Procédures sévères
Développement d’un modèle murin de choc septique par ligature et perforation caecale (CLP) pour évaluer de nouvelles thérapies dans l’ACLF.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Tous tués à l'issue pour prélever sang et organes, 1 720 souris, dont 1 420 dans des procédures au niveau de souffrance le plus élevé, sont utilisées pour reproduire un choc septique. La maladie est provoquée par une opération qui ligature et perfore le cæcum, puis évolue vers une chute de température, une détresse respiratoire et, dans les cas les plus graves, une défaillance de plusieurs organes et la mort. Le résumé reconnaît que les souris "peuvent ressentir une souffrance parfois importante". Le porteur situe l'intérêt du projet dans la recherche de traitements contre une maladie responsable de nombreux décès humains.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre une maladie grave appelée choc septique, qui survient lors d’une infection et provoque un dérèglement important du corps. Pour cela, nous utilisons des souris et provoquons la maladie grâce à une petite opération réalisée sous anesthésie. Cela permet de reproduire la maladie et d’observer comment elle évolue. Les souris développent alors des signes similaires à ceux observés chez les patients, comme une baisse de la température du corps et une respiration plus rapide. À terme, ce travail permettra de tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment cette maladie grave perturbe le fonctionnement du corps, et à trouver de nouvelles façons de la soigner. Nous étudions en particulier certaines substances qui peuvent agir à l’intérieur des cellules et aider l’organisme à mieux contrôler sa réaction face à l’infection. Ces substances pourraient notamment limiter l’emballement des défenses du corps et protéger des organes importants comme le cœur. Les résultats de cette étude pourraient ainsi permettre de découvrir de nouvelles pistes de traitement pour une maladie encore difficile à soigner et responsable de nombreux décès.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (afin de ligaturer et perforer le caecum) qui dure environ 20 minutes. Par la suite, ils seront soumis à des prélèvements sanguins terminaux, sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Cette méthode permet de reproduire chez la souris une maladie grave semblable à celle observée chez l’être humain. Les animaux peuvent alors montrer des signes de mal-être, comme une baisse de la température du corps, une respiration plus rapide, une perte de poids, moins d’activité et une grande fatigue. Cela signifie que les souris peuvent ressentir une souffrance parfois importante. La procédure comprend une petite opération réalisée sous anesthésie, mais elle peut entraîner des douleurs après l’intervention ainsi qu’un risque d’infection. Dans les cas les plus graves, la maladie peut s’aggraver, toucher plusieurs organes et entraîner la mort de l’animal.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux sont endormis de façon à ne pas ressentir de douleur, puis euthanasiés afin de pouvoir prélever du sang et différents organes. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser les analyses qui permettent de mieux comprendre la maladie et d’évaluer l’efficacité des traitements testés. Ces examens ne peuvent pas être réalisés sur des animaux vivants, ce qui rend cette étape indispensable. Tout est mis en œuvre pour que cette fin se fasse dans les conditions les plus respectueuses et les moins douloureuses possible.
Remplacement
Le choc septique et certaines maladies graves du foie sont des maladies très complexes qui touchent plusieurs organes en même temps et provoquent des réactions importantes dans le corps. Aujourd’hui, il n’est pas possible de reproduire entièrement cette complexité en laboratoire avec des cellules ou des outils informatiques. Avant d’utiliser des animaux, les chercheurs testent d’abord les substances sur des méthodes sans animaux ou sur des cellules, afin de sélectionner les plus prometteuses et de limiter le nombre d’animaux utilisés. Malgré cela, l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour ce type d’étude, car elle est la seule façon d’observer comment l’ensemble du corps réagit face à ces maladies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en en utilisant le moins possible. Une première étape, réalisée avec peu de souris, permet de mettre au point la méthode avant de réaliser l’étude complète. Ensuite, seules les conditions vraiment utiles sont conservées, afin d’éviter de répéter inutilement les expériences. L’objectif est de recueillir un maximum d’informations avec chaque animal, tout en limitant leur nombre au strict nécessaire.
Raffinement
Toutes les manipulations sont réalisées dans des conditions propres pour éviter les infections. Les animaux sont endormis et reçoivent des traitements contre la douleur afin qu’ils ne souffrent pas pendant et après les interventions. Après l’opération, ils sont surveillés attentivement et vivent dans un environnement adapté avec des éléments pour se reposer et s’occuper, ce qui permet de réduire leur stress. Leur état de santé est vérifié chaque jour. Si un animal montre des signes de souffrance trop importants, l’expérience est arrêtée et une euthanasie est réalisée rapidement pour éviter toute douleur. Le personnel est spécialement formé, et tout est organisé pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux.
Choix des espèces
La souris est utilisée dans ce projet car elle fonctionne de manière assez proche de l’être humain et est largement étudiée en recherche. La méthode employée pour reproduire la maladie est bien connue chez cette espèce, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables. De plus, les substances testées ont déjà été étudiées chez la souris, ce qui renforce l’intérêt de ce choix. Dans certains cas, le rat pourra aussi être utilisé, notamment lorsque des prélèvements plus importants ou des mesures plus précises sont nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, un âge qui permet d’obtenir des résultats plus réguliers et comparables. Cela aide à limiter les variations entre les animaux et à réduire leur nombre tout en garantissant la qualité de l’étude.
Etude morpho-fonctionnelle des réseaux neuronaux chez l’animal vigil, non anesthésié, à l’aide d’approches d’imagerie in vivo
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris nouveau-nées reçoivent une injection virale dans le cerveau, puis une fenêtre optique implantée dans le crâne pour observer leurs neurones pendant des semaines. 1 750 souris sont utilisées, dont 1 400 dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, toutes tuées à l'issue. Le résumé présente ces observations comme réalisées chez l'animal éveillé, dans des conditions "proches du comportement naturel", quand sa propre grille prévoit de coter des vocalisations persistantes et des comportements d'automutilation. Le cerveau est prélevé après la mise à mort.
Objectifs
Cette plateforme permet d’étudier les circuits neuronaux chez la souris, de la naissance à l’âge adulte, grâce à des techniques d’imagerie réalisées chez des animaux éveillés et dans des conditions proches du comportement naturel. Selon les expériences, différentes méthodes sont employées afin d’observer le cerveau en profondeur ou chez des animaux libres de leurs mouvements. Les animaux subissent d’abord une intervention permettant d’installer un petit dispositif donnant accès au cerveau. Après une période de récupération, ils sont progressivement habitués aux conditions expérimentales. Les observations sont ensuite réalisées chez des animaux éveillés. Trois types de protocoles sont utilisés :1) observation de l’activité du cerveau chez les très jeunes animaux, 2) suivi de cette activité au cours du développement jusqu’à l’âge adulte, et 3) analyse du cerveau après la fin de l’expérimentation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer et valider des méthodes fiables pour observer le fonctionnement du cerveau chez la souris éveillée, dans différentes conditions expérimentales, avec ou sans immobilisation de la tête. Sur le plan scientifique, ces méthodes permettront de mieux comprendre comment les neurones fonctionnent ensemble, dès les premières étapes du développement, et dans des situations plus proches du comportement naturel, notamment lorsque l’animal peut se déplacer librement. Sur le plan technique, ce projet permettra d’améliorer et de structurer les outils disponibles sur la plateforme, afin de les rendre plus accessibles et plus simples à utiliser pour les chercheurs, tout en respectant les exigences éthiques liées à l’expérimentation animale. Enfin, ce travail contribuera à garantir la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques, ainsi qu’à former les utilisateurs aux bonnes pratiques expérimentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs étapes : identification et prélèvement pour génotypage, injection virale à la naissance, chirurgie pour l’implantation d’une fenêtre optique, sessions répétées d’imagerie chez l’animal éveillé, puis mise à mort suivie d’analyses du cerveau. À la naissance, les animaux sont brièvement manipulés pour identification, prélèvement et injection sous anesthésie adaptée, avant d’être replacés avec leur mère. Une chirurgie est ensuite réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur, afin d’installer un dispositif permettant l’observation du cerveau. Après quelques jours de récupération, les animaux sont progressivement habitués au dispositif. Les séances d’imagerie sont réalisées chez l’animal éveillé, soit en position fixe, soit en déplacement libre, pour des durées limitées avec des périodes de repos. Une stimulation lumineuse peut être appliquée dans certains cas. En fin d’expérimentation, les animaux sont mis à mort sous anesthésie profonde, puis leur cerveau est prélevé pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures chirurgicales, notamment les injections intracérébrales et l’implantation d’une fenêtre optique crânienne pour l’imagerie in vivo. Ces interventions peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire associé à l’incision cutanée, à la manipulation des tissus périphériques (crâne, dure-mère) et à la réaction inflammatoire locale. Après une injection intracérébrale, une gêne ou une sensibilité au niveau du site opératoire peut survenir durant les premières heures à 1–2 jours. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L’implantation chronique d’une fenêtre optique constitue une intervention plus invasive, susceptible de provoquer une douleur post-opératoire modérée et une inflammation locale pouvant persister plusieurs jours (en général 2 à 5 jours). Cette chirurgie est également réalisée une seule fois par animal, mais l’implant reste en place sur le long terme. Dans certains cas, des effets indésirables peuvent inclure une perte de poids transitoire, une diminution temporaire de l’activité ou des signes de stress liés à la récupération post-chirurgicale ou au port du dispositif d’imagerie. De manière plus rare, des complications peuvent survenir, telles qu’une infection locale, un déplacement de l’implant ou une détérioration de l’état général.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est justifiée par le caractère invasif des procédures expérimentales et par la nécessité de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux afin de compléter les données obtenues in vivo. De plus, les dispositifs implantés et les interventions chirurgicales ne permettent pas une réutilisation des animaux dans d’autres procédures expérimentales sans risque de compromettre leur bien-être ou la validité scientifique des résultats.
Remplacement
Répondre à notre objectif nécessite de pouvoir étudier le cerveau vivant, éveillé et en comportement. En ce sens, seules des approches menées sur un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau, ciblées par notre projet et dont pourront bénéficier à terme les études menées chez l’homme. En effet, les méthodes alternatives comme les organoïdes cérébrales ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux fonctionnellement connectés et matures, et nous ne possédons pas encore les connaissances suffisantes pour établir des modèles in silico de ces réseaux corticaux complexes. C’est d’ailleurs un des aspects clés de notre projet : nous visons à établir une description fonctionnelle précise de ces réseaux de neurones, en se concentrant sur les différents types cellulaires, avec l’espoir que dans le futur cela rende possible des modèles in silico de ce type.
Réduction
Nous nous engageons à limiter le nombre d’animaux utilisés en maximisant la quantité et la qualité des données obtenues par individu. L’utilisation de protocoles d’imagerie longitudinaux sur les mêmes animaux, la standardisation des procédures chirurgicales et le recours à des outils analytiques puissants (imagerie multiphotonique, systèmes miniaturisés) permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse statistique des résultats. Lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques des projets, des animaux des deux sexes (mâles et femelles) seront inclus afin d’éviter toute discrimination de sexe et de permettre une meilleure représentativité des résultats. Enfin, la mutualisation des données entre projets, lorsque possible, et la formation des utilisateurs aux bonnes pratiques visent également à limiter les pertes expérimentales et les répétitions inutiles.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu’il s’agisse des souris gestantes ou de leur progéniture, sera rigoureusement suivi tout au long du protocole (croissance, état général, comportement). Une surveillance quotidienne sera assurée afin d’évaluer l’activité, l’aspect du pelage, l’alimentation ainsi que tout signe de douleur ou de stress. Des grilles de scores de souffrance seront utilisées pour permettre une prise en charge rapide et adaptée (cf annexe 1). Tout score de 3 attribué à l’un des paramètres (vocalisations persistantes, posture anormale, automutilation, perte de poids importante, absence de prise alimentaire, etc.) sera considéré comme un signe de souffrance sévère et entraînera systématiquement une action corrective immédiate. Ainsi, un animal présentant des vocalisations ou des comportements d’auto-mutilation ne sera en aucun cas considéré comme “normal”, mais fera l’objet d’une prise en charge renforcée et, si nécessaire, d’une consultation vétérinaire. Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés et juvéniles lors des chirurgies afin de minimiser douleur et stress : anesthésie générale et locale adaptée, administration systématique d’analgésiques en péri- et post-opératoire, maintien thermique (tapis chauffant), conditions strictes d’asepsie, protection oculaire, réhydratation, et suivi post-opératoire renforcé, notamment lors de la réintégration des petits à la portée. En cas de dépassement des seuils définis, une analgésie supplémentaire sera administrée, par exemple buprénorphine (0,1 mg/kg, SC, toutes les 8–12 h si nécessaire), avec une réévaluation quotidienne. Si malgré ces mesures l’état de l’animal ne s’améliore pas rapidement, ou si plusieurs paramètres atteignent un score critique, des critères d’arrêt anticipé seront appliqués et l’animal sera euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les mères et leurs petits, opérés ou non, seront hébergés dans des armoires ventilées en environnement contrôlé, avec un enrichissement adapté (igloos, rouleaux de papier, matériaux de nidification) favorisant le comportement naturel. Les animaux plus âgés bénéficieront des mêmes conditions d’hébergement, avec un suivi quotidien.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence en neurosciences, en raison de la complexité de son organisation cérébrale, de la disponibilité de nombreux outils génétiques, et de l’existence de nombreuses lignées transgéniques permettant un ciblage cellulaire précis via le système Cre-loxP. Ce modèle est particulièrement adapté aux approches d’imagerie fonctionnelle in vivo développées sur la plateforme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement, du stade néonatal (P0) à l’âge adulte, afin d’étudier à la fois la mise en place progressive des circuits neuronaux au cours du développement et le fonctionnement de réseaux matures. Cette diversité de stades est essentielle pour comprendre l’évolution des dynamiques neuronales au cours de la vie et répondre aux objectifs des projets menés sur la plateforme, notamment dans le contexte du développement normal ou de troubles neurodéveloppementaux.
Impact du diabète paternel sur la santé métabolique de la descendance
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rendues diabétiques par l'injection d'un médicament, une partie des 96 souris subit des atteintes classées sévères, l'ensemble étant tué à l'issue. Le projet veut mesurer l'effet du diabète du père sur la santé de sa descendance, ce qui conduit à faire entrer dans la procédure les géniteurs, les mères reproductrices et les petits, tous mis à mort. La glycémie des mâles est contrôlée chaque semaine par prélèvement de sang à la queue, sans anesthésie, pendant plusieurs cycles de reproduction. Les mâles sont tués vers trois à quatre mois.
Objectifs
Le diabète et l’obésité chez les parents peuvent augmenter le risque que leurs enfants développent plus tard des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes qui expliquent ce phénomène sont encore mal connus. On sait que l’environnement et le mode de vie peuvent modifier le fonctionnement de certains gènes et influencer ainsi la santé de la descendance. Mieux comprendre ces effets est important pour améliorer le diagnostic et la prévention des maladies. Ce projet vise à étudier l’effet du diabète chez le père sur la santé métabolique de ses descendants. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris dans lequel le diabète peut être provoqué chez les mâles. Le poids de ces animaux sera suivi régulièrement avant qu’ils soient accouplés avec des femelles non diabétiques. Cette approche permettra d’obtenir des petits issus de pères diabétiques ou non diabétiques. L’étude portera ensuite sur les descendants. Des groupes de neuf animaux de chaque sexe seront constitués et étudiés à l’âge adulte (3 à 4 mois). Au total, quatre groupes seront analysés. Tous les animaux feront l’objet d’un suivi de leur croissance grâce à des pesées hebdomadaires, et leur consommation alimentaire sera mesurée. Des tests seront également réalisés pour évaluer la manière dont leur organisme régule le sucre dans le sang. Ces travaux ont pour objectif de mieux comprendre l’origine de certaines maladies métaboliques et cardiovasculaires. À plus long terme, ils pourraient contribuer à améliorer la prévention, le diagnostic et la prise en charge de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Les effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont : 1) des nuisances légères : lésions liées aux injections sous-cutanées et aux prélèvements sanguins. Le diabète est induit chez les mâles après injection sous-cutanée sans anesthésie. À partir du 7ᵉ jour suivant l’induction du diabète, la glycémie sera mesurée une fois par semaine par prélèvement d’environ 10 microlitres de sang au niveau de la queue, sans anesthésie, pendant trois cycles de spermatogenèse. 2) des nuisances sévères : douleurs liées à la pathologie diabétique. Les symptômes cliniques observés chez les souris diabétiques sont l’hyperglycémie, la glycosurie, la polydipsie et la polyurie. En l’absence de prise en charge, une déshydratation peut survenir. Toutefois, les niveaux de glycémie attendus (inférieurs à 35 mmol/L) sont considérés comme tolérables et limitent les risques de déshydratation. 3) du stress lié à l’isolement temporaire lors des tests du métabolisme des glucides. Des douleurs transitoires peuvent survenir lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue, lors de l’administration de solutions sucrées par gavage et lors des injections intrapéritonéales. Ces effets sont de courte durée et réversibles. Les tests du métabolisme des glucides nécessitent une mise à jeun préalable (4 à 6 heures). De même, la veille de l’euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les animaux subiront au maximum deux administrations par gavage, deux prélèvements sanguins et une injection intrapéritonéale au cours du protocole. La contention répétée des animaux pourra également être source de stress.
Procédures
Au cours du protocole expérimental, des administrations seront réalisées par voie intrapéritonéale (IP) et par voie orale (PO), à raison d’une injection IP et d’une administration PO par animal, selon le schéma expérimental défini (sur 36 animaux). L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau complémentée en sucrose sera remplacée par une eau sans sucrose enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimentale. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont : 1) des nuisances légères : Lésions liées aux injections sous-cutanées et prélèvements sanguin. Le diabète est induit chez les mâles Kir6.2-V59M après injection de tamoxifène en sous-cutané sans anesthésie. Dès le 7ème jour après l’induction de diabète chez les mâles, la glycémie sera mesurée 1 fois par semaine par prélèvement de 10 microlitres de sang au niveau de la queue sans anesthésie pendant 3 cycles de spermatogenèse. 2) des nuisances sévères : Douleurs liées à 2 types de maladies. Diabète paternel : Les symptômes cliniques de nos souris diabétiques sont l’hyperglycémie, glycosurie, polydipsie et polyurie. Si le diabète n'est pas traité, la mort résulte de la déshydratation. D’après nos résultats obtenus à partir de souris femelles diabétiques, les glycémies devraient être inférieures à 35 mmol/l. Ces valeurs sont tolérables pour les animaux et limitent les risques de déshydratation. 3) Stress lié à l’isolement lors de test de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT). Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang et lors du gavage avec une dose de glucose (OGTT) et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (ITT). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests OGTT et ITT les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires être réversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests OGTT et ITT.
Devenir
Tous les animaux (géniteurs diabétiques, mères reproductrices et descendants) entrant dans cette procédure seront mis à mort. Les mâles seront soumis à l'euthanasie à l'âge de 3-4 mois.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie dans ce projet, car il n’existe actuellement aucune méthode de substitution permettant d’étudier l’effet d’une surcharge en glucose chez les géniteurs sur la santé métabolique de leur descendance. Il est impossible d’expérimenter ces conditions chez l’être humain, en raison des analyses tissulaires nécessaires. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour étudier cette pathologie. À ce jour, le seul modèle de mammifère fiable pour reproduire un diabète paternel est un modèle génétique de souris permettant de mimer une altération du contrôle de la glycémie. Nous utiliserons ce modèle afin de générer des mâles présentant une surcharge en glucose et capables de transmettre à leur descendance une prédisposition aux troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en minimisant l’utilisation d’animaux. Chaque lot comprendra 9 animaux, ce qui représente le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots, notamment en ce qui concerne l’homéostasie glucidique, à l’aide d’un test de Student. Les tailles de groupes ont été définies sur la base d’analyses statistiques prévisionnelles, garantissant une puissance suffisante pour détecter les effets du diabète paternel sur le métabolisme de la descendance. Les analyses longitudinales permettront de recueillir plusieurs types de données (suivi de croissance, consommation alimentaire, évaluations métaboliques et cardiovasculaires) à partir de chaque animal, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires pour chaque mesure. Cette approche garantit que chaque animal contribue de manière optimale à la production de données scientifiques pertinentes, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.
Raffinement
Le paradigme expérimental, induction du diabète chez les pères est susceptible d’être générateur de souffrance. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.
Choix des espèces
Notre sujet de travail porte sur les troubles métaboliques causés par un diabète paternel. À ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de reproduire de manière fiable ces pathologies. En effet, il existe de fortes similitudes entre les mécanismes de régulation de la glycémie chez l’humain et chez la souris. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris, ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre les désordres métaboliques. Pour la partie reproduction, nous utiliserons des mâles reproducteurs âgés de 8 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge paternel sur l’apparition des troubles métaboliques. Les tests d’homéostasie glucidique seront conduits entre l’âge de 3 et 4 mois.
Rôle de cellules immunitaires du cerveau dans le maintien de la douleur après une lésion nerveuse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une lésion chirurgicale du nerf sciatique qui provoque une douleur sévère et des troubles anxiodépressifs pendant huit à dix semaines, 192 souris seront toutes tuées, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit aussi une fibre optique implantée dans le cerveau, puis subit des mesures de sensibilité par application de filaments sur la patte et par immersion de la patte dans un bain à 10 °C, répétées jusqu'à sept semaines après la chirurgie. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires du cerveau dans le maintien de la douleur. À la fin, le cerveau et d'autres organes sont prélevés, ce qui interdit toute réutilisation des animaux.
Objectifs
La douleur neuropathique touche environ 10 % de la population mondiale et, malgré des années de recherche, les traitements restent limités et souvent associés à de nombreux effets indésirables. Une meilleure compréhension de sa physiopathologie pourrait améliorer sa prise en charge. Il a été suggéré que la dégradation d'un composant de la matrice extracellulaire, les réseaux périneuronaux (PNN) entourant les neurones, par la microglie activée au niveau de la moelle épinière pourrait jouer un rôle crucial dans la douleur neuropathique. Nous avons démontré précédemment que le cortex rétrosplénial (RSC) pourrait jouer un rôle important dans la douleur neuropathique dans un modèle de neuropathie par une approche d’imagerie cérébrale. Cette activation du cortex rétrosplénial était également associé à une activation de la microglie. Cependant, la dégradation des PNN par la microglie ainsi que les conséquences de cette dégradation sur l'activité neuronale et la structure synaptique au sein du cortex rétrosplénial et le comportement douloureux sont inconnus dans un contexte de neuropathie. Notre hypothèse principale est que l'activation de la microglie du RSC en condition neuropathique est responsable de la dégradation des PNN, favorisant une hyperactivité des neurones corticaux et une douleur pathologique. Cette étude sera réalisée sur un modèle de douleur neuropathique chez la souris. Le modèle SNI est un modèle particulièrement reproductible et largement utilisé dans les études précliniques sur la douleur. Dans un premier temps, nous caractériserons la dégradation des réseaux périneuronaux et le type de neurones (inhibiteurs ou excitateurs) affectés ainsi que leur structure synaptique, par la microglie activée dans le RSC au cours du temps par des approches d’immunohistochimie. Nous étudierons ensuite les conséquences de cette dégradation sur l’activité neuronale par d’imagerie calcique in vivo. Enfin, l'effet de l'inhibition locale de l’activation microgliale dans cette structure cérébrale dans la douleur neuropathique sera investiguée. Ce projet permettra d’explorer de nouveaux mécanismes impliqués dans ce type de douleur et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules du cerveau, appelées microglies, modifient le fonctionnement des neurones dans une région précise du cerveau, le cortex rétrosplénial, lors de la douleur neuropathique. Ces cellules peuvent dégrader des structures protectrices entourant les neurones, les réseaux périneuronaux, ce qui pourrait perturber l’équilibre des circuits nerveux impliqués dans la douleur. À plus long terme, mieux connaître ces mécanismes pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou réduire la douleur chronique en agissant sur ces processus de dégradation.
Procédures
Les interventions seront (1) l'administration d'antalgiques, (2) la chirurgie stéréotaxique et (3) la réalisation de tests comportementaux et de photométrie : -(1) chaque injection dure moins d’une minute. -(2) l'induction du modèle de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
(1) L'administration d'antalgique se fait 2 fois par animal le jour de l'implantation de canules, et 24h après. Dans la 2e procédure, les animaux recevront une injection quotidienne de tamoxifen pendant 5 jour afin de faire exprimer la protéine capable de bloquer l'activité de des cellules immunitaires du cerveau, induisant une douleur légère de courte durée. (2) La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion du nerf sciatique qui entraine une douleur sévère et des comorbidités anxiodépressives durant environ 8 à 10 semaines. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. Les injections virales induisent une douleur légère de courte durée. L’induction de l’anesthésie à l’isoflurane précédant la chirurgie stéréotaxique et SNI, et les injections de composés pharmacologiques induisent un stress léger de l’animal. (3) Les tests comportementaux induisent une douleur légère de courte durée et un stress léger de courte durée. La partie externe des canules peuvent entrainer une gêne légère mais n'entrave pas les mouvements et besoins des animaux.
Devenir
Aucune procédure ne permet de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Il n’est pas encore possible d’utiliser des méthodes alternatives pour modéliser l’ensemble du cerveau.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Le nombre d'animaux est défini à partir de tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (seuils de douleur) avec une différence de 50% entre les groupes. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles en respect de la règle des trois "R" et des directives sur la Recherche Animale. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisé pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie selons les conditions d'hébergements règlementaires. De plus, nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h) pour réduire le niveau stress lié à une perturbation du cycle circadien des animaux nocturnes. L'enrichissement pourra être supplémenté par des plateformes ou des roues d'exercice si des comportements agressifs sont observés. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur avec une période d'habituation systématique. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des procédures décrites dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur et a été choisi pour comparer nos résultats avec les données de la littérature. Le choix de réaliser ce projet chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans le projet, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez une autre espèce. Les animaux seront âgés de 8-10 semaines afin que les souris soient considérées comme adultes. L'expérience du laboratoire et les données de la littérature montrent que le seuil de sensibilité douloureux chez la souris varie au cours du développement, et atteint un seuil stable à l'âge adulte, permettant ainsi de comparer nos données aux précédentes études réalisées chez l'adulte.
Modèles expérimentaux de cancer de la prostate pour l’évaluation de nouvelles thérapeutiques par imagerie in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 690 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart classées sévère. Elles subissent l'induction de tumeurs de la prostate, parfois une castration chirurgicale, puis un suivi par imagerie jusqu'à seize semaines, les modèles à métastases osseuses atteignant le squelette entier. Le porteur décrit un projet mené "à la demande de chercheurs extérieurs" et pour "nos clients" souhaitant des études d'efficacité thérapeutique. Ce travail relève ainsi d'une prestation commerciale facturée, dont dépend la mise à mort des 2 690 souris.
Objectifs
Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer de la prostate et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou d'évaluation de nouveaux médicaments. Il s’agit d’une nouvelle demande faisant suite à la fin de validité de la précédente autorisation. Dans le projet précédent, nous avons réalisé 18 études qui nous ont permis de proposer des modèles tumoraux de cancer de la prostate. Les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents avec une publication scientifique et une autre en cours de rédaction. Nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique. Avec 60 000 nouveaux cas en France tous les ans, le cancer de la prostate représente aujourd’hui la première cause de mortalité chez l’homme après 70 ans. On compte actuellement 9 000 décès par an pour ce cancer qui touche 1 homme sur 8. Actuellement, le Docetaxel est le traitement de référence des cancers de la prostate métastatiques résistants au traitement hormonal (CRPC). Cette chimiothérapie apporte un réel bénéfice au niveau de la survie des malades. Malheureusement, on sait qu’une grande partie des malades traités par ce médicament développent une résistance à la chimiothérapie. C’est pourquoi aujourd’hui, l’enjeu majeur consiste à trouver à la fois des méthodes pour prédire cette résistance et de nouvelles combinaisons de traitements pour surmonter cette résistance et éviter les traitements inutiles et toxiques. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer de la prostate à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments. Dans le projet précédent, les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents, nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques impliqués dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique qui mettent en œuvre ces canaux ioniques. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication scientifique et une autre en cours de rédaction.
Procédures
Induction du modèle de cancer : - par chirurgie : 1 acte par animal (15min max d’intervention sous anesthésie générale) - sans chirurgie : injection intracardiaque (quelques secondes sous anesthésie générale) - par injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) par injection intra tibiale (5min sous anesthésie générale avec radiologie). Castration : 1 acte par animal par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale). Non systématique. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 16 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 16 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire ou sur animal anesthésié en rétro-orbitaire : (en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque sur souris endormie en fin d’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables potentiels sur les animaux sont: -pour le modèle sous-cutané (SC) : taille de la tumeur importante en fin d'étude entrainant une gêne pour la locomotion, nécrose de la tumeur (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle orthotopique : taille de la tumeur importante en fin d'étude provoquant une gêne dans la mobilité, les fonctions urinaires et digestives. (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intracardiaque : développement de métastases osseuses ostéolytiques ou ostéoblastiques sur tout le squelette (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intra tibia : développement d’une tumeur osseuse ostéolytique ou ostéoblastique au niveau du tibia et fémur (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -dans les cas d’administrations répétées de traitements : effets indésirables tels que rougeur au niveau du site d’injection ou une légère perte de poids. Les nuisances décrites ci-dessus (certaines sévères) sont potentielles car il ne sera pas nécessaire d’atteindre ces effets pour les besoins expérimentaux. Lors de notre précédent projet, nous avons pu tester les modèles : - Sous cutané : Nous n’avons pas observé de problème particulier, le suivi permet d’éviter l’atteinte des points limites. - Intraprostatique : Nous avons pu observer sur 50% des souris, une perte de poids comprise d’entre 5 et 10%, 5 jours après la chirurgie. Elles ont repris leur poids à J11 grâce aux mesures de raffinement. - Intracardiaque : Nous avons pu observer sur 11% des souris de ce modèle des difficultés de locomotion associé à une perte de poids supérieure à 10%, sur 21% des souris une perte de poids supérieure à 10% sans autres signes apparents. Ces difficultés apparaissent en fin d’expérimentation, elles ont duré moins de 5 jours pendant lesquelles des mesures de raffinement ont été prises avant mise à mort.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car des prélèvements d'organes seront effectués par la suite.
Remplacement
Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études précliniques sont nécessaires et ne peuvent être réalisées que chez l'animal pour tenir compte de la complexité de la physiologie d'un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en œuvre de l'imagerie permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre à 10 par lot. Des tests non paramétriques (type Test de Mann-Whitney ou test de Kruskal-Wallis) seront utilisés par nos clients.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite le stress infligé au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin de limiter la souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées et chauffées (tapis chauffant pour la chirurgie ou plateau chauffant pour l’imagerie). La douleur liée à la chirurgie sera également prise en charge par l'utilisation d'analgésiques. Par ailleurs, nous donnons du gel nutritif (adapté à la récupération après chirurgie) 7 jours avant la chirurgie pour habituation et une fois la chirurgie réalisée, pour assurer un meilleur rétablissement post-opératoire. Pour garantir le statut sanitaire des souris immunodéficientes, elles seront hébergées en portoir ventilé et des procédures strictes seront respectées durant les différentes séances d’imagerie (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (6 à 8 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modifiées pour perdre une protéine musculaire, elles développent une myopathie qui les affaiblit jusqu'à la perte de mobilité et la mort vers treize semaines, et subissent des tests répétés de force, de course sur tapis et de motricité. Le porteur affirme que la maladie ne provoque pas de douleur, tout en décrivant une dégradation musculaire qui mène à la mort. Les bénéfices thérapeutiques restent suspendus à de futurs essais, quand la dissection des muscles après mise à mort, elle, est programmée.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Nouvelle immunothérapie dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral dans le poumon chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Soumises à une inoculation de tumeur par injection ou par chirurgie, 1 864 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la grande majorité classée sévère. Elles reçoivent ensuite des injections de traitements plusieurs fois par semaine pendant deux à quatre semaines, les tumeurs pouvant provoquer douleurs, perte de poids et gêne respiratoire. Le RNT range tous ces modèles parmi les plus sévères et prévoit une surveillance quotidienne aux moments critiques. À la fin de chaque procédure, les souris sont mises à mort et des organes prélevés.
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d’une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d’auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Dans le cas du cancer, les molécules ciblant des points de blocage à la surface des cellules immunitaires ont eu de très bons résultats en essais cliniques. Ces essais ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques chez la souris. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Ce projet s’inscrit ainsi afin d’étudier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules de type protéique dans des modèles de cancer. Nous aimerions donc tester différents traitements de l’immunité capables d’activer un ou plusieurs types cellulaires et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur via injection (5min), ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (10-15min). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections (1min) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection d'une molécule "traceur" de la tumeur lors du suivi de la croissance tumorale par "scanner" (1 à 2 fois par semaine). Les animaux pourront être soumis à des injections (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines) vigiles ou sous anesthésie (5min). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang des animaux pourra être effectué sous anesthésie (intervention sans réveil). Certains animaux seront prélevés en sang en vigile (4 fois par jour le premier jour, puis une fois par jour la première semaine puis une fois par semaine, 20sec).
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Une altération de la respiration peut être observée (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanés) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée, et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules humaines en culture ont permis d’identifier une activité biologique de ces nouveaux traitements et donc, ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude de la molécule chez l'animal.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces se verront évalués lors des étapes suivantes, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin à décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en mettant à mort les animaux selon un score clinique vétérinaire ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements supplémentaires du fait de son isolement (frisottis et dôme/tunnel). L’analgésie, quant à elle, dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance, l’animal se verra administrer une injection d'analgésique deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie un analgésique local. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Recherche des paramètres d’exposition sonore et médicamenteuse induisant un déficit auditif léger chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Quatre semaines d'exposition sonore à raison de huit heures par jour cinq jours sur sept, ou des injections répétées de molécules toxiques pour l'oreille : 264 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. L'objectif est de calibrer des doses de bruit, d'anticancéreux et d'antibiotiques provoquant une perte auditive légère, ces molécules pouvant aussi entraîner une toxicité rénale et digestive. Le RNT reconnaît que la mort d'un petit nombre d'animaux ne peut être exclue. Tous les rats sont mis à mort pour le prélèvement des oreilles et du sang.
Objectifs
Le bruit n’est pas la seule nuisance pouvant endommager le système auditif. Des substances chimiques peuvent également altérer l’audition en détruisant les cellules sensorielles de l’oreille. Parmi elles figurent, entre autres, des substances industrielles (métaux, solvants, …) et des médicaments. Les études révèlent que l’exposition simultanée au bruit et aux médicaments peut entraîner des pertes auditives plus importantes que la simple addition des effets de chaque facteur pris isolément. Le projet actuel s’intéresse à deux familles de médicaments, les anticancéreux et les antibiotiques, qui sont suspectés de persister de longues périodes dans l’oreille, et pourraient donc fragiliser l’oreille vis-à-vis du bruit sur le long terme. L’objectif du projet est de déterminer si des rats préalablement exposés à ce type de médicaments sont plus sensibles au bruit, et si oui, pour combien de temps après la fin des traitements. Avant de mettre en œuvre ces expérimentations, il est nécessaire de déterminer des niveaux de bruit et des doses de médicaments permettant d’obtenir des pertes auditives légères, tout en minimisant la toxicité générale (dans le cas des médicaments). L’objectif est de générer des pertes auditives suffisamment faibles pour ne pas endommager massivement l’oreille, et permettre d’observer une augmentation des pertes lors d’une exposition différée au bruit. C’est l’objet de cette demande d’autorisation de projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de développer des modèles de déficit auditif léger, induits soit par une exposition sonore répétée représentative des conditions rencontrées en milieu professionnel, soit par l’administration de médicaments toxiques pour l’oreille, reproduisant au mieux les protocoles cliniques. Pour chaque nuisance, plusieurs doses ou protocoles d’administration seront testés afin de déterminer celui permettant d’obtenir une perte auditive légère. Ces modèles seront utilisés dans le cadre d’une future étude qui visera à mettre en évidence si des rats traités préalablement avec ces médicaments sont plus vulnérables au bruit après la fin du traitement, et ce pour combien de temps. Ces informations, aujourd’hui absentes de la littérature scientifique, apporteront des informations précieuses sur la vulnérabilité au bruit des personnes ayant été traitées avec ce type de médicaments, et reprenant leur activité professionnelle.
Procédures
Deux groupes de 16 animaux (8 mâles et 8 femelles) seront exposés, dans leur cage d’hébergement, à des bruits industriels conçus pour induire des pertes auditives légères. L’exposition sonore durera 4 semaines (8h/j, 5j/semaine). Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) sera exposé au bruit ambiant de l’animalerie sur la même période. Un groupe exposé (n=16) et un groupe contrôle (n=12) seront ajoutés uniquement si les pertes auditives mesurées ne correspondent pas aux pertes attendues. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront une molécule anticancéreuse toxique pour l’oreille par 4 injections réparties sur 6 semaines. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) recevra 4 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (12 mâles et 12 femelles) et un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront un antibiotique toxique pour l’oreille, à raison de 10 injections consécutives sur 10 jours. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) recevra 10 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (n=24) et un groupe contrôle (n=12) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. L’audition des rats sera évaluée par une méthode non invasive réalisée sous anesthésie qui nécessite une injection et une contention de quelques secondes. Ce test dure environ 20s par animal : • Rats exposés au bruit : Les mesures seront effectuées avant l’exposition, toutes les 2 semaines pendant l’exposition, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’anticancéreux : Les mesures auront lieu avant le traitement, toutes les deux semaines pendant la durée du traitement, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’antibiotique : Les mesures seront réalisées avant le traitement, à la fin du traitement, puis 4 semaines plus tard. À l’issue des mesures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements de sang (analyses biochimiques) et des oreilles pour évaluer les dommages aux cellules auditives.
Impact sur les animaux
L’exposition des rats à différents bruits, au sein même de leur cage d’hébergement, pourra induire un stress modéré et réversible, sans atteinte majeure de l’état de santé des animaux, mis à part une perte auditive. Le traitement des rats par un anticancéreux ou un antibiotique peut générer une toxicité au niveau du système auditif (effet attendu) mais également générer une toxicité rénale. Ces deux molécules peuvent également entrainer des troubles digestifs et une diminution de la prise alimentaire. La mort d’un petit nombre d’animaux ne peut pas être totalement exclue. Les mesures auditives répétées impliquent des anesthésies successives. Un stress léger lié à la récurrence de cette manipulation peut survenir. C’est également le cas pour les injections répétées de médicaments.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de prélever les oreilles pour analyse des tissus. Pour les animaux ayant reçu des médicaments, un prélèvement sanguin sera également pratiqué au moment de la mise à mort pour analyse biochimique.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car l’étude des médicaments toxiques pour l’oreille et de l’exposition au bruit nécessite un système auditif complet ainsi qu’un métabolisme actif. Les réponses physiologiques de l’oreille interne impliquent des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des modèles cellulaires ou informatiques. Par exemple, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’impact combiné du bruit et des médicaments dans un organisme entier, ni d’évaluer l’évolution temporelle d’un déficit auditif. Le rat constitue un modèle pertinent et reconnu pour l’étude des effets du bruit et des substances toxiques pour l’oreille, ce qui permettra une comparaison avec les données de la littérature.
Réduction
Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux soit réduit au minimum tout en garantissant d’observer l’effet attendu et en prenant en compte le risque de toxicité. - Grâce à une analyse de la littérature scientifique et de nos données historiques, nous avons pu identifier des gammes de doses suffisamment réduites pour limiter le nombre de doses/niveaux testé(e)s à 3 par type de nuisance. - Certaines doses de médicaments et niveaux de bruit seront testés en plusieurs phases, afin de s’offrir la possibilité de ne pas réaliser certains essais si la dose optimale a été identifiée précocement. - Les effectifs par groupe et par sexe ont été définis comme le nombre minimal d’animaux nécessaire pour qu’une perte auditive légère soit mesurable par rapport au niveau initial, connaissant la dispersion des mesures individuelles, et en faisant l’hypothèse que les effets du bruit multiplient par deux cette dispersion et les médicaments par trois.
Raffinement
Après la période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » (ou « chatouilles » en français) sera mise en place pendant 5 jours. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats et à créer des états émotionnels positifs. Le « tickling » sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation de l’animal pendant toute la durée du protocole. Tout au long du protocole, les rats seront régulièrement placés, en groupe, dans une aire de jeu sécurisée comportant des tunnels, abris et différents éléments d’exploration. Cet environnement favorise les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. Compte tenu des risques d’effets secondaires pour le rein causés par les traitements médicamenteux, les animaux recevront des injections sous-cutanées de solution de réhydratation pendant le traitement. Par ailleurs, pendant la période de traitement, des aliments gélifiés appétents complémentés de friandises seront disposés à l’intérieur des cages. Enfin, toutes les procédures seront réalisées dans l’enceinte de l’animalerie, y compris les expositions au bruit et aux médicaments, ce qui permettra de minimiser le déplacement des rats et le stress associé.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère qui a un système auditif qui présente un fort degré de ressemblance biologique avec l’Homme, contrairement aux espèces non mammifères (oiseaux, poissons ou insectes) qui sont pertinentes pour l’étude de la toxicité pour les molécules ou les cellules, mais qui sont peu adaptées à l’étude de la fonction auditive dans son ensemble. Ainsi, le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les anomalies auditives. Son oreille interne présente également un volume suffisant pour permettre une dissection et une analyse des tissus relativement aisées. Les rats choisis sont pigmentés. Ils ont donc un pigment coloré dans l’oreille, contrairement aux rats albinos. Cette caractéristique les rapproche davantage de la physiologie humaine. Ce choix permet ainsi une meilleure validité des résultats pour l’Homme. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (16 semaines). Cet âge a été choisi pour que leur cerveau, leur métabolisme et leur oreille interne soient complètement développés et pour modéliser des humains d’âge adulte.
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus Influenza de type A : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, infectées par des virus Influenza A avec, pour une partie, une co-infection au SARS-CoV-2. Les animaux peuvent développer perte de poids, détresse respiratoire et fièvre, avant d'être mis à mort pour le prélèvement des organes. Le protocole prévoit de ne leur administrer aucun anti-inflammatoire, pour ne pas altérer la réponse immunitaire étudiée. Le RNT décrit par ailleurs un projet garantissant "le meilleur niveau possible de bien-être animal".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les virus Influenza de type A responsables de la grippe provoquent la maladie, et de tester de nouvelles façons de la prévenir ou de la traiter. Pour cela, nous utiliserons des modèles de souris qui permettent de reproduire certains aspects de la maladie observés chez l’être humain. L’étude s’intéressera d’abord à la manière dont le virus se multiplie et se propage dans le corps, puis à la façon dont l’organisme réagit pour se défendre. Le système immunitaire peut être comparé à une armée de défense : il est constitué de cellules et de molécules qui reconnaissent le virus et essaient de l’éliminer. Cependant, si cette réponse est trop forte ou mal contrôlée, elle peut provoquer une inflammation importante et abîmer certains organes. Comprendre cet équilibre est essentiel pour savoir pourquoi certaines personnes guérissent facilement, alors que d’autres développent des formes plus graves ou durables de la maladie. Différentes stratégies thérapeutiques seront testées notamment des molécules capables de réguler la réponse immunitaire afin de limiter la multiplication du virus, réduire les symptômes et prévenir les complications. Pour anticiper les conséquences d'une potentielle co-circulation saisonnière du virus Influenza de type A et du SARS-CoV-2, nous réaliserons des doubles infections séquentielles chez l'animal. Cette approche déterminera si la primo-infection exerce un effet protecteur ou aggravant sur la pathologie consécutive au second challenge viral. Ce projet respectera strictement le principe des 3R, qui sont au cœur de la recherche animale responsable : - Remplacer : Utiliser des méthodes alternatives chaque fois que cela est possible, telles que la culture cellulaire ou encore la modélisation informatique. - Réduire : Limiter le nombre d’animaux utilisés en ne réalisant que les expériences indispensables. - Raffiner : Adapter les techniques et assurer un suivi attentif des animaux pour réduire au maximum leur douleur, stress et inconfort. L’objectif global est d’améliorer la compréhension de la maladie afin de développer plus rapidement des traitements sûrs et efficaces pour l’être humain, tout en garantisant le meilleur niveau possible de bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre au point de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre comment la grippe causée par les virus Influenza de type A se développe et évolue. Ces modèles permettront aussi de savoir pourquoi certains modèles de souris, et par corrélation certaines personnes tombent plus gravement malades que d’autres. Une fois ces modèles établis, ils serviront à tester de nouvelles stratégies de prévention et de traitement, comme des vaccins, des anticorps ou des médicaments destinés à bloquer le virus ou à aider le corps à mieux se défendre. Les résultats attendus permettront d’améliorer les étapes de recherche avant les essais chez l’humain et de favoriser le développement de traitements plus sûrs et plus efficaces contre la grippe. A terme, ce projet contribuera à mieux protéger la santé humaine tout en respectant le bien-être animal.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu - Par le muscle : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par le nez : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. - Par voie intraveineuse : Réalisée avec précaution par du personnel spécialement formé. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
A la suite de l’infection des animaux par les virus Influenza de type A, plusieurs effets indésirables peuvent être observés. Les principaux signes attendus incluent une perte de poids, des altérations comportementales (ex. baisse d’activité), ainsi que des signes de détresse respiratoire (respiration rapide, irrégulière ou superficielle). Des réactions locales peuvent également survenir au niveau des sites d’injection, se manifestant par une irritation, une légère inflammation ou un saignement transitoire. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer une gêne légère et passagère au point de ponction, rapidement résolue après compression locale. Les manipulations répétées, telles que les mesures de fonction respiratoire ou les anesthésies, peuvent induire un stress léger à modéré lié à la restriction de mouvement et à l’isolement temporaire. La récupération post-anesthésie chimique est plutôt lente s’accompagnant d’une baisse d’activité temporaire, de frissions, d’une diminution de l’appétit et plus rarement d’une respiration ralentie. Chez les animaux génétiquement modifiés, les réponses inflammatoires ou les troubles respiratoires peuvent être plus marqués ou durer plus longtemps. Un épisode de fièvre est possible ; en l’absence de mesure directe, un soutien thermique est assuré par l’enrichissement des cages (ajout de coton) au moment de l’anesthésie et de l’infection. L’état des animaux sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi qui inclue l’état respiratoire, l’apparence générale, des yeux et des poils ainsi que des comportements spontanés. Tout changement significatif sera consigné et les individus présentant des signes d’alerte feront l’objet d’une surveillance accrue assurée conjointement par le personnel animalier et les ingénieurs responsables des protocoles expérimentaux.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront sacrifiés par euthanasie conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme en carton, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des mesures appropriées, y compris la mise à mort lorsque nécessaire, seront mises en œuvre sans délai afin d’éviter toute aggravation de l’état des animaux. Etant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d’anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l’expression de marqueurs d’intérêt ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser le modèle murin (la souris) car c’est un mammifère dont 99% des gènes sont similaires à ceux de l’Homme. La souris un animal de petite taille, se reproduisant rapidement et facile à élever. De plus, son anatomie, sa physiologie et sa biologie sont aujourd’hui très bien connues, ce qui en fait un modèle de référence pour la recherche scientifique. La souris est particulièrement adaptée à l’étude du système immunitaire grâce aux nombreuses connaissances déjà acquises et aux outils largement disponibles pour ce modèle. Pour nos expérimentations nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Ce critère garantit que les animaux possèdent un système immunitaire pleinement développé, ce qui permet de limiter les variations naturelles qui ne seraient pas liées à l’étude elle-même.
Rôle d’un métabolite (D-sérine) produit par l’intestin et le microbiote dans le dialogue intestin–cerveau au cours des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises à une inflammation intestinale induite, à un gavage quotidien et à une distension colorectale répétée, 1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le RNT classe le test de la nage forcée comme sévère et décrit une inflammation pouvant provoquer perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles. Ce travail de recherche fondamentale explore le rôle d'un métabolite dans le dialogue intestin-cerveau, les perspectives thérapeutiques étant repoussées au "long terme". Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement de tissus.
Objectifs
La finalité de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inflammation intestinale et les douleurs abdominales associées, dans le cadre de l’axe reliant le microbiote intestinal et le fonctionnement de l’organisme. Ce travail relève de la recherche fondamentale. Il vise à identifier comment certaines bactéries intestinales et certaines molécules naturellement présentes dans le corps peuvent influencer l’inflammation et la sensibilité de l’intestin. À court terme, le projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’apparition et le maintien de l’inflammation intestinale et des douleurs associées. À moyen terme, il permettra d’évaluer le potentiel de certaines bactéries dites « probiotiques » pour moduler l’inflammation et limiter les douleurs dans un modèle expérimental. À long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote intestinal afin d’améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires intestinales et des douleurs abdominales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes de communication entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau, en identifiant le rôle spécifique du métabolisme de la D-sérine et des acides aminés de configuration D dans les troubles inflammatoires intestinaux. Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des liens entre inflammation intestinale, dysbiose du microbiote et altérations des fonctions cérébrales associées (comportements anxio-dépressifs et troubles cognitifs). Ce projet fournira également des données translationales originales issues de modèles animaux et d’échantillons de patients, susceptibles d’identifier de nouveaux biomarqueurs liés au métabolisme de la D-sérine dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Enfin, l’évaluation de stratégies innovantes de modulation du métabolisme intestinal de la D-sérine, notamment via l’utilisation de probiotiques ciblés, ouvrira des perspectives thérapeutiques nouvelles pour la prise en charge des troubles intestinaux et de leurs comorbidités neuropsychiques.
Procédures
Les animaux peuvent être soumis aux interventions suivantes : Administration d’une substance dans l’eau de boisson afin d’induire une inflammation intestinale temporaire. Administration quotidienne par gavage oral d’une préparation probiotique pendant 7 jours. Réalisation de tests comportementaux (test de la nage forcée et test du labyrinthe en croix surélevé). Mesure de la sensibilité intestinale par distension colorectale. Prélèvements de selles. Mise à mort réglementaire en fin de procédure suivie du prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Inflammation intestinale induite : nuisance modérée, pouvant entraîner perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles pendant quelques jours (durée limitée à la période d’exposition). Gavage oral quotidien : nuisance légère à modérée, correspondant à un stress transitoire lié à la manipulation (quelques minutes par jour pendant 7 jours). Test du labyrinthe en croix surélevé : nuisance modérée, liée à un stress et une anxiété transitoires (durée du test : quelques minutes). Test de la nage forcée : procédure classée sévère, induisant un stress aigu lors de l’exposition à l’eau (durée limitée au temps du test). Distension colorectale : nuisance modérée à sévère, correspondant à un inconfort intestinal bref et répété (quelques secondes à quelques minutes lors de la mesure). Prélèvements de selles : nuisance faible, car réalisés sans geste invasif.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Les mécanismes étudiés impliquent des interactions complexes entre l’intestin, le microbiote et l’organisme entier. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un modèle in vitro ou informatique. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les différentes analyses sont réalisées sur les mêmes animaux afin d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Les procédures ont été conçues pour limiter le stress et l’inconfort. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation, d’un suivi clinique régulier et de points limites prédictifs permettant l’arrêt immédiat de la procédure si nécessaire. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinale et métabolique et immunitaire
Caractérisation d’un modèle humanisé de myopathie myotubulaire liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris mâles malades atteignent un point limite entre sept et huit semaines, marqué par une paralysie des membres postérieurs et une forte perte de poids. 94 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des mesures hebdomadaires de force, puis un test contractile final sous anesthésie sans réveil, pour caractériser un nouveau modèle humanisé de myopathie myotubulaire. Le porteur reconnaît que les animaux issus du croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu, traité par précaution comme dommageable.
Objectifs
La myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM) appartient à un groupe de maladies génétiques appelées les myopathies centronucléaires (CNM), caractérisées par une altération sévère de la fonction des muscles squelettiques, touchant exclusivement les individus de sexe masculin. Cette pathologie entraîne une atteinte sévère de la qualité de vie des patients, avec un décès prématuré avant l’âge de 18 mois dans environ la moitié des cas, ou plus tardivement au cours de la petite enfance. À ce jour, aucune thérapie curative n’est disponible. Des travaux antérieurs ont mis en évidence deux variations génétiques susceptibles d’être ciblées, présentes chez près de 70 % des patients atteints de myopathies centronucléaires, dont la myopathie myotubulaire. L’objectif de ce projet est de générer un nouveau modèle murin humanisé de la myopathie XLMTM, porteur de ces variations génétiques humaines, afin de permettre le développement ultérieur d’une stratégie thérapeutique applicable chez l’homme. Ce modèle constituerait un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de thérapies géniques dans un contexte de souris humanisée présentant la pathologie.
Bénéfices attendus
La progéniture de ce croisement permettra d’évaluer une preuve de concept thérapeutique ciblant les variations génétiques humaines chez plus de 70 % des patients atteints de CNM, notamment les formes sévères. Ce modèle permettra de valider une approche applicable à diverses formes de CNM.
Procédures
Le projet est divisé en 2 groupes d’animaux : (Groupe 1) : Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la survie des souris. Un suivi non invasif des souris sera mis en place avec la mesure de la force du corps durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaine, un test de mesure de la force des pattes durant 3 fois 1 minute réalisé une fois par semaines et une pesée régulière, une fois par semaine de 2 à 4 semaines d’âge, tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines. Ensuite, (Groupe 2) Évaluation de la surexpression d’un gène d’intérêt sur la force des souris : Chaque semaine, deux tests seront effectués : un test non invasif de la force du corps et un test non invasif de la force des pattes. Ces tests dureront 3 fois 1 minute et seront répétés une fois par semaine, de la 4ᵉ à la 7ᵉ semaine. Chaque semaine, une mesure de la coordination motrice sera répétée de la 4e à la 7e semaine. Pour finir, un test de mesure contractile du muscle, réalisé une fois sous anesthésie générale à la fin de l’étude, durant au maximum 1 heure. Une pesée régulière sera mise en place une fois par semaine, de 2 à 4 semaines d’âge, puis tous les 2 à 3 jours à partir de 4 semaines d’âge, et tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines d’âge. Le test de mesure de la force contractile est une procédure chirurgicale sans réveil, au terme de laquelle les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques humanisée utilisées pour ce croisement ne présentent pas de phénotype dommageable. En revanche, les souris mâles atteintes du modèle de la maladie développent une atteinte locomotrice progressive à partir de 4 à 5 semaines de vie et atteignent généralement un point limite entre 7 et 8 semaines. Cette atteinte se traduit notamment par une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids importante. Les souris issues du nouveau croisement pourraient présenter un phénotype encore inconnu. Par précaution, ces animaux seront considérés comme potentiellement dommageables dans l’attente des premières données expérimentales et feront l’objet du même protocole de surveillance et des mêmes critères de point limite que les souris malades du modèle. Les nuisances associées aux tests phénotypiques pourront inclure la peur de la chute lors du test de mesure de la force du corps, le stress lié à la contention ainsi qu’une douleur potentielle lors des injections nécessaires à certaines mesures expérimentales (mesure de la force des pattes et de la coordination motrice). Les souris malades présentent des difficultés locomotrices à partir de 4 semaines, entraînant une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids vers 7 à 8 semaines. Il n’est pas exclu que les animaux puissent ressentir de la douleur liée à des problèmes musculaires (comme des crampes). Les nuisances liées aux tests incluent du stress lors des différents tests pour évaluer le phénotype musculaire, et lors de la contention durant les injections, ainsi qu’une douleur lors de l’insertion de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et organes nécessaires aux études histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le modèle murin est physiologiquement et structurellement proche de l’Homme, ce qui nous permettra d’étudier, d’une part, la physiopathologie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne suffirait pas à elle seule, car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossibles à mesurer.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi sur la base des données de la littérature, afin de détecter une différence statistiquement significative entre les différents groupes d’animaux (malades, sains, etc.). Lorsque cela est possible, des animaux de la procédure 2 pourront être utilisés pour réduire le nombre nécessaire à la procédure 3. Les tests de mesure de la force du corps, de la force des pattes et de la coordination motrice sont non invasifs ; ils permettent de réutiliser les mêmes animaux à chaque point dans le temps, et un même animal pourra donc produire des données de force globale et contractile, ainsi que des données histologiques et moléculaires.
Raffinement
Pour prévenir toute malnutrition qui pourrait être due à des difficultés locomotrices, de la nourriture hydratée en gelée sera placée dans la cage dès l’apparition des premiers symptômes à 4 semaines. Lors du test sous anesthésie générale, la température corporelle de l’animal sera maintenue à l’aide d’une plaque chauffante. Pour les nouveau-nés, leur capacité à se mouvoir et le comportement maternel seront observés quotidiennement durant la première semaine de vie À partir de l’âge de 2 semaines, les animaux seront pesés de manière hebdomadaire. La fréquence de pesée sera augmentée à tous les 2 à 3 jours dès l’âge de 4 semaines, correspondant au début d’apparition du phénotype, puis à tous les 1 à 2 jours à partir de 6 semaines en raison de l’aggravation progressive du phénotype. En cas d'infection importante, à la suite d’une bagarre par exemple, les animaux seront euthanasiés sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle de souris récapitule fidèlement le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et constitue donc un bon modèle pour l’étude des mécanismes pathologiques et l’évaluation de thérapies. La maladie affectant les hommes, seuls les animaux mâles seront étudiés. Les défauts locomoteurs apparaissent à 4 semaines et progressent jusqu’à 8 semaines. Le suivi longitudinal de force globale sera donc effectué à partir de 4 semaines, avec un test contractile final à 7 semaines, précédant la paralysie des membres postérieurs, dans le cas du groupe 2. Pour les études de survie (groupe 1), le suivi de la force est prolongé jusqu'à atteinte d'un point limite. Tous les animaux sont pesés régulièrement dès 2 semaines d'âge pour détecter toute détresse animale au plus vite
Modulation thérapeutique de l’architecture nucléaire par AAV dans un modèle murin de myopathie centronucléaire et wild type
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Atteintes d'une forme grave de myopathie qui les tue spontanément vers six ou sept semaines, une partie des 224 souris de ce projet développe faiblesse musculaire et perte de poids indépendamment du traitement. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, et toutes les souris, malades comme témoins, sont tuées en fin d'expérience pour analyse des muscles. Elles reçoivent une injection unique de thérapie génique par virus sous anesthésie légère, puis des tests de force et de marche. Seuls des mâles sont utilisés, la maladie étant liée au chromosome X.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester si l’injection d’un traitement génétique peut améliorer le phénotype musculaire de souris atteintes d’une forme grave de myopathie rare. Cette maladie ne dispose actuellement d’aucun traitement curatif. Pour cela, on utilisera des virus inoffensifs capables de transporter soit de petites molécules destinées à bloquer certains gènes susceptibles d’aggraver la maladie, soit des copies complètes de ces mêmes gènes, afin d’en étudier les effets dans des souris contrôles et dans des souris malades. Le traitement sera administré après la naissance afin de corriger le fonctionnement des muscles altérés ou d’analyser les conséquences de cette modulation génétique dans un contexte musculaire sain et pathologique. En complément de ces approches, une étude pilote sera réalisée à l’aide d’une autre méthode de blocage génétique. Cette technique vise à bloquer spécifiquement une molécule d’ARN soupçonnée de jouer un rôle dans la maladie. Ce traitement sera injecté localement dans le muscle afin d’en évaluer l’efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait démontrer qu’il est possible de corriger certains défauts musculaires en ciblant des gènes spécifiques, ou que l’augmentation de l’expression de certains gènes a un effet positif ou négatif sur la fonction musculaire. À terme, cela pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies musculaires génétiques sévères qui ne disposent aujourd’hui d’aucun traitement curatif. Ce projet permettra aussi d’identifier des gènes à privilégier ou à éviter dans une approche thérapeutique.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique par voie systémique ou intramusculaire sous anesthésie légère. L’injection durera moins de cinq minutes par animal. Aucun geste chirurgical lourd ne sera réalisé. Des tests fonctionnels non invasifs (force de préhension, analyse de la démarche, test d’endurance) seront effectués pour évaluer l’effet des traitements. À la fin de l’expérience, après anesthésie et euthanasie, des prélèvements musculaires seront réalisés pour analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent entraîner un léger inconfort transitoire au point d’injection (rougeur, légère inflammation) ou un stress momentané lié à la manipulation. Chez les souris malades, des signes cliniques sévères sont attendus indépendamment du traitement, en lien avec la maladie : perte de poids progressive, faiblesse musculaire marquée, réduction de la mobilité, difficultés d’alimentation et mortalité spontanée entre 6 et 7 semaines d’âge. Chez les animaux sains comme chez les animaux malades, la diminution ou l’augmentation de l’expression de certains gènes candidats pourrait entraîner une faiblesse musculaire, une baisse d’activité, une altération de la marche ou une aggravation du phénotype musculaire. Ces effets, difficiles à prédire, feront l’objet d’une surveillance attentive.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de permettre l’analyse détaillée des muscles et d’autres organes aux niveaux histologique, cellulaire et moléculaire. Ces analyses post-mortem sont indispensables pour évaluer précisément l’effet des traitements et comprendre les mécanismes biologiques impliqués. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
Il n’est pas possible d’utiliser uniquement des cellules en culture à la place des souris, car les phénomènes étudiés (comme la position des noyaux, la force musculaire ou les effets généraux d’une modification de l’expression de certains gènes) nécessitent un organisme entier pour être correctement observés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Des méthodes statistiques seront utilisées pour s’assurer que ce nombre est suffisant, y compris pour les groupes recevant une augmentation de l’expression de certains gènes. Des tests fonctionnels complémentaires (force de préhension, tapis roulant, analyse de la démarche et évaluation de la fonction musculaire) contribueront également à l’évaluation globale des effets du traitement.
Raffinement
Les procédures susceptibles de provoquer de la douleur ou du stress sont réalisées sous anesthésie afin de limiter au maximum la souffrance. Les cages sont enrichies (abris, nourriture en gel facilement accessible) et les animaux sont surveillés régulièrement. Des critères précis ont été définis pour repérer rapidement tout signe de souffrance. Si nécessaire, la procédure est interrompue et l’animal est euthanasié sans délai afin d’éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Le modèle choisi reproduit de manière pertinente la maladie humaine étudiée (une forme grave de myopathie) : les souris présentent des noyaux mal positionnés dans leurs muscles (au centre plutôt qu’en périphérie), une faiblesse musculaire et une mort précoce, ce qui permet d’étudier la maladie dans des conditions réalistes. Seuls les mâles seront utilisés car cette maladie génétique touche principalement les mâles (elle est liée au chromosome X). L’utilisation de femelles n’aurait donc pas d’intérêt scientifique dans cette étude. Les souris seront traitées entre 2 et 5 semaines d’âge, ce qui correspond à une période où les muscles sont encore en cours de développement. Cela permet une bonne efficacité du traitement. Les souris malades ne vivent généralement que jusqu’à 6 ou 7 semaines ; il est donc important d’intervenir tôt pour évaluer les effets du traitement avant que la maladie ne soit trop avancée. Les souris contrôles (WT), y compris celles recevant des vecteurs de surexpression, suivront le même protocole d’injection afin que les groupes soient comparables.