Rongeurs

Une tumeur hypophysaire est implantée par chirurgie stéréotaxique dans le crâne de chaque rat, avec une canule d'injection laissée en place pendant les soixante jours du protocole. 60 rats Wistar Furth vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent des symptômes d'hypertension intracrânienne quand la tumeur devient volumineuse, ressentent une gêne de type démangeaison à cause de la canule, et sont tués au soixantième jour pour peser les tumeurs et chercher des métastases par autopsie cérébrale. Le porteur qualifie cette chirurgie de "peu douloureuse" et les injections intratumorales de "non douloureux", en faisant valoir que les mêmes gestes se pratiquent chez l'être humain sous simple anesthésie locale.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet des analogues de la somatostatine sur le contrôle des tumeurs hypophysaires sécrétant l’hormone de croissance en fonction de la voie d’administration du traitement (voie orale versus traitement local intratumoral) afin de s’affranchir de l’obstacle que représente la barrière hémato-encéphalique

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse de travail selon laquelle les analogues de la somatostatine donnés comme traitement des tumeurs hypophysaires sont relativement peu efficaces à cause de leur incapacité à pénétrer dans l'hypophyse à cause de la barrière hémato-encéphalique, les résultats de notre projet pourraient ouvrir la voie au développement d'une technique chirurgicale visant à délivrer la médicament directement dans la tumeur résiduelle et à améliorer les taux de guérison de ces patients. de guérison des adénomes somatotropes.

Procédures

Les animaux seront initialement soumis à une procédure chirurgicale (stéréotaxie) peu douloureuse (sous anesthésie générale gazeuse). A titre de comparaison, ces chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous anesthésie locale pure chez l'homme en pratique clinique courante en France. Les autres procédures comporteront des prises de sang bi-mensuelles (sous anesthésie générale gazeuse) ainsi que des injections bi-hebdomadaires sur la canule d'injection prévue à cet effet (non douloureux, mais anesthésie générale gazeuse de < 1 minute envisageable en cas d'angoisse de l'animal). Au total, chaque animal ne subira qu'une seule procédure chirurgicale initiale pour implanter la tumeur (20 minutes de chirurgie sous anesthésie générale), puis 3 prises de sang à 15 jours d'intervalle (10 minutes sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement en lien avec les symptômes d'hypertension intracrâniennen lorsque les tumeurs deviennent trop volumineuses. Aussi, les animaux peuvent ressentir une gêne à type de démangeaison en raison de la canule intratumoral qui restera en place pendant toute la durée de l'expérimentation. Enfin, les injections hebdomadaires peuvent être source d'anxiété chez les animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, après 60 jours, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs hypophysaires obtenue pour les peser et les analyser sur le plan moléculaire. Aussi, une autopsie cérébrale sera réalisée à la recherche de métastases à distance.

Remplacement

L’utilisation de modèle animaux pour l’étude du développement tumoral dans son microenvironnement habituel est indispensable. L’effet de la somatostatine administré par voie systémique sur ces tumeurs est connu mais son effet après administration directement dans la tumeur n’est pas connu. Bien que les propriétés de la barrière hémato-encéphalique soient largement connues, il est indispensable de confirmer notre hypothèse dans un modèle préclinique avant d’envisager toute nouvelle procédure chez l’homme. Actuellement il n’existe pas de modèle préclinique non-animal fiable de cette barrière hémato-encéphalique.

Réduction

L'évaluation de l'effet des médicaments selon la voie d'administration nécessite de comparer le médicament à la fois à un placebo mais aussi à sa voie d'administration systémique habituelle (sous-cutanée) ce qui nécessite au moins 3 groupes. Idéalement, il serait utile de tester la voie d'administration en placebo la molécule et la voie d'administration, soit 4 groupes d'animaux. Néanmoins, on peut s'affranchir d'un groupe d'animaux si tous les animaux recoivent une injection locale et une injection sous-cutanée (de placebo ou de médicament), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux en n'utilisant pas de 4ème groupe. D'un point de vue statistique, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique à partir des différences de survie moyenne observées entre les groupes d'animaux dans notre précédente étude de survie des animaux de notre modèle expérimental en fonction de leur exposition à un médicament anti-tumoral. Le nombre d'animaux nécessaire est estimé statistiquement à 19 par groupes. Le geste technique d'insertion d'une canule d'injection intra-sellaire étant nouveau, 3 rats supplémentaires semblent nécessaires à l'optimisation de la technique opératoire. Le nombre total d'animaux nécessaire s'élève donc à 60 animaux (19 par groupe + 3 de mise au point).

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par deux minimum dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre les points limites. Les animaux ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie et celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Toute procédure pouvant engendrer une douleur (prise de sang, injection) sera également effectuée sous anesthésie générale gazeuse. Tous les animaux seront opérés et surveillés par les membres de l’équipe qui a mis au point le modèle expérimental de tumeur hypophysaire orthotopique, sont habitués à ces procédures et à la reconnaissance précoce des points limites des animaux. Les points limites surveillés par l'équipe sont les suivants : hérissement du poil, isolement, aggressivité, ralentissement, inconfort. En cas d'apparition d'un de ces signes clinique, une fiche individuelle sera réalisée de manière quotidienne et ous les animaux qui présentent un score supérieur ou égal à 6/10 seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle animal de rat repose l'absence d'autre modèle expérimental préclinique de tumeur hypophysaire orthotopique. En effet, des modèles d'adénomes hypoophysaires obtenues par modifications génétiques chez la souris ne permettent ni d'étudier ces maladies dans un contexte immunologique physiologique, ni d'étudier des pathologies hypophysaires sécrétantes, ces modèles se limitant à des adénomes non-sécrétant. De plus, les adénomes hypophysaires chez l'homme sont sporadiques dans plus de 95% des cas et les modèles génétiques ne correspondent donc qu'à de rares situations cliniques chez l'homme. Le choix de cette souche spécifique de rats (Wistar Furth) est en lien avec la seule lignée cellulaire immortalisée de cellules hypophysaires somatotropes (GC) qui provient de cette souche de rat. Plusieurs tentatives de reproduction de norte modèle dans des souches plus courantes (Wistar Wi et Han) ont été réalisées, sans succès. Les procédures expérimentales débuteront entre 8 et 12 semaines après leur naissance, âge qui correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d’obtenir un environnement ostreogénique favorable au développement des tumeurs.

Pour observer en temps réel l'activité des neurones du cortex préfrontal pendant un apprentissage associatif, 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'une heure pour injection virale et implantation de fibres optiques, et 150 d'entre elles une seconde chirurgie quelques semaines plus tard pour implanter un miniscope sur le crâne. Le porteur signale le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et de perte de poids inhérent à ces interventions, l'hypothermie et les troubles respiratoires liés aux deux anesthésies, et la contrainte posturale que représente le port permanent d'un appareil d'imagerie sur la tête. Sur la réduction, il décrit une conception expérimentale soigneuse et des études pilotes, sans donner un seul effectif par groupe ni justifier le chiffre de 260.

Objectifs

La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

- Procédure 1 :10 animaux; L’ensemble de ces animaux subiront une chirurgie pour infection virale avec implantation de fibres optiques 1h de chirugie en totale maximum. Cette procédure à pour but de mettre en place et optimiser le protocole utiliser pour soit campari2 ou cal-light. - Procédure 2: 100 animaux,les mémes étapes que la procédure vont se dérouler que la promiére procédure. - Procédure 3 :150 animaux, Une implantation de miniscope va se faire aprés quelques semaines de la premiére chirugie (implantation de fibre +injection virale) afin de permettre un minimum de rétablissement .

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro et des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation.iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'un gel oculaire pour éviter le dessèchement des yeux et d'un tapis chauffant (avec sonde rectale) pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. Formation spécialisée de l'expérimentateur. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie : administration de sérum physiologique, nourriture humide placée sur le sol de la cage. v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation d'un tube de transfert. viii) Habituation à la salle de comportement. ix) Hébergement en binôme jusqu'à l'implantation de la lentille. Utilisation d'une double enrichissement. Pendant la période d'utilisation des séparateurs, les souris bénéficieront également d'une séance d'exploration "supervisée" de 45 minutes par jour. x) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que le NC3R, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

Irradiées pendant dix minutes pour vider leur moelle osseuse, puis injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La maladie s'installe comme prévu et provoque au bout de quelques semaines amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration, déshydratation, hypothermie ou embolie pulmonaire. S'y ajoutent quatre prélèvements sanguins à la mâchoire, une ponction dans le fémur en cas de non-détection des cellules, sept jours de gavage ou cinq jours d'injections abdominales, et un prélèvement de sang au cœur sous anesthésie. Le projet vise à comprendre pourquoi la greffe de moelle échoue chez plus de 40 % des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde, retombée que le porteur situe dans la conception d'immunothérapies futures.

Objectifs

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une LAM récidivante réfractaire à de nouvelles tentatives de chimiothérapie. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement induit une réponse de la partie de l’organisme greffée (ici de la moelle osseuse) contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GVL) afin d’éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre l’hôte. Le projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse GVL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes (cellules immatures de la moelle osseuse qui peuvent se différencier). Nous avons pu valider la réponse bénéfique GVL dans deux modèles précliniques, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Les deux modèles étant un modèle de souris ayant été irradié afin de « faire de la place » dans la moelle osseuse et permettre aux cellules leucémiques de s’y développer. Et un modèle avec des souris recevant des cellules leucémiques de patients. Après l’étude de nombreux gènes chez la souris, nous avons pu identifier des gènes qui modulent la réponse GVL dans les LAM. Nous souhaitons à présent les valider et les définir et en parallèle nous allons tester de nouvelles molécules qui pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GVL.

Bénéfices attendus

L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GVL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels acteurs de l’effet GVL afin d’optimiser la réponse immunitaire contre les cellules leucémiques.

Procédures

Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormi) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation (durée: 10 min maximum) pour éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue. Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang, nous ferons une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs; durée du gavage: 30 secondes) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs; durée de l'injection: 15 secondes). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale. A la fin du traitement, 3 jours après, les souris seront anesthésiées et un prélèvement de sang au niveau du cœur (durée 3 min) sera effectué.

Impact sur les animaux

Lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux), les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie ou encore d’embolie pulmonaire . Pour les injections intraveineuses, les anesthésies ou les prélèvements sous-mandibulaires les effets indésirables sont surtout l’introduction d’une aiguille. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité ou une embolie pulmonaire. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de leucocytes (globule blanc) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.

Remplacement

Pour identifier les acteurs qui permettent une réponse contre la leucémie , des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut modifier leur comportement. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles animaux, ici chez la souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé tous les jours, 4 semaines après la greffe des cellules leucémiques permettent de recenser les différents points limites.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

Caler la dose, la formulation et la voie d'administration avant les études de plus grande ampleur : 300 souris, 300 rats et 180 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à deux administrations par 24 heures pendant quatre semaines, jusqu'à huit prélèvements sanguins par jour, et pour certains une chirurgie de 20 à 45 minutes pour implanter cathéters ou mini-pompe, suivie d'un hébergement isolé pendant toute l'étude. Le porteur mentionne aussi la privation de nourriture et l'isolement en cage de mise à jeun, et reconnaît qu'aucune analyse statistique ne sera conduite sur ces tests pilotes. 650 animaux seront tués, les 130 autres pouvant être réutilisés dans d'autres projets, la formation par exemple, s'ils n'ont pas montré d'effets marqués.

Objectifs

Lors des premières étapes du développement de nouveaux médicaments, des tests préliminaires sur de petits groupes d'animaux vigiles sont souvent nécessaires pour établir des paramètres clés tels que la dose, la formulation et la voie d'administration. Ces essais préliminaires servent à évaluer l'impact de ces changements de paramètres sur le rongeur vigile (rats, souris, cobayes) par des études de peu d'animaux, avec une surveillance accrue des effets secondaires. L'objectif est de s'assurer que les changements apportés dans ces paramètres n'entraînent pas de réactions indésirables majeures. Ces essais initiaux permettent de réduire les risques d’effets secondaires lors des études ultérieures de plus grande envergure qui suivront, et s'assurer qu'elles aient un impact conforme à celui envisagé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes sur le profil du candidat médicament et d’évaluer les éventuels effets secondaires locaux et généraux sur un petit groupe d'animaux avant de pouvoir passer aux premières administrations chez un plus grand nombre d'animaux. Ceci est donc une étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Selon leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Rongeurs) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Lors de ce projet, les animaux seront soumis à une ou des administrations de produit, avec moins de 3 minutes par administration (2 administrations/ 24h maximum, sur 4 semaines maximum). Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Les fréquences des prélevements sont en fonction du volume et mode de prélèvement, sans dépasser 8 prélèvements par 24h. Un prélèvement sanguin ou de tissu terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes). Chirurgie d'implantation de cathéters et/ou de minipompe (pour prélèvements et/ou administration). Cette chirurgie durera environ 20-45min.

Impact sur les animaux

Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour l'administration du composé à tester et pour d'éventuels prélèvements de sang, éventuellement pour induire une anesthésie. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. La chirurgie d'implantation de cathéters et de minipompes chez le rat et le cobaye peut induire des douleurs post-chirurgicales. Post-chirurgie d'implantation de cathéters, les animaux seront hébergés individuellement sur la durée de l'étude pour récupérer. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la suite d’effets marqués des produits testés. Tous les animaux implantés avec des cathéters ou avec une mini-pompe seront euthanasiés. Ce sera également le cas pour les animaux avec prélèvements terminaux (tissus et prélèvements sanguins). Les animaux non-implantés (cathéters et/ou mini-pompe) ou les animaux n'ayant pas subi de prélèvements terminaux pourront être réutilisés si ils n'ont pas présenté d'effets marqués après traitement . Leur réutilisation pour d'autres projets (ex : formation) sera possible si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets systémiques ou locaux d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur les résultats d’expérimentation des tests pilotes, car le nombre d'animaux utilisés par groupe est faible et l'objectif de ces tests est principalement de détecter des effets indésirables sur une petite échelle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, du poids et des signes cliniques • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire , • La mise en groupe des animaux , • Un raffinement spécifique à ce projet sera réalisé par la mise en application d’ une grille de cotation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la douleur et la contrainte subie par l'animal.

Choix des espèces

Ce projet pratique sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets potentiels d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime hypercalorique, puis reçoit sept prélèvements sanguins par la queue coupée aux ciseaux, une mini-pompe osmotique implantée sous la peau, trente injections sur dix semaines et, pour certaines, un cathéter posé dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie de 45 minutes. Cinq jours d'isolement en cage servent à mesurer la prise alimentaire, avec le stress et la perte de poids que le porteur en attend. Il conclut que seul un "modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l'animal entier" permet de comprendre l'effet du peptide testé sur l'obésité et le diabète.

Objectifs

Ce projet permettra d'étudier la régulation de l’expression d'une séléno protéine au niveau de l'hypothalamus. Cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique, un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités, notamment le diabète de type 2. Ce projet permettra également de tester les effets d'un nouveau peptide thérapeutique, capable de mimer l'activité de la séléno protéine, pour le traitement de l’obésité et du diabète de type 2. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.

Bénéfices attendus

L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Le peptide que nous allons tester présente plusieurs avantages qui peuvent en faire un outil thérapeutique très intéressant pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, ce peptide atteind le cerveau et pénètre dans les cellules pour réduire le stress oxydant en général. Il peut agir aussi bien au niveau central que dans des tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.

Procédures

Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes osmotiques sous la peau des animaux, afin de délivrer un composé en permanence, sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes osmotiques sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements par injection (3 par semaine) dureront 10 semaines. Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivront un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 16 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 7 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2. #2. Tests effectués sur les animaux : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #3. Mesure de la prise alimentaire : les animaux seront isolés 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids. #4. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du peptide thérapeutique dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.

Réduction

En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la protéine, tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Au cours de ce projet, plusieurs peptides seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones. Ils seront sélectionnés pour leur capacité neuro-protectrices, les plus prometteurs seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.

Raffinement

L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet d'un peptide thérapeutique sur un modèle animal, dans la perspective de le tester ensuite dans une phase clinique humaine. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.