Recherche fondamentale

Jusqu'à 576 heures d'enregistrement cérébral par animal, par tranches de quatre-vingt-seize heures consécutives chaque semaine : 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Celles opérées à l'âge adulte vivent seules pendant six semaines, de la chirurgie jusqu'à leurs trois mois, les électrodes implantées dans le cerveau interdisant de les garder en groupe. Le porteur indique que la moitié des souriceaux mutés meurent trois semaines après la naissance et que les autres font des crises d'épilepsie entre une et trois semaines de vie, l'objet du projet étant de caractériser ces crises. Il décrit la connexion hebdomadaire au système d'enregistrement comme "simple à réaliser et indolore", et prévoit la mise à mort des animaux surnuméraires au sevrage pour ne pas stresser leurs parents.

Objectifs

La protéine d’intérêt (PI) étudiée dans ce projet est impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT). Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones. Ce projet a pour but de mieux comprendre l'implication de cette protéine PI dans la régulation de l’activité des neurones. En condition normale, elle se situe majoritairement dans le noyau, où elle a plusieurs fonctions. Le noyau est la structure qui contient l’essentiel de l’information génétique de la cellule. Il est entouré du cytoplasme, qui est une structure cellulaire dans laquelle les protéines sont produites. Ainsi, PI doit être transportée du cytoplasme (où elle est produite) jusqu’au noyau (où elle doit se trouver pour remplir ses fonctions). Ce transport est permis car PI contient un "domaine de localisation nucléaire”. Ce domaine est une région spécifique qui indique qu’une protéine doit être transportée jusqu’au noyau. En condition pathologique, PI n‘est plus transportée jusqu‘au noyau, la protéine s‘accumule donc dans le cytoplasme. Chez les souris, il est possible d’induire la SLA et la DFT en supprimant le domaine de localisation nucléaire de PI afin qu’elle ne soit plus transportée jusqu’au noyau et s’accumule dans le cytoplasme. Chez les souris et les humains, cela s’accompagne, entre autres, de défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont importants pour réguler l‘activité électrique du cerveau en l‘empêchant d‘être trop élevée. Pour comprendre le rôle des neurones inhibiteurs dans les pathologies liées à PI, il existe une lignée de souris dans laquelle PI est mutée spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Les premières caractérisations de cette lignée montrent que cette mutation pourrait être pertinente en dehors de l'étude de la SLA-DFT. Lorsqu’une seule copie du gène PI est mutée (l’autre restant à l’état sauvage), les souris présentent une activité électrique anormale dans le cerveau à l’âge adulte. Lorsque les deux copies du gène PI sont mutées, les souriceaux développent des symptômes qui pourraient être liés à une activité électrique anormale dans le cerveau, voire à des crises d'épilepsie. Ce projet a alors pour but d’évaluer l’activité électrique dans le cerveau de souris juvéniles et jeunes adultes, et de caractériser les possibles crises d'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes pathologiques présents chez des souris qui ont une protéine d’intérêt (PI) mutée spécifiquement dans certains types de neurones. Les neurones sont les cellules électriques du cerveau. Leur fonctionnement, et donc le fonctionnement du cerveau, peuvent être modifiés par des mutations. Ainsi, le projet permettra de savoir si l’activité électrique dans le cerveau des souris mutées est anormale avant même qu’elles ne deviennent adultes. Ces souris modélisent des maladies neurodégénératives. Or, les maladies neurodégénératives, telles que la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale, apparaissent majoritairement à l’âge adulte mais il est possible que des altérations soient présentes dès l’enfance, voire avant. En observant des altérations chez des souriceaux et jeunes souris, ce projet soulèverait la question de possibles altérations précoces dans des maladies diagnostiquées bien plus tardivement. Ce projet permettra également d’étudier les mécanismes à l’origine des potentielles crises d’épilepsie. Ainsi, à long terme, ce projet permettra de mieux comprendre l‘implication de PI dans la régulation du fonctionnement des neurones chez l’humain. Un rapprochement pourrait alors être fait entre les pathologies connues pour être liées à PI et l’épilepsie.

Procédures

Les souris étudiées pour ce projet pourraient présenter une activité électrique anormale dans le cerveau, voire des crises d'épilepsie. Afin de vérifier cela, les souris seront étudiées et recevront les gestes techniques mentionnés ci-après. Pour savoir si les animaux sont mutants ou non, un prélèvement d’un bout d’oreille et/ou de l’extrémité distale de la queue devra être réalisé. Ce geste sera réalisé par des personnes expérimentées, sur animal vigile, une seule fois dans la vie de l’animal et durant très peu de temps (cela ne prend que quelques secondes par animal). Une chirurgie d'une heure maximum sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Une seule procédure chirurgicale par animal sera réalisée. Chez les souris adultes la chirurgie sera réalisée à partir de 6 semaines (1,5 mois). A partir de ce moment, ces souris devront être isolées jusqu’à leur 12 semaines (3 mois). Elles seront donc isolées durant 6 semaines (1,5 mois) maximum. La chirurgie sera également réalisée sur des souriceaux de moins d’un mois (avant sevrage). Les souriceaux non-sevrés rejoindront le reste de la portée et leurs parents, qui auront été préparés pour éviter de les rejeter. Ils ne seront donc pas isolés. Après une période de convalescence, l’activité électrique du cerveau des animaux sera mesurée. Pour cela les souris devront être connectées à un système d’enregistrement. Cette connexion hebdomadaire est simple à réaliser et indolore pour les souris. Ces dernières seront vigiles, et pourront se déplacer librement durant le test. Pour les souriceaux, ces tests auront lieu sur 5 jours consécutifs, d’abord durant 1h par jour puis en augmentant progressivement cette durée jusqu’à 3h par jour. Au maximum, les souriceaux réaliseront 5 enregistrements par semaine, soit (5 enregistrements x 3h)15h d’enregistrement par semaine . Pour les souris adultes les tests auront lieu (4 enregistrements *24h) sur 96 heures consécutives par semaine jusqu’à leur 3 mois. Au maximum, les souris adultes réaliseront (6x96h) 576 heures enregistrements. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

une partie des souriceaux mutés sont systématiquement plus petits et plus légers que leurs congénères appartenant aux mêmes portées. Par ailleurs, ces souriceaux développeront potentiellement des crises d’épilepsie lorsqu’ils auront entre une et trois semaines. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont parfois des phases d'absence ou de baisse d’activité. Ces phases sont courtes, le plus souvent suivies par une période où le souriceau redevient actif, et les mères continuent de s’occuper des souriceaux même quand ils sont peu actifs. La moitié de ces souriceaux mutés décèderont trois semaines après la naissance. En revanche, les souris mutées adultes ne présentent pas de symptômes indésirables visibles. Lors du prélèvement (du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue) pour déterminer si l’animal est muté ou non, il pourra ressentir une légère et brève douleur. La chirurgie pourrait créer de l’inconfort et des douleurs, qui seront suivies de près par les expérimentateurs et personnels de soin animalier. Pour mesurer l‘activité électrique du cerveau, les animaux devront être isolés. Pour les souriceaux, il pourrait y avoir un stress et un inconfort lié à l’absence de leur mère. En dehors des phases de test, le protocole mis en place permettra aux souriceaux et à leurs parents d’être hébergés ensemble, ce qui aura un effet bénéfique sur l’ensemble des animaux. A l’inverse les souris opérées à l’âge adulte devront être isolées dès la chirurgie et le resteront pendant la durée de l’étude jusqu’à l’âge de trois mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l’étude seront produits grâce à des accouplements contrôlés, les animaux surnuméraires seront euthanasiés au moment du sevrage (c’est-à-dire lorsqu’ils auront 3 à 4 semaines) pour ne pas stresser leurs parents. Les animaux inclus dans les procédures de chirurgie et enregistrements seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge de trois mois maximum si aucune crise ne survient. Ils ne peuvent pas être gardés en vie et réutilisés après ce projet car ils auront des électrodes implantées dans le cerveau. Les parents seront euthanasiés à la fin de l’étude car ils n’auront plus l’âge de se reproduire.

Remplacement

Avec ce projet nous souhaitons étudier l'implication d’une protéine dans la régulation de l’activité électrique du cerveau. Plus précisément, il s’agira de définir si une mutation, lorsqu’elle a lieu dans un type cellulaire spécifique, entraine la survenue de crises d’épilepsie. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduisent pas toutes les propriétés des crises d'épilepsie observées dans un cerveau entier. La modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à notre question scientifique. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait s’assurer que la mutation soit présente uniquement dans les cellules qui nous intéressent (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem), tout en mesurant l’activité électrique du cerveau des sujets vivants. Finalement, l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité du système nerveux et la complexité comportementale.

Réduction

Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution des groupes expérimentaux en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Au total nous aurons 132 animaux inclus dans le projet, dont 12 reproducteurs et 35 souris opérées. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul statistique. Ce dernier pourra être ajusté selon les premiers résultats, selon les différences observées entre chaque groupe et la possible variabilité au sein d’un même groupe. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d‘animaux par cage, la température ambiante, le taux d‘humidité, les cycles de lumière, et l’accès à l’eau et à la nourriture. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et, si besoin d’une maison en carton. Le prélèvement du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue (pour savoir si les animaux sont mutants ou non) est rapide, parfaitement maitrisé et pratiqué au calme. Il a lieu au même moment que l’identification pour limiter la manipulation de la portée. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination. Le transport des animaux sera réalisé selon les normes en vigueur et avec un transporteur agréé. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Avant la chirurgie, des phases d’habituation permettront aux souriceaux et à leurs parents de découvrir les gestes et matériaux nécessaires pour l’opération. Lors de la chirurgie et après, une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera assurée. Une fois anesthésié, les animaux seront maintenus à bonne température et leurs yeux seront protégés pour qu’ils ne se dessèchent pas. Suite à la chirurgie, les animaux feront l’objet d’un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée jusqu’à leur réveil complet. L’expérimentateur et le personnel de soin animalier réaliseront ensuite une surveillance quotidienne étroite pendant une semaine. Un médicament antidouleur sera administré toutes les 12h. Si nécessaire, ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. Après la chirurgie, les animaux seront pesés chaque jour pendant une semaine, puis une fois par semaine pour s‘assurer qu‘ils ne perdent pas de poids.

Choix des espèces

Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives et l’épilepsie. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1) Cette étude nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’une protéine d’intérêt dans un seul type de cellules du cerveau). 2) Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. De cette façon, le nombre d’animaux nécessaires est réduit. 3) Cette espèce est largement utilisée pour étudier les crises d’épilepsie. Elle a été explorée de manière exhaustive, du niveau moléculaire jusqu‘à l‘échelle du comportement animal. Cela permet d‘avoir une solide base scientifique sur laquelle le projet se repose. 4) Les rongeurs ont un cerveau qui génère des activités électriques et des crises d’épilepsie dont les mécanismes pathologiques, au niveau moléculaire et cellulaire, sont similaires à l'humain. Les procédures seront réalisées sur des animaux de 7 jours (prélèvement pour savoir si les animaux sont mutés ou non) à 3 mois (euthanasie). Pour une partie des animaux, la chirurgie aura lieu quand ils auront 12 à 14 jours. Pour l’autre partie, la chirurgie sera réalisée quand les animaux auront 6 semaines (1,5 mois).

Rendues insuffisantes cardiaques par une chirurgie de cent dix minutes dans un premier établissement, puis transportées vers un second, 92 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles y reçoivent un traitement ou un placebo par voie orale, puis une suspension de SARS-CoV-2 dans le nez, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Ce qui est fait pendant l'opération de cent dix minutes n'est jamais précisé, alors que le RNT annonce un infarctus du myocarde et une insuffisance cardiaque installée, et qu'il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des échographies des huit semaines suivantes. Sur le remplacement, le porteur conclut à la "nécessité" de réaliser l'étude in vivo, aucune approche in vitro ne reproduisant selon lui l'ensemble d'un processus d'infection.

Objectifs

Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.

Procédures

Au sein de l’établissement EU1, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines (20 min). 4) envoi des animaux à l’établissement partenaire. Au sein de l’établissement EU 2 , chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo par voie orale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales décrites ci-dessus, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements des organes.

Remplacement

Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.

Réduction

Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés (n=5) soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie (n=13). De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2, voir Annexe 1) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test » soit n=36), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.

Choix des espèces

La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.

Après une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, des souris développent des nodules pulmonaires qui peuvent causer des douleurs, des difficultés respiratoires, une prostration et l'arrêt du toilettage. 1 794 souris de 6 à 10 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : selon les groupes, une injection sous anesthésie ou sous simple analgésie locale, puis trois ou quatre injections éveillées, et pour 54 d'entre elles une chirurgie suivie de 1 à 3 heures de microscopie intravitale. Le porteur affirme que le point final de chaque expérience "se situe bien avant d'atteindre les points limites", pour des procédures qu'il déclare pourtant en souffrance sévère. Toutes sont tuées pour des prélèvements de tumeurs ou d'organes, ou à l'issue d'une chirurgie prolongée, et 810 d'entre elles reçoivent encore une injection éveillées une heure avant leur mise à mort.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces chez tous les patients. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers présents dans les tumeurs murines et humaines. Ils sont les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans les tumeurs aux cours de l’immunité antitumorale et lors de traitements combinés d’immunothérapie (anti-CTLA-4 et anti PD-1). De plus, un traitement augmentant la fréquence et la maturité de ces vaisseaux induit une meilleure réponse à l‘immunothérapie dans des modèles précliniques murins. Enfin, dans les tumeurs fortement infiltrées par les cellules immunitaires ou tumeurs « chaudes », la présence de lymphocytes B et de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) riches en lymphocytes B dans les tumeurs est souvent associée à une bonne réponse à l’immunothérapie. Cependant, les mécanismes qui régulent l’entrée des lymphocytes B dans ces tumeurs restent inconnus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces vaisseaux dans l’infiltration des lymphocytes B et la formation des TLS dans les tumeurs « chaudes » traitées par immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs dans l'établissement de structures lymphoïde tertiaires (TLS). Ces TLS sont des structures qui ressemblent en partie à nos ganglions lymphatiques et leur induction et leur développement pourrait favoriser la réponse immunitaire anti-cancéreuse.

Procédures

540 souris subiront une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes), ces 540 animaux subiront aussi quatre injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 1200 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes) ainsi que trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 810 souris parmi ces 1200 inclus subiront en plus, 1h avant leur mise à mort, une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). 54 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes), ces 54 animaux subiront trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). Ces 54 animaux seront anesthésiés avant la pose d’un cathéter, puis subiront une chirurgie nécessaire à la microscopie intra vitale, cette procédure dure moins d’1h, l’imagerie quant à elle dure en moyenne une heure pour la microscopie intravitale à champ large et de 2 à 3h pour la microscopie intravitale multiphoton.

Impact sur les animaux

Pour les modèles de développement de tumeurs au niveau des poumons, l’injection des cellules tumorales dans la veine de la queue peut induire une douleur modérée et la contention de l'animal pour cette injection peut entrainer du stress. L’évolution du cancer se manifeste par une apparition de nodules au niveau des poumons ce qui peut causer des douleurs, des difficultés respiratoires et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Pour les modèles de tumeurs développées, l’injection des cellules tumorales peut provoquer du stress chez l'animal. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les traitements d'immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme avec une inflammation et une auto-immunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes ou bien à l’issue d’une chirurgie prolongée ne permettant pas de réutilisation des animaux

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement, en utilisant des tests de comparaison de moyennes multiples appropriés. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille des scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie locale et avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.

À J0, un filament est poussé dans l'artère carotide de chaque rat pour boucher une artère du cerveau, l'animal reste éveillé environ quarante-cinq minutes avec l'artère obstruée, puis il est rendormi pour retirer le filament. Suivent des prélèvements de 500 µL de sang à J-7, J0, J1 et J7, cinq séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à J14 et onze journées de tests comportementaux étalées jusqu'à J30. 3 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire d'un côté du corps et des difficultés à manger et à boire dans les premiers jours. Le projet teste pour des partenaires industriels des molécules contre l'accident vasculaire cérébral, et se termine par l'ouverture du thorax et de l'abdomen des rats pour ponctionner le cœur et prélever le cerveau.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements, la circulation sanguine dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC sévère chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la bifurcation carotidienne dans le cou afin d’induire mécaniquement un AVC ischémique via l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne par un filament inséré dans l’artère carotide externe. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera entre 20 et 30 minutes puis l’animal sera maintenu éveillé environ 45 minutes avant d’être soumis à la deuxième chirurgie permettant le retrait du filament. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation. La pose de cathéter prendra environ 3 minutes. Se dérouleront à J-7, J0, J1 et J7 des prélèvements sanguins sur les animaux vigiles au niveau de la veine caudale à l’aide d’un cathéter 24G inséré à travers la peau. Un volume de 500 µL sera prélevé à chaque temps. Les animaux seront randomisés dans des sous-groupes expérimentaux de manière à ce que chaque animal ne soit pas soumis à l'ensemble de ces prélèvements. À J0, J1, J5, J7 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J2, J3, J5, J7, J14, J21, J24, J25, J28, J29 et J30. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle reproduit les effets d'un AVC ischémique sévère, entraînant des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l’animal à court, moyen et long terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC sévère, les animaux peuvent présenter des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dans les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à interagir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière. Les études de tolérance réalisées avant les études d'efficacités visent à identifier tout effet secondaire potentiel de la molécule thérapeutique.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données (α=0.05 ; β=0.8) permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 26 par groupe expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les rats seront placés à deux ou trois par cage tout au long de l'expérience. Pour faciliter leur récupération après la chirurgie, ils pourront être isolés pendant quelques jours avant de retrouver leurs congénères. Leur bien-être sera surveillé deux fois par jour par du personnel qualifié en semaine, et tous les jours le week-end et les jours fériés. Les rats seront pesés régulièrement, au moins deux fois par semaine. Pendant la chirurgie, les rats seront anesthésiés et recevront un analgésique pour soulager la douleur. L'anesthésie sera maintenue jusqu'à ce qu'ils se réveillent. Chaque incision sera précédée d'une tonte et d’une désinfection. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Les sutures seront faites individuellement pour minimiser les risques de complications. Après la chirurgie, les rats seront placés dans une cage chauffante pendant environ une heure avant de retourner dans leur cage habituelle, où ils auront de la nourriture et un gel nutritif pour les aider à récupérer. Leur état sera surveillé de près, et en cas de problème dépassant les limites fixées, ils seront euthanasiés. Les rats seront également surveillés attentivement pendant les jours suivant la chirurgie, et recevront une autre dose d’antidouleur le lendemain de l'opération.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animal la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 350g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.