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Etude de la formation des tératomes dans les souris NSG pour l’étude de la pluripotence des lignées de cellules ES et iPSC humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.
Objectifs
Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.
Bénéfices attendus
Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).
Procédures
Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).
Impact sur les animaux
L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.
Remplacement
Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.
Réduction
Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.
Raffinement
Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.
Choix des espèces
L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.
Fonction des cellules natural killer dans un modèle murin d’exacerbation viro-induite de l’asthme allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un asthme allergique aggravé par un rhinovirus leur est induit par instillations nasales répétées sous anesthésie, avec administration d'anticorps derrière l'oeil, pour étudier le rôle des cellules natural killer. Le porteur indique que ces protocoles ne sont pas identifiés comme douloureux mais génèrent le stress de préhensions répétées et les effets de l'infection respiratoire. Il affirme que la complexité et la cinétique de cette pathologie ne peuvent être reproduites in vitro ou in silico.
Objectifs
L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, appartenant plus précisément aux groupes A et C. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre la physiopathologie des exacerbations viro-induites des asthmatiques allergiques, quel que soit leur âge et leur traitement. Les cellules natural killer (NK) participent à l’immunité innée antivirale précoce, et sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leur rôle dans les exacerbations viro-induites de l’asthme sont largement méconnus. L’objectif de notre travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation induite par un rhinovirus (RV) chez la souris, après sensibilisation allergique pulmonaire. Nous utiliserons le RV-C15, qui est associé à des symptômes plus sévères. Dans ce modèle, nous identifierons et caractériserons les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet sont de plusieurs niveaux : (1) d’ordre technique ou expérimental, avec la mise en place du modèle d’exacerbation de l’asthme expérimental induite par un rhinovirus de type RV-C15 ; (2) d’ordre fondamental, avec une meilleure compréhension du rôle des cellules NK dans la pathogénèse des exacerbations viro-induites de l’asthme. A plus long terme, ce modèle pourra servir de modèle d’étude pré-clinique pour évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme.
Procédures
- Instillations intranasales sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) : * 25µl par souris et par instillation * 6 instillations intranasale par souris, d’extraits d’acarien ou de solution saline * 1 instillation intranasale par souris, de rhinovirus vivant ou de solution contrôle - administration intraveineuse d’anticorps sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) au niveau du sinus rétro-orbital : 50µl. Une admnistration par souris, uniquement pour la procédure 3. - 1 administration intrapéritonéale par souris pour adminitration léthale de pentobarbital
Impact sur les animaux
Les protocoles d’asthme n’ont pas été identifiés comme protocoles douloureux. Cependant, ils peuvent provoquer des nuisances sur les animaux comme le stress de la préhension pour l'anesthésie volatile (6-7 fois), et celui d'une injection intra-péritonéale pour le surdosage d'anesthésique avant la mise à mort. L'infection avec le rhinovirus RV-C15 génère quant à elle un stress lors de la phéhension pour l'anesthésie volatile (1 fois), et des effets indésirables liés à l'infection respiratoire. Néanmoins, aucune douleur n'a été signalée à ce jour dans la bibliographie concernant l'infection à RV-C15. Les animaux seront donc quotidiennement surveillés afin de répertorier d'éventuels effets indésirables, comme la perte de poids.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.
Remplacement
Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées in silico. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, voire orienter nos études futures.
Réduction
Les calculs des effectifs sont basés sur notre expérience en matière de modèles d’asthme et les calculs de puissance effectués permettant des analyses statistiques correctes et la mesure de nombreux paramètres caractéristiques de l’asthme : inflammation (cellules : nombre et localisation, cytokine) et remodelage bronchique, ainsi que sur la publication ayant décrit l’utilisation du RV-C15 pour induire une exacerbation des réponses asthmatiques chez la souris BALB/c (Rajput, et al. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.649520). Ainsi, le nombre a été calculé au plus juste pour chaque protocole. Plus précisément, pour les procédures 1 et 2, nous nous sommes basés sur des résultats précédemment obtenus (composition du lavage bronchoalvéolaire en nombre d’éosinophiles chez des souris mâles et des souris femelles sensibilisées à un autre acarien ou non sensibilisées), et avons réalisé un calcul d’effectif avec le logiciel InVivoStat v4.3.0 en considérant un risque alpha de 5% et une puissance de 80%. Le calcul ainsi réalisé donne un nombre de sujets de 6 par groupe. Pour ce qui est de la procédure 3, nous nous sommes basés sur des résultats préliminaires sur le pourcentage de cellules NK localisées dans le parenchyme pulmonaire parmi les cellules NK pulmonaires. En utilisant le logiciel InVivoStat v4.3.0, avec un risque alpha égal à 5%, une puissance de 80%, et avec pour objectif de mettre en évidence une différence absolue minimale égale à 2 écart-types, nous avons obtenu un effectif de 6 animaux par groupe L’étude préliminaire permettant d’établir notre modèle chez la souris C57BL/6J sera réalisée sur 6 groupes de souris par sexe afin d’envisager toutes les combinaisons et de ne négliger aucun groupe contrôle (y compris les souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées et leurs contrôles non sensibilisés), afin de caractériser complétement le modèle. Il faut signaler que ce modèle de sensibilisation allergique est très dépendant de l’animalerie où il est effectué, car les réponses immunes mises en jeu sont modifiées par le microbiote de l’animal, lui-même dépendant de la structure d’accueil. Cependant pour les études suivantes, nous éliminerons les groupes « souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées » et leurs contrôles « non sensibilisés » afin de réduire le nombre d’animaux utilisés aux conditions infectées par RV-C15 vivant ou non vivant.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les animaux seront hébergés en cage de 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique teintés. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement d'air) sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Après anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% avec un débit d’air de 1L/min) et instillation intrasale, les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil. Après infection avec le RV-C15, les souris seront suivies quotidiennement par un personnel qualifié. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état de souffrance/douleur des animaux et de prendre les mesures adaptées le plus précocément possible.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Dans la plupart des protocoles, les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.
Étude des effets thérapeutiques associés à l’inhibition de l’activité sécrétoire des cellules sénescentes précancéreuses dans un modèle murin de cancer pancréatique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".
Objectifs
L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas
Procédures
Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.
Remplacement
Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.
Choix des espèces
Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.
Impact des pratiques de production et de transfert embryonnaire sur le bien-être des bovins
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour le renouvellement du troupeau. Chaque animal subit jusqu'à 55 prises de sang, une synchronisation des chaleurs, une production et un transfert d'embryons sous anesthésie épidurale, pour mesurer l'effet de ces techniques de reproduction sur le bien-être des génisses. Le porteur reconnaît que l'étude préliminaire avait mis en évidence le stress lié à l'isolement et à la contention imposés par ces actes. Il affirme qu'aucun système ex vivo ne permet d'évaluer ces effets et invoque une demande sociétale accrue pour le "bien-être animal".
Objectifs
Dans un contexte de demandes sociétales accrues vis-à-vis du bien-être animal (97% des Européens estiment qu’il est important de protéger le bien-être des animaux d’élevage selon l'eurobaromètre 2015 de la comission européenne), donner des éléments de réponse et des pistes d’amélioration est primordial. De ce fait, les entreprises et organismes agricoles cherchent à prendre en compte cette notion au sein de leurs activités. Les entreprises impliquées dans la reproduction et la génétique des ruminants souhaitent pouvoir étudier l’impact des technologies de la reproduction sur le bien-être des animaux en vue éventuellement de les améliorer. Très peu de publications scientifiques sont disponibles sur ce sujet. Ainsi, il a été mis en évidence que la palpation rectale et l’insémination animale entrainaient une augmentation significative de cortisol dans le sang à la suite de ces manipulations. De plus, il a été montré que la ponction folliculaire ovarienne, utilisée dans la cadre des productions d’embryon in vitro, ne semblait pas impacter le bien-être des animaux. Aucune étude n’a étudié l’impact des protocoles de collecte et de transfert d’embryons sur le bien-être des génisses. Or, ces techniques requièrent un ensemble d’actes successifs représentatif des pratiques de reproduction actuelles chez cette espèce, dont l’IA. De plus, l’évaluation du bien-être animal dans les travaux précédemment cités ne prenaient en compte que des données physiologiques ou de production alors qu’il est communément admis aujourd’hui que l’évaluation du bien-être animal doit être multicritères, prenant également en compte des données comportementales. Une expérimentation préliminaire, ayant déjà fait l'objet d'une saisine au comité d'éthique, a été menée l'année dernière sur 6 animaux permettant à la fois de préciser les effets attendus (variabilité indivdiuelle forte) mais soulignant également plusieurs points de vigilance dans les procédures et méthodes utilisées pour éviter les biais expérimentaux (nécessité d'un protocole en carré latin, standardisation de l'approche de l'animal, monitoring de la fréquence cardiaque...). Fort de cette expérience, le projet présenté ici a donc pour objectif de mesurer l’impact des protocoles de production et de transfert d’embryons sur le bien-être de 12 génisses.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de conforter les résultats préliminaires déjà acquis dans l'étude préliminaire et ainsi d’objectiver l’impact de ces technologies de la reproduction sur le BEA des génisses. Sur la base de ces résultats, il conviendra de proposer d'éventuelles voies d'amélioration.
Procédures
Afin d'évaluer l'impact des protocoles de production et de transfert d'embryons sur les génisses, 12 femelles naïves de toutes biotechnologies de la reproduction suivront: - une phase d'acclimatation à leur nouvel environnement, aux moyens de contentions utilisés et aux prises de sang (6 prises de sang) sera effectuée (2 semaines); - une synchronisation des chaleurs pour initier une phase témoin (sans technologies de la reproduction; ~4 semaines) puis une phase expérimentale (avec technologies de la reproduction; ~9 semaines) ou inversement (dispositif en carré latin). Au cours de ces phases, 49 prises de sang seront réalisées sur les animaux pour suivre les paramètres plasmatiques en lien avec l'évaluation du BEA soit au total 55 prises de sang par génisse en incluant la phase d'acclimatation. Lors de la phase expérimentale uniquement, les génisses suivront également un protocole de production d'embryon et un protocole de transfert d'embryons. En dehors du suivi des paramètres plasmatiques, le bien-être de ces génisses sera évalué de façon multicritère par le recueil non invasif de phénotypes physiologiques (monitoring de l’activité et de la rumination par des colliers activimètres, de la température ruminale par des thermobolus, de la fréquence cardiaque par des ceintures Polar) et comportementaux (vidéos individuelles et de groupe) qui ne font pas l'objet d'une procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Les technologies de la reproduction étudiées dans cette étude sont aujourd'hui largement utilisées à travers le monde et ne sont pas connues pour induire des douleurs ou un stress intenses et prolongés aux animaux. De plus, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale sera systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. Enfin, la finalité de cette étude est d'étudier les impacts plus fins sur les animaux dans le but de raffiner les technologies de la reproduction. L'étude préliminaire a mis en évidence le stress causé par l'isolement et/ou la contention des animaux nécessaire à la réalisation des actes mais également quelques tendances qu'il sera nécessaire de de confirmer sur des effectifs plus importants. De plus cette étude a permis de vérifier que les prélèvements répétés de sang ne conduisaient pas à une douleur intense et prolongée des animaux et que ceux-ci n'entrainaient pas de complications particulières. Les animaux seront suivis de façon journalière et placés sous monitoring permanent de la rumination, de l'activité ou de la température ruminale. Cette surveillance continue des animaux nous permettra de réagir rapidement en cas de dégradation de leur état de santé.
Devenir
Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Le bien-être animal est une notion complexe dont l'évaluation ne peut être que multicritères. A ce jour, aucun système ex vivo permet de mesurer l’impact de ces technologies sur le bien-être des animaux.
Réduction
Chaque animal étant son propre témoin dans cette étude, ceci permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation. Sur la base des travaux préliminaires menés et de la grande variabilité individuelle constatée, un nombre de 12 animaux semble suffisant pour mettre en évidence une différence significative (avec un risque alpha de 5% et une puissance de test de 80% minimum) à partir des tendances observées. Compte-tenu des effectifs prévus (12 animaux) et de l’appariement des données (mesures répétées sur les mêmes individus), seuls des tests non paramétriques peuvent être utilisés.
Raffinement
La finalité de cette étude est de raffiner les technologies de la reproduction. Toutefois, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale est systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. De plus, les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (10m² par animal avec un accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...).
Choix des espèces
Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, les techniques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment réalisées en élevages. Afin de produire le matériel biologique nécessaire au déroulement du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères (< 2 ans). Ce stade de développement correspond au stade de développement des animaux sur lesquels les biotechnologies de l’embryon sont pratiquées. De plus, le fait qu’elles n’aient subie aucune biotechnologie de la reproduction avant d’intégrer l’étude permet d’éviter les éventuels biais liés à la répétition des protocoles.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 978 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Un glioblastome leur est implanté dans le cerveau par stéréotaxie, avec suivi par IRM et injections répétées d'un peptide seul ou couplé à des nanocapsules de paclitaxel, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant la mise à mort. Le porteur revendique une combinaison d'études permettant de "raffiner" les doses et de réduire les lots suivants. Il affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle animal reproduisant le glioblastome avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une exérèse chirurgicale suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux publiés ont montré l’action anti-mitotique du peptide NFL-TBS.40-63 dans des cellules de GBM (rats, souris, humain). Ce peptide inhibe la prolifération et la viabilité des cellules souches et différenciées de GBM. Chez des rats porteurs d’un GBM orthotopique (F98), des injections intraveineuses répétées de ce peptide (15 mg/kg, une injection par jour pendant 5 jours) diminue de 53,5% la taille de la tumeur et améliore leur survie par rapport aux animaux non traités (résultats non publiés). Sur ce même modèle tumoral, la barrière hémato-encéphalique est lésée et permet le passage de molécules comme ce peptide (APAFIS N°2901) (résultats non publiés). De plus, adsorbé à la surface de nanocapsules lipidiques (LNCs), ce peptide augmente leur internalisation dans des cellules murines de GBM (GL261) comparativement aux LNCs seules. In vivo, une seule injection intratumorale de LNCs couplées au peptide et chargées en paclitaxel (0,8 mg/kg) diminue de manière plus efficace le volume tumoral de souris portant un GBM murin comparativement aux LNCs chargées en paclitaxel et non couplées au peptide (75% contre 60%, respectivement). Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs-paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique (formulations validées in vitro sur des cellules de GBM, notamment les cellules F98 utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherches pré-cliniques non réglementaires est d’étudier la tolérance et l’efficacité de GC01 et GC04 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM en déterminant la voie d’administration la plus adaptée (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique proche de celui observé chez l’Homme afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.
Bénéfices attendus
Une société de biotechnologies en santé travaille actuellement sur des formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs chargées en paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces nouvelles formulations ont été préalablement testées et validées in vitro sur des cellules de GBM (notamment sur les cellules F98 qui seront utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire est donc d’étudier in vivo la tolérance et l’efficacité de GC04 et de valider le maintien de l’activité de GC01 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM tout en déterminant la voie d’administration la plus adaptée pour ces traitements (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique le plus proche possible de celui observé chez l’Homme, dans le but de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.
Procédures
Dans l’étude 1, les animaux subiront deux types d’intervention, des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et un prélèvement par ponction cardiaque (1 fois puisque cette intervention sera suivie par la mise à mort des animaux). Dans l’étude 2, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront quelques heures et qui seront espacées de plusieurs semaines) et des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles). Dans l’étude 3, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique IV ou IP ou SC qui durera quelques minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale et de la veine jugulaire (5 à 7 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude 4, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 IRM de suivi qui durera quelques heures) et des injections IV ou IP ou SC (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection unique IV, qui dure quelques minutes, ou une injection intra-tumorale qui durera quelques heures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de l’étude 1 qui a pour but d’évaluer l’innocuité des traitements et de définir ainsi les doses maximales répétées tolérées (MTRD) ou les doses sans effet nocif observables (NOAEL). GC04 étant composé d’un anticancéreux (le paclitaxel), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, œdème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, pour toutes les études décrites, les animaux seront tous mis à mort par inhalation de CO2 pour prélèvements de sang et/ou d’organes afin de réaliser des études post-mortem, ou seront mis à mort suite à l’atteinte de points limites spécifiques et établis selon un tableau de score (par animal) qui permettra d’évaluer l’état général des animaux (une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points impliquera la mise à mort de l’animal avant la fin de la procédure ou de l’étude).
Remplacement
L’utilisation de GC01 et GC04 en thérapeutique étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant de passer à des essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur innocuité chez les deux sexes. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer.
Réduction
La combinaison des deux premières études (études 1 et 2) permettra de raffiner la posologie et le mode d’administration, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 3 et 4). Le nombre d’animaux mâles pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les femelles. De plus, lors de l’étude de toxicité, une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. Pour les études 1 (toxicité) et 4 (biodistribution), des comparaisons multiples (ANOVA) et des comparaisons appariées (Bonferroni’s correction) vont être effectués entre les différents groupes, notamment entre les groupes contrôles et les groupes traités. Pour l’étude 2 (efficacité), les analyses statistiques seront réalisées grâce au test Log-Rank après représentation des données sous forme de courbes type Kaplan-Meier, afin d’évaluer de potentielles différences significatives entre les différents traitements.
Raffinement
Les animaux sont reçus 2 à 4 semaines avant de débuter les expérimentations afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement et à la contention. Selon l’Arrêté du 01/02/2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques, le nombre de rats maximum par cage sera défini en fonction de leur poids (et âge) et du type de cage (surface adaptée). Par exemple, 7 rats femelles de 200-300g pourront être hébergées dans des cages de 1820 cm2. Aucune alimentation spécifique (à part nourriture et eau suffisantes), ni enrichissement particulier des cages (à part la présence d’une cabane) n’est nécessaire pour mener ces études. La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien de leur poids, de leur bien-être, d’un changement dans leur comportement, de l’apparition de signes cliniques de souffrance (posture, poils hérissés et sales, tremblements, prostration, difficultés de se déplacer, aucune réponse aux stimuli …). Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sous forme de tableau sera mis en place et annoté régulièrement pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé (apparence physique, comportement, hydratation et prise de poids). Un score de 0 à 4 sera établi pour chaque paramètre contrôlé, 0 correspondant à un paramètre normal et 4 correspondant à un paramètre anormal fortement prédictif d’une souffrance ou d’une douleur. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, pour un score inférieur à 12 points (points limites prédictifs et précoces adaptés), de la buprénorphine (0,05 mg/kg) serait administrée (en sous-cutanée) toutes les 4h en journée (3 injections maximum par jour), pendant plusieurs jours, jusqu’à ce que ces signes disparaissent. Une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points (critère d’arrêt) impliquera la mise à mort de l’animal. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.
Choix des espèces
Au début de l’expérimentation, les rats Fischer adultes seront âgés de 9-10 semaines. A leur arrivée à l’animalerie, les rats fournis seront âgés de 6-7 semaines. Pendant les 2 à 3 semaines de stabulation, les animaux s’acclimateront à leur nouvel environnement et seront manipulés par les expérimentateurs quotidiennement pour les habituer à la contention et ainsi réduire leur stress lors des études. Le choix de l’âge en début de projet a été dicté par la procédure de chirurgie (la taille de l’animal doit être suffisante pour être adaptée au cadre de stéréotaxie utilisé dans l’animalerie), mais aussi par les précédents travaux réalisés dans le laboratoire. Les animaux seront des femelles et des mâles. Il est important de vérifier l’efficacité anti-tumorale de GC01 et GC04 sur les deux sexes puisque ce traitement est destiné à la fois aux femmes et aux hommes. Ces études seront d’abord réalisées sur des rats Fisher femelles adultes, qui ont déjà été utilisées dans de précédentes études menées sur GC01. Selon les résultats (étude 1 et 2), les doses à injecter chez les rats mâles pourront être modulées pour ainsi réduire au strict minimum le nombre de lots d’animaux mâles à utiliser (réduction).
Développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par du DSS, avec gavage, test de perméabilité après huit heures de jeûne et prélèvement de sang derrière l'oeil sous anesthésie avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que le DSS peut provoquer une perte de poids, une altération des selles et la présence de sang, tout en tablant sur des effets "faibles" aux faibles doses employées. Il s'agit d'une étude pilote visant à caler le modèle avant de tester des stratégies nutritionnelles, l'espèce étant retenue faute d'accès aux biopsies humaines.
Objectifs
L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l'intégrité intestinale. L'inflammation aiguë responsable des maladies inflammatoires intestinales (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique) se distingue de l'inflammation chronique qui est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II, les maladies cardiovasculaires et la sarcopénie du sujet âgé. Le développement de l’inflammation intestinale est associé à des altérations majeures des fonctions digestives : augmentation de la perméabilité, anomalies de la couche de mucus protectrice, modifications histologiques significatives comme la profondeur des cryptes, altération de la motricité intestinale, perturbations de l'absorption des nutriments ainsi que des changements importants du microbiote intestinal. La consommation de lipides particuliers induisant des changements bénéfiques du profil et métabolisme lipidiques pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale et à l’altération de la barrière intestinale. Avant de commencer ces études testant de telles statégies nutritionneles de prévention, il est indispensable de réaliser une première étude pilote pour développer un modèle d’inflammation intestinale chronique induite par ajout de DSS (Dextran Sulfate Sodium) à l’eau de boisson chez la souris. Ce modèle est simple, rapide et reproductible cependant de nombreux facteurs peuvent affecter la susceptibilité au DSS et modifier les résultats. Il est donc nécessaire de caractériser le modèle d’inflammation en tenant compte de la source et du lot de DSS, de la souche de souris, de la dose et de la durée du traitement. Une dose excessive de DSS ou administrée pendant une durée trop longue induirait une réponse inflammatoire aigüe, plus typique de la rectocolite hémorragique ou de la maladie de Crohn. L’objectif est d’induire une inflammation chronique avec des doses inférieures à celles classiquement utilisées pour induire une colite chez la souris. D’après la littérature, la dose 0 ,5% - 1,0% DSS pendant sept à dix jours pourrait induire une inflammation suffisante pour mimer l’inflammation intestinale chronique induite lors d’un régime riche en gras et en sucres. Cependant, l’impact relatif de ces doses et durées sur des paramètres importants scientifiquement comme la perméabilité intestinale et la production de cytokines plasmatiques reste mal décrit.
Bénéfices attendus
L’intestin joue plusieurs fonctions essentielles à l’intégrité de l’organisme et au maintien d’une santé optimale. L’inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l’intégrité intestinale comme dans la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique ou les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Le taux de MICI dans le monde est passé d’environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit par le DSS chez la souris permettra d’étudier ultérieurement différentes stratégies nutritionnelles pour limiter cette inflammation soit de façon préventive soit de façon corrective.
Procédures
Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test de perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection sous-cutanée de solution saline pour favoriser la production d’urine et seront gavées oralement avec une solution de lactulose, mannitol, sucralose puis placées individuellement dans une cage vide. L'urine sera collectée directement dans la cage à l’aide d’une pipette tout au long des 4h suivant le gavage. A la fin du test, les souris seront regroupées dans les cages comme précédemment. La durée totale de l’intervention (jeûne compris) sera de 8h. Le dernier jour de l’étude, toutes les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’œil par une goutte de tétracaïne 1min avant anesthésie générale par inhalation isoflurane 3% suivie d’un prélèvement de sang en rétroorbital (500µl) avant leur mise à mort par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation par le traitement au DSS peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Au regard des faibles doses de DSS utilisées, inférieures ou égales à 1%, les effets devraient être faibles et limités aux derniers jours du protocole.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, nous devons collecter du sang pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Nous devons aussi prélever les organes inflammés comme le côlon, l'intestin grêle pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. On ne peut donc pas obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.
Remplacement
Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et les données obtenues de ces études transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit au DSS chez la souris devrait permettre d’accroitre nos connaissances sur l’inflammation et de mettre en place par la suite des stratégies nutritionnelles pour la diminuer ou la prévenir.
Réduction
Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale et des altérations dues au DSS que les souris femelles. L’étude pilote se fera uniquement sur des souris mâles afin de maximiser les chances d’observer une inflammation modérée. Des calculs de puissance avec Rstudio ont été réalisé avec l’objectif de réduire la quantité d’animaux. La puissance a été défini à 0,8, le niveau de significativité à 0,05 et la taille de l’effet à 0,6 (un effet important au niveau du traitement au DSS est attendu). La Après avoir défini le nombre de groupes étudiés, Rstudio détermine le nombre nécessaire de souris par groupe pour avoir des résultats significativement élevés. Pour cette étude pilote avec le traitement au DSS, 7 souris par groupe sont requises selon les calculs d’analyse de puissance (5 groupes, 7 souris par groupe = un total de 35 souris).
Raffinement
Les souris seront mises en cage par groupes de 3 ou 4 afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Pendant toute la durée des traitements, les animaux auront un accès à volonté à l’eau et à la nourriture sauf lors du test de perméabilité intestinale. Pour le prélèvement de sang en rétroorbital, les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’oeil suivie d’une anesthésie générale. Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne pour déceler un potentiel mal-être. L’aspect du pelage, le comportement, la perte de poids comparé au poids initial, la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles seront évalués et récoltés sur une feuille d’observation. Les différents gestes expérimentaux réalisés dans ce projet n’ont jamais démontré de souffrance, d’angoisse ou de douleur chez la souris nécessitant une prise en charge spécifique. Au cours du test de perméabilité intestinale, les gavages peuvent irriter l’oesophage des animaux. Pour minimiser cet effet potentiel, une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté qui vérifiera l’état de la canule et le comportement de l’animal.
Choix des espèces
Les travaux effectués dans ce domaine (dans la communauté scientifique en générale mais également au sein du laboratoire) sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les etudes sur l’inflammation induite au DSS, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J et BALB /c. Cependant, les souris BALB /c sont plus résistantes au DSS que les souris C57BL/6J, donc l’utilisation de souris BALB /c nécessiterait d’utiliser des doses plus fortes de DSS et/ou sur des temps plus longs. Ainsi, la souris C57BL/6J est le modèle le plus pertinent pour ce projet. De plus, elle est reconnue comme souche de référence pour les études métaboliques. Les souris seront commandées à 10 semaines de vie et le protocole débutera à 11 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux. Suite à cette étude pilote, les effets préventifs d’un traitement de 4 semaines avec des lipides polaires sur l’inflammation intestinale seront étudiés sur des souris agées de 6 semaines. C’est pourquoi, nous réalisons l’étude pilote avec des souris agées de 10 semaines.
Intérêt de la supplémentation orale en « molécule M » pendant la grossesse et la période de lactation lors d’un déséquilibre alimentaire maternel induit par la consommation d’une alimentation grasse hypercalorique: étude pré-clinique chez la souris
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 282 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères sont soumises à une alimentation grasse hypercalorique pendant la gestation et la lactation, puis mères et descendance subissent des gavages, des prélèvements sanguins répétés et des tests de tolérance au glucose sur animal vigile, pour étudier l'effet d'une supplémentation en une vitamine. La plupart sont tuées pour prélèvements, seules 80 souris adultes du groupe témoin pouvant être conservées pour l'élevage selon les besoins de l'unité. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes de substitution" pour étudier ces paramètres métaboliques et conclut à un usage "indispensable" de la souris.
Objectifs
Rechercher par quels mécanismes biologiques la supplémentation orale en molécule M chez la mère pendant la grossesse et la lactation améliore la santé métabolique de la descendance.
Bénéfices attendus
Identification du mode d’action de la molécule M lors de la supplémentation orale pendant la gestation et la lactation, en vue de la mise en place d'un protocole de supplémentation systématique chez la femme enceinte et réduire ainsi les facteurs de risque d'obésité chez l'enfant.
Procédures
Ce projet nécessite l’exploration fonctionnelle du contrôle glycémique chez la souris. Les animaux seront ainsi soumis à des tests de performance métabolique, comparables à ceux utilisés chez l’Homme, permettant d’apprécier le rôle physiologique de l’insuline et de détecter des états pré-diabétiques et diabétiques, caractérisés par une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline, voir une hyperglycémie à jeun. Ces tests nécessitent des administrations pharmacologiques et des prélèvements sanguins. Les animaux recevront une charge soit de glucose (2g/kg) soit d’insuline (0,75u/kg) par voie intrapéritonéale et un relevé des excursions glycémiques sera réalisé après administration. Pour cela, des prélèvements sanguins (10 microlitres) seront réalisés afin de mesurer la glycémie et l’insulinémie des animaux. En pratique, 7 prélèvements seront réalisés sur une durée de 135 minutes. Comme chez l’Homme, ces tests de performance métabolique sont réalisés impérativement sur sujet vigile car les anesthésiques sont hyperglycémiants et sont incompatibles avec les paramètres physiologiques mesurés. Les procédures de ces tests sont parfaitement maitrisées et le mode opératoire est parfaitement cadré et partagé par la communauté scientifique.
Impact sur les animaux
Le modèle expérimental de mise sous régime HFD maternel pendant la gestation et la lactation provoque un stress métabolique qui se traduit par une adiposité supérieure voir une intolérance au glucose (cette dernière est recherchée dans ce projet). Il n'y a pas de dystocie, et la taille des portées et le sex-ratio à la naissance est conservé dans ce modèle. D'autre part la consommation en molécule M exogène n’a pas d’effet indésirable connu. La supplémentation orale en molécule M, qui est une vitamine, vise au contraire à contrer une carence induite expérimentalement par une alimentation maternelle appauvrie (modèle conventionnel HFD semi-synthétique). La supplémentation orale en molécule M dans ce contexte a donc un effet bénéfique attendu. Les tests de tolérance au glucose pourront provoquer soit une hypoglycémie (injection d'insuline) ou une hyperglycémie (injection de glucose). Enfin les tests de prélevements sanguins au bout de la queue sont succeptibles de générer un inconfort.
Devenir
Tous les animaux soumis au régime hypercalorique et/ou à la molécule M sont soit mis à mort au cours de la procédure (pour prélèvements post-mortem) ou en fin de procédure (par inhalation de CO2) car ils ne peuvent être conservés pour d'autres études de l'unité, du fait de cette programmation nutritionnelle obésogène. En revanche les 80 souris adulte (mâles et femelles) soumis au régime standard et qui participent au projet uniquement pour produire une descendance F1 controle (qui sera quant à elle étudiée), seront soit mises à mort (par inhalation de CO2) soit éventuellement conservées à des fins d'élevage, en fonction des besoin de l'équipe ou de l'unité. Le choix sera donc fait par la responsable de l'animalerie.
Remplacement
Les animaux de laboratoire nous permettent de modéliser l’obésité nutritionnelle et ses complications. Leur utilisation est indispensable pour décrire les processus qui se déroulent pendant l’installation de cette maladie, souvent asymptomatique dans sa phase précoce, et qui ne sont pas encore totalement élucidés à ce jour. Il n’existe pas de méthodes de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques complexes recherchés dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc). Ces paramètres mettent en jeu des arc-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre les organes qui ne peuvent être modélisés complètement. De plus, ces paramètres sont l’expression d’une perception et intégration cérébrale de signaux nutritionnels et métaboliques qui ne peut être étudiée que dans un organisme vivant.
Réduction
Les procédures décrites dans ce projet, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées lors d'une précédente étude. L’optimisation des procédures réduisent la variabilité interindividuelle et évitent des études pilotes supplémentaires, ce qui finalement réduit les effectifs nécessaires au projet. Cela permet également de déterminer le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour mener à bien les analyses statistiques et donc là encore d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Le personnel a été formé et maitrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les aliments et l’eau de boisson sont fournis ad libitum. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins vétérinaires peuvent être donnés au besoin selon l’avis d’un vétérinaire. Les conditions d’hébergements sont enrichies (maison et matériaux de nidation) et apportent des conditions optimales permettant l’expression de comportements innés (vie sociale, gestation, enfouissement, nidation, protection, lactation).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Sa taille est compatible avec la dissection de tissus et organes d’intérêt permettant des analyses biochimiques, cellulaires, moléculaires, et histologiques. Cet animal permet d’obtenir des analyses pertinentes du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels explorant les performances métaboliques est aussi possible chez cet animal, comme la recherche de la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline, du fait de nombreuses similarités qui existent avec le métabolisme de l’espèce humaine. Les stades de développement étudiés sont les suivants : Stade postnatal P5, P8, P12 (descendance) : ce stade permet d’étudier le rôle neurotrophique de l’insuline (cf procédure 3) Stade postnatal P2 (descendance) : ce stade permet d’étudier le développement sensoriel des animaux (cf procédure 4) Stade postnatal P17 (descendance) : ce stade permet d’étudier la maturation du système neuronal à mélanocortine (cf procédure 5) Stade postnatal P60 (descendance) : ce stade permet d’étudier le contrôle glycémique des animaux (cf procédure 6) Stade adulte (mère) : ce stade permet de caractériser le modèle expérimental et d’évaluer le contrôle glycémique (cf procédure 2)
Effets de type antidépresseurs des nouveaux produits de synthèse de la ketamine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de dérivés de la kétamine puis passent une série de tests comportementaux, dont le test de la nage forcée, le labyrinthe en croix surélevé, l'open field et le splash test, pour évaluer un possible effet antidépresseur. Le porteur retient la souche Balb/C pour son "phénotype naturellement anxieux", ce qui lui évite d'infliger un stress supplémentaire. Il affirme que les réponses comportementales et la pharmacodynamie de ces molécules ne sont "pas modélisables" sans animaux.
Objectifs
Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs des dérivés de la kétamine (NPS) sur des souris Balb/C de phénotype anxieux. Ces effets seront étudiés d'un point de vue pharmacocinétique et comportemental.
Bénéfices attendus
Le potentiel thérapeutique des dérivés de la kétamine (appelé nouveaux produits de synthèse, NPS) n'a jamais été étudié. Cette étude pharmacologique et comportementale permettra d'identifier un potentiel candidat médicament ayant une activité pharmacologique "antidépresseur".
Procédures
Etude pharmacocinétique : 1 prélèvement sanguin/animal : 2 min (n=200); Comportement: 5 à 10 minutes (n=180) : 1-Test de la nage forcée : Les souris sont placées dans des bocaux de 10 cm de diamètre et de 30 cm de profondeur remplis d’eau tiède (25°C). Ce test de 6 minutes, mesure le temps de nage ainsi que le temps d’immobilité (n=45) 2- Test du labyrinthe en croix surélevé : Ce labyrinthe est composé de 2 bras ouverts et de 2 bras fermés reliés par une plateforme centrale, à 50 cm au-dessus du sol et éclairée par une lampe de faible puissance. Les souris peuvent explorer librement l’ensemble du labyrinthe pendant 5 minutes. Une caméra permet l’enregistrement des déplacements. Un phénotype anxieux se caractérise par une diminution du temps passé dans les bras ouverts par rapport au temps passé dans les bras fermés (n=45). 3- Test de l'openfield : L’animal est placé dans une enceinte étrangère en plexiglas à 2 dimensions (43x43 cm). Les souris peuvent explorer librement l’ensemble de l'enceinte pendant 10 minutes. Des cellules photoélectriques infrarouges permettent l’enregistrement automatique des déplacement de l'animal. Ce test est caractéristique d’un phénotype de type anxieux en évaluant le temps passé et le nombre d’entrées dans le centre de l’enceinte (n=45). 4- Splash test : Les souris sont aspergées avec un spray par environ 500 microlitres d’une solution de sucrose à 10%. La latence et fréquence de toilettage est alors mesurée pendant 5 minutes(n=45).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations I.P seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour le test de la nage forcée les animaux ne subiront pas ce test jusqu'à épuisement car limité à une durée de 6 minutes.
Devenir
Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure pour analyses tissulaires et biochimiques des prélèvements.
Remplacement
L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. De façon similaire, les analyses de pharmacodynamique des traitements après administration i.p. ne sont pas modélisables non plus.
Réduction
Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de pharmacologie a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 30% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 10 animaux par groupe. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance (ANOVA) entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p
Raffinement
Le choix de la souche de souris Balb/C constitue un raffinement du protocole dans la mesure où il n'est pas nécessaire d'induire un stress à ces animaux pour évaluer l'activité antidépressive des différents traitements. Par ailleurs, l'évaluation pharmacocinétique effectuée avant la partie comportementale permet de déterminer parvance la dose intéressante de NPS à laquelle l'effet de type anxiodépressif.
Choix des espèces
L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche Balb/C de par son phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.
Effet des anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et anti-RAMP3 dirigés contre les récepteurs de l’adrénomédulline sur la croissance tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des tumeurs humaines leur sont greffées (glioblastome, prostate, rein, poumon) puis traitées par des anticorps monoclonaux, la charge tumorale pouvant atteindre 1 500 mm³ et provoquer nécroses et métastases entraînant la mise à mort. Le porteur revendique un dispositif "ON/OFF" arrêtant les étapes suivantes en cas d'échec, censé réduire les effectifs. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" pour prendre en compte le microenvironnement tumoral que le in vitro ne reproduit pas.
Objectifs
La croissance des tumeurs malignes nécessite un débit sanguin adapté, fourni par des vaisseaux néoformés, permettant l’apport d’éléments nutritifs et d’oxygène nécessaires à cette croissance pathologique. Ce phénomène est le résultat d’actions coordonnées entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement de la tumeur. Parmi les facteurs potentiels, une protéine fortement impliquée notamment dans le phénomène de vascularisation intra-tumorale a été mise en évidence : l’Adrénomédulline (AM). L’implication de l’AM dans le processus tumoral a fait l’objet de nombreux articles de recherche scientifique publiés dans des journaux internationaux. Son rôle a également été valorisé par plusieurs publications sur différents modèles tumoraux in vitro mais également in vivo. L’utilisation d’anticorps polyclonaux anti-système de l'AM, provoque une diminution de la croissance tumorale in vivo sur des modèles de xénogreffes tumorales. Cependant les anticorps polyclonaux ne peuvent être utilisés en thérapie humaine. Ainsi dans cette optique, des anticorps monoclonaux ont été développés. Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité des différents anticorps monoclonaux produits sur différents modèles tumoraux et de les valider comme potentiel outil thérapeutique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de démontrer que les anticorps monoclonaux bloquants anti-récepteurs de l’AM dirigés contre la région extracellulaire peuvent déstabiliser la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires endothéliales et promouvoir une régression tumorale faisant de ces anticorps un outil thérapeutique visant à améliorer le traitement des cancers et permettant de répondre à l’échappement de certains patients aux thérapeutiques actuellement utilisées.
Procédures
3 procédures expérimentales vont être menées: 1/Test d’angiogenèse sur souris C57BL6. Nous aurons différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP2 validés comme efficaces in vitro ; de même 5 groupes pour les 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP3 validés in vitro. Pour chaque groupe, 10 souris seront nécessaires. Nous aurons donc besoin pour une expérimentation de 12 groupesx10 souris soit 120 souris. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons donc besoin de 240 souris C57BL6. Les souris seront mises à mort au 21ème jours. 2/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Suite à l’angiogenèse in vivo, seuls les 3 meilleurs anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et les 3 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés. Il y aura toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif traité avec l'anticorps polyclonal. Pour les modèles du cancer de la prostate, du rein et du poumon, on a 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris par modèle soit pour 3 modèles = 240 souris. Pour le modèle du glioblastome (prise tumorale 100%), on a 8 groupes x 7 souris = 56 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un maximum de 592 souris athymiques. Le temps de traitement sera dépendant de la vitesse de croissance tumorale et du suivi clinique des animaux. 3/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Pour les anticorps monoclonaux, suite aux expériences hétérotopiques, seuls les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP2 et les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés, nous aurons toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif. Pour chaque modèle, on a donc 6 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 60 souris, soit pour l’ensemble des modèles 4x60 = 240 souris. Cette expérience sera dupliquée pour montrer sa reproductibilité ce qui montera le besoin en souris à 480. Le temps de traitement sera dépendant de la perte de poids de l'animal et du suivi clinique, sans modification le temps maximum de traitement sera de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostation, déshydratation, abcès, hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20 % de son poids et la charge tumorale ne devra pas excéder 10% du poids de l'animal ou un volume de 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (2 fois/semaine mais tous les jours si la perte de poids est supérieure ou égale à 10%) et par mesure de la masse tumorale avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique (3 fois/semaine). Si un des critères pré-établis selon la grille d'évaluation de la souffrance ou de détresse mise en place, il sera mis à mort immédiatement. Des phénomène de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître, les animaux seront alors immédiatement mis à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale et du microenvironnement en fonction des traitements appliqués.
Remplacement
Le processus de développement d'une substance originale comme médicament exige, après l'étude in vitro sur des cellules en culture, de valider son utilisation in vivo. En effet préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leur efficacité sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo ainsi parmi les 24 anticorps, seuls les 5 anticorps anti-RAMP2 et les 5 anticorps anti-RAMP3 les plus efficaces ont été retenus pour passer à l'étape in vivo. Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée car elle est indispensable pour prendre en compte le microenvironnement tumoral sachant de nombreuses études publiées au niveau internationnal montre que ce compartiment est un partenaire très actif avec la cellule maligne influançant le processus tumoral, celui-ci n'étant pas pris en compte in vitro. Il est également nécessaire de déterminer s'il existe des effets physiologiques de ces anticorps. Les retours d'expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l'étude clinique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de souris de 1312 cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre d'anticorps à tester. Préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leurs efficacités sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo à 5 anticorps et par conséquent le nombre de lots d'animaux à utiliser. Ainsi une première étude d'angiogénèse sera réalisée avec 5 anticorps anti-RAMP2 et 5 anticorps anti-RAMP3. Si l'expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l'étude sur xénogreffes hétérotopique (étape 2) sera lancée mais avec un maximum de 3 anticorps anti-RAMP2 et 3 anti-RAMP3 à tester. Pour l'étape 3 s'agissant de l'étude sur xénogreffes orthotopiques, seuls les modèles tumoraux positifs à l'étape 2 et un maximum de 2 anticorps ant-RAMP2 et 2 anti-RAMP3 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l'étape 2, l'étude sera arrêtée après les modèles hétérotopiques. Ce nombre de 1312 souris correspond aussi à un nombre de souris n=10 par groupe d'expérimentation sauf pour le modèle hétérotopique du glioblastome où n=7. Ce nombre de 10 souris (ou 7) par groupe d'expérimentation nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable au niveau de la réponse au traitement et de faire face aux problèmes de prises tumorales. Pour analyser les résultats obtenus nous utilisons le test de variance ou de Fischer PLSD, Statview 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées dans des cages de tailles adéquates. Un enrichissement du milieu par igloo teintés en polycarbonate qui réduit le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales sera utilisé. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement) d'air sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquées. Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction du suivi clinique des souris. Au moment de l'injection du Matrigel ou des cellules tumorales, une anesthésie gazeuse sera réalisée. Dans le cas du modèle orthotopique, une anesthésie fixe sera utilisée. Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par application d'une analgésie adaptée. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux et la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique. Si un des critères pré-établis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Pour les tests d’angiogénèse in vivo, nous utiliserons des souris C57BL6, modèle général polyvalent. L’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel, cellules pro-angiogéniques et cellules du système immunitaire. Certes il y a un risque d’immunisation active des souris contre l’anticorps injecté cependant le temps de traitement de maximum 15-20 jours va permettre de limiter au maximum ce biais potentiel. Ce modèle a été validé et publiés dans de nombreux articles internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, la souris athymique nude, laquelle a un système immunitaire déficient, a été choisi afin de pouvoir implanter des cellules cancéreuses (lignées cellulaires humaines établies) permettant la formation de tumeur. Les souris seront âgées de 7-8 semaines afin d'avoir un poids adulte stable. Pour les souris C57BL6, cet âge est également adapté à l’immunocompétence attendue dans le modèle d'étude de l'angiogénèse in vivo.
Etude du rôle du récepteur P2X7 dans un modèle d’uvéite
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une uvéite auto-immune leur est induite par injection d'une toxine et transfert de cellules immunitaires, avec un suivi par imagerie de la rétine sous anesthésie, pour évaluer le récepteur P2X7 comme cible thérapeutique. Le porteur décrit une maladie qui n'entraînerait pas de douleur perceptible, tout en prévoyant la surveillance de signes tels que prostration, abattement ou perte de poids. Il justifie l'effectif élevé par la "grande variabilité" du développement de la pathologie entre souris et affirme que les études in vitro ne permettent pas d'étudier les signes cliniques.
Objectifs
Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ce récepteur de manière constitutive ou de manière induite sur certains types cellulaires spécifiquement ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ce récepteur afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de cette cible pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées.
Procédures
Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse. Les animaux sont anesthésiés au cours de ces explorations également pour le maintien de l’animal immobile.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.
Réduction
Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 900 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isoflurane. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatouage. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement d’un bout de leur queue.
HTAM IL1: Etude du rôle de l’inflammasome dans l’hypertension artérielle maligne chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe sous-cutanée et des séjours en cage métabolique, pour reproduire une hypertension artérielle maligne pouvant atteindre le coeur, les reins et la rétine. Le porteur indique que tous les organes seront prélevés après mise à mort pour analyser les atteintes microvasculaires. Il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la maladie et retient la souris comme "modèle classique de mammifère".
Objectifs
L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.
Bénéfices attendus
Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.