique : Après 3 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2 (intolérance au glucose et résistance à l'insuline), ces nuisances sont modérées. #2. Les animaux qui subiront une injection intranasale peuvent avoir une gêne respiratoire par l'irritation passagère due au liquide placé dans les fosses nasales. #3. Chirurgie : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs modérées et des problèmes de récupération modérés. #4. Tests métabolique : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux (nuisances légères). La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur considérée comme légère. Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible (uniquement chez les animaux non obèses). #5. Isolement : Après la chirurgie, les animaux seront isolés afin d'éviter que les canules de perfusion ne soient endommagées dans leurs interactions sociales et ne les blessent. Cet isolement est un stress en soi. #6. Analyse de calorimétrie indirecte : les animaux seront individualisés pendant 15 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids (nuisance modérée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique afin de prélever des tissus.
Remplacement
Afin d'étudier le rôle d'une hormone intestinale sur le cerveau, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées au niveau d'une zone précise du cerveau : le bulbe olfactif. Nous souhaitons également injecter et faire pénétrer une molécule pharmacologique dans le cerveau par voie intranasale, afin d'obtenir une voie d'accès non-invasive, pour moduler positivement le métabolisme énergétique des souris obèses. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de cette hormone dans le contrôle de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’humain.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et afin d’ obtenir des données statistiquement analysables, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 10 à 12 souris par condition de traitement. De plus, les procédures n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux, intercalées avec des périodes de repos de 7 jours, au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués par nos soins. Nous prendrons soin d'utiliser les mêmes souris pour effectuer des injections croisées entre placebo et molécule pharmacologique. Ainsi les souris seront leur propre témoin à l'intérieur de chaque procédure, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique avant l'acte, qui pourra être poursuivi après l'acte pour prévenir la douleur. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants la chirurgie, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance. Pour éviter tout problème respiratoire pendant l'administration intranasale chez la souris, il sera procédé à une administration par narine à la fois, avec un temps de pause de 3 minutes entre les 2 narines, pour laisser le temps à la souris de récupérer de la première contention et également d'observer son comportement. Pour les tests métaboliques, nous avons limité au maximum les prélèvements de sang nécessaires aux mesures du glucose et de l'insuline, afin de réduire l'impact sur le bien-être animal. Le bien-être de l’animal sera évalué régulièrement par le suivi du poids, la mesure de la prise alimentaire et de la prise hydrique. Des points limites ont été établis préalablement pour chaque procédure afin de veiller au bien-être animal. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous utiliserons les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle physiologique de notre hormone d'intérêt dans le contrôle de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Les expériences seront effectuées sur des souris agées de 8 semaines et au-delà, ce qui permet de travailler sur des animaux adultes, lorsque que toutes les structures cérébrales sont stabilisées dans leur développement.
Les Effets Longitudinaux de la Psilocybine sur le Sommeil Chez La Souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
336 souris reçoivent une injection unique de psilocybine, dont 56 après l'implantation chirurgicale d'un dispositif d'enregistrement cérébral de deux heures, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse histologique du cerveau. Certaines subissent des privations de sommeil répétées et deux tests comportementaux de locomotion et d'anxiété, pour décrire comment la substance modifie le sommeil sur un mois. Les améliorations du sommeil rapportées chez l'humain, que le porteur invoque, restent au conditionnel face à ces atteintes.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment les champignons hallucinogènes, une substance psychoactive, modifient temporairement l’activité cérébrale, et peuvent influencer le sommeil à court terme et/ou sur plusieurs semaines. Le sommeil joue un rôle essentiel dans la santé mentale et physique, mais les mécanismes biologiques expliquant pourquoi cette substance peut modifier durablement la qualité du sommeil restent mal compris. L’objectif est donc de décrire précisément les changements de sommeil induits par cette substance et d’identifier quels circuits cérébraux et quelles cellules pourraient être impliqués dans ces effets. Pour répondre à ces questions, l’étude utilisera des souris adultes. Le sommeil sera enregistré de manière répétée au cours du temps afin de comparer, chez un même animal, une période de référence (avant administration) et plusieurs périodes de suivi (immédiatement après, puis une semaine, deux semaines et un mois plus tard). En complément, des tests comportementaux simples et non invasifs permettront d’évaluer l’exploration et des indicateurs liés à l’anxiété, car ces dimensions peuvent interagir avec le sommeil.
Bénéfices attendus
La psilocybine fait l’objet d’un intérêt clinique croissant en psychiatrie, avec des essais contrôlés rapportant des améliorations rapides et parfois durables des symptômes dans la dépression (notamment épisodes dépressifs majeurs et formes résistantes), et un champ de recherche en expansion pour d’autres troubles liés au stress et au trauma dans des cadres thérapeutiques encadrés. Parallèlement, de nombreux travaux et retours cliniques chez l’humain rapportent, après une prise, une amélioration subjective de la qualité du sommeil (sommeil perçu comme plus réparateur), même si la physiologie du sommeil reste encore insuffisamment caractérisée. Le projet vise donc à mieux caractériser les effets aigus et long terme de la psilocybine sur l’architecture du sommeil et son homéostasie et identifier les effets cellulaires. Ces résultats pourraient améliorer l’interprétation des effets thérapeutiques rapportés en clinique et contribuer à l’optimisation de stratégies de prise en charge où le sommeil est un déterminant majeur du pronostic et de la résilience psychique.
Procédures
Les contraintes pour les animaux proviennent principalement de : (i) l’implantation d’un dispositif d’enregistrement chez 56 souris, correspondant à une chirurgie unique, qui dure environ 2H , suivie d’une récupération de 4 jours ; (ii) une injection expérimental unique (15s) du psychoactive sur 336 souris au total; (iii) des sessions d’enregistrement du sommeil de 24 h réalisées chez 56 souris réalisé 4 fois à 7 jours d’intervalle ainsi que, pour certains de ces animaux, des privations douces de sommeil limitées à 4 h suivies d’un enregistrement de 2 h post-privation pour étudier comment l’organisme essaye de récupérer 4h de sommeil en moins. Deux tests comportementaux non invasifs seront réalisés chez 56 souris à raison de 3 sessions espacées de 24H minimum pour chacun des tests. Le premier test consiste à mesurer la locomotion et l’anxiété (une durée de 10 minutes et qui sera réalisé deux fois pour étudier les effets de la substance psychoactive avant et après son injection). Le deuxième test étudie seulement l’anxiété, et dure aussi 10 minutes, et sera répété qu’une fois 30 jours après l’administration de la substance psychoactive.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées à la chirurgie d'implantation (douleur post-opératoire, inconfort lié aux implants, risques d'infection). La psilocybine peut induire des modifications transitoires du comportement (hyperlocomotion, réactivité accrue); la surveillance post-injection est donc renforcée.
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux sont une mise à mort adaptée pour chaque procédure. Les objectifs poursuivis dans cette étude nécessitent des analyses histologiques des tissus cérébraux ainsi que certains enregistrements ex vivo, ce qui oblige à mettre les animaux à mort en fin de procédure.
Remplacement
L’étude cherche à comprendre comment une substance pouvant modifier l’activité cérébrale influence le sommeil dans un organisme entier, et comment ces effets s’accompagnent de changements durables dans certaines régions du cerveau. Ces questions nécessitent d’observer simultanément le sommeil, l’activité, la température et des réponses biologiques intégrées (réseaux cérébraux, interactions entre différents types de cellules), ce qui ne peut pas être reproduit de façon fiable par des méthodes entièrement alternatives. Des approches non animales (cultures cellulaires, organoïdes, modélisation) peuvent aider à explorer certains mécanismes isolés, mais elles ne permettent pas de mesurer l’architecture du sommeil ni ses régulations physiologiques sur plusieurs semaines. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le projet est conçu pour utiliser le moins d’animaux possible tout en assurant des résultats robustes. La stratégie repose sur des suivis dans le temps d’un même animal et sur plusieurs types d’expériences quand celles-ci ne sont pas invasives ou que c’est possible en respectant le bien-être des animaux, diminuant ainsi la variabilité statistique.
Raffinement
Toutes les procédures sont organisées pour limiter la douleur, le stress et la durée de contrainte. Une habituation progressive est mise en place (manipulation douce, acclimatation aux conditions d’enregistrement) afin de réduire l’anxiété liée aux manipulations. Pour les animaux nécessitant une chirurgie, l’intervention est réalisée sous anesthésie avec des mesures de prévention de la douleur en utilisant des analgiques avant et après l’opération, et une surveillance post-opératoire renforcée ; une période de récupération est respectée avant les enregistrements. Les périodes de privation de sommeil sont limitées dans le temps et réalisées par des stimulations douces, sans recours à des méthodes aversives, avec un retour rapide à des conditions calmes. Les tests comportementaux sont non invasifs, effectués sur des durées minimales, dans une salle dédiée, avec nettoyage systématique et retour rapide au logement. Des critères d’arrêt anticipé (points limites) et une mise à mort précoce sont prévus en cas de signe de souffrance non contrôlée, afin de garantir le niveau de bien-être maximal compatible avec les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est utilisée car elle constitue un modèle de référence pour l’étude du sommeil : elle présente des états de vigilance bien caractérisés et permet des suivis répétés à l’échelle de plusieurs semaines nécessaires à l’analyse des effets persistants. Enfin, l’espèce murine permet le recours à des outils génétiques et histologiques indispensables aux objectifs du projet. De plus, nous étudierons ces effets sur des souris âgées de 80 jours, là où la maturation du cerveau est finie, et donc le sommeil stabilisé, assurant que les effets que nous allons voir ne peuvent pas être attribués à l’âge.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris porteuses d'une myopathie qui les tue en moyenne vers treize semaines vont être utilisées, dans des procédures classées légères à sévères. Elles subissent des injections quotidiennes pendant 28 jours, des tests de force et de course, une stimulation électrique de la jonction neuromusculaire et l'injection d'un virus. Le RNT répète que cette maladie "ne provoque pas de douleur", tout en classant 418 de ces souris en souffrance sévère et en décrivant une dégradation musculaire jusqu'à la mort. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles et tester trois traitements censés prolonger leur survie.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Impact de l’hyperactivité amygdalienne au cours du développement sur l’apprentissage émotionnel (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence dérègle les émotions, 288 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal reçoit une injection de virus dans le cerveau, subit un conditionnement par chocs électriques aux pattes, des séances d'IRM sous anesthésie et une restriction alimentaire de deux mois et demi pour le motiver à une tâche. Le RNT reconnaît que cette étude longitudinale cumule les nuisances de chaque étape sur le même animal, de la chirurgie aux électrodes implantées. La mise à mort, par perfusion intracardiaque pour une partie des rats, sert à analyser leur cerveau.
Objectifs
Chez l’humain, l’hyperactivité d’une structure cérébrale particulière, l'amygdale, est souvent corrélée avec des dysfonctionnements émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. L’objectif scientifique de ce projet, mené en collaboration par deux établissements multisites, est de manipuler l’activité de cette structure au cours du développement post-natal, grâce à l’augmentation de l’activité d’une voie de signalisation intracellulaire et d’analyser son impact sur le comportement d’anticipation temporelle d’un stimulus aversif et ses corrélats neuronaux dans la connectivité de cette structure avec d’autres structures cérébrales. Nous chercherons à perturber l’activité de cette structure chez le rat au stade juvénile ou au début de l’adolescence grâce à l’injection d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette suractivation sur les comportements émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements émotionnels, par IRM fonctionnelle et enregistrements électrophysiologiques in vivo. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés avant et pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.
Bénéfices attendus
Chez l’humain, l’hyperactivité de l’amygdale est souvent corrélée avec des dysfonctionnements émotionnels et l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Ce projet vise à comprendre la dynamique de l’impact d’une modification de l’amygdale par le virus anti-Tsc2 pendant la période critique de l’adolescence sur la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur à l’adolescence jusqu’à l’âge adulte. Au niveau fondamental, ce projet apportera des informations sur la dynamique développementale des circuits sous-tendant les processus émotionnels, le traitement temporel des événements aversifs et leurs corrélats neuronaux, ainsqi que le contrôle par l’amygdale de la maturation de ces circuits et leur connectivité au cours de l’adolescence. Ce projet pourra constituer un modèle animal d’étude des mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme à la jonction entre la pathologie autistique associée à TSC2 et le stress post traumatique (PTSD).
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (juvénile ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. A la fin de l’adolescence, ils seront ensuite soumis à un conditionnement aversif (1 séance d’une heure), puis 24-48h plus tard testés (1 à 2 séances d’une heure). Ils seront ensuite transportés vers l’EU 2 dans un véhicule agréé avec des cages dédiées (eau à volonté, pas de modification des groupes sociaux, présence d'enrichissement, durée du transport ~ 10 min), afin de réaliser une session d’acquisition IRM sous anesthésie légère (durée maximale de 2 heures). Ils seront ensuite transportés dans les mêmes conditions vers l’EU 1 pour être à nouveau testés pour leur mémoire du conditionnement, puis entraînés à réaliser une tâche comportementale à la fois appétitive et aversive qui nécessite un apport de nourriture contrôlé (~2,5 mois) à raison d’une séance d’une heure à une heure et demi par jour au moins 5 jours sur 7. Une nouvelle session d’acquisitions IRM sera réalisée (durée maximale de 2 heures), impliquant un aller-retour vers l’EU 2 et une anesthésie légère. Puis ils seront ré-entrainés pour subir ensuite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans trois régions d’intérêt. Après une semaine de récupération, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale et enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (~2,5 mois). Ils seront tous euthanasiés sous anesthésie, suivi pour certains d’une exsanguination par perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.
Impact sur les animaux
La chirurgie (injection de virus, implantation des électrodes) engendre dans certains cas une douleur post-opératoire. Le conditionnement Pavlovien aversif nécessite de donner de légers chocs électriques de durée brève (500ms) au niveau des pattes de l’animal, ce qui peut provoquer un léger stress initialement. Cependant, avec l’apprentissage, le fait qu’un stimulus prédise l’arrivée du choc diminue rapidement ce stress et ne laisse plus qu’un comportement d’immobilité lors du stimulus en préparation de la réception du choc, avec un léger sursaut de l’animal. La tâche comportementale appétitive n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). L’alimentation est contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux. Cette restriction est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. L’IRM étant une modalité de neuroimagerie non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Une légère perte de poids peut être observée le lendemain, suite au stress potentiellement induit par la combinaison IRM et transport des animaux vers l’établissement où sont réalisées les IRM, même s’il est très proche. Une légère douleur peut faire suite au placement de l’animal dans des barres d’oreille lors de l’examen IRM. Le fait que cette étude soit longitudinale induit un cumul des nuisances de chaque étape (chirurgie, conditionnement aversif, nourriture contrôlée, IRM) chez le même animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).
Remplacement
Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités neuronales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (perte à la chirurgie, mauvaise localisation de l’injection virale et/ou des électrodes, mauvais signal d’enregistrement). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique classiquement utilisée dans la littérature pour ce type de données sera effectuée. L’étude, prévue chez les mâles et femelles, commencera avec l’injection chez les rats mâles, en raison des données pilotes déjà obtenues sur les coordonnées des sites d’injection et les enregistrements électrophysiologiques in vivo simultanément dans les trois structures cérébrales (coordonnées d’implantation déjà validées). Cela permettra de focaliser ensuite les expériences avec les analyses pertinentes pour une comparaison avec les femelles. De plus, les deux virus actifs sont censés produire les mêmes effets. Nous commencerons avec la comparaison d’un des virus actifs avec le virus contrôle pour caractériser les effets. Si les premières données montrent que les deux virus actifs ont des effets similaires, nous pourrons alors poursuivre l’étude sur des mâles et femelles, mais en ne comparant que deux groupes (Contrôle et virus actif) au lieu de trois, ce qui réduira grandement le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de maximiser l’acclimatation et réduire le stress des animaux, leur naissance sera faite dans la salle dédiée adjacente aux salles de chirurgie pour injection virale. Après sevrage, les rats sont manipulés et pesés fréquemment (au moins 1j/3) jusqu’au début de l’expérience, afin de les habituer à l’expérimentateur. Pour la chirurgie, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de la chirurgie ne seraient pas suffisantes. Une grille de score sera utilisée pour évaluer la douleur et l’inconfort des animaux notamment pendant le suivi post-opératoire. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille pour minimiser le risque de cogner l’implant). De plus, nous utilisons un cache des implants permettant de loger les animaux à deux par cage et nous avons des supports d’implants cérébraux améliorant le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifié (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour réduire les risques de se coincer l’implant. Les transports entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face se feront par transporteur et véhicule agréés. Le confort et la sécurité des animaux seront garantis durant toute la durée du transport (eau à volonté, sans modifications des groupes sociaux, présence d'enrichissement). Une période d'acclimatation à l'arrivée sera observée pour garantir aux animaux une période de repos. L’IRM est réalisée sous anesthésie, dans un berceau chauffé, avec contrôle de la respiration et de la température et si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. Le rat est le modèle de choix du laboratoire, car les structures cérébrales étudiées ici chez le rat ont leur correspondant chez l’humain et l’animal permet un accès à des méthodes invasives ne pouvant être faites chez l’humain. La taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central (en particulier pour l’injection chez le juvénile). La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de données importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures, dont le cortex préfrontal, qui sont impliquées dans la majorité des comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et dès le début de l’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de cette structure avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès que les virus sont incorporés dans les neurones principaux de l’amygdale, soit ~10 jours après l’injection et se poursuivront jusqu’à l’âge adulte, avec des analyses comportementales et d’IRM en fin d’adolescence, puis chez l’adulte au niveau comportemental et en corrélation avec des analyses au niveau fonctionnel par IRM et enregistrements électrophysiologiques.
Étude de l’effet d’une molécule visant à protéger le cœur et les muscles dans la dystrophie musculaire de Duchenne chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
119 rats atteints d'une forme de myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, un groupe étant laissé vivre la maladie jusqu'au décès autour de douze mois. Selon les groupes, ils reçoivent une pompe implantée sous la peau renouvelée toutes les quatre semaines, un capteur cardiaque, des échographies sous anesthésie et cinq prélèvements sanguins. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, 32 animaux étant opérés sous anesthésie et tués sans réveil. Le projet teste un dérivé d'oméga-3 censé protéger le cœur et les muscles, bénéfice renvoyé à d'éventuels essais chez l'humain.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (ou myopathie de Duchenne) est une maladie génétique grave causée par une mutation sur le gène codant pour la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des muscles. Elle touche uniquement les garçons et entraîne une faiblesse musculaire progressive, affectant à la fois les muscles du corps et le cœur. Avec le temps, ces faiblesses conduisent généralement à un décès prématuré causé par une insuffisance cardiaque et respiratoire. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, bien que plusieurs approches thérapeutiques soient en cours de développement. De nombreuses études ont montré que certaines graisses nommé « oméga-3 », issus de l’alimentation, ont des effets bénéfiques sur l’organisme. Ils aident à réduire l’inflammation et à améliorer certains paramètres sanguins, en particulier en diminuant des lipides comme les triglycérides. Ces oméga-3 protègent le cœur et les muscles, notamment en maintenant un bon équilibre du calcium à l’intérieur des cellules. Plus récemment, notre équipe a mis en évidence qu’un dérivé d’un oméga-3, possède des propriétés protectrices. Ce dérivé est capable de réduire les troubles du rythme cardiaque, l’inflammation et certains problèmes musculaires, en particulier au niveau du diaphragme. Dans le cadre de la myopathie de Duchenne, les atteintes musculaires et cardiaques ont, notamment un mécanisme commun les altérations de la régulation du calcium. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si les effets d’un traitement avec la molécule peuvent limiter l’évolution d’un modèle de rat atteint de myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Si les améliorations observées chez ces animaux concernant la mobilité, les fonctions respiratoires et cardiaques sont confirmées, ces résultats pourraient potentiellement ouvrir la voie à des études chez l’humain et servir de base au développement de futurs traitements. Au-delà des avancées scientifiques, ce projet pourrait apporter des bénéfices concrets aux patients et à leurs familles, en orientant la recherche vers des stratégies thérapeutiques capables d’améliorer la qualité de vie, ce qui contribuerait à prolonger l’espérance de vie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront répartis en plusieurs groupes et suivront différentes procédures expérimentales. Un premier groupe de 32 animaux recevra une injection. Un second groupe de 18 animaux sera équipé d’un petit dispositif implanté sous la peau, permettant d’administrer le traitement de manière continue et contrôlée. Deux groupes de 23 animaux chacun recevront à la fois ce dispositif d’administration du traitement (une pompe osmotique) et un petit capteur implanté permettant de suivre à distance l’activité du cœur (un capteur télémétrique). Ces animaux bénéficieront également d’examens d’imagerie du cœur (des échocardiographies) réalisés sous anesthésie, ainsi que de prélèvements sanguins, effectués cinq fois au total, dans le cadre de procédures à court et moyen terme. Un dernier groupe de 23 animaux sera suivi sur une période plus longue. Le dispositif d’administration du traitement sera renouvelé toutes les quatre semaines, jusqu’au décès de l’animal. Les interventions sont brèves : les injections durent moins de 5 minutes, les imageries cardiaques environ 15 minutes, les mesures d’activité respiratoire et de force 30 min, et la mise en place des dispositifs implantés moins de 30 minutes. Toutes les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie. Un suivi régulier est assuré afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude.
Impact sur les animaux
Les rats malades qui ne reçoivent pas de traitement vont vivre la maladie, présentant un niveau de stress plus élevé, dont les premières manifestations cliniques apparaissent généralement à partir de 3 semaines. Pour ces animaux, la maladie progressant, leur état devrait se détériorer entre 6 et 10 mois jusqu’au décès autour de 12 mois, au plus tard. Des effets peuvent survenir lors de l’implantation unique du capteur télémétrique et de la pompe osmotique, ainsi qu’au cours des anesthésies gazeuses nécessaires aux échocardiographies. Ces effets incluent principalement un inconfort ou une douleur légère au site d’implantation, une inflammation locale passagère, ainsi qu’un stress lié aux manipulations. Les anesthésies gazeuses peuvent entraîner une fatigue, une désorientation brève au réveil et une baisse de la température corporelle. L’ensemble de ces manifestations est généralement de courte durée et disparaît spontanément, sans séquelles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les dystrophies musculaires notamment de Duchenne touchent plusieurs organes (les muscles, le cœur, le cerveau ...). Avant toute expérimentation animale, ce traitement a fait l’objet d’études approfondies sur des cellules, assurant une compréhension des mécanismes biologiques impliqués. L’administration de la molécule a déjà montré des effets bénéfiques sur le muscle et le cœur validés dans des modèles expérimentaux rigoureux, chez la souris ensuite chez le cochon, pour des applications proches (une altération du diaphragme). Cette démarche progressive garantit que l’utilisation d’animaux est strictement limitée aux questions scientifiques qui ne peuvent être résolues autrement, tout en respectant les principes éthiques.
Réduction
L’équipe de recherche possède une solide expérience sur cette lignée animale. Des analyses statistiques ont été réalisées pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires grâce aux essais déjà obtenus, tout en garantissant la robustesse des résultats. Pour ce projet, nous avons conçu une série de procédures complémentaires, chacune optimisée pour limiter l’utilisation d’animaux. En effet, les expériences sont planifiées pour combiner plusieurs mesures sur un même animal. Chaque animal est suivi précisément, ce qui réduit le risque de perte et donc le besoin d’en utiliser plus. Les procédures sont répétées uniquement si nécessaire. Certaines procédures reposent sur un suivi au long terme permettant que chaque animal soit observé à plusieurs moments et puisse être comparé, ce qui augmente la précision statistique sans avoir besoin d’en utiliser davantage.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à un contact doux et régulier afin de limiter le stress lié aux manipulations. Chaque jour, un temps d’interaction est prévu pour maintenir une relation calme et positive avec les intervenants. De plus, des séances de jeux dans des espaces plus larges seront ponctuellement effectuées. Ils sont hébergés en groupe dans un environnement confortable favorisant leur bien-être La prise en charge de la douleur est assurée tout au long des procédures, de façon préventive et curative si nécessaire, grâce à l’administration de médicaments destinés à l’anesthésie et au soulagement de la douleur. Pour détecter rapidement tout signe de souffrance, des critères de suivi du bien-être ont été établis et évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères concernent l’apparence générale des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité, interactions) et leur état physique (masse corporelle). En cas de signe de douleur ou de gêne, des mesures adaptées sont mises en place immédiatement : surveillance renforcée et traitement médicamenteux pour réduire ou éliminer la douleur.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère proche de l’être humain sur le plan biologique, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Il partage de nombreux aspects avec l’humain, concernant la structure et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux avancées récentes en génétique, il est aujourd’hui possible de reproduire chez le rat certaines maladies humaines, notamment les troubles musculaires, de manière très fidèle. Ce modèle conserve par ailleurs les avantages propres aux rongeurs : une courte durée de gestation, une taille adaptée aux études expérimentales et une durée de vie compatible avec l'observation dans un temps raisonnable d'effets à long terme des médicaments testés sur des individus âgés. Il est un excellent complément aux autres modèles. Les animaux seront suivis dès 5 semaines afin d’évaluer l’effet du traitement sur la durée, en observant les signes cliniques de la maladie, notamment la motricité, la respiration et le fonctionnement cardiaque.
Caractérisation de modèles génétiques de cardiomyopathies hypertrophiques et évaluation préclinique de nouveaux traitements.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 5850
Traités avec les molécules de clients industriels, 16 770 rats et souris porteurs de mutations cardiaques reçoivent des composés une à deux fois par jour, des pompes implantées sous la peau et un cathéter posé dans la carotide en fin de protocole. Ces animaux, dont 12 780 dans des procédures classées sévères, sont tous tués pour prélever le cœur et le sang. Le projet évalue l'efficacité de candidats médicaments contre les cardiomyopathies, maladies génétiques touchant une personne sur 200. Le RNT annonce vouloir réduire les effectifs mais ne justifie pas ce total de près de 17 000 animaux, dont beaucoup manipulés dès leurs premiers jours de vie.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité mondiale, il est primordial de poursuivre la recherche dans ce domaine afin d’identifier et d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. Les atteintes cardiaques peuvent se manifester de différentes façons avec, entre autres, les cardiomyopathies qui se caractérisent par des anomalies fonctionnelles et structurelles du cœur. Elles touchent 1 personne sur 200 dans la population générale et sont, dans la majorité des cas, de causes génétiques/héréditaires. Elles touchent toutes les tranches d’âge, depuis l’enfance jusqu’à l’âge adulte. Il existe différentes formes de cardiopathies. Cette classification est basée sur les différences structurelles du cœur et les manifestations fonctionnelles associées. Il est donc nécessaire de caractériser le développement des cardiomyopathies, de comprendre les mécanismes mis en jeu pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments. Le développement de modèles prédictifs et robustes, ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels dans la prise en charge des cardiomyopathies.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, le prise en charge des cardiopathies consiste à traiter les symptômes et les complications en modifiant l’hygiène de vie des patients (alimentation, arrêt du tabac, activité physique) ou avec des médicaments. Ces mesures n’étant pas toujours suffisantes, la prise en charge de la maladie va, dans certains cas, nécessiter l’implantation de dispositifs tels que des stimulateurs ou des défibrillateurs ou encore des interventions chirurgicales. Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, afin de comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie, et leur temporalité au cours du développement de l’animal. Le but est d’identifier de nouvelles cibles potentielles qui pourraient devenir de nouveaux leviers dans la prise en charge des cardiomyopathies. Ainsi, l’ensemble des expériences effectuées dans ce projet ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouveaux médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.
Procédures
Pour reproduire les atteintes cardiaques des patients atteints de cardiomyopathies, des modèles rongeurs présentant des modifications génétiques seront utilisés afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments. Ces maladies se développant à des stades précoces, des expérimentations seront réalisées sur animaux dès leurs premiers jours de vie. Pour les animaux adultes, les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par différentes voies sur animal anesthésié ou vigile. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 à 15 minutes). Pour les animaux non sevrés (avant 21 jours), les composés à tester seront administrés une fois par jour sur animal vigile à partir du 7ème jour de vie. Après le sevrage, des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés (toutes les 3 semaines au maximum). Avant le sevrage, un seul prélèvement sera réalisé (entre 10 et 21 jours). Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Avant le sevrage, les animaux seront soumis à des suivis de l'évolution de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (15 minutes maximum) tous les 3 jours maximum à raison de 5 fois maximum sur 21 jours. Après le sevrage, les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (15 minutes maximum). Ces examens seront effectués au maximum toutes les 3 semaines. Les animaux (âgés d’au moins 4 semaines) seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course à 2 reprises : avant le début des traitements et à la fin des traitements. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiques faisant l’objet de ce projet vont développer des cardiomyopathies qui seront plus ou moins sévères selon la mutation génétique. Le retrait et le retour des nouveau-nés dans les cages lors des examens et/ou traitements vont générer du stress, à la fois pour le nouveau-né mais également pour la mère. Si les portées sont composées de plusieurs profils génétiques, une étape de génotypage sera nécessaire pour identifier et inclure les animaux portant la mutation d’intérêt. Ceci impliquera la réalisation d’une biopsie tissulaire (queue, oreille ou phalange) afin de procéder à l’analyse du profil génétique. Les mesures de la fonction cardiovasculaire, bien que non invasives, requièrent une anesthésie gazeuse des animaux à l’issue de laquelle l’animal met quelques minutes pour récupérer. Lors des chirurgies effectuées en fin de procédure, la douleur sera prise en charge par une anesthésie/analgésie adaptée à la procédure utilisée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder à la collecte des organes et du sang pour l'évaluation de critères d’efficacité des composés.
Remplacement
Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système biologique complet et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour sélectionner des candidats médicaments, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont pas encore suffisamment développés et ne peuvent pas refléter la complexité des mécanismes au sein de l’organisme de manière physiologique et intégrée. A l’heure actuelle, les répercussions fonctionnelles des cardiomyopathies ne peuvent être pleinement reproduites et donc étudiées que dans un système in vivo. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.
Réduction
Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. Les premières expérimentations permettront la caractérisation des modèles et l’évaluation de l’impact des mutations sur la fonction cardiaque. En se basant sur ces données, nous pourrons ajuster le nombre d’animaux par groupes dans les études d’efficacité. Les premières estimations seront basées sur notre expérience, les données bibliographiques et l’échange avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal de la fonction cardiaque réduisant le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). Le change de la cage sera planifié 1 à 2 jours avant la date de mise bas afin de permettre à la mère de construire son nid et éviter un nouveau change les jours suivants la mise-bas et ainsi limiter le stress. Autour de la période de mise-bas et la semaine suivante, une attention particulière sera portée aux cages concernées. Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Afin de limiter au maximum la manipulation des nouveau-nés, les pesées seront réalisées lors des examens échographiques. Pour les animaux âgés de moins de 7 jours, un point de vigilance sera porté à la poche de lait observable en l’absence de fourrure et au poids. A partir de 7 jours, d’autres critères tels que l’activité et l’aspect général seront également pris en compte. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), une grille de score spécifique est mise en place. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Lors de la procédure, des mesures non invasives de la fonction cardiaque peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques d'imagerie non invasives. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré et per-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs (rat et souris) sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires. Le génome des deux espèces étant connu et proche de celui de l‘Homme, il est possible de recréer chez la souris et le rat les mutations responsables des cardiomyopathies. Ainsi, il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe). Les maladies cardiomyopathiques pouvant se développer dès le plus jeune âge, les expérimentations se feront dans certains cas sur des animaux nouveau-nés. Les femelles gestantes seront réceptionnées dans nos locaux jusqu’à leur 16ème et 17ème jour de gestation pour les souris et les rats, respectivement. La mise-bas aura lieu dans nos animaleries et les expérimentations se feront sur les nouveau-nés à partir de 24h de vie. S’agissant d’un modèle de maladie chronique, les animaux seront utilisés, dans certain cas, jusqu’à l’âge adulte afin d’effectuer un suivi longitudinal de l’évolution de la pathologie (jusqu’à 24 semaines d’âge).
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de Glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
Porteuses d'un glioblastome greffé directement dans le cerveau, 225 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée à sévère, 135 relevant du niveau sévère. La tumeur est induite par injection de cellules dans le cerveau sous anesthésie, puis des nanoparticules sont administrées par le nez pour tester une thérapie génique. Le RNT décrit des symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids liés au développement de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'efficacité du traitement.
Objectifs
En France, les glioblastomes (GBM) frappent plus de 2400 personnes par an. Cette maladie touche majoritairement les adultes (45-70 ans) mais aussi les très jeunes et est classifiée par l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) comme des tumeurs très agressives. Ces tumeurs sont caractérisées par une hétérogénéité intra- et inter- tumorale très élevée, avec des zones de mort cellulaire et une prolifération microvasculaire. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs se résume à un traitement chimio-thérapeutique concomitant à la radiothérapie. L’exérèse chirurgicale partielle ou totale de la tumeur, lorsqu’elle est réalisable, demeure un élément déterminant de cette prise en charge et montre un effet considérable sur la survie des patients. Toutefois, malgré l'agressivité de cette stratégie thérapeutique, la survie des patients est évaluée à environ 18 mois. Ce taux de survie s’explique par les caractéristiques propres aux GBM, notamment la forte hétérogénéité des cellules neuronales responsables de l’initiation tumorale et la mise en place de mécanismes de résistance. La caractérisation moléculaire des GBM, a mis en évidence l’implication de petites molécules (acides ribonucléiques) dans le maintien de la survie cellulaire de ces cellules tumorales. Cet état de l’art, a conduit au développement de nanoparticules lipidiques qui transportent et relarguent les agents thérapeutiques directement dans la zone tumorale. Ainsi, pour la suite du projet, l’efficacité thérapeutique de ces nanoparticules sera évaluée sur un modèle de souris de glioblastome afin de déterminer la transposabilité clinique du système.
Bénéfices attendus
Face à l'échec des thérapies actuelles contre le GBM, le développement de nouvelles voies d’administration est devenu une priorité. Notre approche repose sur des molécules thérapeutiques innovantes dont l'efficacité dépend d'un système de délivrance sophistiqué. Les nanoparticules lipidiques utilisées ici assurent une libération contrôlée et un ciblage spécifique, palliant ainsi les limites de diffusion de ces molécules. L'administration intranasale vient renforcer cette stratégie en offrant un accès direct au compartiment cérébral, assurant une efficacité thérapeutique maximale. Ce projet propose donc une solution intégrée et novatrice, susceptible de transformer l'arsenal thérapeutique contre les tumeurs cérébrales agressives.
Procédures
Les cellules tumorales seront injectées directement dans le cerveau de souris anesthésiées. La procédure est estimée à 15 min par souris. L’administration par le nez de nos nanoparticules se fera sur souris anesthésiées. On estime cette procédure à 3 min par souris. La contention, la pesée et les diverses anesthésies sont estimées à moins d’une minute par souris.
Impact sur les animaux
La contention des souris pour les injections des analgésiques et anesthésiant peut induire du stress chez la souris. La contention est estimée à moins d’une minute par souris. La greffe des cellules tumorales est une chirurgie qui peut induire des douleurs chez la souris. Le développement de la tumeur GBM induit le développement de symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids chez la souris. L’administration intranasale répétée des nanoparticules peut induire une irritation des muqueuses nasales et est réalisée sous anesthésie générale légère.
Devenir
Après chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse de l’induction de la pathologie mais aussi pour évaluer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules.
Remplacement
Le développement de modèles cellulaires en 3 dimensions (type sphéroïdes, tumoroïdes et organoïdes) permet de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité de l’utilisation d’agents thérapeutiques. Toutefois, ces systèmes comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans le cerveau où se développent les glioblastomes. De plus, pour réaliser l’étude de biodistribution, il est nécessaire de passer sur un modèle in vivo.
Réduction
Les effectifs d'animaux ont été calculés à partir d'outil statistique. De plus, à l'issue d'une procédure, si nous n'observons pas d'induction de la pathologie chez les souris, la suite du projet ne sera pas conduite. Ce raisonnement sera également appliqué à la fin des autres procédures.
Raffinement
Des visites journalières des souris seront effectuées pour détecter la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Les souris seront observées quotidiennement pendant chaque pesée afin de détecter l’éventuelle apparition de signes de souffrance (points limites). Un traitement anti-douleur sera administré par voie sous-cutanée dès lors qu'un signe de souffrance est détecté. De plus les souris seront maintenues sur tapis chauffant après la chirurgie pour maintenir une température adaptée au réveil.
Choix des espèces
Le développement de thérapies à base de nanoparticules nécessite des études in vivo chez le petit animal, en complément des tests in vitro, pour évaluer leur devenir et efficacité. Les autorités imposent également ces données précliniques pour les nouveaux médicaments.. Enfin, l’utilisation des souris dépourvues de système immunitaire permet l’implantation des cellules tumorales humaines sans rejets de l’espèce. Des souris âgées entre 8 et 10 semaines seront utilisées pour toutes les procédures du projet. Nous savons que cette pathologie affecte majoritairement les adultes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des souris adultes. De plus, à ces âges, les animaux sont réceptifs à la prise de greffe.
Modèle préclinique de vaccination avec biopuces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées une fois avec des salmonelles vivantes, 696 souris sont utilisées pour tester un vaccin à base de biopuces, 120 d'entre elles dans des procédures classées en souffrance sévère. L'infection provoque perte de poids, pelage hérissé, prostration et anorexie, et le RNT signale qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable. Le même document affirme par ailleurs que l'injection des biopuces n'induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'écart restant net entre les procédures dites indolores et une infection qui peut tuer sans prévenir.
Objectifs
Les salmonelles sont des bactéries qui peuvent infecter les cellules de l’organisme et représentent un problème important de santé publique. Certaines formes provoquent des infections digestives généralement bénignes, mais dans certains cas, notamment chez les personnes fragiles (personnes âgées ou immunodéprimées), elles peuvent entraîner des infections graves pouvant être mortelles. La transmission se fait principalement par contact avec des animaux ou par la consommation d’aliments contaminés (viandes, œufs, produits laitiers). Il est donc important de développer de nouvelles stratégies pour mieux protéger les populations à risque, notamment par la vaccination. Dans ce projet, nous développons une approche vaccinale innovante basée sur des « biopuces ». Il s’agit de petits dispositifs en silicium capables de transporter des bactéries inactivées dans l’organisme. Ces biopuces, appelées ICARO (Intracellular Carriers Against Resistant microOrganisms), peuvent être internalisées par certaines cellules du système immunitaire. Elles permettraient ainsi de déclencher une réponse immunitaire efficace contre la bactérie, en particulier une réponse dite « cytotoxique », essentielle pour éliminer les cellules infectées. L’objectif est de démontrer que cette stratégie peut protéger les souris contre une infection par les salmonelles, constituant ainsi une première preuve de concept pour le développement de nouveaux vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l'utilisation de biopuces en silicium chargées en agents pathogènes inactivés comme méthode de protection contre ces agents in vivo et potentiellement une solution vaccinale innovante. En effet, s’il existe une solution vaccinale disponible dans un cadre vétérinaire pour les poulets, aucun vaccin contre les salmonelles n’est disponible chez les mammifères. Or, comme indiqué plus haut, les souches de salmonelles non typhiques comme Salmonella enterica Typhimurium peuvent entrainer des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés, rendant la recherche de nouvelles approches vaccinales telles que celle proposée dans ce projet indispensable.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris Salmonella enterica Typhimurium sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles, pendant environ 1 minute. 2- L’injection des biopuces par différentes voies (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles (injections intrapéritonéales), ou anesthésiées (injections intraveineuses par voie rétro-orbitale et injections intraplantaires). 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies à l'isoflurane nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Remplacement
Les analyses préalables effectuées in vitro sur des cellules primaires pertinentes permettent d’évaluer la cytotoxicité et la dose optimale de biopuces par cellule cible. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. En revanche, la protection conférée par cette stratégie vaccinale innovante ne peut être évaluée que dans un modèle murin entier dont l’infection par Salmonella Typhimurium est connue pour reproduire les conditions d’infection systémique chez l’homme (recherche préclinique).
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (696) a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées () afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Les injections intraplantaires seront réalisées sur le dessus de la patte pour éviter toute gêne lors de la marche. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Lors des procédures de biodistribution des biopuces, d’optimisation de la cross-présentation antigénique et d’évaluation de l’immunogénicité (procédures de gravité légère), les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et le suivi sera réalisé selon une grille d’évaluation du bien-être adaptée, incluant notamment l’apparence générale, le comportement et la prise alimentaire. Une surveillance accrue et, si nécessaire, une prise en charge analgésique seront mises en place en cas d’altération de l’état général. Lors de la procédure d’infection par Salmonella (procédure de gravité sévère), les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer l’apparition de signes cliniques et l’évolution de la pathologie. Un score de souffrance sera utilisé pour le suivi du bien-être animal. Les critères d’arrêt immédiat incluent notamment une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de signes cliniques sévères ou une altération marquée de l’état général, entraînant une euthanasie immédiate. Pour l’ensemble des procédures, en cas de dégradation de l’état des animaux, une surveillance renforcée sera mise en place (trois fois par jour) avec administration d’un analgésique (buprénorphine, voie sous-cutanée, 0,1 mg/kg en dose initiale, renouvelée à 0,05-0,1 mg/kg toutes les 6-8 h si nécessaire) et, si nécessaire, apport de nourriture adaptée et réhydratation sous-cutanée. La buprénorphine est utilisée à visée préventive ou curative selon les procédures. En cas de persistance de la souffrance malgré les mesures mises en place pendant plus de deux jours, une euthanasie sera réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Des critères d’arrêt indépendants du score, tels que définis dans la grille d’évaluation, s’appliquent à tout moment.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce.
Évaluation des effets radio-protecteurs et pro-régénératifs de traitements sur le syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à doses fortes et modérées de rayonnements ionisants_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-neuf gestes techniques en trente jours par animal : 1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les organes les plus atteints, dont 765 dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles reçoivent une irradiation du corps entier, des gavages, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des injections, avec pour effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation ou septicémie. Le scénario invoqué est celui d'un accident ou d'une attaque nucléaire exposant des populations humaines. L'effet radioprotecteur recherché reste à démontrer, quand l'irradiation et ses suites sont, elles, provoquées à coup sûr.
Objectifs
MODIFICATION – Le protocole 1 du projet a été modifié en supprimant l’étude de l’effet protecteur des molécules après une forte dose d’irradiation, remplacée par l’étude de leur effet curatif après une dose modérée. En effet, la majorité des individus irradiés se trouvera autour du point d’impact de l’accident, recevant ainsi une dose modérée, non létale, qu’il est donc important d’étudier. Le protocole 2 du projet intègre désormais l’étude d’un traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit (forte dose d’irradiation localisée) via l’administration de produits acellulaires (EV). Les individus exposés brièvement (quelques minutes) à une dose d’irradiation forte ou modérée (accident ou attaque nucléaire), vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) engageant le pronostic vital. Les traitements curatifs actuels sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments soulagent les symptômes (diarrhées et vomissements) ou préviennent les infections, sans améliorer significativement la survie. Nous proposons donc un projet pré-clinique chez la souris pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements contre le syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA combine trois syndromes : hématopoïétique, gastro-intestinal et neurovasculaire. Ce projet se concentre sur les deux premiers. L’effet curatif sera mesuré par la capacité de deux tissus très radiosensibles, la moelle osseuse et l’intestin grêle, à se reconstituer plus ou moins rapidement après irradiation. Ces tissus se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales maintenant une barrière imperméable empêchant le passage des bactéries du microbiote dans le sang. Préserver ces tissus est essentiel à la survie. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces traitements après une irradiation ait un effet curatif en améliorant l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé et validé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt (composés chimiques ou produits acellulaires), administrées après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à des doses d’irradiation ionisante fortes et modérées avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) - gavages (4 maximum d’une durée de 2 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (30 secondes) - prélèvements de sang 1 fois/semaine sur animal vigile sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). 1 à 2 injections (1 minute) en vigile pour tous les animaux Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (durée < 10 minutes) - 1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) ou 1 injection i sous anesthésie de produits acellulaires ou cellules Muse (durée < 10 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 gavage post-irradiation abdominale localisée (2 minutes) - 1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). - 2 injections sur animal vigile (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, des résultats significatifs seront obtenus en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également calculé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude à l’aide de tests statistiques et en s’appuyant sur des résultats antérieurs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évalué un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu : 3 souris par groupe seront suffisantes. Sur la base de références bibliographiques, nous avons estimé que l’inclusion de 5 souris par groupe (groupes traités par cellules Muse, groupes traités avec produits de sécrétion de Muse, et groupe irradié contrôle) avec n=3 est nécessaire pour l’analyse des courbes de survie, afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative. Enfin, pour les études de cinétique, un effectif de 4 souris par groupe avec n=2 a été retenu, ce qui est suffisant pour détecter des variations biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris dans ce groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées . Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
Gestion de la production d’animaux qui présentent une myopathie à agrégats tubulaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris qui deviennent rachitiques, sous 18 à 20 grammes, sont mises à mort, comme celles dont la perte de poids persiste ou qui développent des malocclusions. 3 600 souris sont utilisées, toutes dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, toutes tuées à l'issue. Le projet gère la production d'une lignée modifiée pour reproduire une myopathie rare qui provoque faiblesse musculaire, maigreur et déformation du dos. Les surnuméraires à "phénotype dommageable" sont tués avant l'apparition des symptômes.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare congénitale caractérisée par de la faiblesse musculaire, des crampes et de la myalgie. Elle est associé à un syndrome multisystémique appelée le syndrome de Stormorken (STRMK) qui englobe de nombreux symptômes tels qu'une plus petite taille, une thrombocytopénie, de l'hyposplenie ou de l'ichtyose. Le modèle murin TAM/STRMK mimique fidèlement le phénotype musculaire mais également le phénotype multisystémique trouvés chez les patients. Ce modèle nous a déjà permis de valider différentes approches thérapeutiques géniques et pharmacologiques translationnelles, et d'évaluer leur effet systémique sur le phénotype global. Néanmoins, certains aspects de la maladie sont encore mal compris, notamment la thrombocytopénie qui n'a pas pu être amélioré par les traitements testés pour l'instant.
Bénéfices attendus
Ce projet permet la production et le suivi d'animaux à phénotype dommageable afin d'assurer le maintien de la lignée, envoi à des collaborateurs, mais également à l’utilisation continue vers des des projets experimentaux. Ils participent à la meilleur compréhension de la maladie et de ses symptômes multisystémiques, mais également à la mise en place et à la validation d'approches thérapeutiques translationnelles.
Procédures
Ce projet permet la gestion et le suivi de la production d'animaux qui présentent un phénotype dommageable caractérisé notamment par une petite taille et une maigreur. En adéquation avec ce phénotype, les animaux sont régulièrement surveillés et pesés pour limiter et suivre la perte de poids, le nourriture en gel disposée dans la cage permet également de faciliter leur alimentation et s'assurer d'une hydratation normale.
Impact sur les animaux
La souris a un phénotype clair qui s'aggrave avec le temps. Visuellement, elle est plus petite, plus maigre et présente une cyphose claire à partir de 4 mois. La faiblesse musculaire est surtout visible lorsqu'elle est mésurée directement dans le muscle. Les animaux malades peuvent vivre au-delà de 1 ans, mais certains meurent de causes inconnus avant cet âge.
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts afin de permettre: le prélèvement post-mortem (dans le cas de fins d'études experimentales), le renouvellement des reproducteurs (s'ils ne sont pas réutilisés par une étude en cours), de limiter la souffrance en euthanasiant les animaux à phénotype dommageable surnuméraires avant l'apparition des symptômes, mais également d'euthanasier les animaux ayant atteint les points limites de cette étude.
Remplacement
La majorité de nos thérapies sont d'abord validé in vitro dans des cellules murines et humaines. Cependant, la nature multisystémique de notre maladie, ainsi que le muscle qui est une structure complexe encore mal modélisée par les modèles cellulaires, nous oblige pour le moment à utiliser un modèle murin.
Réduction
Nous adapterons le nombre de croisement et donc le nombre de naissances à nos projets en cours afin de limiter la production d'animaux surnuméraires.
Raffinement
Chaque cage est enrichie avec des nids de chanvre pour réduire l’anxiété des animaux. Nos animaux étant plus maigres et plus petits, ils sont régulièrement pesés et observés (au moins une fois par semaine) afin de prévenir toute pertes de poids sévères. Nous déposons également de la nourriture au fond de la cage afin de s'assurer que les animaux puissent se nourrir ad libitum. Les souris malades n'ont pas de phéntoype visible à part leur petite taille et leur poids réduit. Il arrive qu'au-delà de 4 mois d'âge, certaines souris soient rachitiques (avec un poid inférieur à 18-20g), cet état est considéré comme un point limite et les souris seront mises à morts. Additionnellement, les souris ayant perdu au-delà de 10% du poids maximal atteints seront surveillées de près avec ajout de nourriture en gélée (Dietgel)et pesée journalière. Si la perte de poids est maintenue dans le temps, les animaux seront également mis à mort. Enfin, nous avons récemment eu des cas chroniques de malocclusions, si un tel phénotype se produit à répétition, les animaux seront mis à morts. Les animaux à phénotype dommageable surnuméraires sont mises à morts avant l'apparition des symptômes pour limiter la souffrance. Bien que le modèle animal ne présente pas de signes évidents de douleur ou de détresse nécessitant une prise en charge systématique, une analgésie sera mise en place de manière préventive ou curative dès lors qu’un animal présente des signes cliniques évocateurs de douleur (altération du comportement, posture anormale, perte de mobilité, amaigrissement marqué ou tout autre signe jugé pertinent par le personnel formé). Le choix de l’analgésique, sa posologie et sa durée d’administration seront adaptés en concertation avec le vétérinaire référent, conformément aux recommandations en vigueur et aux procédures de l’établissement. Une surveillance renforcée sera assurée après toute intervention susceptible d’induire une douleur.
Choix des espèces
La TAM/STRMK est une myopathie progressive qui s'aggrave dans le temps, notamment chez le modèle murin, avec une apparition tardive des symptômes multisystémiques qui sont marqués à partir de 4 mois (les symptômes commencent à apparaître à partir de 1 mois). Nos études utilisent ces animaux à plusieurs stades entre 1 mois et jusqu'à au-delà d'un an.
Etude des conséquences de la consommation chronique de cocaïne sur le métabolisme énergétique chez le rat adulte
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Dix séances de six heures d'auto-administration de cocaïne par un cathéter implanté dans la veine : 184 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 132 relevant du niveau le plus élevé, tous tués à l'issue. S'ajoutent un régime obésogène de plusieurs semaines, des tests de tolérance au glucose et des examens IRM sous anesthésie. Le projet étudie les effets durables de la cocaïne sur le métabolisme énergétique. Les tissus sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Bien que plusieurs marqueurs globaux des troubles métaboliques soient décrits, il n'existe pas à ce jour de marqueurs pertinents spécifiques de la santé des populations présentant des addictions aux drogues d’abus. Cela pose des défis importants pour comprendre les conséquences métaboliques de l'abus de drogues même après arrêt de la consommation et mettre en œuvre des interventions appropriées sur ces populations. Ce projet a pour but de mieux comprendre la manière dont la cocaïne influence durablement le métabolisme énergétique au cours de l'abstinence à plusieurs niveaux (organisme entier, tissus et marqueurs plasmatiques) ; notamment en réponse à un régime obésogène.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet visent à améliorer la santé humaine ; en particulier celle de populations consommatrices chroniques de drogue. Cette étude permettra de mieux comprendre les conséquences métaboliques de l'abus de drogue. Elle fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à mettre en œuvre une prise en charge et des interventions appropriées sur les populations addictes. Les bénéfices attendus du projet sont de générer des données permettant de comprendre les altérations durables de l'équilibre énergétique à plusieurs échelles biologiques (marqueurs moléculaires tissulaires et plasmatiques, organisme entier) induites par la prise chronique de drogue. A terme et en complément d’études chez l’Homme, ces recherches sont essentielles pour identifier les altérations physiopathologiques durables de l’addiction aux drogues pour améliorer la prise en charge des personnes dépendantes.
Procédures
Certains animaux recevront un psychostimulant en intraveineux pendant 10 sessions d'une durée de 6h chacune. Pour cela, l'implantation d'un cathéter sera nécessaire et réalisée lors d'une procédure chirurgicale unique d'une durée de 20-30minutes. Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, jusqu'à 3 fois par animal. Pour cela, une administration intrapéritonéale de solution de glucose sera réalisée. Ce geste dure 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée totale de la manipulation (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s'étaleront sur deux heures. Des prélèvements de matières fécales émises spontanément seront réalisés sur animaux vigiles. Certains animaux recevront un aliment obésogène pendant 4 à 8 semaines. Pendant la période sous régime obésogène, entre deux et quatre examens IRM par animal seront réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, plusieurs types de nuisances sont susceptibles d’être observés. Les chirurgies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un inconfort transitoire au réveil ainsi que des douleurs post-opératoires, lesquelles seront atténuées par l’administration d’antalgiques. La pose et le maintien d’un cathéter intraveineux peuvent provoquer une gêne légère pendant la durée de l’expérience. L’exposition chronique à la cocaïne est susceptible d’induire un stress modéré et transitoire chez certains rats. La période de sevrage peut également s’accompagner d’un stress dans les premiers jours suivant l’arrêt de l’exposition à la cocaïne. Les phases d’isolement des animaux sont associées à un stress modéré. La mise en place d’un régime alimentaire obésogène entraîne une prise de poids, une diminution de l’activité locomotrice ainsi qu’une perturbation du métabolisme. Les tests de tolérance au glucose impliquent des administrations par voie intrapéritonéale et une manipulation fréquente qui peuvent générer un stress. Enfin, la réalisation d’IRM sous anesthésie peut occasionner un stress court et transitoire au moment de l’endormissement et du réveil. Malgré les efforts de raffinement, on ne peut exclure, (i) un stress thermique dû à l'anesthésie ou à certaines séquences d'imagerie (ii) le réveil de l'animal en cours d’examen ou (iii) un stress lors de l'installation de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle un suivi des paramètres de santé métabolique de patients humains addicts à la cocaïne, le modèle humain possède plusieurs limites majeures pour répondre aux objectifs de notre projet. Notamment, il ne permet pas un contrôle précis de paramètres tells que la dose administrée, la durée d’exposition, ainsi que la qualité et la composition du produit consommé, ni la polyconsommation fréquemment associée. Ces facteurs constituent des variables importantes susceptibles d’influencer les effets métaboliques observés. Cette étude vise à comprendre les altérations des régulations physiologiques impliquées dans la balance énergétique et les conséquences durables de l’exposition à la cocaïne à l’échelle de l’organisme entier. Cela nécessite la présence d’interactions inter-organes, et inter-systèmes physiologiques, intactes et fonctionnelles. Bien que des approches alternatives existent, telles que les organoïdes, celles-ci ne récapitulent que partiellement et de façon isolée les fonctions physiologiques d’un organe, il n’existe pas à ce jour de système permettant de reproduire les interactions systémiques complexes nécessaires à l’étude de la régulation énergétique à l’échelle de l’organisme. A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in silico validé permettant de réaliser cette étude. Ce projet de recherche nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter-organes et de contrôler les paramètres d’exposition à la cocaïne.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu dans ce projet est le nombre minimal permettant d'assurer que des différences biologiquement pertinentes et robustes puissent être détectées grâce à l'emploi d'analyses statistiques adaptées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière de l’état de santé des animaux (alimentation, apparence, comportement). Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des rats permettront de prévenir la survenue de problèmes potentiels. Des points limites stricts et spécifiques à chaque procédure seront appliqués. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Les rats sont hébergés dans un environnement à température et humidité contrôlées, avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; du matériel pour réaliser un nid ; un objet leur permettant de se mettre à l’abri) avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation à l’animalerie. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Une familiarisation à l'expérimentateur sera réalisée avant le début de la procédure. Les rats seront familisarisés à l’injection intrapéritonéale et à la contention pour réduire le stress lors des tests nécessitant ces gestes. Les gestes techniques seront réalisés par des personnels formés et expérimentés. Les prélèvements de matières fécales sont réalisés par excrétion spontanée de l’animal. Le volume et la fréquence des prélèvements sanguins sont limités au strict nécessaire et le volume sanguin est reconstitué après le prélèvement par une administration de solution saline stérile tiède. La réalisation des procédures en phase nuit (phase d’éveil) prend en compte le rythme circadien des rats.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction aux drogues dans les modèles animaux. En effet, les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’humain et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’humain de façon spontanée, ce qui n’est pas le cas avec d’autres espèces, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous avons décidé de travailler sur individus adultes pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Approches thérapeutiques de l’Adrénomyéloneuropathie (AMN) dans un modèle de souris génétiquement modifiées et chez le primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Macaques à longue queue : 6
Cinquante minutes de natation forcée trois fois par semaine pendant quatre mois : 343 animaux, 337 souris et 6 macaques à longue queue, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. 120 souris relèvent du niveau le plus élevé. Le projet teste contre une maladie neurologique rare, l'adrénomyéloneuropathie, trois pistes : une thérapie génique injectée dans le cerveau, un régime enrichi et l'effet de l'exercice, avec des tests de coordination et d'équilibre. Les macaques servent à étudier la distribution du vecteur, mis à jeun et isolés avant l'anesthésie.
Objectifs
L’adrénomyloneuropathie (AMN) est une maladie orpheline redoutable, causée par des mutations d’un gène (le gène ABCD1) porté par le chromosome X. Elle endommage progressivement la gaine protectrice entourant les fibres nerveuses du cerveau et de la moelle épinière. Cette maladie altère la motricité des membres inférieurs et prive des milliers de personnes adultes de marcher normalement. Les déficits apparaissent entre 35 et 50 ans et s’aggravent en 10-20 ans. Aux Etats-Unis, l’AMN est dépistée à la naissance à partir d’un prélèvement de sang déposé sur buvard Il n’existe aucun traitement contre cette maladie. On pourra donc envisager dans le futur de la prévenir en agissant tôt dans la vie. Le projet développe 3 stratégies thérapeutiques : 1. Une thérapie génique faisant exprimer le gène ABCD1 normal dans s des cellules de la moelle épinière. Nous avons conçu agents thérapeutiques portant le gène sainet nous avons comme objectifs i) de tester l’effet thérapeutique de ces agents dans le modèle murin de l’AMN ii) d’étudier la biodistribution de ces agents chez le modèle primate non humain. 2. Un régime alimentaire capable de fournir un supplément de nutriments énergétiques (NE) aux axones, cellules permettant de transporter les messages nerveux . Ces suppléments, bien tolérés, testés dans d’autres maladies neurologiques, mais pas dans l’AMN, pourraient pallier le déficit métabolique des axones et prévenir/ralentir l’évolution de la maladie. Nous étudierons leurs capacités à produire des effets positifs chez le modèle souris AMN. 3. Des tests de modification du mode de vie. Notre hypothèse est que l’activité musculaire peut aggraver l’évolution de la maladie, en augmentant la dépense énergétique des axones à l’inverse d’autres maladies neurologiques. Les axones dans l’AMN étant métaboliquement vulnérables, leur imposer une dépense accrue liée à l’exercice pourrait aggraver leur déficit et peut-être accélérer leur dégénérescence.. Dans notre expérience clinique, nous avons observé quelques cas où au tout début des signes, la pratique d’un sport (jogging, marche prolongée, vélo) avait semblé aggraver les déficits. Cette hypothèse peut être testée dans le modèle souris d’AMN, en étudiant les résultats de séances répétées d’exercice.
Bénéfices attendus
Environ 30.000 adultes en Europe et en Amérique du Nord ont une AMN et ne reçoivent aucun traitement. Il y a donc un grand besoin de progrès thérapeutiques. Notre projet expérimental testera trois stratégies spécifiques et possiblement complémentaires. Notre première approche thérapeutique est la thérapie génique. Cette étude permettra d‘évaluer la capacité de cette approche à ralentir ou inverser l’apparition des signes cliniques dans notre modèle murin d’AMN. La thérapie génique est en plein développement pour traiter plusieurs maladies humaines, notamment certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’Homme. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’Homme. La seconde approche est une thérapie fondée sur un régime alimentaire riche en nutriments énergétiques (« nutraceutique »). Ces régimes déjà testés dans d’autres maladies neurologiques trouveraient une place dans la prévention en ralentissant l’évolution de l’AMN. Si notre projet démontre expérimentalement le rôle bénéfique de ce type de régimes sur notre modèle murin d’AMN, il ouvrirait la voie à des essais cliniques de» pour le traitement de l’AMN humaine. La troisième approche est de réduire les exercices musculaires vigoureux chez les personnes atteintes d’AMN. Notre étude permettra de démontrer leur effet néfaste chez ces personnes. En effet, si l’exercice musculaire est recommandé dans certaines maladies neurologiques cérébrales, il n’en est probablement pas de même pour les maladies touchant les très longs axones de la moëlle épinière, qui contrôlent la motricité et l’équilibre des membres inférieurs et où la conduction de l’influx exige une énorme dépense énergétique. La répétition d’exercices vigoureux soumet à long terme ces longs axones à une forte pression métabolique. Pour les axones fragilisés par l’AMN, cette forte pression pourrait favoriser la dégénérescence axonale. Contrairement à une idée répandue chez certains patients « proactifs », un haut niveau d’exercice devrait alors être évité dès les premiers signes de l’AMN. . Les résultats de cette approche permettront de conseiller aux patients d’éviter une activité physique.
Procédures
Chez les modèles primates non humains et souris : - Injection de l’agent thérapeutique : 1 injection sous anesthésie en moins de 15 secondes. - Chirurgie sous anesthésie profonde pour administration de l’agent thérapeutique : 1 intervention, durée 1h30. - Imagerie sous anesthésie : 1 intervention, durée max 1h30. - Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par jour par souris, 5 jours consécutifs. Selon le groupe expérimental 1 à 3 par animal. - Tests comportementaux : Deux types de tests comportementaux seront réalisés afin d’évaluer la coordination et l’équilibre . 3 fois par animal. Test de coordination : Durée : 20 minutes/jour c’est-à-dire 4 passages d’environ 5 minutes max avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs; Test d’équilibre: 4 passages/jour sur la barre, 3 jours consécutifs, durée max 10-15 min - Exercice : 50 minutes de natation 3 fois/semaine pendant 4 mois. - Souris : prélèvement sanguin : 1x/mois entre 12 et 24 mois - NHP : 1 prélèvement sanguin, nécessitant au préalable une mise à jeun (durée 14-15hr max) avec isolement individuel
Impact sur les animaux
Chez le modèle souris : - Injection: possible complication = gonflement autour du site d’injection qui disparait dans les 24-48 h qui suivent l’injection. Cette injection se fera -sous anesthésie
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour prélèvement d’organe afin d’obtenir des mesures concrètes et reproductibles.
Remplacement
Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permet de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle spécifique des structures du système nerveux central au point de prédire les propriétés d’une thérapeutique nutritionnelle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même type d’étude. . Le suivi longitudinal/répété chez le même individu pour monitorer la réponse des tests moteurs permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour observer un effet significatif des traitements testés.
Raffinement
Chez le modèle souris : Injection au 7ème jour de vie: sous anesthésie générale Injection à 16/18 mois : Anesthésie générale et utilisation systématique d’analgésiques - Souris placées sur des tapis chauffants - Soutien nutritionnel en postopératoire pendant 2 jours Tests comportementaux : précédés d’une phase d’habituation à l’expérimentateur, but : minimiser stress et assurer une reproductibilité optimale de ces expériences. Exercice : familiarisation progressive avec la natation en 2 semaines Régime : Introduction progressive des régimes Imagerie : douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal minimisée par application locale anesthésiant 5 minutes avant. Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux Une observation hebdomadaire des animaux, des pesées hebdomadaires seront réalisées. Les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite à l’administration des produits ou à l’anesthésie, l’évaluation du comportement à l’aide d’une grille tout le long de l’expérience, un suivi du poids hebdomadaire, et la mise en place de points limites permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre et le volume des prélèvements ainsi que la durée de l’anesthésie sont réduits au maximum. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour l’administration des vecteurs, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir), alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets), auditif (musique). L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce se justifie pour les raisons suivantes : il existe une lignée de souris génétiquement modifiées comme modèle d’AMN. Ces modèles présentent des manifestations cliniques et histologiques fiables et représentatives. L’injection des vecteurs se fera à deux stades de vie différents : - à l’âge de 7 jours de vie dans le but de stopper ou ralentir l’apparition des signes cliniques - à l’âge de 16/18mois, à un moment où les signes cliniques commencent à apparaitre. Le développement clinique des approches thérapeutiques demande d’étudier la biodistribution et la sureté des vecteurs AAV dans un modèle bien connu. Le primate non-humain est proche de l’Homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie.Nous utiliserons des jeunes adultes car ils représentent le mieux la physiologie d’un adulte humain, avec un système immunitaire et des organes matures.