Procédures sévères

1 116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent soit un choc contrôlé sur le cerveau, soit une section partielle de la moelle épinière au niveau du cou, chirurgies de vingt à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, et certaines reçoivent en plus une irradiation suivie d'une greffe de cellules immunitaires prélevées sur d'autres souris, tuées pour ce prélèvement. Pendant un mois et demi, leur capacité à marcher, à s'équilibrer et à se déplacer est évaluée sans que les tests employés soient nommés, et le porteur écrit qu'aucun test douloureux n'est prévu, chez des souris dont il décrit par ailleurs les difficultés à marcher après l'intervention. Les traitements qui pourraient en sortir pour les personnes atteintes de lésions du cerveau ou de la moelle épinière restent, eux, au conditionnel et à long terme.

Objectifs

Le projet cherche à mieux comprendre ce qu’il se passe dans le cerveau et la moelle épinière après un traumatisme. Après un choc important au niveau de la tête ou de la colonne vertébrale, une réaction inflammatoire apparaît dans les tissus blessés. Cette réaction peut aider à réparer les lésions, mais elle peut aussi aggraver les dommages et entraîner des difficultés pour marcher, bouger ou utiliser certains membres. Notre but est d’étudier comment certaines cellules du système immunitaire et certaines protéines impliquées dans l’inflammation influencent la récupération après ces traumatismes. Pour cela, des souris subiront un traumatisme contrôlé du cerveau ou de la moelle épinière puis recevront différents traitements destinés à diminuer ou modifier cette inflammation. Ces traitements pourront inclure des anticorps capables de bloquer certaines protéines inflammatoires ainsi que des molécules anti-inflammatoires. Certaines expériences utiliseront des souris dans lesquelles les cellules immunitaires circulant dans le sang auront été remplacées par celles d’une autre souris, c’est ce qu’on appelle des chimères . Cette approche permettra de distinguer le rôle des cellules immunitaires provenant du sang de celui des cellules déjà présentes dans le cerveau ou la moelle épinière après un traumatisme. Les chercheurs pourront ainsi mieux comprendre quelles cellules participent à la réparation des tissus et lesquelles peuvent au contraire aggraver les lésions. Les animaux seront suivis pendant plusieurs semaines afin d’évaluer leur récupération, notamment leur capacité à marcher et à se déplacer. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation du cerveau et de la moelle épinière après un traumatisme. À plus long terme, ces travaux pourraient aider au développement de nouveaux traitements visant à améliorer la récupération des patients après ce type de blessure.

Bénéfices attendus

Les traumatismes du cerveau et de la moelle épinière peuvent entraîner des séquelles importantes et durables, comme des difficultés à marcher, à bouger ou à réaliser certaines activités du quotidien. Aujourd’hui, les traitements disponibles restent limités et permettent rarement une récupération complète. Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines réactions inflammatoires favorisent la réparation des tissus alors que d’autres aggravent les lésions après un traumatisme du système nerveux central. Les résultats obtenus pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques visant à limiter les dommages causés par l’inflammation et à améliorer la récupération des patients après ce type de traumatisme. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de lésions traumatiques du cerveau ou de la moelle épinière.

Procédures

Les animaux subiront une seule intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et avec un traitement contre la douleur. Selon le groupe, il s'agira soit d'un choc contrôlé au niveau du cerveau, soit d'une section partielle de la moelle épinière au niveau du cou. Ces chirurgies dureront entre 20 et 45 minutes. Certains animaux recevront également des injections de médicaments destinés à modifier la réaction inflammatoire, administrées dans l'abdomen ou directement au niveau de la moelle épinière. Dans le cadre d'une partie du projet, certaines souris recevront une irradiation puis une greffe de cellules immunitaires provenant d'une autre souris, afin d'étudier le rôle de ces cellules dans la réaction inflammatoire après le traumatisme. Après la chirurgie, les animaux seront suivis pendant environ un mois et demi. Ils participeront à des évaluations régulières de leur capacité à marcher, à s'équilibrer et à se déplacer. Ces tests durent entre quelques minutes et une quinzaine de minutes. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les tissus du cerveau et de la moelle épinière.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet pourront subir différentes contraintes liées aux chirurgies, aux injections, aux tests de comportement et aux prélèvements réalisés au cours de l’étude. Les principales contraintes sont liées aux traumatismes du cerveau ou de la moelle épinière réalisés sous anesthésie générale. Après ces interventions, les animaux pourront présenter une douleur modérée, une fatigue, une perte de poids temporaire, une diminution de l’activité ainsi que des difficultés à marcher ou à se déplacer. Les injections et les manipulations répétées pourront entraîner un stress léger et transitoire. Les tests moteurs et comportementaux pourront également provoquer une fatigue passagère liée à l’effort et aux manipulations. Aucun test douloureux n’est prévu dans le projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’aggravation de leur état. Des traitements antidouleur adaptés seront administrés systématiquement après les chirurgies. Des critères d’arrêt stricts seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Devenir

À l'issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre l'étude des effets du traumatisme et des traitements sur le cerveau, la moelle épinière et les cellules impliquées dans la réponse inflammatoire. Ces analyses sont indispensables pour répondre aux objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisées sur des animaux maintenus en vie. Pour les expériences nécessitant une greffe de moelle osseuse, les souris donneuses seront euthanasiées après le prélèvement de la moelle osseuse. Seules les souris receveuses poursuivront ensuite les expérimentations jusqu'à leur terme avant d'être euthanasiées pour les analyses prévues.

Remplacement

Le principe de remplacement a été soigneusement évalué lors de la conception de ce projet. À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée les mécanismes inflammatoires, neurologiques et fonctionnels impliqués après un traumatisme du système nerveux central, qu’il touche le cerveau ou la moelle épinière. Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les cellules immunitaires, le tissu nerveux lésé, la circulation sanguine, la réponse inflammatoire de l’organisme et la récupération des fonctions motrices. L’étude de ces mécanismes nécessite un organisme vivant intégrant les interactions dynamiques entre le système immunitaire, le système nerveux central et les fonctions motrices. La souris constitue un modèle biologique particulièrement pertinent et largement validé pour l’étude des traumatismes du système nerveux central. Les modèles murins reproduisent plusieurs mécanismes observés chez l’être humain, notamment les réponses inflammatoires secondaires, les déficits locomoteurs et les mécanismes de réparation et de réorganisation du système nerveux après la lésion. Ils permettent également de suivre l’évolution du comportement, des capacités motrices ainsi que des modifications cellulaires et moléculaires au cours du temps, ce qui n’est pas possible avec les méthodes alternatives actuellement disponibles. Enfin, l’utilisation de lignées génétiquement modifiées et d’approches pharmacologiques ciblées nécessite un modèle animal intégré afin d’évaluer les conséquences globales des modifications étudiées sur le fonctionnement de l’organisme. En l’absence de méthode substitutive permettant de répondre aux objectifs scientifiques du projet, le recours à l’animal est donc scientifiquement justifié.

Réduction

Le nombre d’animaux demandé dans ce projet correspond au nombre maximal nécessaire pour couvrir l’ensemble des conditions expérimentales prévues, tout en utilisant le plus petit nombre d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiques fiables. Les groupes expérimentaux ont été conçus afin d’étudier simultanément l’impact des traumatismes du système nerveux central, des modifications génétiques, des traitements pharmacologiques et du sexe, sans multiplier inutilement le nombre de groupes. Le protocole repose sur un suivi des mêmes animaux tout au long de l’étude afin d’évaluer l’évolution de leurs capacités motrices et de leur comportement. Cette approche permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires par rapport à des expériences indépendantes réalisées à chaque période d’évaluation. Les animaux seront répartis de manière aléatoire entre les différents groupes expérimentaux afin de limiter les biais et de garantir une comparaison fiable entre les groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux compatibles afin de limiter le stress lié à l’isolement. Les cages comporteront des enrichissements adaptés (matériel de nidification, tunnels, abris) renouvelés régulièrement afin de favoriser les comportements naturels. Une attention particulière sera portée au suivi clinique des animaux afin de prévenir et limiter toute douleur ou détresse. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être et des critères d’arrêt prédéfinis seront appliqués si nécessaire. Les procédures chirurgicales de traumatismes du cerveau ou de la moelle épinière seront réalisées sous anesthésie générale avec surveillance continue. Une analgésie sera systématiquement administrée avant et après la chirurgie afin de limiter la douleur. Les animaux seront maintenus au chaud pendant l’intervention et le réveil, et leurs yeux seront protégés pendant l’anesthésie. Après la chirurgie, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée portant notamment sur la locomotion, l’alimentation, l’hydratation et l’état neurologique. Les animaux seront maintenus en hébergement collectif lorsque leur état clinique le permettra afin de préserver les interactions sociales. Si nécessaire, un hébergement individuel temporaire pourra être mis en place pour assurer leur sécurité et faciliter leur surveillance. De la nourriture humidifiée et un gel nutritif seront déposés directement dans la cage afin de faciliter l’alimentation des animaux présentant des difficultés de déplacement. Les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux dispositifs utilisés pour les évaluations comportementales afin de limiter leur stress. Les tests seront réalisés selon des protocoles non aversifs, sans utilisation de stimulations douloureuses.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit de l’espèce de référence pour l’étude des traumatismes du cerveau et de la moelle épinière. Elle permet de suivre l’évolution des capacités motrices et du comportement après une lésion, ainsi que d’étudier les réactions de l’organisme qui participent à la récupération. Certaines souris présentent également des caractéristiques génétiques particulières, indispensables pour comprendre le rôle de certains gènes dans ces mécanismes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, lorsque leur système nerveux et leur système immunitaire sont complètement développés. Ce choix permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables à ceux observés chez l’adulte. Pour les souris recevant une greffe de moelle osseuse, les procédures de traumatismes du cerveau ou de la moelle épinière ne seront réalisées qu’après leur récupération complète.

Chacun des 180 rats subit deux interventions sur le crâne, d'abord la greffe de la tumeur, puis son excision suivie du dépôt en une dose d'un traitement dans la cavité laissée par la chirurgie. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le résumé annonce des hémorragies locales possibles lors de la résection, des douleurs postopératoires liées à la craniotomie, et une perte d'appétit puis de poids à mesure que le glioblastome progresse. Quatre traitements sont ainsi comparés pour répondre à ce que le porteur appelle "un besoin médical non pourvu" depuis 2005, bénéfice renvoyé à d'éventuelles retombées quand les atteintes, elles, sont programmées.

Objectifs

Le glioblastome est une forme de cancer du cerveau particulièrement agressive. Malgré les traitements actuels (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie), l’espérance de vie des patients dépasse rarement 15 mois. Deux grands défis limitent l’efficacité des traitements : une barrière naturelle du cerveau qui empêche les médicaments d’atteindre facilement la tumeur et la présence de cellules cancéreuses très résistantes, difficiles à éliminer. Après chirurgie, la tumeur revient souvent près de la zone où elle a été retirée. Cette région, appelée le bord chirurgical, favorise la repousse des cellules cancéreuses. Pour améliorer les traitements, les chercheurs explorent actuellement une stratégie prometteuse qui consiste à implanter directement dans le cerveau des matériaux contenant des traitements, comme des médicaments anticancéreux ou des molécules qui agissent sur des cellules responsables des récidives. Cette méthode permet de libérer les substances actives là où elles sont vraiment nécessaires, et sur une longue durée. Ce projet vise à tester et comparer l’efficacité de quatre traitements administrés localement dans le cerveau afin de mieux lutter contre ce type de cancer.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse de quatre nouveaux traitements véhiculant des agents thérapeutiques pour le glioblastome. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement du glioblastome qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.

Procédures

Les animaux subiront : 1) une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe tumorale ; 2) une excision chirurgicale de la tumeur suivie de l’administration, en une seule dose, d’un traitement innovant dans la cavité laissée par la chirurgie. La durée approximative de chaque chirurgie ou de tout acte nécessitant une anesthésie ne dépassera pas 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, l'excision chirurgicale de la tumeur et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. La résection peut induire des hémorragies locales et avec la craniotomie elles peuvent générer des douleurs post-opératoires. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. Ils seront mis à mort dès qu’ils atteindront l’un des points d’arrêt définis (modifications du poids corporel, changements dans l’apparence physique, le comportement, les réponses aux stimuli, ou apparition de signes cliniques de souffrance évalués à l’aide d’une grille de score adaptée) ou à des temps préétablis.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse des traitements innovants véhiculant des agents thérapeutiques pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement. Cette étape de validation de l'efficacité du traitement est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif. Animaux des deux sexes seront utilisés dans les procédures expérimentales.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose, de dômes autoclavables et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri- et post-opératoire de la douleur. Les rats seront sous observation quotidienne, et une grille de score sera utilisé pour l’évaluation de la douleur en fonction des changements de poids corporel, des changements dans leur apparence physique, comportement, de réponses aux stimuli ou de l’apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score total obtenu grâce à cette grille (score 4 à 9) des mesures visant à soulager la détresse (ex. eau gélifiée, nourriture dans la cage, ajout d’enrichissement, remise d’un animal isolé en hébergement de groupe) et la douleur (ex. analgésie) seront mises en place. Pour un score total ≥ 10, si l'animal présente des signes cliniques qui ne sont pas stoppés suite aux actions spécifiques mises en place ou si l'animal présente de signes cliniques irréversibles menant vers la mort (ex. perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l’animal, signes neurologiques sévères, léthargie, difficultés respiratoires sévères ou prolongées) l’expérimentation sera immédiatement arrêtée par mise à mort de l’animal. Enfin seront considérés comme points d'arrêt aussi: la présence d’une plaie, d’une tumeur sur un site autre que celui attendu ou un conflit sévère entre plusieurs animaux.

Choix des espèces

Le modèle rat (avec le modèle souris) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Nous avons choisi un modèle de rat pour tester nos traitements locaux et non pas un modèle souris car il représente un modèle plus grand et qui permettra donc d'obtenir une meilleure localisation in vivo de la tumeur, de la distribution du traitement dans le tissu cérébral et d'administrer des volumes plus importants de traitement, ce qui nous rapproche davantage de la clinique. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des rats de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature et avec nos travaux précédents nous avons choisi d’utiliser des rats de 5-8 semaines.

Un caillot de sang injecté dans la carotide interne, par une chirurgie du cou de trente minutes, provoque l'AVC chez 413 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Suivent deux passages à l'IRM sous anesthésie générale, à J+1 et J+7, et des tests comportementaux que le résumé nomme, le neuroscore et le corner test, répétés à J1, J3 et J7. Les déficits attendus, pertes d'équilibre, faiblesse musculaire du côté opposé à la lésion, difficultés à manger, boire et interagir dans les premiers jours, sont présentés comme ce qui rend justement ces tests possibles. Le porteur justifie le choix du rat par les homologies vasculaires avec l'humain, mais aussi par "le coût relativement bas" et "la logistique aisée" de l'élevage, avant de conclure que leur utilisation "devient incontournable".

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC. Ce projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la réalisation des chirurgies et l’évaluation comportementale et un site pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Se déroulera à J-1 un prélèvement de sanguin sur tous les animaux vigiles au niveau de la veine caudale. Ce prélèvement ne prendra pas plus de 5 minutes. Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter un caillot de sang dans la carotide interne provoquant ainsi un AVC. Une fibre doppler sera positionnée sur la tête afin de valider l’AVC. Cet acte chirugical durera 30 minutes, AVC + pose de la fibre. A J+1 et J+7, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 minutes. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 3 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J3 et J7. Nous comptons un total de 15 minutes pour la prise du neuroscore et moins de 10 minutes pour le corner test. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une anesthésie léthale. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes, comprenant la récupération de tissu post-mortem.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l'animal à court et moyen terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC, les animaux peuvent présenter des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dasn les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à intéragir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Pour l’étape de mise au point, nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire pour cette étape de mise au point, a été calculé selon l’expérience de l’expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes) désigné pour réaliser ces gestes chirurgicaux. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 15 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux, l’augmentation de l’effectif à 20 par groupe expérimentaux est prévu mais non obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 15 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages conformes à la Directive, isolées des nuisances sonores, avec enrichissements, nourriture et eau ad libitum. Les rats sont maintenus à 2 par cage. Le bien-être est suivi deux fois par jour en semaine et quotidiennement les week-ends et jours fériés par du personnel qualifié. Lors des chirurgies, les animaux sont anesthésiés avec analgésie pour soulager la douleur. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Le site opératoire est tondu, désinfecté et reçoit une application d'anesthésiant local. Les sutures seront faites par points séparés afin de limiter le risque de déhiscence. Au réveil, les animaux sont placés en cage individuelle chauffée, puis remis en cage avec alimentation facilitée et gel nutritif. La surveillance est continue et renforcée en post-opératoire immédiat. Les points limites sont définis ; en cas de dépassement, ils seront mis à mort. Un suivi strict est assuré les jours suivants (pesée, état général). Le transport entre établissements s’effectue dans les cages d’origine, sur chariot, via un passage souterrain sans exposition extérieure, avec maîtrise des vibrations. À l’arrivée, une période de repos d’1 h est respectée avant toute manipulation.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 275 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles dèjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Une injection de streptozotocine détruit les cellules du pancréas et provoque une hypoglycémie sévère, dont le porteur attend 10 à 15 % de mortalité. 1 700 souris et 1 700 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour récupérer leurs tissus et leur sang. Devenus diabétiques et amaigris, ils subissent jusqu'à vingt et une prises de sang hebdomadaires chez la souris et quinze chez le rat, des tests de sensibilité mécanique et thermique de trente minutes en cage de contention, une échographie cardiaque sous anesthésie, et vingt heures en cage à métabolisme sur grille, hébergement dont le porteur reconnaît qu'il induit un fort stress et un risque d'hypothermie. Les composés évalués ne sont jamais nommés, et l'effectif de 3 400 rongeurs n'est rattaché à aucun calcul.

Objectifs

Le diabète de type I peut être induit chez le rongeur par destruction des cellules du pancréas à l’aide d’un agent pharmacologique. Lorsqu’un trop grand nombre de cellules sont détruites, l’animal devient diabètique de type I. Les conséquences de la destruction des cellules sont une augmentation du taux du sucre dans le sang. Cela va être toxique pour certains organes tels que les nerfs et neurones périphériques touchant la sensibilité, la motricité, le transit intestinal et le rythme cardiaque et le rein. Ces comorbidités associées au diabète altèrent de façon importante la qualité de vie des patients et sont létales arrivées à un certain stade de la maladie. Or ces comorbidités ne sont pas ciblées par des médicaments efficaces ou alors ciblés par des médicaments peu efficaces. Ainsi, il est important de développer des modèles précliniques permettant l’implémentation de médicaments ou des nouveaux médicaments plus efficaces sur le marché. Nous réaliserons 40 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’étude de nouvelles molécules thérapeutiques plus efficaces sur la neuropathie (altération des neuronnes périphériques), l’insuffisance cardiaque et la néphropathie diabétiques (altération de la fonction rénale associée au diabète).

Procédures

Les animaux recevront des administrations de divers composés (molécule chimique induisant le modèle et composés à tester), les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). La sensibilité mécanique et thermique est réalisée sur animal vigile et dure environ 30 minutes où l'animal est dans une petite cage et un stimulus mécanique ou thermique est appliqué maximum 5 fois 10 secondes à intervalle de 5 minutes et ce à 3 reprises durant le projet. Des prélèvements de sang auront lieu toutes les semaines (soit 21 prélèvements pour la souris et 15 pour les rats maximum), sur animal anesthésié (2 minutes) ou vigile (30 secondes). Pour mesurer la fonction cardiaque, nous réaliserons une échographie, l’animal est anesthésié et une sonde est posée sur son thorax. Cette mesure dure environ 20 minutes. Pour mesurer le débit de filtration du rein, l'animal est anesthésié pendant 5 minutes pour placer le moniteur sur dos et injecter le composé fluorescent puis il est réveillé et maintenu en cage individuelle pendant 2h de mesure. Le moniteur est ensuite retiré et l'animal est remis dans sa cage d'origine. Nous récolterons l'urine sur une durée de 20h, l'animal sera donc mis en cage individuelle à métabolisme. Ces mesures seront réalisées 1 fois, en fin de période de traitement.

Impact sur les animaux

L’injection du composé chimique va engendrer un relargage massif d’insuline, donc une hypoglycémie sévère (baisse du taux de sucre dansle sang). Pour limiter cet effet qui peut être mortel, une supplémentation en sucre est mise en place pendant la phase critique (dès l’injection et jusqu’à 24h après la dernière injection). D’après notre expérience, nous attendons 10 à 15% de mortalité. L’état diabétique va induire une perte de poids très importante. Les administrations de traitements réalisées à répétition peuvent générer un stress chronique. Bien que les composés à tester ont pour but d’améliorer l’état de santé de l’animal, ils peuvent avoir des effets adverses. Les prélèvements de sang réalisés peuvent entrainer une infection au niveau du site de prélèvement, notamment sur des animaux diabétiques. Les mesures de sensibilité mécanique et thermique peuvent engendrer un stress et/ou une douleur modérée. Certaines mesures impliquent une anesthésie d’environ 20 minutes. Dans de rares cas, l’animal peut ne pas supporter l’anesthésie. Le test de tolérance au sucre, sur un animal diabétique peut induire des difficultés de retour à une glycémie basale (taux de sucre normal), cela peut entrainer une légère baisse d’activité. Les récoltes urinaires en cage métabolisme implique un hébergement sur grille, en individuel pendant 24h. Cela induit un fort stress et un risque d’hypothermie (baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés.

Remplacement

Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et les atteintes nerveuse et rénale sont des conséquences de ce dérèglement multi organique qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Les cultures de neurones et de cellules rénales peuvent être envisagées dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les comorbidités citées sont la conséquence de ce dérèglement multi-organique. L'utilisation d'un composé chimique pour induire le diabète peut être également remplacée par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.

Réduction

Toutes les procédures seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d’animaux inclut dans l’étude. Des tests statistiques sont réalisés pour démontrer l'efficacité d'un composé.

Raffinement

Dès la première injection du composé chimique, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids et des consommations alimentaire et hydrique, 1 fois par semaine). Une supplémentation en sucre, permettant de limiter la chute du taux de sucre dans le sang qui peut être mortelle, est mise en place durant la phase critique. Une double litière sera déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite en abondance et garantir le confort de l'animal. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une diarrhée, ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier sera mis à mort.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des modèles bien connus pour l’étude du diabète et de ses complications. De plus, il est possible d’induire chez nos rongeurs des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine. Nous utiliserons des animaux adultes donc à partir de l’âge de 8 semaines car le modèle a été développé historiquement comme cela donc nous avons énormément de recul sur l’effet du composé chimique à cet âge et nous souhaitons étudier la maladie se développant chez les adultes.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou par Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie générale, puis reçoivent de une à trois administrations de la molécule testée, par la même voie et sous anesthésie à chaque fois. L'infection grippale entraîne perte de poids, perte d'appétit, inactivité et léthargie pendant six à sept jours, l'infection bactérienne agissant sur quarante-huit heures. Le porteur souligne que la molécule a déjà montré son efficacité in vitro à des doses non cytotoxiques, et écrit dans la même rubrique qu'"aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d'un organisme entier".

Objectifs

Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.

Procédures

Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.

Impact sur les animaux

Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.

Réduction

Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.

Raffinement

MODIFICATION : Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). DE PLUS, POUR FACILITE L’APPORT ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE LORS DES INFECTIONS, DES CROQUETTES HUMIDIFIEES D’EAU SERONT DISPONIBLES A L’INTERIEUR DE LA CAGE.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".

11 940 souris vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles développent un lupus, avec atteintes rénales, inflammation généralisée, douleurs articulaires, problèmes de peau et perte de poids, et reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines, des prises de sang mandibulaires sous anesthésie toutes les deux semaines, et des tests de sensibilité à un stimulus mécanique jusqu'à deux fois par semaine. Le bénéfice attendu reste de repérer des molécules candidates avant toute phase clinique. L'effectif, lui, couvre 109 études dont le porteur écrit que le nombre "ne peut pas être déterminé à l'avance", et il prévoit délibérément une marge pour "éviter des interruptions administratives ou des retards".

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune chronique et complexe caractérisée par la production d’auto-anticorps affectant plusieurs organes (reins, peau, articulations, sang…). Il s’agit d’une maladie du tissu conjonctif dont le symptôme caractéristique est une inflammation associée au système immunitaire. Il touche principalement les femmes (9 femmes pour 1 homme) en âge de procréer. C’est une maladie difficile à prendre en charge, car son évolution est imprévisible, les symptômes varient d’un patient à l’autre, et les traitements actuels, souvent lourds, ne permettent pas de guérir. Ils visent surtout à réduire les poussées inflammatoires et à prévenir les complications. Découvrir de nouvelles solutions thérapeutiques est crucial afin d’offrir des traitements plus efficaces, mieux tolérées et personnalisées améliorant la qualité de vie et réduisant la morbidité et la mortalité. Après une phase de sélection de molécules prometteuses, leur mode d’action sera étudié, et les plus pertinentes seront testées dans des modèles expérimentaux de lupus, qui reproduisent les grandes caractéristiques de la maladie humaine. Les molécules testées auront un potentiel anti-inflammatoire, immunomodulateur ou viseront des cibles biologiques impliquées dans le développement du lupus. Ces recherches, menées dans le cadre d’un programme de maturation préclinique, permettront d’évaluer la sécurité, la tolérance et l’efficacité de ces traitements potentiels avant toute phase clinique. L’objectif final est de proposer des solutions thérapeutiques innovantes qui amélioreront la qualité de vie des patients, tout en respectant les principes éthiques de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet au sein du lupus érythémateux systémique. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement de nouvelles thérapeutiques permettant de réduire la mortalité liée au lupus, de soulager les patients atteints de cette maladie, afin qu’ils aient une meilleure qualité de vie.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Tous les animaux recevront une injection en sous-cutanée pour l'implantation des puces d'identification RFID. Également, les animaux recevront des administrations de traitements. Plusieurs voies d'administrations sont envisagées en fonction du mode d'administration du composé testé. Le traitement sera administré une à sept fois par semaine, jusqu’à deux fois par jour, en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration, pendant plusieurs semaines. Toutes les deux semaines maximum, les animaux pourront subir un prélèvement de sang au niveau mandibulaire. Ces prélèvements se feront sur animal anesthésié. Des tests de comportement pourront être effectués, jusqu'à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude, en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation, soit un test durant 15 minutes en tout). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour évaluer leur état général.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les souris utilisées vont développer des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes de lupus, une maladie causée par un déséquilibre du système immunitaire. Ces signes peuvent avoir un impact sur leur état général et leur espérance de vie. Par exemple, les souris peuvent développer des dysfonctionnements aux reins, une inflammation généralisée, des douleurs articulaires, des problèmes de peau et de multiples atteintes notamment aux organes sièges de l'immunité tels que la rate et les ganglions lymphatiques. Ces dommages peuvent entraîner une perte de poids et une diminution de l'activité. Ces symptômes peuvent varier en intensité selon les modèles utilisés. Tout au long de l'étude, ces différents paramètres seront surveillés en observant l'état de chaque animal. Leur comportement, leur consommation de nourriture et de boisson, ainsi que leur poids seront régulièrement contrôlés, entre 2 et 5 fois par semaine. Les traitements administrés sont prévus à des doses non toxiques, basées sur des études préliminaires ou la littérature et ne devraient pas entraîner d'effets secondaires importants, hormis une légère gêne transitoire liée aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de ne pas provoquer de douleur et en respectant les recommandations éthiques des volumes prélevés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir évaluer l’effet de notre molécule sur la maladie.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, sur l’auto-immunité et sur la douleur implique de disposer de modèles animaux mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce souris à travers nos différents modèles reproduit plusieurs aspects du lupus humain. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation, la production d’auto- anticorps, la prolifération de lymphocytes, la douleur et sur l’aspect histologique des organes, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule candidate). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux. Pour ce projet nous prévoyons d’effectuer 109 études avec l’utilisation de 11940 animaux sur 5 ans. Toutefois, ce sont des estimations larges car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement, de l’efficacité des molécules, du choix du modèle translationnel pour aller en clinique ainsi que les souches d’animaux choisies en fonction du modèle. En effet, dans le cadre de demande d’autorisation, il est nécessaire d'inclure toutes les souches animales potentielles qui pourraient être utilisées. Chaque souche citée doit être associée à un nombre précis d’animaux, même si, dans la pratique, certaines souches pourraient ne pas être sélectionnées en fonction des besoins des projets en cours et des pilotes. Par conséquent, il est prévu en total un nombre d'études plus élevé que le besoin exact anticipé pour éviter des interruptions administratives ou des retards en cas de changements dans les souches animales requises si nous ne prévoyons pas cette marge dès le début du projet.

Raffinement

Pour minimiser les impacts sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie gazeuse (implantation des puces d’identification, prélèvements sanguins) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les procédures d’implantation des puces d’identification et de prélèvements sanguins sont réalisées sous anesthésie gazeuse (un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal). L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. De même, les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Une grille de score pour évaluer la douleur sera mise en place incluant un arbre décisionnel avec critères d’arrêt de souffrance. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré toutes les toutes les 6 à 12 heures jusqu’à 48 heures. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude pour détecter les signes de douleur insupportable et euthanasiés en fin d’expérimentation pour des analyses supplémentaires. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent se cacher et ronger. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux et/ou un marqueur sanguin ou urinaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

En accord avec les recommandations et la littérature, la souris représente un modèle très développé pour étudier le lupus. En effet, chez la souris le lupus ressemble beaucoup au lupus chez l’homme, notamment en ce qui concerne les problèmes rénaux et la production d’autoanticorps. Les modèles murins de lupus se répartissent en deux catégories principales : spontanés et induits. Afin de pouvoir étudier la progression de la maladie, les souris seront âgées de 6 semaines minimum et pourront être étudiées tout au long de leur vie. Ce stade nous permettra de réaliser des études présymptomatiques, symptomatiques et d’étudier l’effet de traitements jusqu’à la fin de la vie des souris.

Anesthésiés, rasés, munis de deux cathéters posés dans la carotide et la jugulaire, 100 rats subissent une injection de glycérol dans les muscles des deux pattes arrière pour provoquer une destruction musculaire, puis un saignement contrôlé d'une heure trente, un remplissage vasculaire et la retransfusion de leur propre sang. Sept heures d'anesthésie au total, coupées par deux heures de réveil, avant une seconde intervention où une caméra collée sur l'abdomen enregistre pendant deux heures la filtration rénale : ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur prévoit cinq rats de plus par groupe pour anticiper les décès pendant l'expérience, et précise que les données d'un rat mort moins d'une heure avant la fin prévue restent exploitables. Les autres sont tués à l'issue de l'enregistrement, pour prélever sang, urine et organes.

Objectifs

Le choc hémorragique, provoqué par une perte importante de sang, est responsable d’environ 1,9 million de décès chaque année dans le monde. Dans près de 8 cas sur 10, il survient à la suite d’un traumatisme grave, comme un accident de la route ou une chute importante. Les traumatismes sévères représentent à eux seuls environ 9 % de la mortalité mondiale. Chez les personnes qui survivent aux premières heures, une réaction excessive du système immunitaire est souvent observée. Cette inflammation importante est déclenchée par les lésions des tissus, qui libèrent des molécules signalant les dommages subis par l’organisme. Si cette réponse est trop intense, elle peut provoquer des atteintes secondaires de plusieurs organes, notamment du foie et des reins, augmentant le risque de complications graves et de décès. À ce jour, il n’existe pas de traitement spécifique permettant de prévenir efficacement ces défaillances d’organes après un choc hémorragique. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules naturellement présentes dans différents tissus de l’organisme. Elles sont étudiées et déjà utilisées dans certaines situations médicales pour leurs propriétés anti-inflammatoires et leur capacité à favoriser la réparation des tissus. Nos travaux précliniques ont montré qu’elles peuvent protéger le foie et les reins après un choc hémorragique. Cependant, l'utilisation de cellules vivantes est difficile à mettre en œuvre dans un contexte d'urgence, notamment en raison des contraintes de préparation, de conservation et de transport. C’est pourquoi nous nous intéressons au « sécrétome », c’est-à-dire à l'ensemble des substances produites par ces cellules, qui sont responsables d'une grande partie de leurs effets bénéfiques. Cette approche, dite « acellulaire », pourrait être plus simple à utiliser en pratique tout en conservant l'efficacité thérapeutique. L'objectif de cette étude est d'évaluer, dans un modèle expérimental de choc hémorragique traumatique, si une administration précoce de ce sécrétome permet de réduire les lésions du foie et des reins. Le recours à un modèle animal est indispensable, car il est aujourd'hui le seul moyen d'étudier simultanément les réactions immunitaires, les troubles de la circulation sanguine et de la coagulation qui conduisent aux défaillances de plusieurs organes. Les résultats attendus fourniront des données essentielles avant d'envisager des essais chez l'être humain.

Bénéfices attendus

L’utilisation de thérapie cellulaire est complexe, en particulier dans des situations d’urgence. En effet, leur mise en œuvre constitue un défi logistique : il faut disposer d’installations spécialisées, de personnel formé, et respecter des délais et des conditions de conservation contraignantes. Face à ces contraintes, une alternative prometteuse consiste à ne pas utiliser les cellules elles-mêmes, mais uniquement les substances qu’elles sécretent. Ces substances sont les principales responsables des effets protecteurs observés avec les cellules. L’intérêt de cette approche est multiple. Contrairement aux cellules vivantes, le sécrétome peut être préparé à l’avance, stocké plus facilement, transporté et utilisé rapidement au moment voulu. Ainsi, cette stratégie pourrait permettre de développer une nouvelle forme de traitement, dite “acellulaire”, combinant efficacité et simplicité d’utilisation. À terme, cela pourrait faciliter l’accès à ces thérapies innovantes, en particulier en contexte d’urgence thérapeutique et dans des environnements isolés.

Procédures

Cette procédure comprend deux étapes réalisées sous anesthésie générale. La première dure environ 5 heures et la seconde environ 2 heures. Ces deux étapes sont séparées par une période de réveil et de récupération d’environ 2 heures. Lors de la 1er étape, l’induction de l’anesthésie sera immédiatement suivie par l’administration sous-cutanée d’une solution d’anesthésiques locaux au niveau du cou et d’un morphinique au niveau du flanc. Au cours de la phase chirurgicale (1h), l’animal sera préparé (délai d’action du morphinique, rasage et dépilation: 40min) et les 2 cathéters nécessaires à l’étude seront posés au niveau du cou (artère carotide et veine jugulaire, 20min). La réalisation du modèle pathologique présente 3 phases : • La phase de choc hémorragique traumatique (1h30) débutera par l’injection intramusculaire dans chacune des pattes postérieures de l’animal d’une substance provoquant le traumatisme musculaire, suivi de la réalisation de l’hémorragie controlée par prélèvement du sang via le catether carotidien. • La phase de remplissage vasculaire (1h00) sera réalisée par perfusion d’une solution saline via le catheter jugulaire. Les traitements expérimentaux seront administrés en bolus dans le flux de perfusion dès le début de la phase de remplissage vasculaire. • Au cours de la phase de re-transfusion (1h00) le sang, prélevé pendant la phase d’hémorragie, sera réinjecté progressivement (1mL/min) par le catheter jugulaire. Au cours de cette première étape quatre prélèvements de sang seront réalisés via le catheter carotidien au début de chaque phase et avant le retrait des catheters (T0, T1h30, T2h30 et T3h30). A l’issue des 5 heures, les cathéters seront retirés et la peau refermée par des sutures (10min). Un morphinique et des anesthésiques locaux seront administrés afin de limiter la douleur post-opératoire. L’anesthésie gazeuse sera ensuite arrêtée et les animaux seront surveillés pendant les 2 heures. Lors de la 2ème anesthésie générale, la fonction de filtration des reins sera évaluée. Pour cela une petite incision cutanée de la peau de 1 cm sera réalisée au niveau de la patte postérieure gauche et une solution fluorescente sera injectée en bolus dans la veine fémorale superficielle. Le signal fluorecent sera enregistré (2h) grâce à une mini-caméra (1,4g) fixée sur la peau de l’abdomen à l’aide d’un patch adhésif non invasif. A la fin de l’enregistrement, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont à prévoir durant le protocole expérimental : 1. Intervention chirurgicale associée à une anesthésie gazeuse de plusieurs heures: La chirurgie réalisée au niveau du cou, nécessaire à la pose et au retrait des cathéters carotidien et jugulaire, présentent un risque d’hémorragie non contrôlée. Par ailleurs l’association de la chirurgie et de l’anesthésie générale prolongée peut entrainer un risque d’hypothermie. Par aillieurs certains animaux pourraient aussi ne pas supporter une anesthésie prolongée. Lors du réveil, la chirurgie réalisée au niveau du cou, peut entraîner une douleur lors de la mastication. 2. Injection de glycérol : L’injection de glycérol dans les muscles tibialis, visant à induire une lésion musculaire de type rhabdomyolyse, provoquera une douleur locale et une réduction de la mobilité des membres postérieurs. 3. Effets du modèle pathologique : L’état général des animaux pourrait être altéré par le modèle expérimental, entraînant une immobilité partielle ou totale.

Devenir

Une seule étape est prévue dans ce projet. À la fin de celle-ci, les animaux seront mis à mort à l’issue afin de permettre le recueil de sang et d’urine pour les analyses biologiques. Certains organes seront également prélevés pour être étudiés au microscope (examen histologique). Cet examen consiste à observer les tissus en détail afin de détecter d’éventuelles anomalies ou des modifications de la structure des cellules. Il permet ainsi de mieux comprendre les effets des traitements étudiée et d’obtenir des informations sur leur impact au niveau des organes.

Remplacement

Les études chez l’animal restent nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet. Elles permettent d’observer comment les thérapies cellulaires se comportent dans un organisme vivant dans son ensemble : quels sont leurs effets bénéfiques éventuels, mais aussi leurs risques ou effets indésirables. À l’heure actuelle, il n’est pas possible d’obtenir ces informations de manière fiable uniquement avec des méthodes alternatives, comme des expériences réalisées sur des cellules in vitro. Ces modèles sont utiles, mais ils ne reproduisent pas toute la complexité d’un organisme vivant, en particulier dans des situations graves comme une hémorragie importante (perte massive de sang) ou une rhabdomyolyse (destruction importante des muscles), où de nombreux organes et mécanismes interagissent en même temps. Cependant, avant de réaliser les études chez l’animal, des expériences sur cellules sont systématiquement menées. Elles permettent de sélectionner les approches thérapeutiques les plus prometteuses et ainsi de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Sur la base des données obtenues précédemment avec ce même modèle de choc hémorragique traumatique, 15 rats par groupe sont nécessaires pour garantir une puissance statistique suffisante. Cinq rats supplémentaires par groupe sont prévus afin d’anticiper les décès liés à la sévérité du modèle pathologique, ainsi que les exclusions éventuelles résultant de contraintes techniques inhérentes à la procédure expérimentale. Le nombre maximal d’animaux prévu par groupe d’intérêt est donc fixé à 20. Cinq groupes d’animaux sont prévus, 2 groupes controles (contrôle négatif et positif) et 3 groupes de traitements. Seules les approches thérapeutiques ayant déjà montré des résultats positifs lors d’expériences réalisées sur des cellules in vitro seront testées dans ce projet. Cela permet de ne retenir que les stratégies les plus prometteuses avant de passer à l’étape in vivo sur l’animal. D’après les résultats obtenus précédemment avec ce même modèle expérimental de choc hémorragique traumatique, nous avons constaté que la gravité de ce modèle peut parfois entraîner le décès de certains animaux avant la fin prévue de l’expérience. Cependant, nous avons observé que lorsque le décès survient moins d’une heure avant la fin prévue de la procédure, les données peuvent tout de même être utilisées, à condition que le prélèvement sang final puisse être réalisé. L’intégration des prélèvements de ces animaux n’altère ni la qualité ni la validité scientifique de l’étude, et permet d’éviter de répéter inutilement certaines expérimentations.

Raffinement

La procédure comprend deux phases réalisées sous anesthésie générale d’une durée globale de 7 heures séparées par une phase de réveil de deux heures maximum. Dès le début de l’anesthésie, un gel hydratant sera appliqué sur leurs yeux pour éviter tout dessèchement ou irritation. L’anesthésie générale sera administrée sous forme de gaz. Elle sera associée à un traitement antidouleur complet comprenant un analgésique puissant ainsi que des anesthésiques locaux injectés aux endroits pouvant occasionner une douleur (au niveau du cou et des muscles des pattes arrières). Deux types d’anesthésiques locaux seront utilisés : l’un agit rapidement mais pour une courte durée (environ 30 minutes), l’autre agit plus longtemps (6 à 9 heures), afin d’assurer une protection continue contre la douleur. Enfin, par précaution, une nouvelle administration d’analgésiques et d’anesthésiques locaux sera réalisée avant le réveil des animaux afin de garantir leur confort au moment du réveil des animaux. En fonction de leur état clinique des animaux pendant la phase de réveil et de l’atteinte éventuelle des points limites, une dose supplémentaire d’analgésique pourra être administrée ou, si nécessaire, l’animal pourra être euthanasié.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser des rats non génétiquement modifiés repose sur l’existence de nombreuses études scientifiques portant sur des modèles de choc hémorragique (perte importante de sang) et de rhabdomyolyse (destruction importante des muscles) chez le rat. Cette base de connaissances solide nous permettra de comparer plus facilement nos résultats à ceux déjà publiés et de mieux les interpréter. De plus, notre équipe bénéficie d’une expertise dans la mise en œuvre de modèles de choc hémorragique, qu’il survienne seul ou en association avec des traumatismes, notamment dans le cadre d’études cardiovasculaires. Pour évaluer les traitements, nous utiliserons des rats de la souche Sprague Dawley agés de 7 semaines et pesant entre 250 et 330 grammes. Ce stade de développement correspond à celui le plus souvent choisi dans les recherches sur la fonction rénale. Cela facilitera la comparaison de nos résultats avec les données déjà disponibles dans la littérature scientifique.

Une chirurgie crânienne d'environ deux heures pour implanter de quoi enregistrer ou moduler des neurones, puis jusqu'à cinq semaines seules en cage pour protéger le matériel : 850 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que cet isolement représente "un appauvrissement pour ces animaux sociaux". L'objectif est de décrire les circuits de l'anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur, la perspective thérapeutique étant renvoyée au-delà de dix ans. Les trois tests comportementaux de vingt minutes que subit chaque souris sont annoncés comme évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle, sans être nommés.

Objectifs

Etat de l’art : L’objectif principal du présent protocole est de découvrir les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anxiété ainsi que l’apprentissage et la consolidation de la mémoire de peur chez la souris. Les troubles liés à la peur et à l'anxiété tels que le trouble de stress post-traumatique sont parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents et représentent un problème majeur de santé publique. Ces troubles sont généralement considérés comme une altération de la mémoire de la peur, en particulier sa consolidation. A ce jour, les circuits et mécanismes responsables de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur restent mal connus. De nos données préliminaires et d'une large littérature, le présent projet propose d'étudier les circuits neuronaux de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire. Hypothèses de travail : les informations des contextes anxiogènes sont transférées au cortex pour la mise en place d’une mémoire émotionnelle à long-terme, consolidée. De plus des population neuronales dédiées, vont jouer des rôles spécifiques dans la mise en place et le cadençage de ce transfert. Approches : Nous combinerons des techniques de pointe en comportement, neurophysiologie et neurostimulation pour comprendre et manipuler ce circuit et ses mécanismes. Interférer avec ces mécanismes en clinique représente une piste thérapeutique d'avenir.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes neurobiologiques de l’apprentissage et de la mémoire affective est une étape indispensable dans l’adaptation des individus au quotidien ou dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies neuropsychiatriques impliquant la peur et l’anxiété. À moyen terme (5–10 ans), ces résultats permettront d’améliorer la compréhension intégrée du fonctionnement des circuits dans différentes structures cérébrales et à long terme (au-delà de 10 ans), de contribuer à une compréhension mécanistique plus fine des désordres émotionnels associés aux pathologies neuropsychiatriques, ouvrant potentiellement la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces circuits.

Procédures

Ce projet faisant intervenir de l’imagerie et de la modulation de neurones spécifiques, tous les animaux utilisés seront soumis à une chirurgie ayant pour objet de pouvoir moduler ou enregistrer l’activité des neurones. Toutes nos chirurgies seront réalisées après analgésie préalable, couvrant la durée de la chirurgie et la période post-opératoire. Elles seront également toutes conduites sous anesthésie générale. Chaque souris sera soumise une chirurgie unique d'environ 2h et 3 tests comportementaux de 20 minutes évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle.

Impact sur les animaux

- Les chirurgies réalisées sur les animaux sont susceptibles d’occasionner stress et douleur. Cela se traduit habituellement par une perte de poids. - Une fois les chirurgies réalisées, les animaux sont maintenus en habitat isolé afin de garantir l’intégrité des équipements, et ce pendant une durée maximum de 5 semaines. Si cet isolement prévient nombre de blessures infligées entre congénères et évite d’endommager les équipements (impératif), elle représente aussi un appauvrissement pour ces animaux sociaux qu'il est important de limiter au maximum dans le temps. - Un stress pourra être observé sur les quelques jours du protocole qui contient des expositions à des environnements potentiellement anxiogènes.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Le présent projet explore le rôle des circuit neuronaux au niveau structurel mais également systémique et comportemental. De ce fait, les approches explorant l’activité de ces cellules in vitro et in silico bien qu’indispensables à la compréhension complète de leur fonctionnement, restent pour l’instant insuffisantes pour remplir nos objectifs scientifiques. De même, la dimension comportementale de l’étude des mécanismes émotionnels dicte l’utilisation d’un modèle animal vigile et non anesthésié.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum, en prenant en compte l’effectif nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, déterminé grâce à un calculateur de puissance statistique, ainsi que le taux d'échec des procédures, évalué lors de précédentes expérimentations. Afin de diminuer ce taux d’attrition, certains animaux seront logés en cages individuelles une fois les chirurgies réalisées pour éviter la détérioration des équipements fragiles. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de formules statistiques standards, en nous basant sur nos données préliminaires et les variables que nous souhaitons soumettre à des tests statistiques. Les données recueillies au cours de ce projet seront traitées à l’aide de logiciels et d’algorithmes adaptés puis la significativité statistique sera évaluée en fonction des données et de leur répartition (normale ou non).

Raffinement

Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Le temps de maintien des souris en hébergement individuel sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes). Les souris seront quotidiennement pesées et évaluées pendant un minimum de trois jours après la chirurgie. Une analgésie per- et post-opératoire sera délivrée, et une analgésie supplémentaire sera effectuée le lendemain de la chirurgie au besoin. Si des signes de mal-être sont observés en dehors de la période post-opératoire, les animaux seront placés en observation quotidienne afin d’alléger ce mal-être et de remédier à la cause sous-jacente. Une grille d’observation des signes cliniques et un arbre décisionnel correspondant sont mis en place afin de limiter le stress ou la douleur et d’optimiser le bien-être animal. Tout signe de douleur sera pris en charge médicalement, à titre conservatoire, par analgésie, jusqu’à amélioration de l’état de l’animal ou euthanasie si dépassement des points limites. Afin de diminuer le stress provoqué par les expérimentations, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention manuelle nécessaire à la connexion des différents équipements. De plus, ce stress sera maintenu au minimum nécessaire pour induire un apprentissage chez les souris et il est à noter que les souris peuvent à tout moment se réfugier dans un endroit abrité et diminuer leur niveau d’anxiété.

Choix des espèces

Chez l’homme, les traitements disponibles des troubles anxieux (au sens large) pâtissent d’un manque relatif d’efficacité et sont associés à de nombreux effets secondaires, causant notamment des troubles de la mémoire. De plus, chez l’homme, aucune méthode ne permet de comprendre les mécanismes cellulaires de la mémoire, nous devons donc utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Nos objectifs scientifiques nécessitent l’enregistrement et/ou la manipulation de neurones spécifiques d’une part et l’évaluation comportementale du comportement anxieux et de la mémoire de peur d’autre part. La caractérisation très solide de tests comportementaux évaluant les éléments sus-cités chez la souris fait de cette espèce, la plus indiquée pour réaliser notre étude. En effet, compte tenu de leur répertoire comportemental riche, de leur relative complexité cérébrale et de leur position position dans l’évolution des espèces, les rongeurs constituent le meilleur modèle animal pour comprendre les fonctions ou dysfonctions du cerveau humain, en particulier dans la dimension cognitive et notamment les fondements comportementaux et neuronaux de la mémoire. Notre étude ne se concentrant pas sur un stade de développement spécifique, nos procédures seront effectuées sur de jeunes souris adultes de 12 à 16 semaines. Elles seront donc à un âge ne présentant pas de vulnérabilité particulière, tout en réduisant au maximum le temps d’élevage.