Recherche fondamentale

Les souris de ce projet portent une double mutation qui les prive de la capacité à fabriquer leur vitamine C, et 48 d'entre elles ainsi que 8 femelles reproductrices subissent une carence entretenue de la naissance jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique que cette carence les laisse de petite taille et peut provoquer une ataxie ou une hypertrophie des pattes. Au total, 376 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec une mise à jeun de quatre heures, un gavage, une injection intraveineuse sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal. Toutes seront tuées, les unes pour le prélèvement, les autres parce qu'elles ont atteint la limite d'âge pour la reproduction.

Objectifs

Les diarrhées d’origine bactérienne se manifestent généralement par une gastro-entérite, et plus spécifiquement par une rectocolite aiguë. Leur transmission se fait par voie féco-orale, principalement dans les pays en développement ou chez les voyageurs. Chaque année, ces infections causent plusieurs millions de décès, touchant surtout les enfants de moins de cinq ans. À ce jour, aucun vaccin commercialisé ne protège contre ces bactéries, même si de nombreuses stratégies vaccinales sont actuellement à l’étude. Le développement de ces approches est notamment freiné par l’absence d’un modèle animal fiable permettant d’en évaluer l’efficacité. La virulence de ces bactéries a été étudié depuis de nombreuses années dans divers modèles animaux (primate, lapin, souris, cobaye) qui, même imparfaits ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la virulence de ces pathogènes. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet de reproduire l’infection du colon suite à l’ingestion de bactéries virulentes. Il est connu que la souris est naturellement résistante à ce type d'infection. Et contrairement à l’être humain, elle est capable de synthétiser la vitamine C (ascorbate). Grâce à nos récents travaux, nous avons pu examiner l’impact d’une carence en ascorbate sur la sévérité d'une infection bactérienne, en utilisant un modèle souris présentant une double mutation. Cela nous a permis de mettre en évidence et validé une sensibilité accrue avec présence de symptômes comme retrouvés chez l’Homme. Cette demande de projet est en continuité avec les résultats issus de nos précédents travaux. Ici nous souhaitons identifier la nature de la fragilité de ces animaux qui expliquerait cette sensibilité accrue à l’infection. Ce projet porte sur l'évaluation du niveau de perméabilité du tissu colique et des vaisseaux saunguins, potentiellement fragilisé de par la carence en vitamine C chez nos animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances fondamentales de l’impact d’une carence modérée en ascorbate sur la structure et la perméabilité de la barrière épithéliale colique et de la paroi vasculaire. Il nous permettra également d’évaluer le rôle de l’ascorbate dans le maintien de l’intégrité de ces barrières biologiques dans la réponse aux infections aux bactéries pathogènes. Si une relation s’avère existante entre carence nutritionnelle, altération des barrières biologiques et sévérité de l’infection, alors ce projet pourrait contribuer à plus long terme à l’amélioration des stratégies de prévention et de prise en charge des infections intestinales, notamment par des approches nutritionnelles complémentaires.

Procédures

48 animaux générés ainsi que les 8 femelles reproductrices subiront de leur naissance à leur mise à mort une carence modérée en ascorbate via une dose sous-optimale d’ascorbate dans l’eau de boisson. Les animaux subiront avant le test de perméabilité du tissu colique une mises à jeun de 4h. Tous les animaux subiront les actes suivants : gavage sur animal vigile. Chaque animal concerné subira un seul gavage qui sera d'une durée inférieure à 1 minute; L'injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse s'executera pendant une durée de 2 minutes maximum. Chaque animal concerné subira une seule injection. Enfin, les animaux soumis au gavage auront un prélèvement de sang terminal sous anesthésie général. Ce prélèvement se fera sur une durée inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

En relation avec la phase d’induction de carence modérée, nos précédentes études ont montré que celle-ci avait un impact sur le développement de l’animal au niveau phénotypique (petite taille). Ce dernier peut également développer une ataxie ou une hypertrophie au niveau des pattes. Au cours des procédures de test de perméabilité, la contention, le gavage pourront être source de stress pour l'animal. Aussi, la mise à jeun peut induire non seulement un stress à l'animal mais aussi une perte de poids n’excédant pas 10 %.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement soit car ils ont atteint la limite d'âge pour la mise en reproduction.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une continuité d'une validation in vivo d’un nouveau modèle capable de récapituler totalement l’infection du colon suite à l’ingestion d'une bactérie pathogène. L’évaluation de la perméabilité du tissu colique et des vaisseaux sanguins nécessite l’intégrité d’un tissu vivant fonctionnel, incluant les interactions entre cellules épithéliales, jonctions serrées, et système immunitaire. Les modèles alternatifs actuellement disponibles ne permettent pas de reproduire fidèlement cette complexité physiologique ni les mécanismes dynamiques impliqués dans la régulation de la barrière intestinale ni de l'endothélium.

Réduction

Pour ce projet, nous avons pu déterminer l’effectif minimum requis pour nous permettre d’avoir des résultats robustes en s’appuyant sur des tests statistiques. Les évaluations de la perméabilité du tissu colique et des vaisseaux sanguins seront effectués sur un même animal. En outre, l’utilisation d'animaux de même génotype pour la partie reproduction et des deux sexes pour la partie expérimentation permet la genèse de moins d’animaux pour atteindre l’effectif total.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum par différentes actions : L’hébergement des animaux dans des cages adaptées en groupe sociaux. Ces cages seront enrichies avec du matériel de nidification à base de coton compressé et de frisure de papier, des bâtons à ronger, un tunnel transparent, leur permettant d’organiser leur environnement selon leurs besoins ; Une anesthésie de l’animal avant injection pour limiter le stress de l'animal et avant prélèvement de sang; Une acclimatation et une habituation en début de projet consistant à manipuler régulièrement les animaux en appliquant les différents gestes nécessaires à l'étude; Des phases de mises à jeûn limitées au plus possible ; La surveillance tout au long de la vie de l’animal, par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure et à une grille de scoring. Une supplémentation en vitamine C dans l’eau de boisson calculée de sorte à limiter les symptômes de carence (perte de poids, troubles articulaires), concernant les animaux génétiquement modifiés carencés en vitamine C.

Choix des espèces

De multiples modèles animaux ont déjà été utilisés pour modéliser l’infection humaine mais aucun n’a pour l’instant permis de récapituler l’infection du colon suite à l’ingestion de bactéries pathogènes. De nombreuses données dans la littérature existent associées aux modèles murins, les modifications génétiques permettant de rendre ces modèles plus sensibles aux infections et ainsi d’analyser les différents mécanismes de la pathogénèse dans le temps. Nos précédents travaux ont montré que notre lignée murine deficiente en ascorbate permet de reproduire les infections associées aux diarrhées chez l’homme. C'est dans une continuité logique que nous souhaitons poursuivre nos investigations avec cette espèce animale afin d'incrémenter nos connaissances dans ce domaine et de pouvoir effectuer des analyses comparative et critique des résultats obtenus. Pour ce projet, les animaux exposés ou non à une carence modérée en vitamine C dès leur naissance, seront utilisés à 5 semaines d'âge. Cet âge correspondant à celui utilisé pour nos infections, conciliant installation de la carence, et efficacité de l'infection. Aussi, d'un point de vue clinique, l'infection par ces bactéries touche majoritairement des jeunes enfants. Le choix de cet âge nous permettra ainsi d'être le plus représentatif possible.

891 souris vont être utilisées, chacune subissant la pose chirurgicale d'une pompe diffusant la molécule testée en moins de vingt minutes, puis deux tests comportementaux au plus, étalés sur cinq et six jours, dont le résumé ne dit pas lesquels. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles de la lignée transgénique employée présentent un risque élevé d'agressions entre eux en groupe, avec des blessures possibles, et le mâle dominant peut être isolé. Les souris entrées en procédure expérimentale sont toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau, tandis qu'une partie des souris nées à l'élevage est gardée en vie pour la reproduction, les surnuméraires étant tuées quand leur génotype ne sert ni à l'élevage ni à l'expérimentation et qu'aucune adoption n'est possible.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer s'accompagne d'une diminution progressive de la capacité du cerveau à utiliser l'énergie dont il a besoin pour fonctionner correctement. Cette perturbation apparaît trés tôt, avant même l'apparition des premiers symptômes, et pourrait contribuer aux troubles de la mémoire, ainsi qu'aux autres troubles cognitifs observés chez les patients. Le fonctionnement du cerveau repose sur une coopération étroite entre les différentes cellules cérébrales. Parmi elles, les astrocytes jouent un rôle important en fournissant aux neurones une partie de l'énergie nécessaire à leur activité. À l’heure actuelle, peu de traitements visent à corriger directement ces anomalies du métabolisme énergétique cérébral. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer une nouvelle approche thérapeutique visant à améliorer l’approvisionnement énergétique des neurones. Pour ce faire, nous étudierons les effets d’une hormone naturellement présente dans l’organisme, capable d’atteindre le cerveau et connue pour agir sur le métabolisme énergétique, l'inflammation, ainsi que sur la faculté du cerveau à récupérer et à se restructurer. Ce projet permettra de déterminer si cette hormone permet de compenser ce déficit énergétique en améliorant le fonctionnement des mécanismes de transfert d’énergie dans le cerveau et de limiter ou au moins de ralentir l’apparition des troubles associés à la maladie d’Alzheimer. Les objectifs de cette étude sont d'évaluer l'effet de notre molécule d'intéret sur le métabolisme énergétique cérébral et sur les symptômes de la maladie d'Alhzeimer, ainsi que de vérifier si ses effets protecteurs peuvent être obtenus après une administration périphérique, ce qui en ferait un candidat thérapeutique prometteur. Ce projet répond à un enjeu majeur de santé publique en explorant une stratégie innovante susceptible de préserver le fonctionnement cérébral et de limiter les effets de la maladie d’Alzheimer grâce au maintien d'un apport energétique adapaté.

Bénéfices attendus

La maladie d'Alzheimer s’accompagne d’une diminution de la capacité du cerveau à produire et à utiliser l’énergie nécessaire à son bon fonctionnement. Cette altération, observée très tôt au cours de la maladie, pourrait contribuer aux troubles de la mémoire et aux autres difficultés cognitives observées chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d'une molécule capable d'améliorer le métabolisme énergétique du cerveau. A court et moyen termes, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le transport et l'utilisation de l'énergie entre les cellules du cerveau, ainsi que leur implication dans les processus d’apprentissage et de mémoire. Cette étude contribuera aussi à déterminer les effets de notre molécule d'intérêt sur ces mécanismes. Les résultats obtenus permettront d'enrichir les connaissances scientifiques sur les mécanismes impliqués dans la maladie d’Alzheimer et pourraient ouvrir de nouvelles pistes de recherche. A long terme, ce projet pourrait avoir des retombées cliniques importantes. Si les effets bénéfiques de notre molécule sont confirmés, celle-ci pourrait être envisagée comme une nouvelle stratégie thérapeutique visant à préserver l'approvisionnement énergétique du cerveau. Cette stratégie pourrait ainsi contribuer à ralentir l'évolution des symptômes et à améliorer la prise en charge des patients atteints de la maladie d’Alzheimer, une pathologie qui touche une part importante de la population âgée (15% des personnes de plus de 80 ans). Plus largement, ce projet pourrait favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les mécanismes énergétiques impliqués dans les maladies neurodégénératives.

Procédures

Tous les actes chirurgicaux décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux venant à naître au sein de notre animalerie subiront au maximum un prélèvement (durée de moins de 10 secondes), ainsi que la pose d’un tag permettant leurs identifications (durée moins de 5 secondes). En ce qui concerne, l’ensemble des animaux entrant dans la procédure expérimentale, une unique chirurgie (durée de moins de 20 minutes) sera réalisée permettant la mise en place de la pompe diffusant notre molécule d’intérêt. À la suite de laquelle les animaux effectueront au maximum deux tests comportementaux, repartis sur 5 et 6 jours respectivement ( ils n'auront pas lieux la même semaine). Chaque session durera au maximum 5 minutes par jour pour l'un des tests et 3 minutes par jour pour l'autre.

Impact sur les animaux

La procédure d'identification et le prélèvement, qui ne durent que quelques secondes, peuvent entraîner un inconfort transitoire dans les 24 à 48 heures suivant l’intervention. La procédure chirurgicale est susceptible d’induire une douleur post-opératoire, un inconfort local au niveau du site d’implantation, ainsi qu'une perte de poids au cours des 48h suivante. Les manipulations répétées nécessaires au suivi des animaux et à la réalisation des tests comportementaux peuvent également induire un stress transitoire. De même, l’administration des anesthésiques et analgésiques par injection peut occasionner un inconfort transitoire au point d’injection ainsi qu'un stress lié à la manipulation. Enfin, les souris mâles de la lignée transgénique utilisée présentent un risque élevé de comportements agressifs lorsqu’elles sont hébergées en groupe. Ces interactions peuvent induire un état de stress et entraîner des blessures plus ou moins importantes.

Devenir

La majorité des animaux issus de la procédure d'élevage seront conservés afin d'être intégrés dans une procédure expérimentale ou pour assurer le renouvellement des couples reproducteurs. Concernant les animaux surnuméraires, si leur génotype ne présente pas d'intérêt pour l'élevage, la formation ou l'expérimentation et qu'ils ne peuvent pas être proposés à l’adoption, ils seront euthanasiés. Tous les animaux concernés par la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issue de celle-ci. Le prélèvement des cerveaux, incompatible avec le maintien en vie des animaux, sera réalisé afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires, métaboliques et histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’effet d’une molécule sur le fonctionnement énergétique du cerveau et à évaluer son impact sur les capacités cognitives, notamment les processus liés à l’apprentissage et à la mémoire. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire totalement la complexité du cerveau et de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant pour répondre à ces objectifs. Les études réalisées sur des cellules permettent d’analyser certains mécanismes au niveau cellulaire et moléculaire. Elles seront utilisées dans ce projet en complément afin de mieux comprendre le mode d’action de notre molécule d'intérêt. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l'organisation globale du cerveau, les interactions complexes entre les différents types cellulaires, les échanges avec les vaisseaux sanguins,ni les mécanismes de régulation métabolique qui interviennent dans un organisme entier. De même, les modèles informatiques ne permettent pas actuellement de reproduire de manière suffisamment fiable les relations complexes entre le métabolisme cérébral et les fonctions cognitives. Ils ne permettent notamment pas d'évaluer des fonctions complexes telles que l’apprentissage et la mémoire. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour étudier ces fonctions. Le modèle murin utilisé est, à ce jour, le plus pertinent pour l'étude de la maladie d’Alzheimer. Il permet d’évaluer les effets de la molécule sur des mécanismes énergétiques cérébraux et des fonctions comportementales.

Réduction

Plusieurs stratégies sont mises en œuvre afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. La reproduction des animaux est réalisée à la demande et non en continu, ce qui permet d’ajuster précisément le nombre d'animaux produits aux besoins expérimentaux et de limiter la production au strict nécessaire. La majorité des animaux produits est utilisée dans les procédures expérimentales ou d’élevage. Lorsque cela est possible, les animaux ne présentant pas le génotype requis sont réutilisés dans d’autres projets compatibles, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaire, à la procédure expérimentale, pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant, a été déterminé à l’aide d'outils statistiques. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du projet. Les conditions d’élevage et d’hébergement sont optimisées et adaptées à l’espèce et aux contraintes du projet. Les animaux sont hébergés en groupes et bénéficient d’un environnement enrichi (matériel de nidification, tunnel et/ou igloo), compatible avec les objectifs expérimentaux. Pendant la formation des lots, les zootechniciennes vont réaliser une surveillance accrue des cages, aidées par un logiciel, qui les alertera en cas de conflit. Lors de l'apparition d'agressivité chez les mâles, davantage d'enrichissements seront ajoutés dans un premier temps. Si la situation devient récurrente ou si les blessures deviennent plus importantes, le mâle dominant sera isolé (autorisation) dans une cage fortement enrichie, positionnée prés de ses congénères sur le portoir ventilé. Pendant l’élevage, les procédures d'identification et de prélèvements sont réalisées dans des conditions d’asepsie stricte et sous anesthésie générale. La taille des prélèvements est réduite au minimum afin de limiter l’impact sur les animaux. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé. Des points limites gradés, associés à un arbre décisionnel et à des critères d’arrêt sont définis pour chaque étape du protocole avec des grilles de suivi adaptées. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et locale, sur un tapis chauffant, dans des conditions d’asepsie stricte et associée à une analgésie adaptée (avant, pendant et aprés l'intervention). Les tests comportementaux ont été sélectionnés afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Une phase d’habituation est systématiquement mise en place afin de réduire le stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation.

Choix des espèces

Le choix du modèle Souris repose sur les critères principaux suivants : 1- La souris partage de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec l’Homme, notamment en ce qui concerne l’organisation et le fonctionnement du système nerveux central. Elle est largement utilisée dans l’étude des maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie d’Alzheimer. 2- Le modèle de la maladie d’Alzheimer chez la souris transgénique reflète les mécanismes pathologiques observés chez l’Homme, notamment l’accumulation de peptides β-amyloïdes et les altérations cognitives associées. Il constitue un modèle validé et largement décrit dans la littérature scientifique. 3- La souris offre par ailleurs des avantages expérimentaux majeurs, notamment l'existence de tests comportementaux validés permettant d’évaluer les fonctions cognitives telles que l’apprentissage et la mémoire. Entre J21 et J28 postnatal, les animaux seront identifiés et génotypés. Cette période correspond au sevrage et permet la séparation des animaux en fonction de leur sexe et de leur génotype, ainsi que la constitution des lots expérimentaux. La réalisation de ces procédures à ce stade limite leur impact sur le développement postnatal. À partir de 4,5 mois, les animaux mâles et femelles seront transférés dans la zone expérimentale et soumis à une période d’acclimatation de 14 jours. À l'âge de 5 mois, les animaux subiront la procédure chirurgicale. Cet âge correspond à un stade adulte jeune, caractérisé par une stabilité des paramètres physiologiques, métaboliques et comportementaux. Il permet la réalisation d’interventions chirurgicales dans des conditions expérimentales homogènes et limite les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Ce stade est également favorable à une récupération post-opératoire optimale et à une standardisation des conditions expérimentales entre individus. À l'âge de 6 mois, les évaluations comportementales seront réalisées. Dans le modèle de maladie d’Alzheimer utilisé, cet âge correspond à un stade d’expression du phénotype, permettant l’observation de déficits comportementaux pertinents pour l’évaluation des effets neuroprotecteurs de la molécule d'intérêt.

Les embryons utilisés dans ce projet sont génétiquement incapables de former un cœur ou un pancréas, et reçoivent des cellules souches de chimpanzé et de macaque pour tester si elles compensent ce déficit. 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue. Les femelles donneuses reçoivent deux injections hormonales intrapéritonéales, les receveuses une chirurgie abdominale de quinze à trente minutes sous anesthésie générale, avec une douleur postopératoire attendue. Le calcul d'effectif part d'un minimum de cinquante embryons à analyser et d'au moins cinq réplicats, sans que le millier de souris mobilisées soit rapporté à ce chiffre.

Objectifs

Le développement d’approches innovantes de reconstruction d’organes représente un enjeu scientifique et biomédical majeur. Les malformations cardiaques congénitales ainsi que les pathologies pancréatiques sévères, notamment le diabète, constituent des problématiques médicales majeures pour lesquelles les options thérapeutiques curatives restent limitées. La transplantation d’organes est contrainte par la pénurie de greffons, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies de production d’organes fonctionnels. Dans ce contexte, la compréhension des mécanismes permettant la formation et la reconstruction d’un organe in vivo constitue un besoin scientifique fondamental. Le présent projet vise à évaluer une approche de complémentation embryonnaire inter-espèce appliquée à deux organes essentiels : le cœur et le pancréas. Cette stratégie repose sur l’injection de cellules souches pluripotentes (PSC) dans des embryons génétiquement incapables de former un organe donné, afin de tester si les cellules injectées peuvent compenser ce déficit développemental et contribuer à la formation de l’organe manquant. Si ce concept a été démontré dans des modèles intra-espèce chez le rongeur, son potentiel dans un contexte inter-espèce impliquant des cellules de primates non-humains reste encore largement inexploré. L’objectif principal est de déterminer si des PSC de primates non-humains (chimpanzé et macaque), rendues compétentes pour la colonisation embryonnaire, sont capables de s’intégrer dans des embryons murins déficients pour les gènes clés nécessaires à la formation du cœur ou du pancréas.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes du développement embryonnaire et sur la capacité de cellules souches pluripotentes à contribuer à la formation d’organes dans un contexte inter-espèce. Il apportera des données originales sur les interactions cellulaires précoces, la reconnaissance des signaux développementaux entre espèces différentes et les limites biologiques du chimérisme. À court terme, les bénéfices attendus concernent principalement l’avancée des connaissances scientifiques. Le projet permettra de déterminer si des cellules souches de primates peuvent s’intégrer dans un embryon murin déficient pour un organe donné (cœur ou pancréas) et participer à sa formation. Il permettra également d’identifier les freins biologiques à cette intégration, qu’ils soient liés à la différenciation cellulaire, à la compétition cellulaire ou à l’incompatibilité des signaux moléculaires entre espèces. Ces données contribueront à mieux comprendre les principes fondamentaux de la formation des organes et de la plasticité cellulaire. À moyen terme, les résultats obtenus pourraient permettre d’optimiser les conditions expérimentales favorisant la complémentation d’organes et d’identifier les paramètres déterminants pour une intégration efficace et contrôlée des cellules injectées. Cela pourrait contribuer à l’amélioration de modèles expérimentaux pertinents pour l’étude des anomalies du développement cardiaque et pancréatique. À long terme, ces travaux vont permettre une meilleure compréhension des mécanismes de complémentation inter-espèce pour la médecine régénérative. En particulier, ils vont participer, de manière progressive et encadrée, à la réflexion scientifique visant la génération d’organes fonctionnels dans un contexte contrôlé afin de répondre à la pénurie de greffons pour la transplantation.

Procédures

Pour la stimulation ovarienne, deux injections d’hormones en intréapéritonéales par souris seront effectuées pour les femelles donneuses. Pour les femelles receveuses des injections en intrapéritonéal d’antalgiques et d’anesthésiques seront effectués. Dans tous les cas, le geste est rapide et dure de 30 secondes à moins d’une minute). Concernant la récupértion des embryons après transfert embryonnaire, l’accès à l’utérus se fera par chirurgie sous anésthésie générale. L’intervention durera de 15 à 30 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent d'une part les injections intrapéritonéales pour les femelles donneuses et receveuses, et d'autre part, les chirurgies de réimplantation d’embryons pour les receveuses qui peuvent entrainer une douleur postopératoire et un stress modérés.

Devenir

Tous les animaux adultes seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures.

Remplacement

La pierre angulaire du projet est de tester la capacité de cellules souches dérivées au laboratoire de remplacer un organe au cours du développement embryonnaire. Aucune technique in vitro ne permet, à l’heure actuelle, de reproduire le développment normal d’un embryon ou d’un organe entier à long terme. Pour faire des analyses statistiques robustes, nous avons besoin d’un nombre suffisant d’embryons de qualité.

Réduction

Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Pour évaluer le nombre d’animaux nécessaires à ce projet nous avons tenu compte du nombre d'embryons à analyser de façon à déterminer si les cellules injectées sont capables ou non de coloniser, c’est-à-dire si on observe une colonisation significative (>50% de l’organe), en fonction des risques statistiques d’erreur (5%) et de la puissance des tests (80%). Ce type de test nécessite un minimum de 50 embryons analysés. C’est pourquoi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour avoir assez d’embryons (voir le Tableau 1 en annexe), tout en s’assurant que nous aurons suffisamment de réplicats (au moins 5) pour que nos données soient valables statistiquement.

Raffinement

Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), les souris ayant subi une injection ou une chirurgie seront placées en milieu enrichi (coton, dôme) dans une zone de stabulation dédiée, avec moins de bruit et de passages, et seront observées quotidiennement par un animalier ou l’expérimentateur. Nous insistons sur la formation et l’expérience des personnes pratiquant les injections et la chirurgie. La maîtrise de ces gestes réduit d’une part le temps de contention, diminuant ainsi les effets stress chez les animaux, et garantissent la bonne tolérance de la procédure et une meilleure reproductibilité auprès des animaux. Nous établissons les points limites les plus précoces possibles en fonction de l’objectif de l’expérimentation. Dans le cadre d’un raffinement, il existe une technique alternative à la chirurgie de transfert d'embryons qui sera testé au cours de ce projet. Cette technique dite de NSET 'Non-Surgical Embryo Transfer' se fait par les voies naturelles, permettant ainsi de réduire le stress et la douleur habituellement liés à la chirurgie lors d'un transfert d'embryons. Cette technique sera appliquée si elle s’avère aussi reproductible et efficace que la technique de chirurgie pour produire un nombre suffisant d’embryons par femelle.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris pour plusieurs raisons : 1- Le développement de l’embryon de souris est rapide et le nombre d’embryons par portée est important. 2- Les souris génétiquement modifiées sont un atout majeur et indispensable à l’étude et à la réalisation de notre projet. 3- Chez la souris, le développement embryonnaire est assez similaire à celui décrit chez l’Homme et donc un modèle très pertinant pour notre projet. Les animaux sont utilisés à maturité sexuelle, à partir de 8 semaines chez la souris.