Recherche fondamentale

Tester si un probiotique améliore l'absorption intestinale chez l'adulte dénutri suppose de créer la dénutrition. 120 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 110 d'entre elles subissent une restriction alimentaire de quatorze à trente jours, avec la sensation de faim que le porteur reconnaît. Chacune vit seule en cage pendant vingt-huit à soixante-dix jours, témoins compris pour éviter un biais expérimental, et subit deux à cinq prélèvements de sang à la veine submandibulaire sous anesthésie. Au titre de la réduction, le porteur annonce le prélèvement de tous les organes qui pourraient l'intéresser, congelés en vue d'analyses qu'il n'a pas encore prévues.

Objectifs

La dénutrition du sujet adulte est un phénomène retrouvé dans diverses pathologies humaines telles que la sarcopénie (perte musculaire liée à l'âge) ou suite à des chirurgies onco-intestinale par exemple. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte physiologiquement dénutri et ainsi lutter contre le phénomène de dénutrition. Un probiotique se définit comme un micro-organisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin de dénutrition, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de dénutrition chez la souris en soumettant les animaux à une restriction calorique. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses derivés peuvent limiter les effets de cette dénutrition et/ou favoriser les effets d'une renutrition. A terme, cela pourrait permettre de mieux comprendre l'influence du microbiote sur les phénomènes de dénutrition chez l'adulte. Nous espèrons pouvoir ainsi améliorer l’absorption intestinale dans le cadre de la renutrition des patients adultes en post-chirurgie onco-intestinale ou souffrant de sarcopénie par exemple, ces patients présentant tous des altérations de l'absorption intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter l’effet de la dénutrition et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients agés souffrant de sarcopénie mais également des patients ayant subit une intervention chirurgicale onco-intestinale qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.

Procédures

- Individualisation des animaux : 70 souris pendant 28 à 42 jours, 50 souris pendant 56 à 70 jours - Restriction alimentaire : 110 souris pendant 14 à 30 jours - Contention de moins de 2 minutes pour une mesure de la composition corporelle : 2 fois pour 120 souris - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse : 2 fois pour 20 souris, 3 fois pour 50 souris, 5 fois pour 50 souris. Le geste prend moins d’une minute. - Injection dans le ventre sur l'animal vigile : le geste prend moins d'une minute

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entrainer que des nuisances modérées chez les animaux : - Sensation de faim associée à une restriction calorique de leur prise alimentaire moyenne pendant un temps limité à une diminution de leur poids (14 jours attendus, 28 jours au maximum). - Stress associé à l'individualisation des animaux pendant toute la durée de l'expérience, tout d'abord, pour calculer leur prise alimentaire puis pour assurer une restriction calorique précise et individuelle. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition ad libitum. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. Pour éviter un biais expérimental sur les conditions d'hébergement, nous devrons également individualiser les animaux contrôles non soumis à une restriction calorique. - Stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal. - Stress associé aux prélèvements sanguins à la veine submandibulaire, l qui seront espacés d’au moins 7 jours . Ces prélèvements se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. - Le stress lié aux 2 transports (allé /retour dans la journée) des animaux jusqu'à l'analyseur de masse corporelle reste limité (30 minutes de transport, en véhicule climatisé, dans les cages d'hébergement, dans des sacs opaques) - Le stress induit par la contention pour l'analyse de la masse corporelle des animaux est au maximum de 2 minutes. - Le stress associé au traitement par un probiotique ou un post-biotique qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue 100µl de solution qui seront alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une restriction calorique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte de restriction. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte de dénutrition étudié.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental tout animal de moins de 20g au debut du projet sera exclu. Les animaux seront pesés à minima tous les 3 jours afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront, sous anesthésie, puis un point de compression sera réalisé jusqu'à arrêt complet du saignement. Les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement se fera en deposant 100µl dans le creux de la joue à l'aide d'une pipette. Le transport jusqu'à l'analyseur de masse corporelle par RMN se fera dans les cages d'hébergement mises dans des sacs opaques, dans un véhicule climatisé et le temps de trajet est limité (30 minutes). Les animaux seront habitués au préalable au tube de contention dans les jours précédent la premiere analyse de masse corporelle.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser la dénutrition chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris mâles de 12 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement).

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont bloquées jusqu'à cinq minutes dans un tube en plastique pour mesurer leur composition corporelle, jusqu'à quatre fois chacune, 384 d'entre elles subissant en plus une neurochirurgie sous anesthésie générale et 128 une seconde opération pour remplacer un implant. 496 souris passent deux semaines seules en cage de calorimétrie et 752 un test de tolérance au glucose après cinq heures de jeûne, le régime hypercalorique pouvant faire augmenter leur poids de 200 %. Le porteur espère que ces données serviront à moduler les cellules microgliales pour contrer les troubles métaboliques, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Une région du cerveau appelé hypothalamus regroupe des neurones sensibles aux signaux des autres organes du corps, les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD) entraîne une inflammation de l’hypothalamus. On sait que les microglies, qui sont les cellules immunitaires du cerveau (qui protègent le cerveau des attaques extérieures), sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à l’inflammation hypothalamique suite à la consommation d’un régime HFD. Leur activation est variable en fonction de la période d’exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). On sait que limiter l’activation des microglies en réponse au HFD limite l’inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces cellules restent mal connus. Nous faisons l’hypothèse que certaines molécules microgliales, qui sont impliquée dans les fonctions inflammatoires, participent aussi à la régulation de la prise de poids. Dans ce projet, nous souhaitons présicer le rôle des microglies dans le développement de l’inflammation hypothalamique en réponse à un régime hypercalorique afin de mieux les contenir et ainsi de prévenir la prise de poids. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux transgéniques). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène. Nous réaliserons un suivi métabolique chronique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend six procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris vigile soit maintenue en contention, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1536 animaux). 2) Neuro-chirurgie : cette technique permettra soit de mettre en place un implant permettant d’injecter des traitements pharmacologiques, soit un virus qui permettra un changement génétique des microglies. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une seconde chirurgie de courte durée (10 minutes, 128 animaux) pour le remplacement d’un implant sous-cutané. 3) Test de tolérance au glucose : ce test nécessite de réaliser, après un jeûne de 5 heures, une injection de gluocose dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Les 5 mesures de glycémie sont espacées d’au moins 15 minutes chacune. Ce test est réalisé sur souris vigiles. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude (752 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (496 animaux concernés au maximum) : ces cages spéciales permettent d’enregistrer en temps réel la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et la dépense énergétique. Elles nécessitent d’isoler l’animal en cage individuelle (pendant deux semaines), qui sont enrichies avec un nid de coton et un bâtonnet de bois à ronger.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les souris seront aussi maintenues en contention dans leur tunnel en carton carton avec la queue qui dépasse, pendant 5 secondes, pour réaliser des prélèvements sanguins au bout de la queue (zone peu innervée). Le poids des animaux pourra varier en fonction du régime alimentaire donné (+200% sur le long terme en réponse à un régime hypercalorique) ou des restrictions alimentaires (-10% maximum du poids du jour précédent lors d’une mise à jeun). Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne, l’hypoxie relative et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

La perte de 20 % du poids maximal accompagne souvent une baisse de mobilité, une prostration et un retrait de l'animal dans sa cage, et le porteur prévoit de tuer les hamsters avant ce seuil. 22 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent dans l'abdomen des parasites responsables de la leishmaniose viscérale, qui colonisent leur foie et leur rate au cours d'une phase silencieuse pouvant durer six mois, puis subissent jusqu'à trente-six séances d'imagerie sous anesthésie, chacune précédée d'une injection dans l'abdomen, et un à quatorze gavages. L'objet déclaré est de faire apparaître chez ces animaux des parasites résistants au principal traitement de la maladie, et leur mise à mort permet de prélever le foie et la rate qui en sont la source.

Objectifs

Le développement de parasites résistants à la molécule testée devient un problème de santé publique d’autant qu’il s’agit actuellement du principal traitement contre la leishmaniose viscérale. Les résultats des recherches conduites in vitro sur le développement de parasites résistants à cette drogue anti-parasitaire ne sont malheureusement pas transposables sur des parasites de terrain (isolés de malades ne répondant pas au traitement) suggérant qu’in vivo les mécanismes et les cibles conduisant à l’apparition du phénotype de résistance sont différents. Le principal objectif de ce projet est donc de nous donner les moyens de comprendre les mécanismes qui conduisent à l’apparition chez les mammifères de parasites résistants à la molécule testée.

Bénéfices attendus

Les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée in situ chez l’homme et l’animal sont encore très mal connus alors que des récidives à l’issu de ce traitement apparaissent. Les recherches réalisées à ce jour par des approches in vitro sont insuffisantes puisqu’elles ne nous permettent pas d’appréhender et de comprendre pourquoi les malades ne répondent pas au traitement. Par ce projet qui consiste à générer in vivo (chez les hamsters) des parasites résistants à la molécule testée et donc à se rapprocher des conditions de terrain, nous espérons être en mesure d’apporter des réponses à cette problématique de santé publique. En effet, les parasites résistants à la molécule testée ainsi générés seront analysés par séquençage de leur génome et de leur transcriptome. Cette approche duelle nous informera sur les signaux génétiques et les signatures transcriptomiques corrélant avec l’adaptation des parasites en réponse à la molécule testée et nous permettra d’identifier les réseaux d’interaction à l’origine de la réponse/résistance à la drogue. Au-delà de l’importance de ces résultats sur notre connaissance générale des mécanismes d’adaptation des Leishmania en réponse à un stress (molécule testée), si ces derniers sont validés avec des prélèvements provenant de patients/chiens en échec de traitement ils représenteront une avancée majeure dans la recherche sur les traitements anti-Leishmania.

Procédures

A compter de l’inoculation des parasites, les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Imagerie intra-vitale non invasive sous anesthésie générale, impliquant une injection intrapéritonéale préalable (15 minutes). Ce suivi sera réalisé au maximum 36 fois, avec un délai entre chaque mesure de 2 semaines minimum. - Pesée une fois par semaine (20 secondes), pendant toute la durée de la procédure soit entre 20 et 50 fois selon les groupes d’individus. - Gavage (20 secondes),1 à 14 fois selon les groupes sur toute la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

L’inoculation des parasites aux hamsters se fera en intrapéritonéale après anesthésie légère des animaux par exposition à l’isoflurane dans une chambre d’induction. En absence de traitement par les drogues anti-parasitaires, les espèces de Leishmania viscérales vont coloniser principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer jusqu’à 6 mois selon les individus. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint la limite de 20% du poids maximal de l’animal s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage. Le traitement est délivré par administration intragastrique (gavage), pendant un maximum de 5 jours ce qui est source de douleur et inconfort de courte durée et de stress. Dans les cas de traitement de l’homme ou du chien pour lesquels l’administration de la drogue anti-parasitaire est répétée sur 28 jours des troubles digestifs ont pu être observés. Compte-tenu de nos connaissances sur le modèle hamster dans un contexte de traitement, la probabilité d’apparition de tels effets chez les hamsters est toutefois minime. Le suivi de la parasitémie par imagerie intra-vitale non invasive est réalisé sur des animaux anesthésiés par exposition continue à l’isoflurane. Toutefois, cette procédure nécessite une injection intrapéritonéale, source de douleur et inconfort légers de courte durée, lorsque les animaux sont endormis. La répétition de la mesure au cours du temps est potentiellement vectrice de stress chronique pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites nécessaire à nos analyses.

Remplacement

Les recherches réalisées à ce jour sur les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée par des approches in vitro sont réalisées majoritairement sur des parasites libres. Or les traitements anti-Leishmania administrés aux mammifères ciblent le stade de développement intra-cellulaire du parasite. Les lignées de cellules de type macrophage qu’elles soient d’origine humaine ou murine sont peu permissives au développement intracellulaire des parasites étudiés ce qui limite fortement leur utilisation. De plus, notamment dans le cas de traitement ou de résistance aux drogues anti-parasitaire il est primordial de pouvoir prendre en compte le tissu (organes cibles = rate et foie) et au-delà l’organisme entier. Le recours à des animaux vivants est de fait indispensable.

Réduction

Ce projet repose sur l’utilisation de 22 hamsters. Ce nombre nous permet d’avoir 4 à 6 individus par groupe pour chacune des analyses que nous avons prévues de réaliser. Le but final n’est pas de faire une étude comparative statistique entre les animaux traités et non traités mais d’observer les trajectoires individuelles sélectionnées après un traitement flash ou une augmentation croissante de la dose de molécule testée comparativement à l’inoculum initial. Pour réaliser ce projet et afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés nous avons choisi d’utiliser le parasite transgénique qui nous permet de mesurer l’évolution de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive sans avoir à mettre à mort les animaux. Ceci nous permet également d’adapter au mieux la mise en œuvre du traitement sur tous les animaux.

Raffinement

L’infection parasitaire étant silencieuse en terme de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, les hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. Afin d’adapter au mieux la mise en place des traitements par la molécule testée, en plus d’un suivi pondéral les animaux font l’objet d’un suivi de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive. L’imagerie sera réalisée toutes les deux semaines entre la deuxième semaine suivant l’inoculation des parasites et la fin des cycles de traitement. L’augmentation de la charge parasitaire dans les organes cibles est corrélée à l’apparition des signes cliniques de la maladie, notamment la perte de poids. En fin de processus, les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite. L’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux et l’imagerie intra-vitale non invasive est réalisée sous exposition continue d’isoflurane. Durant l’expérience, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Un triple enrichissement des conditions d’hébergement est mis en place (frisettes carton, coton, boule).

Choix des espèces

Deux raisons majeures quant au choix du hamster pour ce projet : - Le modèle murin est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales,d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et du foie des animaux infectés. - Le traitement anti-Leishmania par la molécule testée est efficace avec une même posologie que celle de l’homme. C’est donc l’animal de choix pour toute recherche liée aux traitements anti-parasitaire. Les parasites seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 6ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale. D’autre part, compte tenu de la durée de l’expérimentation il est important d’utiliser des animaux jeunes.

3 850 souris privées de système immunitaire complet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées puis disséquées. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur un patient métastatique, quelques-unes une injection de cellules tumorales dans le cœur, et celles qui reçoivent un traitement subissent un prélèvement de sang hebdomadaire à la mandibule qui laisse des hématomes plusieurs jours. Le porteur retient des souris dépourvues de poils parce que la tumeur se suit mieux sous la peau et que les poils rayent les lames des microtomes, et prévoit 670 animaux par an rien que pour entretenir les lignées de xénogreffes. Il écrit qu'il n'est pas possible de se passer de ces greffes pour proposer des traitements personnalisés aux patients, tout en notant que ces souris sont plus exposées aux infections opportunistes.

Objectifs

Depuis ces dernières années, l’incidence des cancers augmente de par le monde. Avec l’avancé des traitements, la survie des patients s’est améliorée. Toutefois, la maladie métastatique reste un problème majeur et implique une morbidité et une mortalité importante. Dans le cancer, la maladie métastatique est un problème majeur et une cause importante de décès. Si les chiffres sont difficiles à obtenir, une étude estime que 66.7 pourcent des décès par cancers sont dues à des métastases. Leur traitement est rendu d’autant plus difficile que ces métastases ont tendance à résister aux traitements conventionnels. C'est pourquoi nous cherchons à identifier des biomarqueurs de résistance ou de toxicité aux anti-cancéreux, dans l’optique du développement de nouveaux traitements personnalisés.

Bénéfices attendus

La première partie du projet doit permettre de maintenir et de mettre en place de nouveaux modèles de xénogreffes de tumeurs humaines issues de prélèvements métastatiques de patients. Le recrutement des prélèvements métastatiques greffés est fonction de l'incidence des métastases dans chaque type de cancer. Pour le cancer du sein, qui est aujourd’hui le cancer le plus diagnostiqué et la 5eme cause de décès par cancer dans le monde, la maladie métastatique est responsable de la majorité des décès avec, pour ces cas, une médiane de survie à 5 ans de 30 pourcent. Outre les cancers du sein, les autres types de cancers très pourvoyeurs de métastases sont les cancers de la prostate, du pancréas, du poumon, du rein, le cancer colorectal et le mélanome. Le cancer du poumon, du rein et le mélanome métastatiques ont un pronostique particulièrement sombre avec une survie à 5 ans inférieure à 10 pourcent. Ces modèles de xénogreffe consistent à greffer un fragment tumoral humain sous la peau de la souris et constituent des modèles uniques et particulièrement pertinents pour l'étude de la pathologie humaine. Une fois établis, ces modèles doivent permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement des tumeurs humaines, ainsi que permettre de proposer des traitements personnalisés aux patients. La seconde partie; qui consiste à traiter les souris xénogreffées avec des thérapeutiques déjà utilisées dans le cadre du soin, ou de nouveaux composés innovent; doit permettre de proposer des nouvelles alternatives au traitement de ces pathologie, comprendre les mécanismes d'échappement des tumeurs et, dans le cas de nouveaux composés, évaluer leur potentiel thérapeutiques en vue d'essais cliniques. L'objectif étant d'améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux utilisés sont immundéficients. Leur système immunitaire n'est pas complet ce qui limite les risques de rejets de la greffe. Tous les animaux de ce projet seront greffés avec des tumeurs humaines. La plupart recevront un fragment sous-cutané. A de rares exceptions, certains animaux pourront recevoir une injection sanguine de cellules tumorales. Dans les 2 cas, le geste s'effectue sur animal anesthésié et la durée de l'acte ne dépasse pas les 5 minutes. Les greffes sous cutanées se feront sous analgésie générale. Les injections sanguines de cellules tumorales se feront sous analgésie locale. Une partie des animaux xénogreffés sera traité afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur la progression des tumeurs. Dans ce cas, les modalités de traitement varient. Les modalités retenues étant le gavage, l'injection intra-péritonéale et l'injection intraveineuse. Le choix des voies d'injection et des posologies étant soumis à la molécule thérapeutique employée. Les animaux en traitement seront également soumis à un prélèvement de sang hebdomadaire effectué à la mandibule. Le traitement et le prélèvement d'un animal s'effectue sur animal vigile et ne dure pas plus d'une minute.

Impact sur les animaux

La xénogreffes d'une tumeur humaine ; dans la mesure où il s'agit d'insérer un petit fragment tissulaire en sous-cutané ; est un acte peu invasif et peu douloureux. Les injections sanguines présentent un risque hémoragique au moment de l'injection. La croissance des xénogreffes sous cutanées occasionnera une gêne pour l'animal si elle est trop volumineuse. En sous cutanée, les greffes sont peu métastatiques et nous n'avons pas constaté que cela entrainait une diminution du bien-être animal. Les cellules tumorales injectées dans le sang auront une dissémination systémique entrainant la formation de tumeurs dont nous suivrons l'évolution par l'évaluation des signes cliniques de l'animal. Enfin, les traitements qui seront réalisés n'entraineront pas d'effets indésirables majeurs dans la mesure où les doses, les voies et les fréquences d'administration seront établies à partir de la pratique clinique. Les nuisances sont liées à la contention, l'insertion de la canule de gavage et la piqure à l'aiguille. Les prélèvements de sang à la mandibule occasionnent des hématomes localisés pendants quelques jours. Les souris sont immunodéficientes car athymiques, mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. L'immunodéficience des animaux utilisés peut leur conférer une sensibilité aux infections opportunistes plus grandes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation. La survenue de l'euthanasie est soumise à l'atteinte des points limites fixés. La dissection complète des animaux est systématique après l'euthanasie. Les prélèvements effectués permettent d'effectuer des analyses histologiques et moléculaires. Le recueil systématique des échantillons participe au raffinement des modèles.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de pouvoir étudier les mécanismes de résistance aux traitements de tumeurs métastatiques de patients. Des cultures de cellules peuvent être réalisées dans certains cas mais avec des résultats très variables. Par ailleurs, la culture cellulaire sélectionne un type cellulaire, et on perd donc la richesse et l’organisation structurelle de la tumeur telle qu’elle existe chez le patient. Ceci constitue un biais analytique important car on sait qu'une tumeur est constituée d'une variété de cellules tumorales, plus ou moins sensibles aux agents thérapeutiques. Les cellules et les structures qui entourent les tumeurs jouent également un rôle dans les mécanismes de résistance. C’est pourquoi il n’est actuellement pas possible de nous passer de ces modèles de xénogreffes pour la prise en charge personnalisée des patients et la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour maintien des lignées de xénogreffes a été évalué en fonction de notre expertise de plusieurs années dans le domaine. Pour chaque tumeur, 4 souris sont greffées pour limiter le risque d’échec de prise de greffe. Ce risque varie en fonction de l’agressivité tumorale. Nous utilisons en moyenne 670 souris pour entretenir ces xénogreffes par an. Pour 5 ans, 3350 animaux seront donc nécessaires. Pour les traitements, 10 animaux par groupes est un nombre minimum pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous testons une dizaine d’agents ou de combinaisons d’agents thérapeutiques par an, soit 100 animaux traités par an (soit 500 pour 5 ans). Pour 5 ans, 3850 animaux seront nécessaires.

Raffinement

Pour les xénogreffes réalisées en sous-cutanée, les animaux sont anesthésiés. La technique chirurgicale de greffe est peu douloureuse mais une analgésie générale est donnée au préalable. Pour les xénogreffes de cellules tumorales en intracardiaque, les animaux sont anesthésiés durant toute la procédure. La posologie des traitements administrés aux animaux est adaptée des traitements faits chez l’homme. Les doses administrées sont donc bien en dessous des doses létales et la toxicité des molécules se rapproche des effets observés chez l’homme. Les traitements sont administrés par gavage, intraveineuse ou intrapéritonéale. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Les souris utilisées sont immunodéficientes mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. Néanmoins, conformément aux recommandations du fournisseur, les animaux seront hébergés en cages à couvercles filtrant. Le change sera effectué sous atmosphère contrôlée et propre. Enfin, la stérilisation des consommables (litière, enrichissement, eau et nourriture) et des équipements (cages, portoirs, bouteilles, etc.) limitera le risque d'infection chez ces animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise des souris immunodéficientes adultes, de 6 semaines. Le caractère d'immunodéficience limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines Par ailleurs, le choix d’animaux dépourvus de poils nous permet de suivre plus facilement le développement sous cutané de la tumeur. L’évaluation de la taille tumorale est facilitée. L’absence de pilosité est un critère important pour les analyses histologiques. En effet, les poils ont tendance à rayer les rasoirs de microtomes. Les souris xénogreffées sont choisies jeunes adultes afin de maximiser les chances de prise de greffe. En effet, les cellules de la graisse brune situées entre les omoplates constituent un terreau nutritif pour les tumeurs xénogreffées, favorisant leur développement. Cette graisse brune disparait avec l’âge.