Procédures sévères

2 213 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, mères allaitantes et souriceaux de deux à vingt et un jours. Chaque femelle peut être infectée par la dengue, Zika ou la fièvre jaune, subir jusqu'à trois prises de sang en huit jours, recevoir une injection d'hormone, puis passer cinq minutes sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement de son lait. Les souriceaux sont infectés par voie orale ou par gavage, et le porteur indique que certains peuvent exceptionnellement s'aggraver rapidement jusqu'à la mort, plus souvent avec le virus Zika qu'avec celui de la fièvre jaune. Aucune souris ne sort vivante de la zone de sécurité biologique de niveau 3, et le porteur écrit que cette recherche fondamentale "n'aura pas d'application médicale immédiate".

Objectifs

L’objectif général du projet est de caractériser les mécanismes de transmission par l’allaitement des orthoflavivirus (virus de la dengue, Zika et fièvre jaune) et d’identifier les déterminants viraux et les facteurs du lait maternel impliqués dans cette transmission. Cet objectif se décline en trois objectifs scientifiques : Objectif 1 : Évaluer la transmission du virus de la dengue par l’allaitement et par voie orale • Caractériser la dissémination du virus de la dengue vers les glandes mammaires au cours de l’infection. • Déterminer la présence de virus infectieux dans le lait maternel et en caractériser les formes (virus libre et/ou associé aux cellules). • Évaluer l’infectivité du virus par voie orale chez les souriceaux. • Analyser la transmission du virus aux souriceaux lors de l’allaitement. Objectif 2 : Caractériser les facteurs viraux et la composition du lait en contexte d’infection • Rechercher la présence de la protéine virale NS1 sous forme sécrétée dans le lait maternel pour les trois virus. • Déterminer les formes de NS1 (libre et/ou associée à des lipoprotéines). • Analyser la composition du lait (lipides, lipoprotéines, apolipoprotéines) en conditions infectées et non infectées. • Étudier les interactions entre les particules virales, NS1 et les composants lipidiques du lait. Objectif 3 : Étudier l’infection des glandes mammaires et ses conséquences • Déterminer le tropisme cellulaire de l’infection dans les glandes mammaires. • Évaluer l’impact de l’infection sur l’intégrité des tissus mammaires. • Analyser la réponse immunitaire locale associée à l’infection. Les données obtenues permettront de mieux comprendre les mécanismes de transmission des virus par l’allaitement et d’identifier des facteurs modulant la transmission/l’infectivité virale dans ce contexte. Pour compléter ces expériences, des modèles in vitro d’épithélium intestinal seront utilisés pour étudier l’impact de NS1 et/ou des lipides et des lipoprotéines du lait sur la capacité des virus à franchir la barrière intestinale, étape clé de l’infection orale chez le nouveau-né.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à mieux comprendre si certains virus transmis par les moustiques, comme ceux de la dengue, du Zika ou de la fièvre jaune, peuvent également être transmis de la mère au nouveau-né par l’allaitement. Les chercheurs étudieront si ces virus peuvent être présents dans le lait maternel, sous quelle forme ils s’y trouvent et comment ils pourraient éventuellement franchir les défenses naturelles de l’intestin du nourrisson. Ils analyseront également l’impact de l’infection sur les glandes mammaires et sur la composition du lait. Les résultats permettront de mieux comprendre les interactions entre les virus, le lait maternel et le nouveau-né. Ils contribueront à combler un manque important de connaissances sur une voie de transmission encore mal connue. Cette recherche est avant tout une recherche fondamentale visant à améliorer les connaissances scientifiques. Elle n’aura pas d’application médicale immédiate, mais les données obtenues pourront à terme aider à mieux évaluer les risques potentiels pour les nourrissons et à orienter les futures stratégies de prévention.

Procédures

Une partie des souris seront infectées avec un virus (dengue, Zika ou fièvre jaune) par une injection sous-cutanée une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées par administration orale dans la bouche à l’aide d’une pipette ou par gavage avec une sonde souple une fois pour une durée de quelques secondes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Certaines souris feront l’objet d’une injection intrapéritonéale d’hormone une fois pour une durée de quelques secondes puis de prélèvement de lait maternel, sous anesthésie générale sans réveil, une fois pour une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les administrations et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille (ou d’une sonde souple pour le gavage) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. Par conséquent, l’impact principal de nos procédures proviendra de l’infection virale elle-même (virus de la dengue, Zika ou de la fièvre jaune (virus sauvage ou souche vaccinale)). Dans certains cas (selon le virus, la dose infectieuse, la voie d’injection), l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie, et des signes extérieurs de souffrance tels qu’un dos voussé, un pelage hérissé, et/ou un faciès de souffrance. Dans le cas particulier de l’infection de souriceaux, d’après notre expérience avec les virus Zika et de la fièvre jaune, certains animaux peuvent exceptionnellement présenter une aggravation rapide de leur état, pouvant entraîner des signes de souffrance importants ou une mortalité malgré la surveillance mise en place. Ce phénomène reste rare, mais il est observé plus fréquemment avec le virus Zika qu’avec le virus de la fièvre jaune.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ces animaux auront été infectés et manipulés en zone de sécurité biologique de niveau 3.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une collaboration de recherche visant à mieux comprendre et mesurer les risques en santé humaine liés à la transmission des virus de la dengue, Zika et de la fièvre jaune par le lait, ainsi que les mécanismes et les facteurs de risques associés. Des expériences in vitro, utilisant des organoïdes et cultures de cellules primaires, seront réalisées en parallèle de ce projet pour caractériser l’impact de facteurs viraux ou composants du lait maternel sur le franchissement de la barrière intestinale du nourrisson. Cependant, aucune expérience in vitro ne peut permettre de répondre aux objectifs de ce projet (étude de la dissémination du virus dans les glandes mammaires des individus infectés, de la charge virale dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme cellulaire de l’infection dans la glande mammaire, l’impact de l’infection sur la composition du lait maternel, l’efficacité de transmission par allaitement et l’impact à plus ou moins long terme de l’infection sur l’intégrité et la fonction de la glande mammaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une planification rigoureuse des expériences, permettant de sélectionner les conditions d’étude les plus pertinentes et de limiter les répétitions inutiles. Les résultats acquis au cours des premières étapes du projet seront utilisés pour déterminer les conditions expérimentales dans la suite du projet, et éviter la réalisation de conditions expérimentales superflues sur un grand nombre d’animaux. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de l’expérience acquise lors de travaux antérieurs et de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en utilisant le plus petit effectif compatible avec cet objectif. Les animaux étant infectés et les analyses nécessitant le prélèvement de différents organes, ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres expériences. En revanche, après la mise à mort, un maximum d’échantillons sera prélevé sur chaque animal afin d’exploiter au mieux les tissus collectés et de limiter le recours à des animaux supplémentaires. Le nombre de répétitions pour chaque expérience pourra éventuellement être réduit au cours du projet grâce à des analyses statistiques intermédiaires.

Raffinement

Deux enrichissements seront utilisées dans toutes les cages contenant des souris lactantes et leurs portées : des igloos ainsi que du coton afin notamment que les mères puissent construire des nids pour leurs portées de souriceaux. Durant la gestation et après la mise bas, chaque mère sera toujours hébergée en compagnie d’une autre femelle adulte (mère elle-même ou pas) , ce qui selon notre expérience réduit considérablement leur stress et le risque que la(les) mère(s) mange(nt) ses(leurs) souriceaux. Tous les gestes techniques effectués sur les mères allaitantes et leurs portées ont été discutés avec la structure du bien-être animal et adaptés spécifiquement afin de garantir un maximum de bien-être pour tous les animaux durant toutes les expériences. Les expérimentateurs changeront également de gants entre les manipulations de chaque portée pour ne pas perturber la reconnaissance (par l’odorat) des souriceaux par leur mère. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et d’autres signes de souffrance (dos voussé, poils hérissés, faciès douloureux). Les animaux infectés seront évalués quotidiennement pendant la période symptomatologique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : perte de poids importante (>20%, ou colonne vertébrale visible), dos voussé, faciès douloureux, isolement dans la cage et/ou perte de mobilité. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire. Au besoin, une réhydratation sous-cutanée sera effectuée, et les cages pourront être chauffées. Des points limites (précisés dans chaque procédure) spécifiques et précoces seront utilisés afin de minimiser la souffrance.

Choix des espèces

La souris A129 est un modèle d’étude scientifiquement reconnu pour l’infection par les orthoflavivirus, notamment les virus Zika et de la fièvre jaune . Ce modèle nous a déjà permis d’effectuer des études publiées sur l’efficacité de la transmission des virus Zika et de la fièvre jaune par allaitement, et a permis de montrer des résultats discriminants concernant l’efficacité de cette vie de transmission selon les virus et les souches sauvages ou vaccinales. Cette lignée est établie depuis longtemps et est élevée dans notre animalerie. Bien que les glandes mammaires de souris soient de forme plane et au nombre de 10, leur structure interne et composition cellulaire est semblable aux glandes mammaires humaines. Ce modèle permet d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, comme l’indiquent nos précédentes études. Les animaux utilisés dans les procédures seront : Des souris femelles adultes (procédures 1, 2 et 4, car études concernant les glandes mam-maires et/ou l’allaitement), et des souriceaux mâles et femelles (âge : entre 2 et 21 jours, pro-cédures 2, 3 et 4). Le choix des âges utilisés est lié à la nature du projet, qui est d’étudier la présence de virus infectieux dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme viral dans les glandes mammaires, et l’impact de l’infection sur les glandes mammaires ; ainsi que la transmission par voie orale ou directement par allaitement aux souriceaux.

Tester si un composé immunostimulant injecté avant l'apparition d'une tumeur protège du cancer : 60 souris vont être utilisées pour cette question, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent trois injections hebdomadaires dans la veine de la queue ou sous la peau en étant vigiles, puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, et leurs tumeurs sont mesurées trois fois par semaine pendant six semaines. Après l'injection, les souris peuvent présenter fatigue et baisse d'activité comparables à un état grippal, et une gêne pour se déplacer quand la tumeur grossit. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, renseigner sur le caractère préventif du produit, pour un projet qui prévoit la mise à mort des 60 souris.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie innovante contre le cancer qui consiste à stimuler les défenses naturelles du corps pour qu’elles attaquent les cellules tumorales. Un composé capable d’activer le système immunitaire est connu depuis longtemps pour déclencher une forte réponse immunitaire. Cependant, son utilisation chez l’humain est limitée car il peut être toxique, même à très faible dose. Pour contourner ce problème, une version modifiée, moins toxique et plus efficace a été développée. Chez la souris, ce traitement a permis de ralentir fortement la croissance de plusieurs types de cancers, soit utilisé seul, soit combiné à d’autres immunothérapies, sans provoquer d’effets secondaires graves. Jusqu’à présent, seul l’effet comme traitement du cancer déjà installé a été étudié. En revanche, on ne sait pas encore s’il pourrait aussi agir comme une forme de « vaccin » capable de préparer durablement le système immunitaire à se défendre contre l’apparition d’une tumeur. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer si l’injection de ce composé avant l’apparition du cancer peut protéger les souris contre le développement tumoral, à court et à long terme.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de renseigner sur le caractère préventif du médicament, en plus de sa capacité à freiner la croissance tumorale (curatif).

Procédures

- contention + injection dans la veine de la queue et/ou sous la peau (animal vigile) – durée

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans cette étude peuvent subir plusieurs formes d’inconfort liées aux procédures expérimentales. La manipulation et le maintien des animaux pour les examens ou les mesures des tumeurs peuvent être source de stress. Certaines interventions peuvent également provoquer une douleur légère et de courte durée, notamment lors de l’injection des cellules tumorales sous la peau ou lors de l’administration du vaccin dans la veine de la queue. Après l’injection du vaccin, les souris peuvent présenter pendant quelques heures des signes temporaires de fatigue et de baisse d’activité, comparables à un état grippal chez l’humain. Une perte de poids passagère peut aussi être observée, mais les animaux retrouvent généralement leur poids normal en un à deux jours. Au fur et à mesure de la croissance de la tumeur, les souris peuvent ressentir une gêne pour se déplacer si celle-ci devient volumineuse. Toutefois, le modèle de cancer utilisé ne provoque pas de métastases attendues.

Devenir

Les animaux seront à mis à mort à la fin des procédures dû à la présence de tumeurs.

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité des différents composés testés a été préalablement validée. Le modèle animal doit être utilisé pour évaluer l’effet de ces composés sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion d’un composé dans le sang et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée, sa migration et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte du pourcentage de prise tumorale. Le nombre d’animaux prévu pourra être revu à la baisse en fonction des résultats obtenus lors de la première procédure.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs. Les souris seront randomisées par marquage à la queue (feutre de couleur) afin d’éviter le stress des changements de cages/congénères. De la nourriture humide sera ajoutée après chaque traitement pour encourager la prise, et palier à la perte de poids. Afin d’améliorer le bien-être animal et limiter les gestes subis, les souris contrôles ne recevrons pas d’injections « placebo ».

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats suffisamment représentatifs. Les souris seront utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale. Des femelles et des mâles seront utilisés afin d'avoir une bonne représentation de l'effet du médicament.

Tous tués à l'issue pour prélever cerveau, moelle épinière et ganglions nerveux, 10 924 souris et 6 992 rats, soit 17 916 individus, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Une neuropathie est provoquée par chirurgie ou par injection d'un produit chimique, puis la douleur chronique, avec hyperalgésie au chaud et au froid et allodynie mécanique, est entretenue plusieurs semaines et mesurée jusqu'à deux fois par semaine par stimulation mécanique, immersion de la queue ou test thermique sur les pattes. Le porteur écrit que les études sur la douleur "n'utiliseront pas d'anesthésie ou d'analgésie pour ne pas fausser les résultats". Le nombre de souris et de rats reste une estimation, puisqu'il dépend, selon le porteur, de ses partenaires et des molécules de son pipeline.

Objectifs

Dans le cadre de programmes de maturation, nous développons au stade préclinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité sont réalisées. Ce projet concerne les études d’efficacité et a pour but d’étudier l’effet analgésique de différents traitements dans différents modèles de douleur chez la souris ou chez le rat. Le développement de molécules analgésiques et antalgiques pour traiter les douleurs (neuropathiques, chroniques ou aigues) est particulièrement important pour le confort des patients. Pour ce projet nous pensons effectuer 303 études avec pour chaque étude, l’utilisation de 10924 souris et 6992 rats, soit 17 916 animaux sur 5 ans. Toutefois, cela reste des estimations car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement interne ainsi que du choix du modèle translationnel pour aller en clinique

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la douleur. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’Homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes

Procédures

[MODIFICATION:Un modèle de neuropathie pourra être induit par procédure chirurgicale ou injection de produit chimique.] La dose et la posologie seront déterminées à l’aide de la littérature existante et/ou d’études pilotes (varie entre 1 injection unique à plusieurs injections par semaine pendant plusieurs semaines). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés en fin de procédure (phase terminale). Les animaux recevront les administrations des traitements par différentes voies d’administration, jusqu’à 7 jours par semaine pendant la durée de l’étude. Des tests de comportement seront effectués jusqu’à 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude : soit en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation soit un test durant 15 minutes en tout), la sensibilité au chaud ou au froid au niveau des pattes arrières (30 sec ou 50 sec maximum, respectivement, en test unique) ou au niveau de la queue (immersion pendant 15 sec maximum avec 3 tests séparés de 5 minutes). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’induction du modèle, l’animal va développer une douleur transitoire ou chronique (généralement d’une durée supérieure à 7 jours après l’induction du modèle expérimental et jusqu’à plusieurs semaines) avec hyperalgésie à la chaleur ou au froid et une allodynie mécanique ; l’animal peut également développer un œdème. Les modèles chroniques que nous utilisons sont conçus pour induire des douleurs d'intensité modérée, mimant la douleur chronique humaine, mais tout est mis en œuvre pour éviter une douleur excessive. L'intensité de la douleur est régulièrement évaluée à l’aide de tests comportementaux afin de s'assurer que les animaux ne souffrent pas inutilement. Nous anticipons une douleur chronique modérée et contrôlée, et les protocoles incluent des évaluations fréquentes pour s'assurer que celle-ci ne dépasse pas un seuil tolérable. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) en dehors de celle induite par la piqure. De plus, les prélèvements de sang éventuels se feront en phase terminale sous anesthésie générale. Pour le modèle de neuropathie diabétique, des petits prélèvements de sang seront réalisés régulièrement (1 goutte) pour mesurer la glycémie à l’aide d’un glucomètre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car certains tissus devront être prélevés pour réaliser des analyses complémentaires indispensables à l'évaluation scientifique des expérimentations menées. Nous prévoyons de collecter différents tissus (comme le cerveau, la moelle épinière, les ganglions nerveux, ou encore des tissus périphériques) afin de réaliser des analyses d'expression génique ou histologique pour évaluer les éventuels changements morphologiques ou dégénératifs. Ces analyses sont essentielles pour valider les résultats comportementaux et physiopathologiques observés durant les expériences, en apportant des preuves complémentaires au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Notre projet se focalise sur l’induction de modèles expérimentaux de de douleur nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal. La douleur transitoire ou chronique est un sujet d’étude complexe nécessitant des expériences à l’échelle de l’organisme entier. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales alternatives n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

MODIFICATION: Pour minimiser les impacts sur les animaux, des études pilotes (576 animaux maximum) seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur, qu’elles soient chirurgicales (PSL, SNI) ou liées aux prélèvements sanguins, seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane (induction et maintien au masque) afin de limiter la douleur. Les interventions chirurgicales seront réalisées par du personnel habilité. Dans les modèles de douleur, l’administration systématique d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas applicable afin de ne pas interférer avec l’évaluation des comportements. Toutefois, lorsque nécessaire, une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire sera mise en place pour limiter la douleur liée à l’acte chirurgical. Les animaux en chirurgie feront l’objet d’une surveillance rapprochée, avec un suivi quotidien pendant les 5 premiers jours puis bihebdomadaire. Les animaux présentant une douleur chimique ou naturelle seront suivis trois fois par semaine. Les injections intraveineuses seront surveillées et remplacées par des injections intrapéritonéales si nécessaire (queue abimée, veine collapsée…). Les études sur la douleur n’utiliseront pas d'anesthésie ou d'analgésie pour ne pas fausser les résultats, et les tests comportementaux dureront jusqu’à 15 minutes pour limiter la souffrance. Dans les procédures 3 et 4 (streptozotocine), les mises à jeun nécessaires à la mesure de la glycémie seront limitées au strict minimum afin de réduire le stress, avec un accès rapide à la nourriture après chaque mesure, l’eau restant disponible ad libitum. Elles seront réalisées en période diurne pendant 4 à 6 heures. Une attention particulière sera portée à l’état général des animaux, avec surveillance accrue et critères d’arrêt en cas de perte de poids ou de dégradation clinique. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage et les rats par 2 à 3. L’environnement sera enrichi (nidification, divertissement) afin de réduire le stress et permettre aux animaux de se cacher et ronger. Les procédures auront lieu dans une pièce calme, avec manipulation délicate et habituation à l’expérimentateur. Un tunnel sera utilisé pour manipuler les souris sans les saisir par la queue. Les animaux seront randomisés afin d’optimiser l’expérience. L’objectif est de préserver le bien-être animal et de garantir la validité des résultats en limitant les biais.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, ils sont appropriés pour les études comportementales et pour l’étude de la douleur. Les modèles que nous allons utiliser ont été spécialement développés afin de modéliser de manière simple la douleur et d’étudier l’effet de médicaments sur celle-ci. L’utilisation des souris et des rats est reconnue pour ces modèles. Ils développent des symptômes de douleur, décrits dans la littérature et présentés dans la partie « Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux ». Pour comprendre l’efficacité potentielle des médicaments testés, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles avec différents mécanismes d’induction de la douleur. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante. Les animaux seront âgés de 7-10 semaines au début de l’étude en accord avec la littérature existante ce qui correspond à un stade de développement de jeune adulte.

Greffées sous la peau ou injectées dans le sang avec des cellules tumorales humaines, opérées dans certains cas pour retirer la tumeur, soumises jusqu'à cinq prélèvements sanguins et à une imagerie hebdomadaire sous anesthésie, 2 875 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour que soient prélevés les tumeurs et les tissus d'autres organes. Une partie d'entre elles est immunodéficiente, donc exposée, écrit le porteur, à "l'infection par un large éventail d'agents pathogènes". Le laboratoire agit comme "prestataire de services" pour des laboratoires publics ou privés, et prévoit trente études précliniques en cinq ans. Il concède que ces protocoles "demandent à être améliorés", tout en disant espérer "le développement dans un futur proche de thérapies innovantes".

Objectifs

Malgré les progrès de la médecine, le cancer reste actuellement la première cause de décès en France. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants. La réalisation complète de ce projet permettrait sur 5 ans de mener 30 études précliniques en cancérologie.

Bénéfices attendus

En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

Les souris devront être transplantés soit au niveau sous-cutané sous anesthésie gazeuse (1x5min), soit par injection dans la voie sanguine à l’aide d’un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (1x2min). Une partie des animaux recevra l’administration de candidats médicaments (douleur d’une aiguille/1-2min). Une partie des animaux subira jusqu’à 5 prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse (5 min/souris). En fonction des conditions expérimentales, une intervention chirurgicale sous anesthésie sera nécessaire afin d’effectuer la résection de la tumeur. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué soit bihebdomadairement par une mesure au pied à coulisse (contention de 2min), soit hebdomadairement par imagerie, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris). Les actes de pesée des animaux seront réalisés à minima bihebdomadaires et dureront quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont relatives : 1) aux interventions chirurgicales et aux risques d’infection liés; 2) au développement d’une tumeur sous-cutanée qui pourrait s’accompagner d’une faible gêne lors de la locomotion et plus rarement d’une perte de poids ; 3) au développement de nouvelles tumeurs secondaires (métastases), éloignées de la tumeur primaire d’origine), qui pourrait affecter le bon fonctionnement des organes envahis ; 4) aux manipulations et anesthésies (prélèvements sanguins ou imagerie) qui seront une source potentielle d’un stress de courte durée ; 5) à l’administration du traitement à évaluer (au maximum durant 4 semaines) et aux effets indésirables associés qui constitueront potentiellement jusqu’à une nuisance modérée et 6) aux souris immunodéficientes (ayant un système immunitaire non fonctionnel) qui sont sensibles à l’infection par un large éventail d’agents pathogènes.

Devenir

Afin de caractériser l'effet de nos traitements ; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité des traitements testés

Remplacement

Notre projet avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de prélèvements tumoraux, de cultures de cellules ou d’organoides/tumoroides (modèle de mini organes simplifiés). Ces expériences permettent de sélectionner les traitements les plus prometteurs. Une telle approche permettra de réduire significativement le nombre d’animaux que nous utiliserons. Cependant, le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la distribution dans l'organisme du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par imagerie.

Réduction

Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux tout en permettant d'obtenir un effet statistique robuste et significatif, nous avons réalisé un calcul d’effectif en utilisant d'anciennes données afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaires. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles et la transplantation sera réalisée au niveau des 2 flancs des animaux afin de diviser par 2 le nombre d’animaux. Le projet comprend 3 étapes séquentielles et chaque étape ne sera réalisée que si la précédente aura été validée

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie per-opératoire sera appliquée lors de la chirurgie. En cas d’administration orale de traitement, lorsque possible, mise en place de protocoles d'administrations orales volontaires après apprentissage. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir soit des mesures au pied à coulisse, soit des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Le modèle murin a été choisi car certaines souches de souris possèdent un système immunitaire déficient permettant ainsi la transplantation de cellules tumorales humaines tout en maitrisant les risques de rejet de greffe. Conformément à la littérature et à nos expériences précédentes, nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 6 à 12 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales humaines

14 020 souris vont être utilisées, chacune pouvant être suivie jusqu'à 38 semaines, privée de ses congénères pendant 24 heures à deux semaines de façon répétée, mise à jeun jusqu'à 24 heures et exposée quatre fois à 4 °C, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères. Les gestes vont de l'injection dans le cerveau à l'ablation des gonades, avec une chirurgie intracrânienne de deux à quatre heures pour poser des dispositifs d'enregistrement, et des régimes riches en graisses de trois à douze mois. Le porteur reconnaît que ces conditions d'hébergement dérogent aux standards réglementés. Ce qui est promis en retour reste au conditionnel, des cellules de l'hypothalamus qui "pourraient un jour servir de cible pour de nouveaux traitements" du diabète, de l'obésité et de l'infertilité.

Objectifs

Notre laboratoire cherche à mieux comprendre comment le cerveau contrôle des fonctions essentielles du corps, comme l’alimentation, le poids, la dépense d’énergie et la reproduction. Nous étudions en particulier les circuits du cerveau qui pilotent ces fonctions, ainsi que leur manière de recevoir et d’interpréter les informations venant du reste du corps. Nos travaux visent à comprendre : - quels mécanismes permettent aux cellules de communiquer entre elles dans ces processus ; - comment certaines cellules participent à la formation et au bon fonctionnement des réseaux de neurones qui contrôlent le comportement et le fonctionnement du corps ; - comment des facteurs comme l’alimentation, la lumière ou la température peuvent influencer certaines fonctions du cerveau liées au métabolisme et à la reproduction ; - comment ces cellules peuvent aussi jouer un rôle dans le vieillissement du cerveau et dans les fonctions qu’il coordonne. Pour répondre à ces questions, nous travaillons principalement sur des rongeurs, car cela permet d’étudier le cerveau et ses réseaux de manière précise, dans des conditions contrôlées. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 et le transfert des animaux entre les établissements sera limité au maximum.

Bénéfices attendus

Les maladies métaboliques, comme l’obésité et le diabète, posent aujourd’hui un vrai problème de santé publique. Elles ont un coût important pour la société et peuvent aussi empêcher de vieillir en bonne santé. Elles peuvent également perturber la fertilité, qui est devenue un enjeu important en France et en Europe. Nos recherches s’intéressent à certaines cellules d’une zone du cerveau appelée hypothalamus. Cette région joue un rôle essentiel dans l’équilibre entre le métabolisme, comme le poids corporel et la régulation du sucre, et la reproduction. Nous cherchons à comprendre comment ces cellules participent à ces fonctions et si elles pourraient un jour servir de cible pour de nouveaux traitements. L’un de nos objectifs est aussi de trouver des moyens d’agir sur le cerveau de manière plus sûre, sans avoir à forcer le passage à travers sa barrière naturelle de protection (la barrière hématoencéphalique), ce qui peut présenter des risques. À terme, ces travaux pourraient aider à mieux traiter certaines maladies métaboliques et troubles de la reproduction, tout en contribuant à préserver la santé du cerveau au cours de la vie.

Procédures

Les interventions décrites ici auront lieu dans les 2 établissements utilisateurs. Les animaux recevront différents traitements (vecteurs viraux ou molécules pharmacologiques), soit directement dans le cerveau (durée d’intervention : 30 minutes à 1h maximum), ou intracérébrale (durée d’intervention : 30 minutes à 1h maximum), soit en périphérie (20 minutes maximum). Ces traitements permettront d’étudier leurs effets sur plusieurs fonctions importantes, comme la reproduction, le métabolisme, le comportement et l’activité du cerveau. Les animaux seront suivis pendant plusieurs semaines au cours d’un suivi longitudinal afin d’observer l’évolution de ces effets dans le temps sur plusieurs fonctions importantes : - la reproduction (8 semaines), - le métabolisme (4 à 20 semaines), - le comportement (8 semaines), l’activité du cerveau (8 semaines maximum). La durée totale de ce suivi sera de 2 à 38 semaines avec des temps de récupération allant de 6 à 30 semaines pour les procédures nécessitant plusieurs gestes chirurgicaux. Au cours de ces procédures, des anesthésiques et des antidouleurs seront utilisés chaque fois que nécessaire pour limiter l’inconfort. Les anesthésies seront réalisées par injection intrapéritonéale ou inhalation et l’analgésie en injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou en spray. Selon les besoins du protocole, les traitements pourront être administrés aux animaux par différentes voies : eau de boisson ou gavage, injection intrapéritonéale, injection intraveineuse, injection sous cutanée ou implants. Des prélevements sanguins pourront également être réalisés de manière unique ou répétées (veine mandibulaire, caudale, ou latérale) selon les volumes et fréquences maximales recommandées pour le bien être de l’animal et dans le respect de la réglementation en vigueur (durée des interventions 5 à 20 minutes). Dans certains groupes, des interventions chirurgicales seront nécessaires, comme l’ablation des gonades dans les études sur la reproduction (Durée intervention : 15-20 min. Durée anesthésie maximum 1h). Une intervention chirurgicale intracranienne sera pratiquée pour la mise en place de dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (durée de l’intervention 2 à 4h). Pour les études sur le métabolisme, les animaux pourront recevoir des régimes particuliers, tels que des régimes hyperlipidémiques (riche en graisses, durant 3 à 12 mois), une restriction alimentaire (10 jours maximum), ou une mise à jeun (durée maximale 24h).

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Les procédures de chirurgie, d’injections ou de prélèvements de sang peuvent provoquer des douleurs à court-terme qui seront limitées par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure si nécessaire. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les animaux seront soumis à des conditions d’hébergement dérogeant aux standards réglementés. En effet les animaux pourront être privés de leur congénères (sans isolement visuel et olfactif) pendant des durées allant de 24h à 2 semaines et pouvant être répétées. Les animaux pourront être restreints en quantité de nourriture (maximum 10 jours) et/ou être exposés à des jeûnes allant jusqu’à maximum 24h. Enfin, pour évaluer la thermogénèse adaptative, les conditions standards de température d’hébergement pourront également modifiées dans les tests d’exposition au froid (maximum 24h d’exposition à 4°C, 4 expositions au maximum espacées d’au minimum 72h) ou de thermoneutralité (48h à 29-30°C > 4-8h à 4°C > 64-68h à 29-30°C > 6-8h à 4°C). Les différentes contraintes sont cependant appliquées de manière séquentielle avec des périodes de récupération permettant la stabilisation physiologique entre étapes et les animaux disposent d’un enrichissement compatible avec les mesures (litière et matériel de nidification).

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés, puis certains organes et tissus seront prélevés pour être analysés postmortem.

Remplacement

A chaque fois que cela sera possible, nous utiliserons des méthodes alternatives (cellules souches pluripotentes induites (IPS), organoïdes, cultures cellulaires, …). La dernière procédure consiste à prélever des tissus chez des animaux sans intervention lourde, afin de créer des cultures de cellules sur lesquelles nous pourrons tester des molécules directement en laboratoire (in vitro). Cela nous aidera à réduire le nombre de molécules et de doses à tester chez l’animal (in vivo), et donc à diminuer le nombre total d’animaux utilisés, en accord avec le principe des « 3R » (Remplacer, Réduire, Raffiner). Cependant, pour comprendre finement le fonctionnement normal et les dérèglements du système nerveux et des hormones (neuroendocrinologie), il est aujourd’hui encore indispensable d’avoir recours à des modèles animaux. Des méthodes alternatives permettant d’étudier, en laboratoire, des interactions très complexes entre cellules et tissus sont en cours de développement dans notre équipe, mais elles ne sont pas encore suffisamment avancées pour remplacer complètement les animaux. Notre recherche porte sur de grandes fonctions du corps, comme la reproduction, la régulation du poids et de l’équilibre énergétique, ou encore certaines fonctions liées à la mémoire. Ces fonctions sont trop complexes pour être entièrement étudiées uniquement avec des cellules en culture. En revanche, les travaux réalisés dans le cadre de ce projet permettront de produire de nouvelles connaissances et de nouvelles méthodes qui, à terme, aideront à mieux modéliser certains aspects de ces phénomènes in silico et ainsi, progressivement, à limiter davantage l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans ce projet est limité au strict minimum pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique. La taille de chaque groupe a été calculée à l’aide d’un outil de planification expérimentale, afin d’éviter tout animal surnuméraire tout en garantissant la solidité des résultats. Par ailleurs, comme indiqué dans les procédures, certaines expériences ne seront réalisées que si les résultats des étapes précédentes le justifient. Nous présentons donc ici un nombre maximal d’animaux, qui ne sera en pratique pas atteint dans de nombreux cas.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions strictement contrôlées, avec un haut niveau de protection sanitaire. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture en continu, et leur environnement est enrichi, par exemple avec des cylindres de coton, pour favoriser leurs comportements naturels, réduire le stress et les aider à maintenir leur température corporelle. Les périodes d’isolement sont limitées au minimum nécessaire et toujours justifiées. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, et les animaux sont progressivement habitués à ces manipulations pour diminuer au maximum leur stress. Une attention particulière est portée au principe de raffinement, qui consiste à adapter les procédures pour réduire au mieux la peur, l’anxiété et la douleur. Cela inclut, par exemple, le regroupement des animaux, l’enrichissement de leur environnement, ainsi que des soins attentifs avant, pendant et après les interventions (asepsie, anesthésie, analgésie). Toutes les procédures pouvant être douloureuses ou invasives sont effectuées sous anesthésie appropriée, avec une prise en charge de la douleur avant et après l’intervention lorsque c’est nécessaire. Après chaque anesthésie, les animaux sont surveillés en continu jusqu’à leur réveil complet. Par la suite, leur état général est contrôlé chaque jour : activité, posture, aspect du pelage, alimentation, hydratation et poids sont évalués à l’aide d’une grille de suivi. Des critères d’arrêt précis sont définis. Si un animal présente des signes de souffrance, de détresse prolongée, une perte de poids importante ou une dégradation de son état général, il est immédiatement retiré de l’étude et, si besoin, euthanasié afin d’éviter toute souffrance supplémentaire. Dans le cas où cela s’avèrerait vraiment nécessaire, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) entre les établissements utilisateurs. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute manipulation.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre le cerveau et la périphérie afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité, l’infertilité et les maladies neurodégénératives. Le recours aux animaux est strictement limité aux situations où aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un niveau d’information équivalent. Les espèces utilisées ont été choisies afin de maximiser la pertinence scientifique tout en minimisant la douleur, la souffrance et le nombre d’animaux. La souris est privilégiée en raison de la disponibilité d’outils génétiques et viraux permettant de cibler précisément des populations cellulaires, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires et la variabilité expérimentale. Le rat est utilisé uniquement lorsque la quantité de tissu requise ou la robustesse cellulaire ne peuvent être obtenues chez la souris, notamment pour l’établissement de cultures primaires. Pour les étapes principales (procédures 1 à 8), nous utiliserons des souris adultes, dès l’âge de 6 semaines, jusqu’à des animaux plus âgés (plus de 24 mois).

Le genou de 240 souris est déstabilisé chirurgicalement pour provoquer une arthrose, puis reçoit une ou plusieurs injections dans l'articulation, que le porteur situe lui-même entre la douleur légère et la douleur sévère. Ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes tuées à l'issue. La description des atteintes tient en une ligne, "Dans le modèle d'arthrose de douleur, les animaux développeront une boiterie", quand celle des procédures prévoit des manipulations tous les trois ou quatre jours pendant vingt et un jours pour mesurer la motricité. La mise à mort sert à établir un score histologique du genou, seule façon selon le porteur d'évaluer l'efficacité de l'hydrogel testé.

Objectifs

Chez les patients arthrosiques, on retrouve une destruction du cartilage articulaire. Dans l'arthrose le principal motif de consultation des patients est la douleur articulaire. Ainsi, nous souhaitons évaluer les effets de formulations thérapeutiques à visée anti-arthrosique, sous la forme de gels complexes. Nous avons développé précédemment un produit efficace dans l’arthrose mécanique chez la souris (diminution des dommages sur le cartilage), et sur la douleur dans l’arthrose, quand il est injecté une fois par semaine. Ici, deux gels contenant le produit actif seront testés dans les mêmes modèles d'arthrose. Les gels relargueront le produit actif de façon prolongée et continue, nous vérifierons qu'une seule injection sera efficace pour obtenir un effet anti-arthrosique, comparativement au produit actif seul (injecté toutes les semaines pendant 8 semaines).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont à la fois l'optimisation de la délivrance du produit parmi deux types de gels, mais également la réduction du nombre d'injections de la molécule en vue d'une utilisation en clinique chez l'Homme. Comparativement à l'injection du produit "seul", soit une fois par semaine (8 injections), l'utilisation d'un gel diminuerait ces injections à une seule fois.

Procédures

Dans le modèle chirugical d'arthrose, les souris subiront des manipulations (stress léger), une chirurgie de destabilisation du genou pour induire l'arthrose sous anesthésie (15 minutes, douleur modérée), une ou plusieurs injections intra-articulaires sous anesthésie (5 minutes, douleur légère) Dans le modèle de douleur d'arthrose, les animaux subiront des manipulations fréquentes (5 minutes tous les 3/4 jours pour évaluer leur motricité, stress léger), plusieurs injections intra-articulaires sous anesthésie (5 minutes, douleur légère à sévère)

Impact sur les animaux

Dans le modèle d'arthrose de douleur, les animaux développeront une boiterie.

Devenir

Les animaux sont utilisés dans la cadre de l'évaluation de l'efficacité d'un hydrogel à but anti-arthrosique. L'efficacité ne peut être évaluée qu'avec l'étude d'un score histologique au site affectant la pathologie (genou) représentant les lésions dans l'articulation, nécessitant la mise à mort des animaux impliqués dans cette étude.

Remplacement

Certaines expériences peuvent être menées sur des modèles cellulaires plus ou moins complexe (un ou plusieurs types cellulaires, modèles cellulaires plus ou moins complexe (un ou plusieurs types cellulaires, en 2 ou 3 dimensions) mais l'impact d'un traitement potentiel d'une pathologie complexe comme l'arthrose ou de multiples compartiments sont impliqués (mécanique et douleur, notamment) est difficilement mesurable dans un système simplifié, ainsi le modèle animal est indispensable à la connaissance des effets sur l'articulation dans son intégralité

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum d'après nos résultats précédents, diminuant le nombre de 18 à 12 animaux par groupe.

Raffinement

L’induction de l’arthrose (chirurgie, douleur) ainsi que l’injection des molécules (injection intra-articulaire) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Nous faciliterons l'accès à la nourriture par mise à disposition de croquettes dans la cage, et à la boisson par mise en place d'un biberon à col plus long (évite à l'animal de se lever). Au vu de nos résultats précédents, nous parvenons à réduire la durée du modèle de douleur à 21 jours au lieu de 28. Enfin, seules des personnes expérimentées dans les injections et les chirurgies intra-articulaires participeront à cette étude, améliorant grandement la vitesse d'exécution des gestes et limitant ainsi les suites post-intervention.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus étudié pour l'arthrose. Le modèle de chirurgie du genou est actuellement considéré comme le modèle reproduisant le mieux l'arthrose humaine, en termes de manifestations articulaires et de durée d'installation. Le modèle d'arthrose de douleur est un modèle reconnu comme modèle explorant le compartiment de la douleur dans l'arthrose. Les animaux sont utilisés à partir de 10 semaines d’âge, auquel les articulations sont bien formées. Il a été montré que les études articulaires ne doivent être faites sur des sujets ni trop jeunes ni trop âgés.

Une maladie du greffon contre l'hôte fait partie des effets attendus, avec perte de poids et perte de poils, et l'imagerie sous anesthésie revient deux fois par semaine. 5 238 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes tuées pour des analyses post mortem sur organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale, puis des monocytes humains modifiés génétiquement pour porter un récepteur CAR, l'objectif étant de mesurer où ces cellules vont, combien de temps elles survivent et quelles toxicités elles provoquent. Le porteur écrit avoir déjà évalué ces approches en coculture 2D et 3D, et conclut que "l'utilisation du modèle animal reste indispensable" parce qu'il faut observer l'interaction dans un "organisme entier".

Objectifs

Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. La modification génétique consiste à faire un exprimer un récepteur dénommé CAR spécifique d’une molécule tumorale permettant la reconnaissance des cellules tumorales et l’activation des cellules myéloïdes génétiquement modifiées contre les cellules cancéreuses Nous souhaitons modifier génétiquement les cellules myéloïdes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des cellules myéloïdes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR, nous étudierons à la fois la capacité des CAR-M à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR-M au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR-M de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR-M sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR-M est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les cellules myéloïdes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces. MODIFICATION La modification proposée permettra de non seulement mieux comprendre les mécanismes d’action de notre thérapie seule ou en combinaison avec d’autres immunothérapies. De plus, l’utilisation d’autres modèles tumoraux permettront d’évaluer l’efficacité de cette thérapie dans plusieurs types de tumeurs solides induisant ou non l’apparition de métastases, plus ou moins résistantes aux traitements déjà mis en place.

Procédures

Pour évaluer la capacité des CAR-M à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées nous injecterons les cellules tumorales et les CAR-M directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 à 4 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR-M injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injecté 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).

Impact sur les animaux

L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. MODIFICATION Les nuisances attendues lors des différentes injections seront minimes, avec un geste qui dure moins de 10 secondes par souris. Les prélèvements de sang sont effectués par du personnel entraîné dont le geste a été validé par le responsable Bien-Etre Animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des cellules modifiées ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des CAR-M avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.