Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation des activités biologiques et de l’effet sur la santé de micro-organismes utilisés comme additifs alimentaires chez le Bar Européen – 1/2
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
6 240 bars juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, dont 2 600 recevront une injection bactérienne, et aucun ne sortira vivant de l'étude. Les épreuves infectieuses provoquent lésions cutanées, ulcères, atteintes nerveuses, nage anormale et léthargie, avec une mortalité pouvant atteindre 60 à 70 % sans intervention. Trois pesées sous anesthésie par poisson, des prélèvements sanguins, un transfert sous sédation entre deux établissements distants de 500 mètres. L'objet du projet est de tester sept formulations d'additifs à base de protistes, pour réduire la dépendance de l'aquaculture à l'huile de poisson et augmenter la rentabilité des producteurs.
Objectifs
En aquaculture, l'alimentation des poissons carnivores dépend toujours de la farine et de l'huile de poissons issus de la pêche de capture. Comme ces éléments se raréfient et deviennent plus chers, leur réduction dans les aliments aquacoles a donné lieu à l’intégration de protéines et de lipides végétaux, ce qui a eu pour conséquence de réduire la teneur en oméga 3 des poissons commercialisés et, de fait, contribue à diminuer les bienfaits pour la santé des consommateurs. Il est donc nécessaire de trouver des sources alternatives de ces ingrédients clés. Par ailleurs, la pisciculture est régulièrement impactée par des épidémies contre lesquelles il existe peu de vaccins et de médicaments antimicrobiens efficaces, avec en complément la problématique de résistance aux antibiotiques. La production à partir de protistes - organismes marins unicellulaires - tels que Thraustochytrium d'omégas 3 comme alternative à l'huile de poisson a suscité un intérêt croissant au cours de ces dernières années. En plus des omégas 3, ces organismes, qui peuvent se multiplier avec des sources de carbone et d'azote à faible coût (sous-produits et déchets alimentaires), ont la capacité de produire d'autres molécules à forte valeur ajoutée telles que les caroténoïdes, les phytostérols et le squalène qui peuvent avoir des effets immunostimulants ou antioxydants. Ce projet, qui se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU), a pour objectifs d'utiliser ces protistes, sous forme de fractions plus ou moins purifiées et industrialisées, comme additifs alimentaires afin d'améliorer l’élevage des poissons d’aquaculture (croissance, réduction des malformations et de la mortalité) et leur capacité de résistance aux maladies. L'espèce marine choisie, le bar commun, est la plus produite en Europe et représente un fort enjeu économique.
Bénéfices attendus
Les résultats aboutiront à la sélection des fractions les plus intéressantes permettant de réduire la dépendance de l'aquaculture à la farine et à l'huile de poisson et d'améliorer la fonctionnalité des aliments aquacoles pour optimiser la robustesse et la résistance aux maladies des animaux. Les fractions les plus pertinentes pourront faire l'objet d'un dossier Européen de demande d'autorisation comme additifs alimentaires à destination des poissons. Cela contribuera à terme à entrainer une augmentation de la productivité et de la rentabilité des producteurs aquacoles (augmentation du nombre de poissons vendus / poissons produits, réduction des traitements de type antibiotiques) et renforcera la qualité des produits français dans un marché mondial très concurrentiel.
Procédures
Des pesées et mesures de taille seront réalisées à 3 temps différents sous anesthésie pour chaque animal (EU1). La prise biométrique dure 30 secondes, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum. -Des prélèvements sanguins uniques seront réalisés sur 60 animaux par formulation alimentaire après 8 semaines de supplémentation (EU1) et sur 12 animaux / formulation et pathogène 24 à 72 heures post-infection (EU1 et 2). Une prise de sang unique sera réalisée sur les animaux survivants au terme des challenges (EU2). Ces prélèvements seront pratiqués sous anesthésie. Le prélèvement dure 30 secondes, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum. -Des injections seront réalisées pour les animaux qui subiront une infection bactérienne (n=2600, 1 seule fois par individu), d'un volume de 100 microlitres et sous anesthésie (EU1). L'injection dure 15 secondes environ, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des nuisances sévères puisqu’elles induisent l’apparition de signes cliniques (changement de couleur de robe, atteintes nerveuses, lésions cutanées, rougeurs/érosions bucales, nage anormale, ulcère épidermique, léthargie, déséquilibre, anorexie ...) qui peuvent apparaitre dans les 24h post-infection pour les bactéries et après environ 7 jours pour le VER. La durée des signes observables est de quelques heures pour les bactéries et peut aller jusqu'à quelques jours pour le VER. Sans intervention, ces nuisances aboutissent à une mortalité variable en fonction des conditions (qui peut atteindre 60-70%), qui intervient généralement dans les 5 premiers jours pour les bactéries et entre 7 et 15 jours pour le VER. Les mesures biométriques et les prélèvements sanguins (1 min/poisson) seront réalisés sur animaux anesthésiés par balnéation, opérations qui peuvent induire un léger effet indésirable (stress). Le transfert d'une partie des animaux sous sédation entre les deux établissements (distance de 500 mètres, 15 min) générera également un léger stress.
Devenir
Les animaux subissant des épreuves infectieuses expérimentales, il n'est pas envisageable de conserver les survivants pour des essais ultérieurs.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer le potentiel d'organismes unicellulaires (prostistes) comme source de nutriments et de molécules fonctionnelles en remplacement de farine et d'huile de poissons dans l'alimentation aquacole. Des essais in vitro seront menés en première intention afin d'évaluer la toxicité sur lignées cellulaires mais également les capacités anti-oxydantes, anti-bactériennes et anti-virales des différentes fractions générées. Ces tests in vitro ne pourront néanmoins pas se substituer à des essais sur animaux qui seuls permettront de mesurer l'effet sur le développement et la croissance des poissons et d'approcher les mécanismes impliqués dans une potentielle amélioration de leur capacité de résistance aux maladies (stimulation de l'immunité, modification du microbiome, ...).
Réduction
Le nombre de poissons et de bassins par condition a été réduit à son minimum en intégrant les temps et nombre de prélèvements prévus, la variabilité inter-bassins fréquemment observée, les mortalités pouvant survenir sur les stades juvéniles et de façon à assurer une robustesse statistique des résultats. Pour la phase de paramètrage des infections expérimentales, un total de 240 animaux maximum seront nécessaires. Pour la phase de supplémentation, 600 poissons / fraction seront répartis dans 4 bassins. Pour les challenges infectieux, 208 poissons/fraction et par pathogène (n=2) seront utilisés, répartis dans 4 bacs (3 pour le suivi de la mortalité et 1 pour l'échantillonnage ; 1 bac témoin non infecté avec 52 poissons en complément). Pour les 7 formulations alimentaires à tester et en intégrant les contrôles et les tests de calage, cela représente un total de 6240 bars juvéniles.
Raffinement
Un enrichissement est mis en place au travers d'un bullage et d'un éclairage adapté. Le transport d'une partie des animaux entre les EU1 et 2 est réalisé sous sédation dans des seaux (eau de mer oxygénée à la température des bassins de départ). Les animaux sont positionnés à leur arrivée en bassins dans les mêmes conditions (température d'eau, oxygénation, circuit ouvert) que celles en place dans les bassins de départ. Pour les infections par bain, les animaux sont placés dans un milieu hyperoxygéné sous surveillance resserrée. Pour les infections par injection, les animaux sont préalablement anesthésiés. L'état de santé général des poissons sera évalué quotidiennement en utilisant une grille de points limites adaptés et spécifiques du projet intégrant plusieurs paramètres (nage, comportement, état physique).
Choix des espèces
Le bar commun, espèce marine carnivore d'intérêt aquacole, a été choisie car il s'agit de l'espèce ciblée par le développement des formulations alimentaires supplémentées en protistes. Nous travaillerons sur des animaux juvéniles afin de pouvoir mesurer les effets de nos formulations d'une part sur la croissance mais également sur l'amélioration potentielle de leur capacité à résister à des maladies infectieuses - sachant que les jeunes stades sont les plus fragiles.
Rôle des adipocytes bruns dans la réponse immunitaire adaptative chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs adipocytes bruns soient détruits. 7 018 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles passent de sept à vingt jours à des températures dérogatoires et reçoivent jusqu'à quatre injections, l'inflammation provoquée par les adjuvants étant reconnue comme une source de douleur, alors que le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Leurs ganglions lymphatiques et leur tissu adipeux brun sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Chez les mammifères, comme chez l’humain et la souris, la température du corps est très bien régulée. Quand il fait froid, le corps met en place différents mécanismes pour rester à une température stable, par exemple en resserrant les vaisseaux sanguins ou en produisant de la chaleur dans de la graisse spéciale qu’on appelle le tissu adipeux brun. Mais cette température peut aussi changer en cas de maladie ou après une vaccination. On peut avoir de la fièvre (hausse générale de la température) ou une chaleur localisée à l’endroit de l’inflammation. Cette élévation de la température n’est pas anodine et elle peut jouer un rôle important dans le bon fonctionnement du système immunitaire. Les ganglions lymphatiques, sortes de petits centres de contrôle du système immunitaire, sont entourés de graisse. Cette graisse pourrait, elle aussi, produire de la chaleur en cas d’inflammation, aidant à réguler la température locale autour des ganglions. Des signaux envoyés par le système immunitaire (comme des cellules ou des molécules solubles) pourraient contrôler cette fonction "chauffante", comme cela a déjà été observé en cas d’exposition au froid. Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre ces mécanismes, à travers trois grands objectifs : 1) voir comment la température ambiante influence la réponse immunitaire chez la souris, 2) tester si certains adjuvants (substances ajoutées à un vaccin pour renforcer la réponse du système immunitaire) peuvent activer cette graisse "chauffante" autour des ganglions, et 3) déterminer si cette production de chaleur locale par la graisse joue un rôle dans la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent pourrait aider à trouver de nouvelles façons d'agir sur nos défenses. Par exemple, cela pourrait permettre de renforcer la réponse du corps lors d'une vaccination pour qu'elle soit plus efficace, ou au contraire de la calmer dans certaines maladies où le système immunitaire s'emballe, comme les maladies auto-immunes.
Procédures
Les interventions réalisées seront les suivantes : 7 jours d’exposition à des températures expérimentales (64 animaux), 7 jours d’exposition à des températures expérimentales + 1 injection (30 secondes) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (800 animaux), 8 à 10 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections sous anesthésie (10 minutes) (954 animaux), 9 à 15 jours d’exposition à des températures expérimentales + 2 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (400 animaux), 12 à 20 jours d’exposition à des températures expérimentales + 4 injections (30 secondes par injection) + 1 prélèvement sanguin (1 minute) (4800 animaux).
Impact sur les animaux
Les injections entraînent une douleur légère. L'inflammation induite par les adjuvants est également une source de douleur potentielle. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température dérogatoires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les ganglions lymphatiques et le tissu adipeux brun dans le but de les analyser.
Remplacement
Pour comprendre comment la température, la production de chaleur par le corps et le système immunitaire interagissent, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre un ganglion lymphatique et la graisse qui l’entoure et entre les différents types de cellules à l’intérieur du ganglion.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. Pour les élevages, nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles dans certaines procédures. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins trois fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’humain nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’humain. De plus, nous étudions le tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant la déplétion spécifique des adipocytes bruns. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines).
Tests de vaccination contre Clostridium difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Immunisées à trois reprises par voie sous-cutanée, nasale ou orale, puis infectées par Clostridioides difficile après un gavage antibiotique qui détruit leur flore intestinale, 432 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue en raison de leur infection. Les diarrhées attendues durent deux à trois jours, avec des pertes de poids de 5 à 15 %, et les selles sont recueillies tous les deux jours pendant tout l'essai. L'enjeu est de tester des candidats vaccins déjà évalués in vitro et in silico, dont un essai préliminaire chez la souris n'avait montré qu'une efficacité partielle. Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire sont annoncés au nombre de cinq pour quatre dates listées, et de quatre dans la rubrique des atteintes, sans que le texte lève la différence.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser une évaluation préclinique de leur efficacité in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire suite aux vaccinations. Des essais préliminaires in vivo en modèle murin ont montré qu’administré seul par voie parentérale les antigènes étaient capables d’induire une efficacité vaccinale partielle. L'objectif de ce projet est d’améliorer cette efficacité vaccinale in vivo par une vectorisation des candidats vaccins dans des vecteurs viraux, de les combiner et de tester plusieurs schémas vaccinaux (voie parentérale et/ou voie muqueuse). Les animaux seront immunisés à trois reprises. Le statut immunitaire des animaux sera vérifié avant et après immunisation afin d'évaluer l'efficacité des différents candidats vaccinaux testés. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la colonisation intestinale par C. difficile (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux) une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire spécifique analysée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices apportés par ces essais sont d’un intérêt majeur. C. difficile a été classée comme «menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. En effet, le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Notre approche vaccinale permettrait à moyen terme de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire est induite lors de ces essais de vaccination, la bactérie sera limitée dans son développement et les symptômes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles. L’analyse de la réponse immunitaire suite à des immunisations est réalisable uniquement in vivo, aucun système in vitro ne permet d’évaluer cette stimulation par un antigene du système immunitaire dans sa globalité. Le développement à moyen terme d’un vaccin ciblant les infections à C. difficile permettrait de reduite l’incidence des infections, leur cout mais également de réduire le risque majeur de développement d’antibio-resistance grâce à une reduction notable du recours aux antibiotiques.
Procédures
Le modèle nécessite différents types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée (anesthésie locale), nasale (qui dure moins de 10 secondes par animal),ou orale, immunisation ou administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale. De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours après infection, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement, 5 prélèvements à J-3, J13, J28 et J45. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite plusieurs types d’actes expérimentaux réalisés sur animaux vigiles à savoir 3 immunisations : injections par voie parentérale (sous-cutanée) ou administration par voie muqueuse (nasale ou orale), 1 injection intrapéritonéale d’un antibiotique pour l’induction d’une dysbiose, l’administration par voie orale de C. difficile et 4 prélèvements sanguins par voie submandibulaire. Les injections entrainent une douleur légère. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poids initial est généralement observé 4 jours après l'infection. La procédure d’immunisation, d’induction de la dysbiose et la procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.
Devenir
En raison de leur infection par une bactérie pathogène, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Plusieurs tests in silico, in vitro et in vivo ont permis d'évaluer l'intérêt des antigènes vaccinaux sélectionnés. La méthode de vectorisation dans des vecteurs viraux a déjà démontré son efficacité dans d’autres modèles de vaccination. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. Les interactions entre l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de les reproduire dans leur intégralité.
Réduction
Des tests in silico et in vitro ont présélectionné les antigènes candidats selon trois critères : conservation entre souches de C. difficile, pouvoir immunogène et présence membranaire, réduisant ainsi le nombre de tests in vivo. Critère de jugement principal et calcul d'effectif Le critère principal est le score clinique , couramment utilisé dans les modèles murins d'infection à C. difficile. Une différence de 3 points entre groupe vacciné et contrôle est cliniquement pertinente. Le calcul indique 12 animaux/groupe. Procédure 1 : 144 animaux (12 groupes × 12 animaux) Procédure 2 : 288 animaux maximum (24 groupes × 12 animaux). Cette planification garantit des résultats conclusifs en une seule expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement par examen clinique incluant : Évaluation du score clinique (posture, activité, aspect du pelage, diarrhée) selon une grille définie, pesée quotidienne, état d'hydratation (test du pli cutané). Concernant la traçabilité : Toutes les observations seront consignées individuellement dans des fiches de suivi quotidiennes. Dès l'apparition de diarrhée ou perte de poids, nous procèderons à l’administration de DietGel. Une euthanasie anticipée sera réalisée en cas d’atteinte des points limites.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile. Les animaux, âgés de 4 semaines, seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine.
Evaluation des activités biologiques et de l’effet sur la santé de micro-organismes utilisés comme additifs alimentaires chez le Bar Européen – 1/2
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Pour tester des additifs alimentaires à base de protistes destinés à l'aquaculture, 6 240 bars européens juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par une bactérie, dont 2 600 par injection, ou par un virus, ce qui provoque lésions cutanées, ulcères épidermiques, atteintes nerveuses, nage anormale, léthargie et anorexie. Le porteur indique que sans intervention la mortalité peut atteindre 60 à 70 %, dans les cinq premiers jours pour les bactéries et entre sept et quinze jours pour le virus. Aucun survivant n'est conservé, et les bénéfices annoncés portent sur la productivité et la rentabilité des producteurs aquacoles ainsi que sur la place des produits français dans un marché concurrentiel.
Objectifs
En aquaculture, l'alimentation des poissons carnivores dépend toujours de la farine et de l'huile de poissons issus de la pêche de capture. Comme ces éléments se raréfient et deviennent plus chers, leur réduction dans les aliments aquacoles a donné lieu à l’intégration de protéines et de lipides végétaux, ce qui a eu pour conséquence de réduire la teneur en oméga 3 des poissons commercialisés et, de fait, contribue à diminuer les bienfaits pour la santé des consommateurs. Il est donc nécessaire de trouver des sources alternatives de ces ingrédients clés. Par ailleurs, la pisciculture est régulièrement impactée par des épidémies contre lesquelles il existe peu de vaccins et de médicaments antimicrobiens efficaces, avec en complément la problématique de résistance aux antibiotiques. La production à partir de protistes - organismes marins unicellulaires - tels que Thraustochytrium d'omégas 3 comme alternative à l'huile de poisson a suscité un intérêt croissant au cours de ces dernières années. En plus des omégas 3, ces organismes, qui peuvent se multiplier avec des sources de carbone et d'azote à faible coût (sous-produits et déchets alimentaires), ont la capacité de produire d'autres molécules à forte valeur ajoutée telles que les caroténoïdes, les phytostérols et le squalène qui peuvent avoir des effets immunostimulants ou antioxydants. Ce projet, qui se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU), a pour objectifs d'utiliser ces protistes, sous forme de fractions plus ou moins purifiées et industrialisées, comme additifs alimentaires afin d'améliorer l’élevage des poissons d’aquaculture (croissance, réduction des malformations et de la mortalité) et leur capacité de résistance aux maladies. L'espèce marine choisie, le bar commun, est la plus produite en Europe et représente un fort enjeu économique.
Bénéfices attendus
Les résultats aboutiront à la sélection des fractions les plus intéressantes permettant de réduire la dépendance de l'aquaculture à la farine et à l'huile de poisson et d'améliorer la fonctionnalité des aliments aquacoles pour optimiser la robustesse et la résistance aux maladies des animaux. Les fractions les plus pertinentes pourront faire l'objet d'un dossier Européen de demande d'autorisation comme additifs alimentaires à destination des poissons. Cela contribuera à terme à entrainer une augmentation de la productivité et de la rentabilité des producteurs aquacoles (augmentation du nombre de poissons vendus / poissons produits, réduction des traitements de type antibiotiques) et renforcera la qualité des produits français dans un marché mondial très concurrentiel.
Procédures
Des pesées et mesures de taille seront réalisées à 3 temps différents sous anesthésie pour chaque animal (EU1). La prise biométrique dure 30 secondes, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum. -Des prélèvements sanguins uniques seront réalisés sur 60 animaux par formulation alimentaire après 8 semaines de supplémentation (EU1) et sur 12 animaux / formulation et pathogène 24 à 72 heures post-infection (EU1 et 2). Une prise de sang unique sera réalisée sur les animaux survivants au terme des challenges (EU2). Ces prélèvements seront pratiqués sous anesthésie. Le prélèvement dure 30 secondes, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum. -Des injections seront réalisées pour les animaux qui subiront une infection bactérienne (n=2600, 1 seule fois par individu), d'un volume de 100 microlitres et sous anesthésie (EU1). L'injection dure 15 secondes environ, avec un temps total en incluant l'anesthésie de 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des nuisances sévères puisqu’elles induisent l’apparition de signes cliniques (changement de couleur de robe, atteintes nerveuses, lésions cutanées, rougeurs/érosions bucales, nage anormale, ulcère épidermique, léthargie, déséquilibre, anorexie ...) qui peuvent apparaitre dans les 24h post-infection pour les bactéries et après environ 7 jours pour le VER. La durée des signes observables est de quelques heures pour les bactéries et peut aller jusqu'à quelques jours pour le VER. Sans intervention, ces nuisances aboutissent à une mortalité variable en fonction des conditions (qui peut atteindre 60-70%), qui intervient généralement dans les 5 premiers jours pour les bactéries et entre 7 et 15 jours pour le VER. Les mesures biométriques et les prélèvements sanguins (1 min/poisson) seront réalisés sur animaux anesthésiés par balnéation, opérations qui peuvent induire un léger effet indésirable (stress). Le transfert d'une partie des animaux sous sédation entre les deux établissements (distance de 500 mètres, 15 min) générera également un léger stress.
Devenir
Les animaux subissant des épreuves infectieuses expérimentales, il n'est pas envisageable de conserver les survivants pour des essais ultérieurs.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer le potentiel d'organismes unicellulaires (prostistes) comme source de nutriments et de molécules fonctionnelles en remplacement de farine et d'huile de poissons dans l'alimentation aquacole. Des essais in vitro seront menés en première intention afin d'évaluer la toxicité sur lignées cellulaires mais également les capacités anti-oxydantes, anti-bactériennes et anti-virales des différentes fractions générées. Ces tests in vitro ne pourront néanmoins pas se substituer à des essais sur animaux qui seuls permettront de mesurer l'effet sur le développement et la croissance des poissons et d'approcher les mécanismes impliqués dans une potentielle amélioration de leur capacité de résistance aux maladies (stimulation de l'immunité, modification du microbiome, ...).
Réduction
Le nombre de poissons et de bassins par condition a été réduit à son minimum en intégrant les temps et nombre de prélèvements prévus, la variabilité inter-bassins fréquemment observée, les mortalités pouvant survenir sur les stades juvéniles et de façon à assurer une robustesse statistique des résultats. Pour la phase de paramètrage des infections expérimentales, un total de 240 animaux maximum seront nécessaires. Pour la phase de supplémentation, 600 poissons / fraction seront répartis dans 4 bassins. Pour les challenges infectieux, 208 poissons/fraction et par pathogène (n=2) seront utilisés, répartis dans 4 bacs (3 pour le suivi de la mortalité et 1 pour l'échantillonnage ; 1 bac témoin non infecté avec 52 poissons en complément). Pour les 7 formulations alimentaires à tester et en intégrant les contrôles et les tests de calage, cela représente un total de 6240 bars juvéniles.
Raffinement
Un enrichissement est mis en place au travers d'un bullage et d'un éclairage adapté. Le transport d'une partie des animaux entre les EU1 et 2 est réalisé sous sédation dans des seaux (eau de mer oxygénée à la température des bassins de départ). Les animaux sont positionnés à leur arrivée en bassins dans les mêmes conditions (température d'eau, oxygénation, circuit ouvert) que celles en place dans les bassins de départ. Pour les infections par bain, les animaux sont placés dans un milieu hyperoxygéné sous surveillance resserrée. Pour les infections par injection, les animaux sont préalablement anesthésiés. L'état de santé général des poissons sera évalué quotidiennement en utilisant une grille de points limites adaptés et spécifiques du projet intégrant plusieurs paramètres (nage, comportement, état physique).
Choix des espèces
Le bar commun, espèce marine carnivore d'intérêt aquacole, a été choisie car il s'agit de l'espèce ciblée par le développement des formulations alimentaires supplémentées en protistes. Nous travaillerons sur des animaux juvéniles afin de pouvoir mesurer les effets de nos formulations d'une part sur la croissance mais également sur l'amélioration potentielle de leur capacité à résister à des maladies infectieuses - sachant que les jeunes stades sont les plus fragiles.
Bases neurologiques de l’équilibre entre les comportements dirigés vers un but et les comportements habituels chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
337 rats vont être utilisés, chacun sous restriction alimentaire pendant quatre-vingts jours au maximum et soumis jusqu'à soixante-dix sessions d'apprentissage sur dix semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 241 d'entre eux passent deux heures de chirurgie sous anesthésie pour l'implantation d'un dispositif d'enregistrement neuronal, et 87 restent seuls en cage jusqu'à la fin du projet. Trois jours de suite, tous reçoivent une injection de chlorure de lithium qui provoque des crampes intestinales pendant une dizaine de secondes, pour les détourner d'un choix appris. Le projet est présenté comme une piste pour aider à terme les personnes addictes à reprendre le contrôle de leurs actions, quand la restriction alimentaire, la chirurgie et l'isolement sont immédiats et que tous les rats finissent tués pour analyse du cerveau.
Objectifs
Dans notre vie quotidienne, nous adoptons deux grands types de comportements : ceux que nous faisons de manière volontaire pour atteindre un but, et ceux que nous faisons automatiquement, par habitude. Les comportements orientés vers un but sont conscients et flexibles : on réfléchit à ce qu’on veut faire et pourquoi. Mais ils demandent du temps et de l’énergie. À l’inverse, les comportements habituels sont des actions que l’on répète jusqu’à ce qu’elles deviennent automatiques, comme se brosser les dents ou attacher sa ceinture. Ils ne demandent plus d’effort mental et nous permettent d’économiser nos ressources. Ces deux formes de comportement doivent être équilibrées pour s’adapter au mieux à notre environnement. Pourtant, cet équilibre est parfois altéré dans certaines maladies mentales, où la personne agit de manière trop automatique, même si cela devient inadapté ou nuisible. Les chercheurs ont déjà bien étudié comment un comportement devient une habitude dans le cerveau, notamment en identifiant certaines régions cérébrales impliquées dans ce processus. Mais on sait encore peu de choses sur la manière dont on peut interrompre une habitude pour revenir à un comportement plus réfléchi, surtout lorsque les circonstances changent. Une autre limite des recherches actuelles est que les études chez l’animal sont souvent menées dans des environnements très simples, où l’animal n’a qu’un seul choix possible. Cela ne reflète pas la complexité du monde réel. Pour mieux comprendre le fonctionnement de l’équilibre entre action réfléchie et habitude, il faut donc étudier les comportements dans des situations plus variées et plus proches de la vie naturelle. C’est l’objectif de ce projet : explorer comment le cerveau équilibre ces deux types de comportements, et comment il s’adapte lorsque les habitudes ne sont plus efficaces. Pour cela, nous répondrons à 3 sous-objectifs : 1. Comprendre comment les comportements orientés vers un but et les habitudes se mettent en place et s’influencent mutuellement. 2. Observer l’activité cérébrale lorsqu’un individu passe d’un comportement automatique à un comportement plus réfléchi, à l’aide d’une technique pour enregistrer un groupe de neurones. 3. Approfondir cette observation avec une autre technique qui permet d’enregistrer l’activité de neurones individuels.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment le cerveau équilibre comportements automatiques et actions réfléchies, un mécanisme essentiel dans notre vie quotidienne, mais qui peut devenir problématique dans certaines maladies comme l’addiction. En identifiant les bases cérébrales qui permettent de rompre avec des habitudes devenues inadaptées, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles stratégies pour aider les personnes à reprendre le contrôle sur leurs actions. À terme, ces recherches pourraient améliorer la prévention et le traitement des troubles liés à une perte de flexibilité comportementale, comme les addictions.
Procédures
Tous les rats seront sous alimentation restreinte pendant 80 jours maximum et seront pesés 5 fois par semaine. Tous auront accès à des récompenses plaisantes après avoir exécutés et appris des tâches simples (appui sur des leviers) dans des cages de comportement. Les sessions d'apprentissage et de détection des habitudes s'étaleront sur 10 semaines (70 session maximum). Les animaux seront soumis à 3 séances de 10 minutes en présence de la récompense suivi d'un stimulus aversif (injection d'une solution provoquant des crampes intestinales pendant quelques dizaines de secondes) à raison d'une séance par jour pendant 3 jours consécutifs. Les injections ne durent que quelques secondes. 241 rats suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée 2 heures) afin d’implanter un dispositif pour mesurer ou modifier l’activité neuronale. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, 87 rats seront hébergés seuls dans leur cage. Pour mesurer l'activité neuronale, 241 rats vigiles seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Les rats auront 20 sessions de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats recevront 3 injections d’un agent aversif pour les détourner de leur choix.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Restriction alimentaire : peut induire un léger stress. - l’injection intra-péritonéale peut engendrer une douleur au niveau du site d’injection. - Le chlorure de lithium induit des contractions abdominales transitoires pendant une dizaine de secondes. - Léger stress transitoire due à la contention de l’animal lors des injections - Chirurgies : inconfort transitoire au réveil et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience - Isolement nécessaire dès lors que l’animal est équipé avec le dispositif de mesure de l’activité cérébrale (électrodes d’enregistrement, procédure 3): stress
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau ou pour des vérifications histologiques (expression du virus, localisation de l’implant, …etc).
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier. Les connaissances acquises dans ce projet devraient permettre dans le futur d’apporter des connaissances pour développer des algorithmes permettant de modéliser le comportement. Ces algorithmes pourraient à terme constituer des outils de remplacement.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 337 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.
Raffinement
Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 5 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux récompenses qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, ainsi que les récompenses sucrées, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.
Évaluation de molécules naturelles du cerveau pour protéger les neurones et réduire l’inflammation dans un modèle de maladie neurodegenerative chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris subissent une opération d'une heure sous anesthésie générale, au cours de laquelle l'expérimentateur injecte dans leur corps calleux une substance qui détruit la myéline, avec à la clé une douleur post-opératoire de 24 à 48 heures et des difficultés motrices pouvant durer deux semaines. 318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un unique test de coordination sur échelle, quelques minutes par animal vers la fin de l'étude, doit mesurer la récupération, l'essentiel des résultats venant des analyses du cerveau après la mise à mort. Le porteur teste deux neuropeptides à trois doses et par trois voies d'administration, en les désignant comme "peptide X" et "peptide Y", sans les nommer.
Objectifs
Les pathologies neuroinflammatoires, dont la sclérose en plaques (SEP) est un exemple paradigmatique, constituent un défi thérapeutique majeur. Ces maladies sont initiées ou entretenues par une réponse immunitaire délétère au sein du système nerveux central, qui provoque des dommages chroniques tels que la destruction de la myéline (démyélinisation) et la perte neuronale. Les thérapies actuelles se concentrent sur une modulation globale de la réponse immunitaire pour freiner la progression de la maladie. Toutefois, leur efficacité reste partielle, et elles ne permettent pas de restaurer les tissus déjà endommagés, soulignant le besoin de nouvelles stratégies ciblant plus finement les mécanismes de l'inflammation locale et de la réparation tissulaire. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif principal d'évaluer le potentiel neuro-modulateur et anti-inflammatoire de deux neuropeptides, le peptide X et le peptide Y. Étant exprimés de manière endogène par les neurones du système nerveux, ces peptides pourraient agir comme des régulateurs naturels de l'homéostasie tissulaire, avec une faible probabilité de toxicité intrinsèque. Nous utiliserons un modèle murin d'inflammation focale et de démyélinisation induit par l'injection d'une substance mimant la démyélinisation dans le corps calleux. Ce modèle est particulièrement adapté car il déclenche une activation rapide des cellules immunitaires résidentes (microglie) et une infiltration de cellules immunitaires périphériques, permettant ainsi d'étudier directement l'impact d'une intervention sur le processus neuroinflammatoire et ses conséquences. L'étude visera à : 1. Déterminer la concentration la plus efficace pour chaque peptide. 2. Identifier la meilleure méthode pour administrer le traitement : soit directement au niveau de la zone lésée, soit à distance dans le liquide circulant dans le cerveau, ou encore au niveau de la moelle épinière. 3. Étudier la cinétique de réparation myélinique et de récupération fonctionnelle à différents temps post-lésion (3, 5, 7, 10 et 14 jours).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension fondamentale des mécanismes de régulation neuro-immune dans le contexte de la réparation myélinique. L'identification d'un neuropeptide endogène capable de promouvoir la remyélinisation pourrait ouvrir une nouvelle voie thérapeutique majeure pour les patients atteints de maladies neurodégénératives. Les résultats guideront les recherches futures du laboratoire, en disséquant les mécanismes d'action de ces peptides et en envisageant potentiellement des études sur des modèles précliniques plus complexes de la maladie.
Procédures
Les animaux du projet seront soumis aux interventions suivantes : Procédure chirurgicale : Une opération chirurgicale unique sera réalisée sous anesthésie générale. Sa durée sera d'environ 1 heure. Injections d'analgésiques : Plusieurs injections sous la peau pour l'administration d'antidouleurs seront effectuées pour la gestion de la douleur avant et après la chirurgie. Chaque injection dure quelques secondes. Test comportemental : Un test de coordination motrice (test de l'échelle) sera effectué une seule fois vers la fin de l'étude , pour une durée totale de quelques minutes par animal. Procédure terminale : Un prélèvement de sang réalisé sous anesthésie profonde à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut provoquer une douleur post-opératoire modérée pouvant persister 24 à 48 heures, qui sera prise en charge par des médicaments. La lésion du système nerveux peut entraîner des difficultés motrices temporaires apparaissant quelques jours après l'opération et pouvant durer jusqu'à 2 semaines. Enfin, l'anesthésie générale gazeuse et les manipulations lors des soins ou des tests peuvent générer un stress de courte durée (quelques minutes)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole. Cette étape est scientifiquement indispensable car les objectifs du projet, comme l'évaluation de la réparation de la myéline et de la neuro-inflammation, ne peuvent être mesurés que par des analyses histologiques et biochimiques. Celles-ci nécessitent obligatoirement la collecte d'échantillons de cerveau après le sacrifice des animaux.
Remplacement
L'objectif est d'étudier l'effet de neuropeptides sur la neuro-inflammation au sein d’un processus intégré de démyélinisation et remyélinisation, impliquant des interactions complexes entre les neurones, les oligodendrocytes (Les cellules productrices de myéline du cerveau), la microglie (Les cellules immunitaires résidentes du cerveau) et les cellules immunitaires périphériques dans l'architecture tridimensionnelle du système nerveux central. Cette complexité biologique ne peut être modélisée de manière satisfaisante par des approches in vitro ou in silico. Toutefois, les approches in vitro sur des lignées cellulaires restent essentielles et complémentaires pour disséquer les mécanismes moléculaires et intracellulaires spécifiques. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour évaluer les effets globaux et intégrés des peptides dans un contexte physiopathologique pertinent.
Réduction
Le nombre total d'animaux a été optimisé grâce à une approche séquentielle et une analyse de puissance. • Plan expérimental séquentiel : Le projet est divisé en deux phases. Une phase 1 de screening (avec n=7 souris/groupe) permettra d'identifier la condition la plus prometteuse parmi de nombreuses variables (2 peptides, 3 doses, 3 voies d'administration). Seule cette condition optimale sera étudiée en profondeur dans une phase 2 (étude cinétique), évitant ainsi de mener des études complètes sur des conditions sous-optimales. • Calcul d'effectif : Une analyse de puissance, basée sur des données de la littérature pour des modèles similaires, indique qu'un effectif de 7 animaux par groupe est suffisant pour détecter une taille d'effet pertinente dans la phase de screening, tandis que 10 animaux par groupe dans la phase 2 fourniront une puissance statistique robuste pour l'analyse cinétique détaillée. Le nombre d'animaux a été calculé précisément pour garantir que l'analyse des résultats au cours du temps soit fiable et scientifiquement valide • Nombre total estimé : Le projet nécessitera un maximum de 318 souris, en fonction des résultats de la phase 1. Ce nombre est calculé pour garantir la significativité statistique tout en respectant le principe de réduction.
Raffinement
De multiples mesures seront prises pour minimiser la douleur : utilisation d'analgésiques puissants avant et après la chirurgie, et application d'anesthésiques locaux au niveau de l'incision. La chirurgie sera entièrement réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Des points limites stricts ont été définis (comme une perte de poids importante ou des signes de douleur évidents) : si un animal atteint l'un de ces seuils, il sera immédiatement euthanasié pour ne pas le laisser souffrir.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix et largement validé pour l'étude de la neuro-inflammation. Son système nerveux central partage des similitudes anatomiques et physiologiques importantes avec celui de l'homme. Le modèle utilisé, qui consiste à induire une perte localisée de la gaine des neurones, est bien connu et maîtrisé chez cette espèce, ce qui permet des protocoles efficaces et des résultats interprétables pour la biologie humaine. Des souris adultes (âgées de 8 à 10 semaines) seront utilisées. Ce stade correspond à l'âge adulte chez l'homme, période où la neuro-inflammation se déclare le plus souvent, et est optimal pour observer les processus de démyélinisation et remyélinisation.
Étude des effets de la stimulation magnétique répétitive dans un modèle de démyélinisation de la moelle spinale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Sous anesthésie, une injection de détergent lèse la moelle épinière de 346 souris, 173 mâles et 173 femelles, dans une procédure de trente minutes impliquant un niveau de souffrance sévère. La paralysie des membres postérieurs qui suit les empêche d'atteindre facilement nourriture et boisson, le porteur y répondant par des croquettes mouillées et des biberons à tétine longue. La moitié d'entre elles subit ensuite dix minutes de stimulation magnétique par jour sous anesthésie, sept jours durant, pour mesurer si cette technique module la réponse inflammatoire différemment selon le sexe. Toutes sont tuées au plus tard sept jours après la lésion pour le prélèvement de la moelle, le porteur justifiant l'effectif par dix animaux par groupe sans indiquer combien de groupes sont prévus.
Objectifs
La moelle épinière conduit les informations entre le cerveau et le reste du corps : elle transmet les messages liés aux mouvements, aux sensations et au fonctionnement automatique de notre organisme. Lorsqu’elle est endommagée, à cause d’un accident ou d’une inflammation, certaines fonctions neurologiques peuvent être perdues. Les lésions traumatiques, comme celles causées par un accident, sont les plus fréquentes et entraînent une série de dommages cellulaires et une réaction inflammatoire. Les lésions inflammatoires, comme la myélite transverse, sont plus rares mais peuvent être tout aussi handicapantes. Des recherches précédentes ont montré que la stimulation magnétique répétitive, une technique non invasive utilisant des champs magnétiques, peut réduire certains effets de ces lésions en limitant la formation de cicatrices, la perte de myéline et la mort des neurones. Cette stimulation semble aussi influencer la réponse du système immunitaire, et cet effet peut varier selon le sexe. L’objectif de cette étude est donc d’examiner comment la stimulation magnétique répétitive agit sur le système immunitaire au fil du temps dans un modèle de lésion médullaire inflammatoire, en prenant en compte les différences entre mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans le cadre de maladie inflammatoire démyélinisation comme la myélite transverse et notamment de son efficacité en fonction du sexe.
Procédures
346 souris (173 males et 173 femelles) seront utilisées. Sur celles-ci sera réalisée une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 30 min. Le lendemain et ce pendant 7 jours maximum, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 173 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). L’ensemble des animaux (346 souris) sera euthanasié, 7 jours maximum après la lésion afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (346 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (7 jours maximum après la chirurgie) afin de procéder au prélévement de la moelle.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal suite à une lésion par injection de détergent et après un traitement par stimulation magnétique répétitive. De plus, le modèle d’injection ainsi que le traitement ont déjà été mis au point lors d'une étude antérieure chez la souris. De ce fait, pour notre étude, il n’existe pas de moyen de substitution.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir des études précédentes effectuées dans notre Laboratoire, à savoir que les expériences histologiques et de cytométrie nécessitent 10 animaux par groupe. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6-10 par groupe. L'utilisation de 10 animaux par groupe se justifie par la variabilité pouvant être observée.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires présents dans la moelle épinière dans le cadre d’un modèle inflammatoire démyélinisant. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettrait de pouvoir proposer des thérapies plus efficaces aux personnes souffrant de myélite transverse ou plus largement de lésions inflammatoires de la moelle épinière. Dans une étude antérieure, nous avons mis en évidence chez la souris adulte que le traitement par stimulation magnétique permettait de moduler la réponse inflammatoire dans ce modèle. De ce fait, il est important de continuer ces travaux chez la souris adulte. En effet, le modèle de lésion utilisé n’est reproductible et stable que chez l’animal adulte. De plus, les phénomènes étudiés — inflammation, démyélinisation, formation de cicatrice et récupération motrice sont représentatifs de cette tranche d'âge. Enfin, les effets du traitement par stimulation magnétique ne sont connus que chez l'animal adulte.
Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anti-cancéreux. EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes pendant quatre semaines et une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, pour tester des molécules censées protéger le cœur de la doxorubicine sans réduire son effet antitumoral. Le porteur signale une nécrose possible au point d'injection, une intolérance à l'effort et une respiration accélérée, et transporte les souris à pied entre deux établissements, en cage placée dans un sac opaque. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever le cœur, la tumeur, le foie et les reins, prélèvements qu'il qualifie d'"indispensables".
Objectifs
La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.
Procédures
Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.
Raffinement
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.
Rôle des macrophages tissulaires dans l’altération de la réparation des organes après un sepsis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Neuf mesures de pression artérielle et trois échocardiographies par animal, plus la pose sous la peau du dos d'une pompe osmotique : 5 148 souris mâles vont être utilisées, 3 822 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 326 d'un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la rate, du rein, du cœur, de la moelle osseuse et du sang. Des injections intrapéritonéales et sous-cutanées leur provoquent un sepsis, avec un état fébrile de plusieurs heures, une perte de poids et une baisse d'activité. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles étant selon lui relativement protégées du sepsis par les œstrogènes. Il affirme avoir réduit les effectifs "à son minimum" grâce à des analyses statistiques, sans donner ni calcul ni taille de groupe pour ces 5 148 souris.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le coeur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre, à court terme, un meilleur suivi de ces patients, et de dégager de nouvelles thérapeutiques à plus ou moins long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intra-péritonéales et sous-cutanées) pour générer l’état de sepsis et faire varier la réponse inflammatoire au cours des 14 premiers jours de la procédure. Ces injections sont peu douloureuses et sont réalisées en quelques minutes. Une chirurgie quelques jours plus tard permettra la pose sous cutanée d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie en début de procédure, avant la chirurgie et au moment de la mise à mort de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle non invasive sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant le début de la procédure pour habituer l’animal, puis au moment de la chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la chirurgie (9 fois 10 minutes). Pour les animaux élevés au sein de l'établissement, une biopsie de queue est réalisée dans les premiers jours de vie (10 à 15 jours) pour nous assurer de leur conformité génétique. Ces biopsies sont réalisées en moins d’une minute par un expérimentateur qualifié.
Impact sur les animaux
L’induction d’une infection septique induit un état fébrile qui perdure plusieurs heures. Un traitement antibiotique sera administré durant les premiers jours pour limiter la fièvre. La perte de poids et une diminution de l'activité sont des complications attendues, et reviennent à la normale en quelques jours. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress pour l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure. La pose de pompe sous la peau du dos est un acte chirurgical qui comporte peu de risques pour l’animal, mais peut occasionner une gêne pour celui-ci. Pour caractériser génétiquement les animaux du projet, une biopsie unique à la queue est effectuée 10 à 15 jours après la naissance. C’est un acte peu douloureux et qui ne met pas en jeu la survie de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Afin de réduire les nuisances causées par l’induction du sepsis, une antibiothérapie sera mise en place les premiers jours. La chirurgie ser fera sur animal anesthésié et analgésié.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Prélèvement de jus de rumen chez la vache et le veaux pour une utilisation en fermentation in-vitro
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Choisies dans les troupeaux de l'établissement, six vaches laitières adultes et huit veaux non sevrés sont maintenus au cornadis pour un sondage œsophagien sur animal vigile, sans anesthésie. Ces 16 bovins subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, un prélèvement unique de dix minutes au maximum, renouvelable une fois en cas d'échec technique. Le jus de rumen recueilli sert à tester in vitro des composés végétaux censés réduire les émissions de méthane des ruminants, avant d'envisager des essais sur des animaux vivants. Tous retournent ensuite à leur troupeau et aucun n'est tué, le porteur affirmant malgré tout que le recours à des animaux donneurs de contenu ruminal est "indispensable".
Objectifs
Le principal objectif de notre projet est de tester l’effet des composés naturels dérivés de plantes sur la fermentation ruminale et la production de méthane chez les ruminants, en utilisant un modèle in vitro, avant d’envisager des tests in vivo pour une évaluation à long terme. Pour réaliser les expérimentations in-vitro nous utilisons du jus de rumen de vache. Celui-ci sera prélévé par sonde œsophagienne sur 6 vaches adultes en production laitière et 8 veaux, pour être utilisés dans les fermentations in-vitro. L’objectif de la DAP est de prélever du jus de rumen afin de tester in-vitro l’effet des composés naturels dérivés de plantes sur la fermentation ruminale et la production de méthane chez les ruminants.
Bénéfices attendus
L’utilisation des analyses de la diversité microbienne dans ce projet permet de mettre en lumière un aspect essentiel de la fermentation ruminale, à savoir les interactions entre les populations microbiennes. Cette approche offre un aperçu précieux des mécanismes microbiens sous-jacents qui régissent la production de méthane dans le rumen et permet d’identifier des moyens d’optimiser les processus fermentaires pour réduire les émissions de gaz à effet de serre. L'un des avantages majeurs de cette analyse est de permettre une étude fine de la compétition pour l'hydrogène entre les archées qui l'utilisent pour produire du méthane et les autres micro-organismes qui l'utilisent pour leur développement.
Procédures
Les animaux seront soumis à un prélèvement unique de contenu ruminal par sondage œsophagien, réalisé sur des animaux vigiles, sans anesthésie ni chirurgie. Cette méthode est peu invasive, n'entraîne pas de douleur persistante et ne laisse aucune séquelle. Chaque prélèvement est effectué une seule fois par animal (6 vaches adultes et 6 veaux), sauf en cas de besoin exceptionnel (échec technique), auquel cas un second prélèvement ponctuel pourra être envisagé sur un même individu ou un animal de remplacement prévu à cet effet. La durée totale de l’intervention (mise en contention, introduction de la sonde, prélèvement et libération de l’animal) n’excèdera pas 10 minutes par animal. Aucun traitement, chirurgie ou manipulation supplémentaire n’est prévu dans le cadre de ce protocole.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce protocole, six vaches laitières adultes et huit veaux non sevrés seront sélectionnés pour un prélèvement unique de jus de rumen à l’aide d’une sonde œsophagienne. La technique de sondage œsophagien requiert la contention de l'animal et est légèrement intrusive, pouvant occasionner un inconfort léger transitoire au moment de l'introduction de la sonde (réflexe de déglutition, agitation légère). Nous pouvons nous attendre aussi à ce que le geste déclenche une réaction de stress et un comportement de défense mais de courte durée. Cette méthode, bien établie en recherche animale, permet d’accéder au contenu du rumen de manière, sans chirurgie ni anesthésie, et avec des effets indésirables minimes pour l’animal. Chaque séance de prélèvement sera de durée très limitée, ne dépassant pas 10 minutes par animal. Cette méthode est sans conséquence sur la santé ou l'intégrité physique des animaux. Aucune douleur prolongée, ni altération de l’alimentation ou du comportement post-intervention ne sont attendus. Aucun effet secondaire notable n’est attendu après le prélèvement, et un suivi attentif sera réalisé après chaque intervention pour s’assurer du bon état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie et réintégreront les troupeaux respectifs à la fin de la procédure.
Remplacement
Dans ce projet, le recours à des animaux donneurs de contenu ruminal est indispensable, car aucune alternative in vitro ou modèle synthétique ne permet actuellement de reproduire fidèlement la complexité du microbiote ruminal vivant, notamment la diversité des interactions microbiennes. Le contenu ruminal frais est nécessaire pour garantir des fermentations in vitro scientifiquement robustes et représentatives. Cette approche respecte le principe des 3R, car un prélèvement unique par animal permet de générer de nombreux tests (8 traitements prévus) sans expérimentation directe prolongée sur les animaux, limitant ainsi leur nombre et l’impact de l’étude.
Réduction
Le nombre d’animaux donneurs (6 vaches et 6 veaux parmi les 8 vaches et 8 veaux sélectionnés) a été défini pour réduire au maximum le nombre d’individus tout en respectant les recommandations méthodologiques pour ce type d’essai. Le choix de 6 animaux permet ici de limiter le nombre total d'essais in vitro, en utilisant chaque individu comme unité expérimentale. Chez les veaux en particulier, le microbiote est immature et fortement variable d’un individu à l’autre, ce qui justifie un effectif un peu plus large pour capturer une diversité inter-individuelle suffisante sans multiplier les essais. Ce dispositif permet ainsi de maximiser la robustesse scientifique tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répondent aux exigences réglementaires et vont même au-delà grâce à des équipements pemettant un enrichissement du confort des bovins (brosses, ballons suspendus, boule de foin...) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habilité à effectuer ces prélèvements assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. Les animaux seront maintenus aux cornadis pour le prélèvement dans le but de limiter les risques de blessures pour eux et pour le personnel qui prélèvera. Les animaux sont habitués aux cornadis pour leur alimentation quotidienne.
Choix des espèces
Les espèces choisies sont pertinentes car elles représentent deux stades clés du développement du microbiote ruminal. La vache adulte, avec un microbiote mature et stable, permet d’évaluer l’effet des composés sur une fermentation ruminale pleinement fonctionnelle. Le veau avant sevrage, doté d’un microbiote immature et variable, offre la possibilité d’étudier l’impact précoce des traitements sur la structuration microbienne et d’identifier des solutions à long terme. Cette double approche assure une meilleure compréhension des effets des composés naturels à différentes étapes de la vie du ruminant. Les vaches adultes en production sont utilisées pour étudier un microbiote mature, stable et représentatif d’un rumen pleinement fonctionnel, permettant d’évaluer l’effet des composés sur la fermentation et la production de méthane en conditions réelles. Les veaux avant sevrage, avec un microbiote immature et en cours d’établissement, sont inclus pour analyser l’impact précoce des traitements sur la structuration microbienne, afin d’identifier des interventions susceptibles d’influencer durablement la fermentation ruminale et les émissions de méthane à long terme.
Etude du rôle de la microglie dans les effets anxiolytiques et neurogéniques de la fluoxétine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
En cas de douleur manifeste ou de blessure persistant trois jours, les souris sont tuées par perfusion intracardiaque. 1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont privées d'abri et de matériel de nidification pendant quatre à sept semaines pour induire un stress, mises à jeun dix-huit heures, aspergées de sucrose sur le dos pour déclencher une heure de toilettage intense, puis placées seules dans une cage inconnue fortement éclairée, avec deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage et à une fausse route. Il s'agit de savoir si des récepteurs à la sérotonine portés par la microglie conditionnent les effets de la fluoxétine, un antidépresseur inefficace chez un tiers des patients pour des raisons que le porteur dit indéterminées.
Objectifs
La dépression et l’anxiété représentent les troubles psychiatriques les plus répandus à l’échelle mondiale, touchant environ 332 millions de personnes. Les traitements de première intention appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est très variable, et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore indéterminées. Les ISRS, tels que la fluoxétine, augmentent les concentrations extracellulaires de sérotonine en bloquant sa recapture. Chez la souris, un traitement chronique de fluoxétine provoque à la fois une diminution de l’anxiété et des processus de plasticité dont une augmentation de la neurogenèse adulte dans l’hippocampe. Il a par ailleurs été montré que cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et qu’elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques de la fluoxétine. La microglie, c'est-à-dire les cellules immunitaires du cerveau, joue un rôle important dans la régulation de la neuroinflammation. En situation de stress, d’infection ou de lésion, elle adopte un phénotype pro-inflammatoire qui favorise la défense immunitaire. À l’inverse, lorsque la menace est résolue ou pour maintenir l’homéostasie, elle adopte un phénotype anti-inflammatoire qui soutient la réparation tissulaire, et favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, et un nombre croissant d’études suggère que cet état pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que la fluoxétine peut réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes ou limiter les dégâts liés à la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs à la sérotonine spécifiquement exprimés par la microglie. Notre projet a pour objectif de déterminer si l’expression de ces récepteurs par la microglie est nécessaire pour permettre les effets de la fluoxétine sur l’anxiété et la neurogenèse adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.
Procédures
Dans ce projet, des animaux âgés de 4 à 6 semaines vont recevoir par gavage oral un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un récepteur dans un type cellulaire spécifique. 2 prises espacées de 48h sont nécessaires. L’acte est réalisé sur animal vigile et dure moins de 30 secondes. Les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental (absence d’abri et de matériel pour faire un nid) afin d’induire un stress basal modéré pour une durée totale de 4 à 7 semaines selon la procédure et seront répartis dans 4 lots différents. Dans le lot 1, ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson pour une durée totale de 5-7 semaines. Au cours du traitement, ils seront soumis à 2 tests comportementaux : un qui mesure l’anhédonie (un marqueur de la dépression) sur une durée d’1 heure, et un qui mesure l’anxiété pendant une durée maximum de 10 minutes, avec 7 jours d’intervalle entre les 2 tests. Dans le lot 2, ils recevront un traitement anxiolytique par une injection unique sur animal vigile (geste durant moins de 20 secondes), et seront soumis à un test mesurant l’anxiété sur une période de 10 minutes maximum. - Dans le test d’anhédonie, les animaux sont aspergés sur le dos avec une solution de sucrose, ce qui déclenche une activité intense de toilettage pendant environ une heure, et la qualité du toilettage du pelage sera mesurée à l’aide d’un score dans l’heure qui suit, ainsi que 24h après. - Dans le test d’anxiété, les animaux préalablement soumis à un jeûne alimentaire la veille (durée du jeûne : 18 heures), sont placés individuellement dans une cage inconnue et fortement illuminée. La latence pour aller manger une croquette située au centre de la cage est mesurée sur une période de 10 min. - Dans les lots 3 et 4, les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental afin d’induire un stress basal pour une durée totale de 4 semaines, pendant laquelle ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson, également pendant 4 semaines. Ils recevront soit une unique injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle et réalisées de chaque côté de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée à l’issue des 2 procédures. Ce geste dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’hébergement sans enrichissement environnemental, le jeûne alimentaire de 18h ainsi que le test comportemental associé à ce jeûne (test suppression de la prise alimentaire par la nouveauté) vont provoquer un stress modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats tels que des ANOVA pour des comparaisons multiples afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement, ou des t-test. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 1104 sur 5 ans.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 10-12 semaines et ce pendant une durée de 4 à 7 semaines selon la procédure, pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Concernant le traitement antidépresseur, nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par perfusion intracardiaque pour être utilisés dans les mises au point.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.
Formation aux gestes techniques spécifiques
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Aucune connaissance ne sort de ce projet : 600 souris sont utilisées pour entraîner du personnel aux gestes d'injection, de prélèvement sanguin et d'administration par voie orale, nasale ou trachéale. 450 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et 150 un niveau modéré, chacune tuée dès le geste appris. Les prélèvements peuvent provoquer des hématomes, les injections une douleur locale que l'animal signale en se léchant ou en se mordant, et le porteur précise que les actes se font sous anesthésie générale sans analgésie prévue. Il affirme que les rongeurs en plastique existants ne suffisent pas, puisqu'il faut un animal vivant pour un prélèvement rétro-orbital et une souris qui respire pour qu'une instillation intra-nasale soit efficace.
Objectifs
L’objectif du projet est de former les personnes aux gestes techniques des différents types d’injections, de prélèvements et d’administration de substances par différentes voies afin d’assurer le bon déroulement des protocoles expérimentaux en termes scientifique et de bien-être animal. Il s’agit d’un renouvellement de projet. La formation sera dispensée par des personnels 'tuteurs' de l’unité bien formés à ces gestes et sensibilisés au bien-être animal.
Bénéfices attendus
La maîtrise des gestes est un prérequis pour le succès des futures procédures d’expérimentation animale du laboratoire, destinées à faire progresser les connaissances pour identifier des pistes thérapeutiques en santé humaine à moyen terme. La formation permettra aussi de faire en sorte que la manipulation des animaux soit effectuée selon les bonnes pratiques en termes de bien-être animal. Il s’agit du renouvellement d’un projet. Les bénéfices obtenus du précédent projet comprennent la formation de 3 nouveaux personnels sur contrat, 1 doctorant et de 2 personnels permanents.
Procédures
Il est prévu un prélèvement de sang (maximum 5 minutes/souris) ou une administration (maximum 5 minutes/souris) sur animaux anesthésiés ou vigiles selon le cas et les bonnes pratiques vétérinaires.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent principalement les prélèvements sanguins pouvant générer des hématomes. Les injections peuvent occasionner une douleur localisée au point d’injection qui pourra être détectée si l'animal a tendance à se lécher ou se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les administrations, intra-nasale ou intratrachéales, réalisées sous anesthésie, et le gavage ne devraient causer qu’une gêne passagère. Si l’animal est en souffrance au cours de la procédure, il sera mis à mort. Il s’agit d’un projet renouvelé, sans nuisances relevées lors du précédent projet, la majorité des actes étant réalisés sous anesthésie et de gravité légère.
Devenir
Dans cette DAP ‘Formation aux gestes techniques spécifiques’ nous limitons le nombre de geste par animal, l’animal est donc mis à mort une fois la formation au geste réalisée.
Remplacement
Ce projet est à visée de formation du personnel aux bons gestes techniques expérimentaux sur la souris afin de réaliser les protocoles de recherche avec compétence. Même si des rongeurs en plastique ont été développés pour permettre certains aspects de la formation à l’expérimentation animale, leur utilisation est limitée pour apprendre la maîtrise des gestes techniques de prélèvements sanguins, d’injections ou d’administration par voie orale, intra-nasale ou intra-trachéale. En effet, l’utilisation de rongeurs en plastique n’est pas possible puisqu’il est nécessaire d’avoir un animal vivant pour réaliser un prélèvement sanguin rétro-orbital ou sub-mandibulaire, il faut que la souris respire pour que l’instillation intra-nasale soit efficace, et il faut ouvrir la bouche de la souris pour effectuer l’administration par gavage ou intra-trachéale. De plus il n’est pas possible de vérifier que le volume injecté est allé directement dans les poumons par coloration avec le bleu Evans sur un rongeur en plastique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour acquérir la maîtrise du geste. Ainsi il est estimé qu’une répétition, soit 2 fois 5 animaux par groupe, sera nécessaire. Les animaux utilisés seront issus de l’élevage ne pouvant pas être utilisés pour les projets de recherche.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être et suivis avant et pendant l’expérimentation afin d’éviter au maximum la douleur et le stress au moment de l’expérimentation. Les dommages attendus pour l’animal sont limités, les gestes se faisant sous anesthésie générale, sans analgésie prévue, et les animaux étant mis à mort juste après le geste technique ou dès l’atteinte des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris permettra l’apprentissage des gestes techniques - Les souris (consanguines ou génétiquement modifiées) âgées de 2 à 10 mois seront utilisées dans ces études. - L’établissement utilisateur où se situe notre laboratoire, utilise principalement des souris, ce qui nous donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 2 mois et 10 mois) qui correspond à l’âge des animaux étudiés dans les protocoles de recherche.