Procédures sévères

80 souris, la moitié atteintes d'une myopathie congénitale, sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection hebdomadaire de l'âge de trois à sept semaines, subissent des tests de force et de démarche, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie profonde d'une heure suivie de la mise à mort. Les souris myopathiques, plus vulnérables, peuvent développer une faiblesse progressive et des complications respiratoires. Le porteur qualifie ce protocole de conforme aux 3R et destiné à minimiser la souffrance, alors qu'il programme la mise à mort de quarante animaux en gravité sévère.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer de manière préclinique l’effet de trois inhibiteurs d’une cible protéique clé de la dynamique membranaire sur le phénotype neuromusculaire de souris sauvages et de souris présentant une myopathie congénitale de type X, dans un schéma de traitement précoce débutant au sevrage, et de caractériser l’impact de ces molécules sur la fonction locomotrice, la force musculaire, l'activité électrique des muscles, la structure microscopique, du muscle tibial antérieur afin d’identifier des candidats thérapeutiques prometteurs pour les myopathies congénitales associées à cette voie moléculaire. Il s’agit également de définir un protocole expérimental standardisé, reproductible et conforme aux principes des 3R, qui pourra servir de base à des études ultérieures, tout en produisant des données scientifiques robustes sur l’efficacité et la tolérance de ces inhibiteurs, tout en minimisant la souffrance animale et en garantissant la qualité méthodologique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’approfondir la compréhension du rôle d’une cible protéique clé de la dynamique membranaire dans la physiopathologie des myopathies congénitales de type X, ainsi que des mécanismes par lesquels son inhibition peut moduler la fonction neuromusculaire et la structure musculaire. Il vise également à identifier, parmi les trois inhibiteurs testés, ceux qui présentent un effet bénéfique sur la fonction locomotrice, la force musculaire, l’électrophysiologie et l’architecture histologique du muscle tibial antérieur, en vue de leur éventuelle valorisation comme candidats thérapeutiques. Le projet contribuera à définir un protocole expérimental standardisé, reproductible et conforme aux principes des 3R, qui pourra servir de référence pour des études futures, tout en minimisant la souffrance animale. Les données produites pourront alimenter des publications scientifiques, des collaborations avec d’autres laboratoires ou des partenariats avec l’industrie pharmaceutique, dans une logique de transfert de connaissances et de technologies. À plus long terme, ce projet pourra contribuer à l’amélioration des perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de myopathies congénitales, en apportant des preuves précliniques solides sur l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches pharmacologiques.

Procédures

Chaque animal sera pesé et une fois par semaine de 3 à 7 semaines. Les animaux recevront une injection intrapéritonéale hebdomadaire de l'âge de 3 semaines jusqu'à l'âge de 7 semaines. L’analyse de la démarche sera réalisée à 3, 5 et 7 semaines, avec une séance de marche d’environ 1 minute par animal. Le test de la grille retournée sera effectué à 3, 5 et 7 semaines, avec 3 essais de 60 secondes maximum chacun, espacés de 15 minutes de repos entre essais. L'enregistrement de l’activité musculaire sera réalisé une fois à 7 semaines, sous anesthésie, avec une durée maximale d’environ 15 minutes par animal. La mesure de force musculaire sera réalisée à 7 semaines sous anesthésie générale profonde, avec une durée totale de procédure d’environ 1 heure par animal, suivie d’une mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement liés aux manipulations, aux injections et aux procédures fonctionnelles. Les prises en main répétées, les pesées et les tests comportementaux peuvent induire un stress modéré transitoire, limité par une acclimatation préalable et des conditions de travail standardisées. Les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur ou un inconfort local minime, ainsi qu’un stress lié à la contention, mais ces effets sont limités par l’utilisation d’aiguilles fines, de volumes faibles et d’un geste rapide. Les tests fonctionnels sont non invasifs ou peu invasifs mais peuvent entraîner une fatigue ou un stress modéré transitoire, en particulier chez les souris présentant une myopathie congénitale de type X, plus vulnérables. Ces tests commencent au sevrage à 3 semaines d’âge et se répètent jusqu’à 7 semaines pour la démarche et le test de la grille retournée et à 7 semaines pour la mesure de force musculaire. La mesure de force musculaire sous anesthésie générale profonde comporte des risques de dépression respiratoire et d’hypothermie, limités par un monitoring et une gestion adaptée réalisé à 7 semaines.

Devenir

Le protocole prévoit des prélèvements terminaux de tissus musculaires (tibial antérieur) et, le cas échéant, d’autres organes, nécessaires pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Ces prélèvements entraînent la mise à mort de l’animal, réalisée sous anesthésie profonde immédiatement après la dernière procédure fonctionnelle à 7 semaines. Cette approche permet de limiter la durée de souffrance potentielle et d’éviter toute détérioration clinique ultérieure, en particulier chez les souris myopathiques susceptibles de développer une faiblesse progressive et des complications respiratoires. La collecte terminale de muscles et d’organes est indispensable pour corréler le phénotype fonctionnel avec les analyses moléculaires et histologiques, et pour évaluer l’impact bénéfique potentiel des traitements sur le phénotype musculaire. Les prélèvements étant réalisés après la mise à mort, ils ne s’accompagnent d’aucune douleur supplémentaire pour l’animal.

Remplacement

Les tests précliniques in vitro et in cellulo (culture cellulaire, modèles cellulaires de myotubes) ont été utilisés en amont pour identifier les trois molécules testées, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à la phase de criblage. Les analyses histologiques, moléculaires et ultrastructurales seront réalisées sur un même lot de tissus musculaires (tibial antérieur), permettant de répondre à plusieurs questions scientifiques avec un même prélèvement et d’éviter des expérimentations supplémentaires sur de nouveaux animaux. Le recours à un modèle animal est justifié par l’objectif de tester l’effet des molécules sur un organisme entier, afin d’évaluer la biodistribution, la tolérance systémique, l’impact sur la fonction musculaire globale et les interactions entre tissus, ce que les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d’appréhender de manière satisfaisante. Des approches alternatives (cultures cellulaires, modèles bio‑informatiques) sont utilisées en amont ou en parallèle lorsque cela est pertinent, mais ne remplacent pas la nécessité d’un modèle murin vivant pour l’étude de la myopathie congénitale et de l’effet des traitements.

Réduction

Les procédures de phénotypage non invasif (pesée, mesure de la longueur corporelle, analyse de la démarche sur Digigait, test de la grille retournée) et les mesures de force musculaire in situ sont regroupées autant que possible sur les mêmes animaux, afin d’obtenir un maximum d’informations fonctionnelles par individu. Les prélèvements terminaux de muscles et d’organes sont réalisés sur chaque animal à la fin de la période de traitement ou de survie, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Le nombre d’animaux est calculé de façon statistique afin d’obtenir des résultats scientifiquement robustes avec le minimum d’individus nécessaires, en évitant les répétitions inutiles. Les mêmes animaux servent pour l’ensemble des tests fonctionnels et pour les prélèvements terminaux, ce qui maximise l’information obtenue par animal et limite le recours à de nouvelles expérimentations. Les analyses histologiques, moléculaires et ultrastructurales seront réalisées sur un même lot de tissus musculaires Tibialis Antérior (TA), permettant de répondre à plusieurs questions scientifiques avec un même prélèvement et d’éviter des expérimentations supplémentaires sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Au sevrage vers 3–4 semaines, les animaux sont pesés une fois par semaine afin de surveiller leur état général ; en cas de perte de poids, la pesée est effectuée quotidiennement pour suivre l’évolution et adapter rapidement la prise en charge. En cas de difficultés de locomotion ou de prise alimentaire, de la nourriture en gel est ajoutée dans les cages pour faciliter l’accès à la nourriture, améliorer l’hydratation et prévenir la dénutrition. Les animaux sont progressivement habitués aux manipulations et aux tests comportementaux non invasifs (pesée, mesure, Digigait, grille retournée) au cours des semaines précédant l'expérience, afin de minimiser le stress et d'améliorer la fiabilité des mesures. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur (grille retournée, analyse de la démarche) et l’enregistrement de l’EMG sont non invasifs ou peu invasifs et réalisés chez l’animal vigile ou sous anesthésie, avec une durée de test strictement limitée et une fréquence régulée pour éviter la fatigue et le stress cumulatif. Les mesures de force musculaire in situ sont réalisées sous anesthésie générale profonde et anti‑douleur, avec une durée d’anesthésie minimale, une surveillance respiratoire continue et un maintien de la température corporelle afin de préserver le bien‑être de l’animal. Pour l'électromyographie (EMG) et la mesure in situ de la force musculaire, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux afin de prévenir le dessèchement cornéen pendant l’anesthésie. Les injections intrapéritonéales (anesthésie et traitement) sont réalisées avec une contention douce et une manipulation rapide. Enfin, la mise à mort en fin de procédure, suivie de prélèvements terminaux, évite la poursuite de l’expérience au‑delà d’un stade où la progression de la myopathie pourrait entraîner une détérioration importante de l’état des animaux. Des points limites clairs ont été définis et seront strictement appliqués afin d'assurer le bien-être animal conformément aux principes des 3R.

Choix des espèces

La souris est choisie comme espèce car elle constitue le modèle mammifère de référence pour l’étude des myopathies génétiques, avec une physiologie musculaire, une organisation du système neuromusculaire et une génétique très proche de celles de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les données fonctionnelles et moléculaires aux patients. Les animaux sont utilisés du sevrage (3–4 semaines) jusqu’à 7 semaines, stade correspondant à la jeune souris adulte où le phénotype musculaire est suffisamment exprimé pour permettre l’évaluation de la myopathie et de l’effet des traitements. Cet intervalle couvre la période où la progression de la myopathie est mesurable par tests comportementaux et locomoteurs (grille retournée, analyse de la démarche, électromyographie (EMG) ) et où les prélèvements terminaux de muscles et d’organes fournissent des tissus de qualité pour les analyses histologiques et moléculaires. Ce choix d’espèce et de stade de développement est considéré comme le plus raffiné et pertinent pour atteindre les objectifs du projet : tester des molécules sur un organisme entier, corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires, et minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant la robustesse des données.

Jusqu'à quarante et une anesthésies, douze lavages broncho-alvéolaires et vingt-deux séances d'imagerie par individu : 112 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils sont infectés par un virus de grippe aviaire, puis subissent prélèvements sanguins, ponctions de moelle osseuse et biopsies répétés, pour mettre au point un modèle d'évaluation de candidats vaccins. Le porteur envisage des atteintes pulmonaires importantes pouvant conduire à mettre les animaux à mort, et un hébergement individuel jusqu'à huit semaines après l'infection. Sur les 112 individus, 64 sont tués pour prélever leurs organes et 48 réutilisés dans de futurs projets, ce que le porteur présente comme une façon de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

La grippe aviaire peut être causée d’une part, par des virus influenza aviaires faiblement pathogènes qui induisent des infections asymptomatiques ou cliniquement modérées chez les oiseaux sauvages et les volailles, ou d’autre part, par des virus influenza aviaires hautement pathogènes qui sont responsables de pathologies sévères et de fortes mortalités chez les oiseaux. Chez l’humain, la contamination se produit principalement à la suite d’un contact direct avec des oiseaux infectés ou un environnement souillé. Certaines espèces mammifères peuvent également s’infecter par les oiseaux ou l’environnement et transmettre à l’humain, alors que la transmission interhumaine reste sporadique et très rare. L’infection chez l’humain se traduit par l’apparition de symptômes similaires aux infections grippales saisonnières par les virus humains (rhume, fièvre, toux) conduisant à des difficultés respiratoires, une pneumonie sévère, un syndrome respiratoire aigu pouvant conduire au décès. Les premières infections par un virus de la grippe aviaire chez l’humain ont été documentées à la fin des années 1990. A ce jour, entre début 2003 et mars 2024, l’OMS a répertorié 888 cas humains confirmés d’infection par le virus H5N1 dans 23 pays, dont 463 décès, ce qui correspond à un taux de mortalité très élevé d’environ 52%. Bien que les cas humains restent isolés, ces virus peuvent muter ou se recombiner faisant craindre la capacité à franchir la barrière d’espèces. Une adaptation favorable à l’humain pourrait transformer une zoonose occasionnelle, c’est-à-dire une maladie passant de l’animal à l’humain, en épidémie pouvant aller jusqu’à une pandémie, dans le cas où la maladie se propagerait à travers les pays ou les continents à un rythme rapide. La vaccination reste une solution privilégiée pour limiter les infections, le nombre de cas graves et de décès et pour réduire le risque d’une propagation. Dans ce projet, nous développerons un modèle d’infection par le virus de la grippe aviaire chez le primate non-humain permettant l’évaluation de nouveaux candidats vaccins qui ont pour objectif d’empêcher une crise sanitaire mondiale.

Bénéfices attendus

Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez les modèles primates non-humains pourront à court terme être évalués lors d’essais cliniques chez l’humain. Ils pourront, à moyen-long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés en cas d’émergence de nouvelles épidémies de grippe aviaire chez l’humain.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont réalisées sous anesthésie générale : - Anesthésie des animaux (20 fois environ (16 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Administration de solutions lors des événements d’immunisation (3 fois environ, 5 minutes, 96 animaux) - Infection par un virus influenza (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 15 minutes, 112 animaux) - Prélèvement de sang (20 fois environ (16 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 5 minutes) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois environ (16 animaux) ; 7 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Biopsie (5 fois environ maximum (16 animaux) ; 9 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Ecouvillonnage mucosal (19 fois environ (16 animaux) ; 28 fois environ (96 animaux), 2 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (7 fois environ (16 animaux) ; 12 fois environ (96 animaux), 20 minutes) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, 112 animaux) - Imagerie in vivo (7 fois environ (16 animaux) ; 22 fois environ (96 animaux), 45 minutes) - Examen permettant de mesurer les variations de volume pulmonaire (7 fois environ (16 animaux) ; 19 fois environ (96 animaux), 10 minutes) Hébergement individuel (1 fois si naïf ; 2 fois si convalescent, 8 semaines maximum après exposition virale, 112 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux injections de vaccin (peu attendues) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza aviaire : Fatigue, difficultés respiratoires avec encombrement bronchique, toux, inactivité, fièvre, déshydratation, trouble de l’appétit. Nous envisageons des atteintes pulmonaires importantes qui peuvent s’atténuer spontanément dans les 2 premières semaines selon le modèle. L’ensemble de ces symptômes peuvent s’aggraver et entrainer une euthanasie pour limiter la souffrance des animaux. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation trachéale liée à l’intubation. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. Il sera limité au strict minimum.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible chez l’humain. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire la physiopathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par le virus influenza aviaire, notamment la réponse à l’infection et l’immunité induite, et suite à la vaccination. La caractérisation de la maladie, y compris les impacts tissulaires, et la mise en évidence des vaccins qui protègent de la maladie n’est pas réalisable avec les modèles actuels in vitro, in silico ou ex vivo. Enfin, le primate non humain étant proche physiologiquement de l’humain, son utilisation permet une transposition rapide des résultats précliniques à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de sélectionner les conditions expérimentales d’infection les plus appropriées, des études pilotes de groupes de 2 individus seront utilisés en amont des tests d’efficacité. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique des résultats obtenus.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation pourront être instaurées par l’apport de fruits secs, fruits frais additionnels, compléments nutritionnels. Une grille de notation a été mise au point pour évaluer l’état de santé des animaux suite à l’exposition au virus influenza. Les animaux seront observés quotidiennement par un personnel qualifié, dont des vétérinaires. Des points limites, tenant compte du stress et de leur souffrance, ont été définis. Lorsque ces points limites sont atteints, les animaux seront sortis de l’étude et l’euthanasie pourra être envisagée. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puces permettant un suivi régulier de paramètres physiologiques, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra décider du retrait de la puce et éventuellement de la sortie de l’animal de l’étude et appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés en cages individuelles suite à l’exposition virale pour empêcher toute surinfection liée à une contamination croisée et le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie. Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement en cage individuelle sera limitée au maximum et validée par la structure chargée du bien-être animal. Elle pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans les fluides corporels.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est justifié pour sa proximité phylogénétique de l’humain, rendant la transposition des résultats plus optimale. En effet, les symptômes induits par l’infection influenza et les réponses immunitaires induites par la vaccination sont similaires à ceux qui sont observés chez l’humain. La grippe infectant des personnes de tout âge en clinique, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature.

Pour tester si renforcer certaines connexions nerveuses ralentit la maladie de Charcot, 560 souris vont être utilisées, 140 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces 140 souris développent une paralysie progressive et une perte de poids pouvant atteindre 40 pour cent, tout en subissant deux tests moteurs par semaine que le RNT reconnaît fatigants pour des animaux déjà affaiblis. Les 420 autres sont tuées avant l'apparition des symptômes pour des prélèvements. La mise à mort intervient avant la paralysie complète, selon des seuils fixés à l'avance.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également appelée maladie de Charcot, est une maladie grave du système nerveux qui affecte les cellules responsables du contrôle des muscles. Elle apparaît généralement à l’âge adulte et provoque une paralysie progressive incurable. La plupart des recherches se concentrent sur les stades avancés de la maladie, lorsque les symptômes sont déjà apparus. En revanche, on connaît encore mal ce qui se passe aux tout débuts de la maladie, bien avant l’apparition des premiers signes. Des études récentes ont montré que, chez des modèles animaux de la SLA, certaines connexions nerveuses qui freinent l’activité musculaire fonctionnaient moins bien dès les premières étapes de la vie. Ce projet part de l'hypothèse que la maladie pourrait débuter très tôt, durant le développement du système nerveux, mais que le corps met en place des mécanismes de compensation qui retardent l'apparition des symptômes. Avec le temps, ces mécanismes finiraient par s'épuiser, déclenchant ainsi la maladie. L’objectif est donc de renforcer ces connexions nerveuses protectrices chez l’animal afin de voir si cela permet de ralentir ou de limiter le développement de la maladie à l’âge adulte. Cette approche pourrait permettre de mieux comprendre la SLA et, à terme, d'envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, seul un traitement est proposé aux patients atteints de SLA, lorsque le diagnostic de la maladie est clairement établi, un processus qui peut prendre plusieurs mois. La SLA est une maladie neurodégénérative, et à l’instar des autres maladies neurodégénératives, elle a toujours été perçue comme une maladie de l’âge adulte, voire même une forme de vieillissement prématurée du cerveau et de la moelle épinière. Cependant, cette vision de la neurodégénérescence est en train d’évoluer, avec une démonstration récente d’altérations développementales dans la maladie de Huntington, et des séries d’arguments en faveur d’une origine développementale des maladies d’Alzheimer, de Parkinson, ainsi que de la SLA. La démonstration d’une composante développementale à ces maladies, et en particulier à la SLA, permettrait d’envisager 1) la recherche de biomarqueurs beaucoup plus précoces, par exemples parmi les familles de patients, 2) une administration des traitements en amont de l’apparition des signes cliniques de la maladie, et 3) éventuellement un enrôlement plus précoce des patients dans les études cliniques dans le but d’améliorer les traitements actuels.

Procédures

420 animaux, à phénotype dommageable, seront euthanasiés avant le développement des symptômes de la maladie SLA afin de procéder à des prélèvements. 140 autres subiront des tests de motricité. Ainsi, de l'âge de 8 semaines (stade postnatal P60) jusqu'à 18-20 semaines (P120-P140), ils seront soumis à des tests moteurs ayant pour but de déterminer avec précision le déclin de leur force musculaire. Les deux tests utilisés seront le test d’endurance sur roue et le test d'opposition à la gravité. Ils seront réalisés deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisances sont attendus au cours de cette étude : 1- Le développement d'atteintes motrices et d'une mort précoce, typiques de la SLA, avec une perte de poids qui commence aux alentours de 75 jours et peut atteindre 40 % au fil du temps, ainsi que l'apparition de symptômes moteurs aux alentours de 90 jours, sous forme de problèmes d'extension des pattes arrière, suivis d'une paralysie progressive qui touche d'abord les pattes arrière, puis les pattes avant, et qui évolue vers une paralysie totale et une mort prématurée aux alentours de 130 jours. 2- Un suivi moteur hebdomadaire des animaux par le biais de tests de locomotion et de force motrice, qui peut s'avérer fatiguant et stressant pour des animaux présentant une faiblesse musculaire et une paralysie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux modèles de la maladie de Charcot seront euthanasiés avant la paralysie complète, conformément aux seuils établis, et les animaux contrôles ayant servi de contrôle seront euthanasiés aux mêmes âges.

Remplacement

Ce projet consiste à déterminer si la SLA pourrait avoir une origine développementale liée à dysfonctionnement de la transmission synaptique inhibitrice. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les étapes-clé du développement du système nerveux central ainsi que les caractéristiques de la SLA : déclenchement de symptômes moteurs à l’âge adulte et mort prématurée. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in silico permettant de modéliser la maladie et donc d’éviter l’utilisation d’animaux.

Réduction

La taille des groupes est déterminée afin de réaliser des tests statistiques pertinents. Pour rappel, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles afin d’analyser l’effet sexe. Ceci nous permettra de ne pas avoir à mettre à mort d’animaux n’ayant pas le sexe d’intérêt.

Raffinement

Les mesures de raffinements pour améliorer le bien-être des animaux ont été pensées pour chaque étape de la vie des animaux transgéniques exprimant un phénotype dommageable sévère.

Choix des espèces

Parmi les modèles de la maladie de Charcot, les souris sont les plus appropriées à notre étude, car elles présentent : 1) un niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat ; 2) un développement comparable à celui de l’homme ; 3) plusieurs lignées exprimant une mutation d’un gène causatif de la maladie, dont certaines reproduisent les symptômes observés chez l’homme et sont donc adaptées à l’évaluation préclinique de traitements médicamenteux.

Des injections d'une émulsion activant le système immunitaire, une toxine, puis des tests d'équilibre et de course sur tapis: 1 360 souris traversent ce protocole de sclérose en plaques, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chez les nouveau-nées, des outils génétiques sont injectés dans la moelle épinière après trois heures de séparation d'avec la mère. L'inflammation induite provoque des déficits moteurs progressifs dont la sévérité varie selon les individus. Toutes les souris seront tuées pour prélever leur moelle épinière, l'équipe présentant la souris comme "indispensable" faute de pouvoir reproduire ces mécanismes en culture.

Objectifs

Le canal central de la moelle épinière est bordé par une barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant. Cette barrière est en contact avec différentes cellules spécialisées qui participent au bon fonctionnement du système nerveux. Lors d’épisodes neuro-inflammatoires, la structure et la perméabilité de la barrière peuvent être altérées, ce qui risque de modifier la composition du LCR, de perturber la communication entre les cellules nerveuses, et d’entraîner des troubles des fonctions sensorimotrices et autonomes, par exemple le contrôle de la vessie. Les mécanismes de plasticité de cette barrière restent encore largement méconnus, en particulier dans un contexte inflammatoire. Mieux comprendre son fonctionnement et ses modifications en situation de maladie est essentiel pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Notre projet a pour objectif de déterminer comment une neuro-inflammation chronique comme celle observée dans la sclérose en plaques modifie cette barrière et son fonctionnement. Nous chercherons à déterminer quels changements surviennent dans les cellules et quelles sont les conséquences sur la dynamique du LCR et la régulation des fonctions sensorimotrices et autonomes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre la plasticité de la barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant en contexte neuro-inflammatoire. À court terme, les travaux permettront de caractériser les modifications cellulaires, moléculaires et fonctionnelles (miction (action d'uriner), locomotion) liées à l’inflammation, grâce à plusieurs approches complémentaires. À moyen terme, les résultats permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour restaurer ou protéger l’intégrité de la barrière. L’étude des conséquences fonctionnelles, notamment urinaires et locomotrices, apportera des éléments déterminants pour comprendre l’origine de certains symptômes observés dans les pathologies inflammatoires de la moelle épinière. À long terme, ce projet contribuera à identifier des biomarqueurs mesurables dans le LCR permettant de suivre l’évolution et la réponse aux traitements. Les connaissances acquises ouvriront également la voie à des stratégies thérapeutiques visant à limiter les effets de l’inflammation et à favoriser la régénération tissulaire.

Procédures

Selon les cas, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : # Trois injections sous-cutanées d’une émulsion composée d’une protéine et d’une substance qui active le système immunitaire, sous anesthésie : 10 minutes. # Deux injection intrapéritonéales ou sous-cutanées d’une toxine : moins d’une minute. # Cinq injections sous-cutanées d’un composé pharmacologique une fois par jour pendant 5 jours : moins d’une minute. # Injection dans la moelle épinière d’outils génétiques chez la souris nouveau-née sous anesthésie → induction anesthésie : 10 min - chirurgie : 10 min - surveillance post-op : 20 min - séparation de la mère : 3h. # Injection dans les ventricules du cerveau d’un virus (non pathogène) chez la souris adulte sous anesthésie → induction anesthésie : 5 min - chirurgie : 30 minutes - surveillance post-op : 1h - l’animal est en dehors de la zone de stabulation pendant 2 à 4h. # Prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Injection d’un traceur dans les ventricules du cerveau sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Test comportementaux : - Etude la miction : 4h. - Activité locomotrice spontanée : 40 minutes. - Poutre d’équilibre : 3/5 x 5 minutes. - Tapis roulant : 30 minutes.

Impact sur les animaux

1\ L’injection de l’émulsion composée d’une protéine et d’une substance qui active le système immunitaire associée à l’injection de la toxine entraîne un état inflammatoire chronique, associé à des déficits moteurs progressifs dont la sévérité peut varier selon les animaux. 2\ Les injections sous-cutanées quotidiennes d’un composé pharmacologique pendant cinq jours consécutifs peuvent provoquer du stress lié aux manipulations répétées. 3\ Les interventions chirurgicales sont susceptibles de générer des douleurs et un inconfort après l’intervention. 4\ Les tests comportementaux peuvent induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. Certains tests sont peu contraignants (étude de la miction ou locomotion spontanée), tandis que d’autres demandent plus d’effort aux animaux (poutre d’équilibre, tapis roulant).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de la moelle épinière et analyses.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier la plasticité de la zone de la moelle épinière en contact avec le LCR en contexte neuro-inflammatoire chronique et ses conséquences sur différentes fonctions de l’organisme. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre cellules et circulation du LCR qui ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire ou par des modèles informatiques. De plus, certaines fonctions comme la miction ou la locomotion nécessitent l’étude d’un organisme entier. Ce projet ne peut pas être réalisé chez l’humain car il implique l’analyse des extractions de moelle épinière. L’utilisation de la souris est indispensable car elle permet d’utiliser des outils génétiques précis adaptés aux objectifs du projet.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés soit à partir de notre expérience, soit à partir d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire. Pour les tests comportementaux (miction et locomotion), les mêmes animaux seront suivis à différents temps post-inflammation, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Ces animaux seront ensuite utilisés pour des analyses post-mortem, ce qui maximise les informations obtenues à partir de chaque animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-4 animaux par cage) et enrichies (maison, buchettes, tunnel, …). Nous leur fournirons une grande quantité de matériel de nidification quelques jours avant l’induction de la neuro-inflammation afin qu’ils puissent avoir des zones de température différentes au sein de la cage. Après l’induction, ils auront accès à des friandises et/ou du gel nourrissant et/ou des croquettes mouillées en plus de leur nourriture habituelle. Toutes les injections (hormis les injections dans les ventricules du cerveau et dans la moelle épinière) se feront par voie sous-cutanée afin d’éviter la voie intrapéritonéale, plus douloureuse et moins reproductible. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie appropriée avec analgésie systématique par du personnel expérimenté. Pour limiter le stress et l’inconfort liés aux injections sous-cutanées quotidiennes de composés pharmacologiques sur cinq jours, nous essaierons de mettre en place l’administration volontaire par micro-pipette (composé dilué dans une solution appétente). Pour les tests comportementaux, les animaux seront habitués à la pièce / cage d’expérimentation la semaine précédant l’induction de la neuro-inflammation (3 séances de 30 min – 1h). Nous ferons attention à ce que les animaux soient toujours en présence d’odeurs familières (litière de leur cage d’origine).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus pertinente pour notre étude car ce modèle est maîtrisé au sein de notre équipe et permet l’utilisation de lignées génétiquement modifiées. Ces modèles permettent de cibler précisément certains types de cellules. Les animaux utilisés seront des souris femelles adultes (8-14 semaines), car à cet âge le modèle de neuro-inflammation chronique est fiable et reproductible. Les injections chez les nouveau-nés seront réalisées précocement car les outils utilisés sont plus efficaces à ce stade.

496 souris vont être utilisées dans une étude sur le toucher social pendant l'enfance, 320 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un isolement social de quatorze jours après le sevrage, une chirurgie du cerveau, puis jusqu'à six heures d'électrophysiologie sous anesthésie et des séances de contention. Toutes sont tuées à la fin pour vérifier les injections et analyser le cerveau, hormis les souris démonstratrices, réutilisées jusqu'à deux fois puis gardées pour d'autres expériences. Le projet cherche à comprendre comment une caresse sur la peau au stade juvénile modifie les circuits de l'anxiété.

Objectifs

Les troubles anxieux touchent entre 15 et 20% de la population, les femmes plus que les hommes, et peuvent avoir des conséquences parfois invalidantes pour les personnes qui en souffrent. La qualité de l’environnement psychosocial (présence d’une cellule familiale solide sans violence physique/psychologique/sexuelle) et émotionnel (relation parents/enfant, cercle familial et amical) dans lequel un individu grandit et évolue constitue un des éléments clés favorisant sa capacité à faire face à un épisode de stress, sans développer de troubles anxieux en réponse à cet épisode. Ce phénomène de « résistance » au stress est appelé résilience. De l’enfance à l'adolescence, chaque individu traverse une période charnière permettant la maturation et le bon fonctionnement des régions du cerveau participant à la régulation émotionnelle. Des recherches récentes menées chez l’humain ont montré que les thérapies basées sur le toucher donnaient des résultats encourageant sur la diminution du sentiment d’anxiété, suggérant un rôle important, bien que très peu compris, du toucher dit social/affectif (TS/A) dans la régulation émotionnelle. En stimulant les neurones à ocytocine, une molécule clé de la régulation émotionnelle, le TS/A entraîne l’activation de l’aire tegmentale ventrale, une région dopaminergique régulatrice de l’anxiété. Ce projet de recherche, conduit sur un modèle murin, vise ainsi à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels le TS/A, via l’activation des neurones ocytocinergiques, régule la réponse au stress de l'aire tegmentale ventrale et favorise la résilience. Les régions cérébrales ciblées dans ce projet étant connues pour montrer des différences en fonction du sexe des individus, la prise en compte de ce paramètre est un point central de ce projet, et apportera de nouvelles connaissances qui permettront de mieux comprendre la surreprésentation des femmes parmi la population de personnes affectées par des troubles anxieux.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux font partis des troubles psychiatriques les plus communs mais leurs causes complexes et variées rendent ces troubles encore difficiles à soigner. Les approches thérapeutiques actuelles (psychothérapie couplée ou non à traitement pharmacologique de type anxiolytiques/antidépresseurs) imposent une mise au point longue et fastidieuse pour trouver une approche adaptée aux besoins de chaque patient, et nécessite donc une prise en charge de longue durée, aux résultats variables. Bien que les études chez l’humain apportent des connaissances essentielles quant à l’importance des liens sociaux dans la santé mentale et la résilience, l’essentiel des recherches se sont plutôt concentrées sur les effets délétères de l’absence de lien social (notamment les interactions parents/enfants), et ont laissé de côté l’étude des effets bénéfiques et protecteurs des liens sociaux sur la santé mentale. En identifiant les mécanismes biologiques de l’anxiété sensibles au TS/A, ce projet de recherche ouvrira de nouvelles perspectives aussi bien préventives que thérapeutiques sur la prise en charge des troubles anxieux.

Procédures

Protocole d'isolement social : 14 jours consécutifs - Chirurgie stéréotaxique : 1h30-2h - Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié: 4-6h - Stress de contention : 30 min - Tests comportementaux: 20 min répétés 7 fois maximum

Impact sur les animaux

Plusieurs types d’effets indésirables pourraient être observés chez les animaux de cette étude. Ces effets comprennent : 1) un risque de douleur au moment de la chirurgie et dans les jours post-opératoire ; 2) un risque d’infection lié aux chirurgies ; 3) un stress induit par les tests de comportements choisi ; 4) un stress induit par le protocole d’isolement social; 5) le stress de contention.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, soit pour vérifier la qualité des injections stéréotaxiques/pose d'implant, soit pour procéder à des analyses post-mortem de type immunohistochimie ou quantification des projections neuronales. Les animaux démonstrateurs seront en partis utilisés à plusieurs reprises (2 fois maximum) lors des tests. Les animaux démonstrateurs pourront être réutilisés ultérieurement.

Remplacement

Ce projet se base sur une approche intégrative développementale, permettant de comprendre comment un stimulus périphérique tel que le TS/A (qui correspond à une caresse sur la peau) au stade juvénile peut remodeler à long terme les circuits neuronaux en charge de la régulation du stress et de l’anxiété sur le long-terme. Ainsi, cet objectif et les techniques nécessaires pour y répondre (injections pour du traçage neuronal/marqueur de population neuronale/biocapteur ; comportement ; enregistrements électrophysiologique) ne peuvent se faire que sur animal se comportant, à plusieurs stades de sa vie, et ne peut donc pas être remplacé par un modèle « in vitro ».

Réduction

L’essentiel des protocoles expérimentaux nécessaires à la réalisation de ce projet reposent sur des techniques utilisées en routine dans l’équipe. Cette expérience permet une estimation précise de la taille des échantillons nécessaires pour l’obtention de résultats fiables, et d’analyses statitisques robustes sans surestimation. Par ailleurs, la taille des groupes a été confirmé grâce à des analyses statistiques basées sur des calculs de puissance. Par ailleurs, pour chaque expérience l’échantillon d’animaux prévu sera divisé en plusieurs lots. Les résultats obtenus à partir de chaque lot seront analysés dans la foulée, ce qui permettra d’ajuster à la baisse la taille du lot suivant (et donc le nombre d’animaux nécessaires) si besoin. Par ailleurs, les femelles et les mâles seront utilisés, limitant la production d’animaux non-utilisés. Si les résultats préliminaires ne montraient aucun différence entre les mâles et les femelles, ce facteur d'analyse serait alors abandonné, entrainant une reduction drastique du nombre d'animaux nécessaires à l'étude.

Raffinement

Plusieurs procédures de raffinement seront mis en place pour maximiser le bien-être des animaux, dans le cadre des contraintes de ce projet : 1) l’établissement de points limites précis et de procédures de prises en charge associés misent en place dès que les points limites sont atteints ; 2) chaque animal bénéficiera de suivi post-opératoire pour assurer la mise en place de soins adéquats pendant et après les opérations et chaque interventions invasives sera réalisée sous anesthésies/analgésie ; 3) l’hébergement en cage collective sera privilégié, sauf pour les animaux soumis au protocole d’isolement social ; 4) ; la mise a disposition systématique d’enrichissement (tube en carton) et de matériel pour le nid dans chaque cage ; 5) afin de diminuer le stress lié à chaque manipulation, les animaux seront habitués à être sorti de la cage et posé dans la main de l’expérimentateur avant chaque procédure comportementale ; 6) un temps de repos de minimum une semaine sera assuré après intervention chirurgicale avant de poursuivre le protocole expérimental afin de laisser les animaux se reposer et minimiser le stress ; 7) un délai de 24h sera établi entre chaque tests comportementaux afin de maximiser le temps passer chaque jour par les souris dans leur cage d’hébergement et de minimiser le temps de solicitation afin de réduire le stress. Par ailleurs, les souris seront hébergées en cycle inversé de façon à ce que chaque étape des protocoles soient réalisées en phase nocturne, c’est-à-dire pendant la phase naturelle active des animaux. L’utilisation du cycle inversé permettra donc d’éviter de perturber les animaux pendant leur phase de sommeil. Les animaux bénéficieront du suivi journalier par les zootechniciens ce qui permettra de détecter rapidement l’apparition de symptômes négatifs, et donc une prise en charge rapide. Ce suivi sera encore plus poussé pendant la période péri-opératoire, lors de laquelle des analgésiques pourront être administrés en cas de douleur, et renouveller 24h plus tard si besoin. Si au bout de 3 jours, malgré l’administration répétée d’analgésiques, les signes de douleurs persistent, l’animal sera euthanasié. Par ailleurs, avant le début de chaque procédure, le poids et la taille des animaux sera contrôlé : tout animal qui trop petit ou trop faible sera exclu de facto de l’échantillon.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré une grande convergence anatomique et fonctionnelle du système nerveux à l’origine de la détection cutanée du TS/A, et des zones cérébrales activées suite au TS/A chez l’humain et la souris. Par ailleurs, le système ocytocinergique, qui est au coeur de notre étude, montre un niveau de conservation très important chez les mammifères. Ces similarités entre la souris et l’humain assureront la validité translationnelle des résultats obtenus dans notre étude et apporteront donc des connaissances nouvelles bénéfiques aux améliorations de la prise en charges des troubles anxieux. Par ailleurs, la souris est un modèle animal permettant la mise en place de méthodes invasives bien maitrisées par l’équipe. Ce projet se concentre sur le rôle du TS/A pendant l'enfance sur la capacité, à l'adolescence, de développer une résilience au stress. En effet, l'enfance et l'adolescence/début de l’âge adulte sont des périodes clé dans le développement cérébral et sont donc particulièrement sensibles au stress. Cette sensibilité au stress et donc au développement de troubles anxieux est vrai aussi bien chez la souris que l'humain. Ce projet cherche se concentre donc sur ces deux périodes développementales. Le protocole de TS/A, selon le protocole préalablement établi et publié, est effectué chez des souris juvéniles (P15-P19). Quant au protocole d’isolement social, il intervient au premier jour de sevrage des souris juvéniles (P21), et ce pour une durée de 14 jours. Les procédures de chirurgie stéréotaxique nécessitent d'être réalisées avant les tests comportementaux, et sont donc réalisées chez des souris de 6-10 semaines. Les tests comportementaux sont quant à eux faits chez des souris de 8-12 semaines.