Recherche fondamentale

Privées d'un récepteur plaquettaire, du fibrinogène ou de la fibrine, ou porteuses de récepteurs humains, les souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, dont certaines seront créées pour l'étude. 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le volet EU1 d'un projet partagé entre deux établissements. Anesthésiées, elles reçoivent des injections ou des perfusions de trente minutes et subissent une chirurgie de deux heures au plus qui provoque un AVC, puis sont transportées vers le laboratoire de l'IRM. Pendant 72 heures, elles peuvent présenter une activité réduite, voire une prostration. Toutes sont tuées après une laparotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour l'analyse histologique de l'AVC.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

Des souris subissent une chirurgie de deux heures au plus, avec craniotomie, pour provoquer un AVC ischémique, puis une IRM sous anesthésie à 24 ou 72 heures et une laparotomie avec perfusion intracardiaque. 456 souris, dont des lignées génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le porteur jugeant l'AVC "pas compatible avec un maintien en vie de la souris". Pendant les 72 heures qui suivent l'opération, elles peuvent présenter une prostration, des paupières fermées et des mouvements de rotation, pour une étude du rôle de deux récepteurs plaquettaires dans la reperméabilisation des artères. Ce résumé porte la mention EU2/2, un résumé jumeau au même texte existe pour l'autre établissement (NTS-FR-411894), et chacun déclare 456 souris sans dire s'il s'agit des mêmes.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

60 souris subissent chacune deux implantations de cellules tumorales, l'une sous la peau, l'autre directement dans la prostate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les effets attendus courent sur les trente jours de la procédure, perte de poids, perte d'appétit, douleurs prolongées au site de greffe, et pour l'implantation intra-prostatique des saignements, des difficultés urinaires et une gêne des mouvements. Les tumeurs sous-cutanées sont mesurées deux fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, pour prélever les tumeurs, les organes lymphoïdes et le foie.

Objectifs

Le taux de cholestérol peut modifier la prolifération et l’activation des cellules immunitaires. La concentration du cholestérol dans les cellules est contrôlée par des récepteurs spécifiques, les récepteurs nucléaires LXRs (Liver X Receptors). Le rôle de ces LXRs dans la composante immunitaire de la prostate tumorale n’est pas clairement établi. Il existe deux récepteurs LXRs, alpha et beta codés par des gènes différents. Au niveau des cellules immunitaires, les deux types de récepteurs semblent avoir des rôles distincts et spécifiques de certains sous-types cellulaires. Ce projet consiste à définir si les deux types de récepteurs ont des conséquences différentes sur la nature et la fonction de l’infiltrat immunitaire des tumeurs prostatiques. Les études seront conduites sur des tumeurs greffées sur des souris avec des cellules immunitaires dont le gène codant pour chacun des récepteurs LXRs est non fonctionnel. Le but de ces travaux sera de définir l’impact de l’absence des récepteurs LXRs dans l’infiltrat immunitaire tumoral prostatique.

Bénéfices attendus

Plusieurs études montrent que les LXRs peuvent moduler le paysage immunitaire de différentes tumeurs avec des rôles différentiels pour les deux isoformes de LXRs . L’objectif de ce travail est de définir les différences d’implication des deux LXRs sur la croissance tumorale et sur la réponse immune antitumorale dans un modèle pré-clinique de cancer de la prostate. L’utilisation d’un modèle syngénique (cellules greffées et hôte de la même espèce) est pertinent pour s’approcher au mieux d’une réponse immunitaire réelle et complète, à l’inverse de l’utilisation de modèles xénogreffés sur souris immunodéprimées. A court terme ce projet donnera des arguments pour poursuivre l’investigation entre les LXRs et la réponse immune chez la souris, notamment pour établir des modèles transgéniques dans lesquels on manipulera de façon génétique l’expression des LXRs dans certaines cellules immunitaires. L’élucidation des rôles précis des LXRs dans ces sous-types immunitaires et la possibilité d’utiliser des modulateurs de leur activité permettrait le développement de thérapies adjuvantes pour accroître l’efficacité de l’immunothérapie du cancer de la prostate.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions :1) implantation sous-cutanée de cellules tumorales de souris réalisé 1 seule fois durée de la procédure maximum 10 secondes 2) une implantation intra-prostatiques des cellules tumorales de souris réalisé une seule fois, durée de la procédure maximum 10 minutes. Toutes les souris seront observées deux fois par semaine selon une grille de score permettant d'évaluer leur comportement et les tumeurs sous-cutanées mesurées deux fois par semaine sous anesthèsie gazeuse (environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Le projet proposé est susceptible d’induire des nuisances, telles qu’une perte de poids, un stress, une perte d’appétit et des douleurs successives au geste chirurgical et à la prise tumorale. En particulier , l’implantation de tumeur en sous-cutanée peut induire des grosseurs susceptibles de gêner les mouvements normaux de l’animal. Il peut induire des douleurs de longue durée ou gonflements au niveau du site de greffe. Une infection/inflammation locale au site d’injection, ainsi que l’apparition d’hématomes font également partie des effets indésirables possibles (sévérité modérée). Des effets systémiques peuvent être attendus : perte de poids, faiblesse musculaire, altération du comportement (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. L’implantation de tumeur en orthotopique (intra-prostatique) est une procédure pouvant également induire des effets néfastes, tels qu’une inflammation locale et des douleurs moyennes, de moyenne durée. L’insertion de cellules tumorales dans la prostate (organe richement vascularisé) peut entraîner des saignements locaux de courte durée. Malgré un geste maitrisé, la lésion des structure et tissus environnants est possible, entrainant des difficultés urinaires. La prise tumorale et le développement d’une masse pelvienne peuvent également entrainer des douleurs, et des difficultés urinaires et de motilité de l’animal (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. Des effets indésirables consécutifs à l’anesthésie sont possibles : détresse respiratoire, hypotension, bradycardie, hypothermie. Ces effets indésirables sont immédiats et seront pris en charge dans les minutes post-observation. Les données de la bibliographie n’indiquent pas de potentiel métastatique de cette lignée cellulaire, les effets indésirables liés aux métastases ne sont donc pas attendus.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale apres une anesthesie à l'isoflurane pour les prélèvements de tumeurs, organes lymphoïdes et foie pour analyses.

Remplacement

Ces études sont précédées par des études in vitro de cocultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires (cellules tumorales de souris ou autres cellules de cancer de la prostate) et de cellules immunitaires. Nous évaluons notamment l’effet de l’activité ou de l’inactivation des LXRs sur les mécanismes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (activation, capacités phagocytaires et migration), permettant de limiter le recours à l’expérimentation animale. Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques (mêmes espèces entre tumeur greffée et animal receveur) permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs au sein d’un système complet. .

Réduction

Une étude pilote, permettant d’ajuster la dose/le modèle de souris à utiliser dans l’étude principale, effectuée sur un petit lot d’animaux, permettra de limiter le nombre d’animaux inclus dans l’étude. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé et minimisé tout en maintenant la puissance statistique de l’étude. Le prélèvement de plusieurs organes par animal à la fin des expérimenations permet également d’optimiser ce nombre utilisé. Des données préliminaires obtenues par l’équipe in vitro/sur d’autres études ont également été utilisées dans la mise en place du design expérimental, afin d’affiner les hypothèses de recherche et d’éviter l’utilisation trop importante d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 4 souris avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’ensemble des enrichissements est adapté aux éventuels changements de corpulence du rongeur induits par la prise tumorale (grosseurs/gènes locomotrices). Les animaux bénéficieront d’un suivi pré, per et post-opératoire renforcé, qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal être (feuille de score pour chaque animal). Une observation quotidienne est réalisée par les zootechniciens et un suivi bihebdomadaire par les participantes au projet. Une intervention par des traitements analgésiques et anti-inflammatoires est prévue le cas échéant.

Choix des espèces

La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous utiliserons des individus post-puberts de 2 à 4 mois, correspondant à a période optimale pour les procédures d’implantation au niveau de la prostate.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dès la gestation avec un régime carencé en oméga 3 ou équilibré, elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, une injection de N-oxyde de clozapine, puis un test de mémoire de travail spatiale et un test de mémoire associative. Ce second test consiste à associer un environnement à des "stimulations" appliquées aux pattes, susceptibles selon le porteur de provoquer une douleur passagère, sans qu'il précise lesquelles. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale" et qu'aucune méthode de remplacement n'apparaît dans les bases de données consultées, l'apport annoncé étant une meilleure compréhension des liens entre alimentation et mémoire.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de notre équipe et fait suite à plusieurs années de recherche sur l'impact des acides gras polyinsaturés oméga 3 sur la physiologie du cerveau. Les données obtenues sur ce projet ont donné lieu à plusieurs publications et nous ont permis d'obtenir des soutiens financiers importants (ANR JCJC, JPND Solid européen). La carence en lipides oméga 3 est associée à des déficits du développement cérébral et des altérations de comportement à l'âge adulte. Nos résultats récents indiquent une augmentation de l'activité des neurones de l'hippocampe dans le cerveau lorsque les souris sont soumises à un régime déficient en lipides oméga 3 depuis la gestation chez les mâles et les femelles à l'âge adulte. Cette hausse d'activation de l'hippocampe est associée à une altération des mémoires de travail et associatives dépendantes de l'hippocampe en condition de carence en oméga 3. Notre objectif est de démontrer que cette hyper-activation est responsable des déficits comportementaux par des approches de pharmacogénétiques permettant de diminuer l'activité des neurones de l'hippocampe pendant la tâche comportementale.

Bénéfices attendus

Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche de pharmacogénétique et comportementale. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre les mécanismes cérébraux des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3 depuis la gestation. Ils sont soumis à 1 test comportemental à 3 mois visant à mesurer la mémoire de travail spatiale et la mémoire associative, toutes deux dépendentes de l'hippocampe. Une injection intrapéritonéale de N-oxyde de clozapine juste avant le comportement sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 1 réaliseront un test de mémoire de travail spatiale qui dure 15 min au total sur deux jours (acquisition, test) et ne cause aucune détérioration de l'état général des animaux. Les animaux de la procédure 2 subiront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations pouvant entrainer une douleur passagère au niveau des pates mais n'entrainant pas de perte de poids, ni d'altération de l'état général des animaux. Pour les deux procédures, les régimes équilibré, carencé en Oméga 3 n’impactent pas le bien-être général de l’animal en termes de comportements alimentaire ou social mais pourraient modifier les capacités cognitives que nous voulons étudier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection stéréotaxique chirurgicale d'un virus dans le cerveau, qui induira une douleur passagère chez les animaux, traitée par une approche d'antalgiques pré et post-opératoire. Une baisse de l'appetit et une diminution du poids des animaux est possible en post-opératoire et nécessitera un suivi post-opératoire journalier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection de N-oxyde de clozapine en périphérie, qui n'a pas d'effet indésirables à la dose et fréquence d'administration sur l'état de bien être des animaux, mais induira une légère douleur passagère liée au geste.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en oméga n-3 sur les mémoires à l'âge adulte chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique afin de permettre un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu tel que des igloo en carton ou en plastique, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Les souris auront plusieurs phases d'habituation : une semaine d'habituation à l'arrivée des géniteurs, une habituation à l'experimentateur avant les tests et/ou les chirurgies, une habituation aux pièces de comportement avant les tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Le projet porte sur le stade adulte des animaux pour lequel des données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement notamment à l'âge adulte.

Un patch d'ovalbumine posé chaque jour pendant quatorze jours sous anesthésie, ou du calcipotriol appliqué chaque jour pendant onze jours, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations à la clé. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les modèles animaux "ne reproduisent pas fidèlement la complexité" de la dermatite atopique humaine et qu'ils en représentent seulement des sous-phénotypes, puis installe deux de ces modèles dans son laboratoire. Les bénéfices annoncés se limitent à cette installation, pour des projets de recherche à venir.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA déjà établis pour nos futurs projets de recherche sur la DA. La dermatite atopique (DA) est la première et la plus fréquente maladie allergique, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Cliniquement, elle se manifeste par une peau sèche, une inflammation cutanée et des démangeaisons intenses, qui peuvent être exacerbées par divers déclencheurs tels que les allergènes, les infections ou le stress. Chez les patients atteints de DA, les cellules de l’épiderme produisent de grandes quantités de molécules pro inflammatoire. Alors que 70 % des patients voient leurs symptômes disparaître naturellement pendant l’enfance, 30 % souffrent de symptômes persistants et présentent un risque accru de comorbidités atopiques associées telles que l’asthme, la rhinite ou les allergies alimentaires. Actuellement, il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Il existe des phénotypes cliniques distincts de la DA ce qui conforte la nécessité d'une approche médicale personnalisée. La recherche préclinique sur la DA visant à développer de nouveaux traitements, à caractériser les mécanismes fondamentaux de la pathologie et à identifier les sous-types distincts de la DA a depuis longtemps rendu indispensables les modèles animaux appropriés. Malheureusement les modèles animaux ne reproduisent pas fidèlement la complexité de la DA humaine, mais représentent plutôt des sous-phénotypes de la maladie. Une publication récente résume très bien les différents modèles murins de DA existants, leurs caractéristiques et les avantages/inconvénients de chaque modèle. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de mettre en place au laboratoire, deux modèles de DA différents – ovalbumine et calcipotriol – qui répondent à des questions biologiques différentes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont la mise en place dans notre laboratoire de deux modèles murins de DA pour nos futurs projets de recherche sur la DA.

Procédures

Procédure 1 = anesthésie et application journalière d’un patch ovalbumine pendant 14 jours. Procédure 2 = anesthésie et application journalière de calcipotriol pendant 11 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la présence d’un patch sur le dos, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses répétées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris seront âgées de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.

Injection de cellules tumorales en moins d'une minute, mesure du volume de la tumeur tous les deux jours sur animal vigile, trois vaccinations sous anesthésie espacées d'une semaine, deux prises de sang, puis radiothérapie. 2 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du sein pour les femelles et de mélanome pour les mâles. Le porteur affirme que le développement de la tumeur ne créera pas de contrainte mécanique et que la radiothérapie, administrée au quart ou à la moitié de la dose maximale tolérée, n'induit aucune nuisance. Toutes sont tuées, soit après avoir atteint les points limites, soit pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité antitumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par le matériel génétique tumoral hors des cellules. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération du matériel génétique tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et potentialise l’immunité antitumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité du matériel génétique dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité antitumorale. Nous avons caractérisé récemment une composante dont la fonction principale est de couper/digérer le matériel génétique libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de cette enzyme limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de protéine, ciblant le matériel génétique tumoral, dans la régulation de l’immunité antitumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de cette composante dans la régulation de l’immunité antitumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'une composante ciblant le matériel génétique libéré dans les tumeurs dans la régulation de l’immunité antitumorale induite par différentes radiothérapies en oncologie. C’est une question fondamentale car le matériel génétique libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Des résultats préliminaires de nos collaborateurs semblent indiquer que cette composante soit requise pour l’induction de l’immunité antitumorale induite par certaines chimiothérapies, notre but est d’étudier les rôles de cette composante dans les mêmes modèles tumoraux mais traités par radiothérapies. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Procédures

1. L’injection des cellules tumorales ou des anticorps est réalisée en moins d’une minute. 2. Certains animaux de l’étude auront deux prélèvements de sang. 3. La mesure du volume tumoral est effectuée tous les deux jours sur des animaux vigiles. et dure moins d’une minute par souris. 4. La vaccination par des cellules s’effectue sur souris endormies à 3 reprises espacées d’une semaine ; l’injection dure au maximum une minute par souris.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée à l'injection de cellules par voie sous-cutanée ou dans le coussinet de la glande mammaire est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs sera suivi par des mesures régulières et leur développement ne créera pas de contraintes mécaniques chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements par les vésicules, des études préliminaires ont montré qu’elles ne seraient pas supérieures à celles induites par une piqûre d’aiguille ; aucune autre douleur n’est prévisible. Dans ce projet, la thérapie radioactive n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la dose maximale tolérée.

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront euthanasiés à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction d’une enzyme coupant/digérant le matériel génétique relargué par les cellules cancéreuses impliquée dans la mise en place de la réponse antitumorale suite aux traitements anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés avec une déficience de cette enzyme. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudierons l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Concernant la gestion de la colonie de souris, nous utilisons les souris femelles pour le modèle de cancer du sein, tandis que les souris mâles seront utilisées pour le modèle de mélanome. Ainsi, les mâles et les femelles issues de notre colonie seront utilisés pour l’un de nos modèles, afin d’optimiser au maximum la gestion de notre colonie.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car nous avons une souche de souris génétiquement déficiente pour la composante que nous étudions afin répondre au mieux à nos objectifs. Nous utiliserons les souris adultes à partir de 8 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle d’une composante l’induction de l’immunité antitumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein et du mélanome, des pathologies qui affectent exclusivement l’adulte.