Recherche fondamentale

Soumis à un régime enrichi en glucose ou en methylglyoxal et à des prises de sang répétées par ponction de la veine de l'aile, 90 diamants mandarins subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique attendre du traitement une accélération de leur vieillissement, et prévoit de les suivre jusqu'à leur mort, celle-ci pouvant être provoquée quand l'amaigrissement, la diarrhée ou l'état du plumage rendent leur état incompatible avec le maintien en captivité. Les oiseaux retenus ont déjà été utilisés dans des expériences antérieures sur le stress social ou les stratégies de reproduction, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction. Il affirme qu'aucune alternative sur culture cellulaire n'existe et que "les études sur l'animal entier restent la seule alternative scientifique".

Objectifs

Ce projet fait partie des projets pluridisciplinaires mêlant approches biologiques et chimiques pour une meilleure compréhension des adaptations animales à leurs environnements. L’approche expérimentale décrite ci-dessous forme une tâche d'un programme de recherche plus global nommé « AGEs : résistances des oiseaux aux glycations », et ayant obtenu un financement international en 2021.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension du métabolisme des oiseaux (ici du glucose) associé à leur plus grande longévité. Test de causalité entre stress du glucose et durée de vie. Caractérisation potentielle de mécanismes protecteurs vis à vis d'une glycémie élevée. Pistes d'études futures chez les mammifères et l'Homme.

Procédures

Nous réaliserons les prélèvements répétés suivants : -Prise de sang : Les prises de sang se font en effectuant un petit trou avec une aiguille (0.45*12 mm) dans la veine alaire (oiseaux). Le sang sera récupéré dans un capillaire de 75 microlitres. La fréquence des prélèvements est de 10 jours pour l’expérimentation pilote et mensuelle ou trimestrielle pour l’expérimentation finale. Les prises de sang à jeun se feront au réveil, après retrait de la nourriture et de la boisson la veille au soir. Les oiseaux étant inactifs dans le noir, cela ne perturbera que peu leur cycle physiologique. Les prises de sang se feront selon un protocole déjà décrit. Nous effectuerons également un suivi mensuel de la biométrie des individus (mesures masse, oiseaux [longueur du tarse, longueur tête-bec] et trimestriel de leur taux métabolique (respirométrie indirecte sur la nuit).

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux soumis aux traitements glucose ou methylglyoxal sont une accélération du taux de vieillissement. Mais cette prédiction est basée sur l'idée que ceux-ci ne pourront montrer d'augmentation de leurs mécanismes putatifs de protections vis à vis du stress du glucose. Post-expérimentation : À l’issue de l’expérimentation pilote (45 j), une prise de sang spécifique sera effectuée et diluée dans un milieu de culture cellulaire, pour des essais de mesure des aberrations télomériques. Si cet essai est couronné de succès, cette mesure sera répétée au début et à la fin de l’expérimentation finale. Les oiseaux de l’expérimentation pilote seront aussi dans l’expérimentation finale (objectif éthique de réduction). Le but de celle-ci étant de suivre les animaux jusqu’à leur mort naturelle, les individus seront sacrifiés lorsque leur état sera jugé incompatible avec le maintien en captivité (voir procédure expérimentale). Conditions de captivité : Pour l'expérimnetation test, les diamants mandarins seront en cages standards (150 cm de long, 70 cm de large et 100 cm de hauteur) placées en extérieur (voir ci-après). Pour l'expérimentation ultime, les diamants mandarins seront maintenus dans des cages extérieurs qui font 400 cm de long, 400 cm de large et 215 cm de hauteur, permettant de larges vols. Nous maintiendrons les individus par groupes expérimentaux ad libitum, avec abris chauffés. Les animaux sont déjà acclimatés en élevage extérieur, et sont donc non-stressantes pour les individus. Le diamant mandarin étant une espèce sociale, les individus seront répartis soit par groupe de 3 (expérimentation pilote) ou de 15 (expérimentation finale).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie (sauf détérioration drastique de leur état général, voir plus haut). Jusqu’à leur mort naturelle, qui pourra être induite si l’état général de l’animal le nécessite (e.g. amaigrissement marqué détecté par dynamique de masse ou réduction des muscles pectoraux (bréchet saillant), diarrhée, plumage mal entretenu, animal toujours au sol…). Le décision sera prise en accord avec la SBEA et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Notre but est de mesurer les effets in vivo d’une diète enrichie en glucose ou en methylglyoxal sur la physiologie des individus, plus précisément les relations entre réactions de glycation et marqueurs pro-vieillissement. Il est donc nécessaire d’avoir recours à des animaux vivants pour mener ce projet à bien.Enfin, les expériences sur la résistance aux glycations nécessite une approche physiologique qui ne peut être réalisée que chez l’animal vivant, mais nous utiliserons des animaux issus de la population maintenue dans notre animalerie ou en provenance d’un laboratoire partenaire, tous ayant été déjà utilisés en partie dans des expériences passées sur l’évolution des stratégies de reproduction des 2 sexes utilisant une approche de génétique quantitative (oiseaux du laboratoire partenaire) ou sur l’effet du stress social sur le vieillissement (oiseaux de notre animalerie). Il n’existe aucune alternative sur culture cellulaire pour étudier les effets des glycations sur le vieillissement. Le vieillissement étant un phénomène multifactoriel, les études sur l’animal entier restent la seule alternative scientifique.

Réduction

Avant de mettre en place notre étude finale, nous effectuerons une courte étude pilote visant à évaluer sur un groupe restreint d’oiseaux (n=18) les effets plasmatiques de différentes doses de glucose et methylglyoxal. Une fois la dose expérimentale déterminée, le projet sera réalisé en accord avec la règle des 3R. Nous allons utiliser 72 individus supplémentaires (pour un total de 90 individus) répartis en 3 groupes de 30 individus chacun (Contrôle, glucose, Methylglyoxal), afin d’avoir une puissance de test statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d’animaux impliqués dans l’expérience ; en effet une partie des animaux (les 18 individus initiaux) sera utilisée à la fois dans l’étude pilote et l’étude finale.

Raffinement

Les volières extérieures sont suffisamment grande pour permettre un vol important des animaux, des interactions sociales nombreuses et une densité d'individus faible. Pour l’enrichissement des cages nous utiliserons des perchoirs et branchages naturels, et des abris chauffés.

Choix des espèces

1) Espèce largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution et en biologie de la santé, notamment sur l’immunité ou l’étude des facteurs environnementaux modulant le stress oxydatif et le vieillissement. 2) Facilité de manipulation et de maintien en élevage de ce modèle. Les prises de sang de 75 microlitres peuvent être réalisées de manière peu ou non invasive (sans seringue, aiguille et récupération des gouttes de sang avec un capillaire). 3) Le responsable du projet a plus de 15 années d'expérience concernant l'utilisation de ce modèle pour la recherche en biologie évolutive. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 4-6 ans, c’est à dire relativement vieux (espérance de vie maximale en captivité 9 ans). Le but étant d’évaluer l’impact du traitement sur le taux de vieillissement sur 3-4 ans, l’utilisation d’adultes à mi-parcours de leur vie est une option clef.

Pour évaluer si les aloses franchissent des barrages de navigation, 50 grandes aloses adultes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes remises à l'eau vivantes après marquage. Capturées au filet puis anesthésiées, elles reçoivent un émetteur acoustique implanté dans l'estomac et subissent un prélèvement d'écailles, la manipulation ne dépassant pas une minute. Le porteur reconnaît que la capture, le transport, la stabulation, l'anesthésie et le marquage peuvent induire un stress, et son propre calcul d'effectif intègre de rares cas de mortalité post-opératoire ainsi que la régurgitation possible des émetteurs. Il affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à des animaux autochtones, et justifie la limite de 50 individus autant par la réduction que par le coût élevé des émetteurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1-évaluer les conditions actuelles de franchissement de barrages par un poisson migrateur menacé, la grande alose, en analysant les voies de passages, les conditions environnementales favorables et les temps de migration ; 2-produire des connaissances permettant l’évaluation des pratiques de gestion des ouvrages de navigation (écluses) situés au niveau de ces barrages, pour faciliter la migration de cette espèce.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration de la grande alose, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Il permettra également d’évaluer quelles sont les voies de passages prioritaires (écluses ou passes à poissons) et d’adapter le cas échéant les modalités d’ouverture des écluses.

Procédures

Les aloses capturées seront anesthésiées puis marquées par implantation gastrique d'émetteur acoustique sans chirurgie (50 individus), et feront l’objet de prélèvements d’écailles. La manipulation n’excédera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation, l’anesthésie et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Toutefois, les opérateurs ont réalisé ces étapes lors de deux phases précédentes du projet sans aucun dommage.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. Nous attendons des données sur la propension des individus à se déplacer et à poursuivre migration jusqu’aux frayères potentiellement accessibles pour elles. Par ces observations écologiques, il s’agira d’évaluer l’impact cumulé des obstacles physiques sur l’accessibilité des grandes aloses aux habitats de reproduction. Il est donc nécessaire d'avoir recours à des animaux autochtones pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le projet prévoit le marquage de 50 aloses, sur une ou plusieurs années en fonction de la capturabilité (maximum 5 ans), ce qui est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements, et évaluer la franchissabilité des différents ouvrages, les temps d’attente moyens et les voies de passage (écluses / passes à poissons). En effet, chez cette espèce migratrice et selon le type d’ouvrages de franchissement, il peut être attendu un taux de montaison de 50 à 70 %. Cet effectif théorique tient compte des rares cas de mortalité post-opératoire, de la régurgitation possible des émetteurs chez de rares individus et de la mortalité des animaux par prédation. Les redétections attendues grâce à la télémétrie acoustique seront a priori importantes, d’où une limitation à un maximum de 50 aloses marquées ; cet effectif est également justifié par le coût élevé des émetteurs. Cet objectif apparaît comme une cible réaliste au vu des effectifs en migration sur la rivière étudiée, en dépit d’un caractère très aléatoire des remontées attendues chez les poissons migrateurs, en particulier chez l'alose.

Raffinement

Le protocole a été pensé pour tenir compte de la grande sensibilité des aloses, particulièrement aux opérations de capture-biométrie-marquage. Les techniques de captures ont été éprouvées et visent à limiter les traumatismes physiques et les temps d’attente. Le transport des aloses sera limité et réalisé dans des conditions permettant de réduire le stress. Toutes les étapes du protocole, de la capture au réveil, seront réalisées précisément sur le même site, sur le bateau ou à proximité de la rivière. La manipulation s’effectuera à l’aide d’une épuisette non abrasive. Les animaux seront gardés en stabulation uniquement en cas de nécessité et le moins longtemps possible dans des bacs adaptés constamment alimentés en eau de rivière fraîche. L’utilisation d’un brancard pour l’anesthésie puis le marquage permet de réduire le stress durant la phase d’induction. Les poissons seront régulièrement observés et la physico-chimie surveillée. La méthode de marquage tient compte des spécificités et de la sensibilité de l’espèce et a déjà été expérimentée et validée. Des mesures sont prises (anesthésie individuelle, faible poids de la marque, maintien en immersion) pour réduire les effets délétères sur la survie et le comportement de l’animal. La phase de réveil se déroule dans des cages flottantes positionnées dans la rivière. Ceci permet de limiter les manipulations des poissons après marquage. Dès reprise de la nage, les aloses seront relâchées.

Choix des espèces

L’espèce cible est la grande alose (Alosa alosa). Cette espèce migratrice remonte les fleuves de la côte atlantique, et peut être considérée comme un indicateur pertinent de connectivité des grands cours d’eau (latérale, longitudinale). Grâce à l’aménagement de passes à poissons au niveau des barrages et à l’adaptabilité de l’espèce, l’alose voit sa population s’accroître sur certains bassins. Mais compte-tenu du faible recul disponible sur ces migrations, il semble d’intérêt de suivre plus finement les comportements des individus à l’approche des barrages. Ces éléments de connaissance permettront d’envisager des aménagements futurs (passes à poissons, gestion des écluses, habitats écologiques favorables) de manière plus objective. Les poissons seront au stade adulte reproducteur. Ils seront marqués avant la maturation complète des gonades (soit entre avril et début mai). Quelle que soit la taille des géniteurs marqués (dès 400 mm pour les petits mâles), le ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » sera en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique pour la plupart des espèces de poissons.

Pour mettre au point une reconstruction de mâchoire par ingénierie tissulaire, 19 brebis subissent des chirurgies sous anesthésie générale de plusieurs heures, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les échantillons osseux. Chaque animal subit un prélèvement de moelle osseuse, puis la pose d'au moins huit implants pendant deux heures, et pour sept d'entre elles un transfert microchirurgical de trois à quatre heures. Le porteur prévoit une gêne à l'alimentation après la chirurgie maxillo-faciale et la mise à mort immédiate en cas de rupture de la plaque d'ostéosynthèse. Il annonce comme bénéfice d'éviter aux patients des prélèvements osseux "lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques", après un premier passage par le rat jugé trop limité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale visant à s’affranchir des prélèvements osseux autologues. Un travail précédent a permis de poser les bases d’une procédure de régénération ostéo-cutanée couplant un biomatériau osseux synthétique, un pédicule perforant et un lambeau cutané. Il a été effectué chez le rat, avec pour preuve de concept finale, la régénération d’un défaut massif ostéo-cutané (hémi-mandibule) chez le rat. Aujourd’hui, l’objectif de ce projet est de s’affranchir des limites du modèle murin pour élaborer la preuve de concept finale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes ostéo-cutanées en s’affranchissant de prélèvements dommageables. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéo-cutanés tels qu’un lambeau de fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire) et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelles sur la zone donneuse.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Le temps de prélevement de la moelle osseuse est estimée à 30 minutes. Ce dernier permet d'enrichir les implants afin de favoriser l'ossification. La durée d'implantation des 8 implants est de 2h et le transfert microchirurgical est estimé à 3-4h. Après un période postopératoire (plus ou moins longue selon les procédures), les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les echantillons osseux.

Impact sur les animaux

Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la mise en place de l’implant autour du pédicule in situ - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier Les éventuels effets dureront 8 semaines lors de la procédure de mise en place d’implants. Concernant la chirurgie maxillo-faciale de la preuve de concept, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée. L'alimentation sera donc adaptée en fonction des possibles difficultés observées. Potentiellement, dans le pire des cas, une exposition ou rupture de la plaque d'ostéosynthèse pourrait advenir, ce qui engendrera directement une euthanasie de l'animal concerné.

Devenir

A la suite de la procédure,les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prelever et analyser les échantillons osseux.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux n’est possible : les systèmes de bioréacteurs in vitro n'étant pas assez avancés pour réaliser le projet. Seul un modèle animal vivant permet de nos jours la génération d'une construction ostéo-cutanée transplantable selon les principes du bioréacteur in vivo. L’utilisation d’un modèle animal plus petit a montré des limites lors de la preuve de concept finale (procédure trop lourde, limite technique et anatomique). C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle ovin est indispensable pour mener ce projet innovant.

Réduction

Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de brebis nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente, le nombre d’animaux pour les procédures d’implantation a été évalué à 5 avec une implantation d’au minimum 8 implants par animal. 7 animaux seront nécessaires pour la réalisation de la preuve de concept microchirurgicale.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille présentée en annexe 1 : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (Echelle de scoring). De façon générale, la gestion de la douleur per et post-opératoire est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles d’analgésie et d’antalgie en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

La brebis permet une poursuite de l’approche in vivo réalisée précédemment chez le rat avant de tester les hypothèses thérapeutiques chez l’Homme. Il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des brebis femelles adultes, c'est-à-dire, âgées de 4 à 7 ans, leur poids sera d’environ 80 kg, ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années.

Pour mesurer les effets du réchauffement climatique sur le vieillissement, 80 diamants mandarins adultes sont exposés quatre heures à 30 puis 40 °C, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque oiseau, qui pèse entre 14 et 20 grammes, subit quatre prises de sang de 75 microlitres, l'implantation d'une puce RFID sous la peau et des prélèvements de plumes. Aucun ne sera tué à l'issue, tous restent en élevage et pourront être réutilisés dans d'autres expériences. Le porteur écrit que le stress provoqué "n'est pas un effet indésirable mais l'effet désiré", et justifie le classement en gravité modérée par les 45 °C que l'espèce subit en Australie, alors que les oiseaux du projet vivent en captivité.

Objectifs

Le réchauffement climatique actuel entraîne un stress thermique chez les organismes vivants. L’augmentation future de la température va encore exacerber ce phénomène. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de ce stress thermique sur la reproduction et la physiologie chez une espèce d’oiseau qui est le diamant mandarin. En particulier, nous allons analyser le métabolisme, le vieillissement cellulaire et des régulateurs endocriniens comme la corticostérone qui est une hormone métabolique et marqueur de stress. Nous allons mimer en laboratoire les conditions du réchauffement climatique en provoquant un stress thermique. Le milieu sera enrichi grâce à un enrichissement structurel (balançoire, perchoirs, piscines) et un enrichissement alimentaire (millet, os de seiche) dans les volières. Étudier ces effets sur les mécanismes clés du vieillissement, ainsi que leurs conséquences sur la reproduction et la survie des individus pourrait nous aider à mieux prédire la dynamique des populations en réponse aux changements globaux.

Bénéfices attendus

Tester les conséquences du stress thermique sur la condition physique et les mécanismes physiologiques sous-jacents pourra permettre une meilleure modélisation des effets futurs du changement climatique sur la réponse adaptative des organismes vivants.

Procédures

#procédure 1 (abandonnée) : sur poussins La bioimpédance est mesurée de façon non-invasive en créant une tension aux bornes des électrodes placées sur le corps, ce qui permet de quantifier la quantité d’eau corporelle et la quantité de graisses. Ces mesures sont effectuées pour les poussins à J10, J30 et J100 et pour les adultes au moment de la mise en couple et quand les poussins ont 30 jours. Le suivi de la température interne se fera à l’aide pit-tags RFID sous-cutané (après désinfection à l’alcool dilué à 70%, injection à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille stérile de 3,17 mm en sous-cutané interscapulaire). Cette opération est la même que le puçage des chats et chiens. Voici les durées de chaque geste cité qui seront réalisés sur animal vigile: prélèvement sang et insertion du pitTAG (30 s chacun), prélèvement de plumes (1s), analyse métabolique dans la chambre calorimétrique et mesure de la bioimpédance (20 mn chacun). Chez les poussins, des prélèvements sanguins seront effectués en cours de croissance (J7, 20 μl), en fin de croissance (J30, 100 μl), à moyen terme (J100, 100 μL), puis annuellement jusqu'à leur mort, pour mesurer les bio-marqueurs présentés ci-dessus ; le taux métabolique au repos mesuré sur une durée de 30 mn et la déshydratation seront également mesurés à ces moments-là. Les animaux adultes seront soumis à 4 prélèvements sanguins d’une durée de 30 secondes chacun réalisés sur animaux vigiles. #Avenant (procédure 2) : sur 80 adultes. Les individus seront exposés pendant 4h à 30°C et 40°C avec 30 jours de délais entre chaque exposition. Nous effectuerons 4 prises de sang (systématiquement 75µL prélevés) sur ces individus : une immédiatement après exposition à 30 et 40°C, et une 48h post-exposition, afin d'évaluer la capacité de récupération à un stress.

Impact sur les animaux

Les protocoles de stress thermique sont conçus pour engendrer une perturbation de l’homéostasie des animaux pouvant créer un inconfort, mais pas de douleur physique. Ils ont déjà été employés avec succès chez le modèle aviaire choisi, et ce à des stades équivalents. L’induction d’un ‘stress‘ modéré chez les animaux n’est pas un effet indésirable mais l’effet désiré dans le cadre de la question scientifique de ce projet. Nous considérons que le stress thermique est modéré car ce sont des animaux qui dans leur milieu naturel en Australie subissent des températures beaucoup plus élevées (jusqu’à 45 °C). C’est pour cette raison que nous avons classé cette procédure dans la catégorie «modéré». Si l’animal s’avère présenter un comportement particulier (inactivité), un aspect général modifié (plumes ébouriffées), une diarrhée ou une perte de 20% de son poids, il sera remis en conditions d’élevage contrôle (23°C) et ils seront soumis à un traitement en fonction des symptômes en accord avec une prescription du vétérinaire de référence.

Devenir

Les 80 adultes seront gardés en élevage et éventuellement réutilisés pour d’autres expériences.

Remplacement

Le projet vise à comprendre l’effet du stress thermique sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacent. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives disponibles à ce jour.

Réduction

Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire (20 nids/groupe) à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs. Cela est possible grâce à l’utilisation partielle d’un suivi longitudinal où chaque individu sera échantillonné (sang et plumes) avant d’entrer en procédure, ce qui permettra de corriger les données similaires obtenues post-traitement par la variabilité interindividuelle initiale.

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux expérimentaux aussi bien avant l’entrée en protocole, que pendant les procédures : - phase d’habituation dans de grandes volières extérieures. - enrichissement structurel (balançoire, perchoirs) et enrichissement alimentaire (millet, os de seiche) - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance et/ou gain de masse < 20% du gain de masse du groupe contrôle (= points limites). A la sortie du traitement (exposition à 30 ou 40 °C), les individus seront directement placés dans leur cage avec eau à disposition ainsi qu’une piscine. Un suivi pendant 1h sera mis en place avec un observateur dans la pièce. Quelques gouttes d'eau seront immédiatement placées au bec des individus en cas de signes de détresse.

Choix des espèces

1) Espèce largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution, notamment sur le vieillissement cellulaire et la physiologie, l’étude des compromis d’histoire de vie, le comportement social, la sélection sexuelle et les effets maternels. 2) Facilité de manipulation et de maintien en élevage de ces oiseaux. Les prises de sang de 100 µl peuvent être prélevées puisque les individus font 14-20g. Les animaux seront utilisés au stade adulte pour identifier les effets du stress thermique pendant la reproduction des parents des nids suivis, ainsi qu’au stade poussin pendant toute la croissance (jusqu’au J100) afin d’identifier les effets de ce stress pendant ce stade de vie.

Pour entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation qui affaiblit leur système immunitaire et enflamme leurs poumons, 545 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent un prélèvement au bout de la queue pour le génotypage, et chaque adulte destiné aux expériences une prise de sang sans anesthésie, juste avant sa mise à mort pour le prélèvement des organes. Les souris mutantes grandissent moins et meurent davantage à partir de six mois, et une grille de score hebdomadaire fixe le point limite qui déclenche leur mise à mort. Le porteur juge la règle du remplacement "pas applicable ici", faute de pouvoir étudier in vitro les coopérations entre cellules immunitaires. Les souris gardées pour l'entretien de la lignée et les croisements restent en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions des lymphocytes (cellules incluses dans les globules blancs et impliquées dans la réponse du système immunitaire) ce qui conduit à induire un déficit immunitaire (baisse de la fonction d’une partie au moins des cellules du système immunitaire) chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris portant cette mutation ainsi que l’identification de la mutation par analyse génétique pour identifier les animaux.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire. Un prélèvement tissulaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souriceaux seront prélevés à la queue pour le génotypage, et un prélèvement sanguin sera réalisé sur chaque animal adulte utilisé dans les expériences, juste avant la mise à mort. Ces gestes peuvent générer de la douleur, cependant les gestes réalisés sont des gestes de base, rapides (moins de 2 minute par geste), pour lesquels nous sommes expérimentés, donc ils ne nécessitent pas d'anesthésie. De plus les animaux sont habitués à la contention réalisés pendant ces gestes, ce qui réduit leur stress.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

Section du réseau lymphatique de la peau et ablation des ganglions de l'aisselle et du bras : 256 souris femelles sont opérées sous anesthésie pour provoquer un lymphœdème, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite, éveillées, une injection quotidienne d'une substance non nommée, cinq jours par semaine, pendant deux à huit semaines selon les groupes, puis une lymphographie sous anesthésie générale. Le porteur décrit le lymphœdème comme "une pathologie douloureuse et handicapante", puis annonce chez ces souris un seul effet indésirable, un gonflement de la patte opérée de 10 à 15 %. À l'issue de la lymphographie, elles sont tuées sans réveil pour récolter leurs tissus.

Objectifs

La principale fonction du système lymphatique est de collecter la lymphe, ce fluide riche en protéines et en lipides, afin de le ramener à la circulation sanguine par le biais de la veine sous-clavière. Ces deux systèmes travaillent en étroite collaboration afin de maintenir l’équilibre homéostasique de l’organisme. En cas de perturbation de ce système, lors du traitement du cancer (ablation des ganglions lymphatiques, radiothérapies, chimiothérapies), on observe la formation d’oedèmes massifs qui peuvent, à long terme, devenir douloureux et handicapants: les lymphoedèmes. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons utiliser un modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez la souris. Les vaisseaux lymphatiques interagissent étroitement avec la matrice extracellulaire les environnant. Des changements dans la composition ou les propriétés biomécaniques de cette matrice sont donc susceptibles d’inhiber leurs fonctions. Nous étudierons dans ce modèle le développement de la fibrose (accumulation et remodelage pathologique de matrice), les régulations moléculaires des facteurs de croissance lymphangiogéniques et des protéines impliquées dans le remodelage de la matrice ainsi que les propriétés bio mécaniques de cette matrice afin d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction endothéliale lymphatique en normalisant la matrice extracellulaire et ainsi de pouvoir proposer un traitement pour le lymphoedème

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal.. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Pour étudier les neurones qui commandent la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Chacune subit une ou deux chirurgies de quatre-vingt-dix minutes pour l'infusion de substances dans le cerveau et la pose d'un dispositif d'enregistrement, puis vit isolée dans un baril individuel pendant les quatre semaines d'expérimentation. Le porteur compte parmi les nuisances le stress de cet isolement et le dérèglement provoqué du sommeil, l'objectif étant de reproduire chez la souris les mouvements violents du trouble comportemental humain. Il écarte la mouche, le poisson zèbre et le ver C. elegans faute de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes cérébraux ne constituent "pas encore" une alternative crédible.

Objectifs

Le sommeil paradoxal (SP) pendant lequel nous rêvons se caractérise au niveau physiologique par une forte activité cérébrale et une paralysie musculaire. Plusieurs pathologies sont associées à une défaillance de cette paralysie comme les apnées/ronflement, la narcolepsie-cataplexie et les troubles comportementaux en SP (TCSP). Le patient souffrant de TCSP extériorise ses rêves sous la forme de mouvements involontaires violents (bagarres, coups, cris, paroles). Le TCSP est un trouble neurologique annonciateur de maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et serait dû à la mort des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP. Nos travaux antérieurs chez le rat ont permis d’identifier ces neurones et de montrer expérimentalement que lorsqu’on les lèse, on est capable de reproduire un tableau symptomatique proche du TCSP humain alors que le SP lui-même est par ailleurs normal. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cérébraux responsables du SP qui sont largement inconnues. Pour aborder cette question, nous proposons d’affiner les connaissances physiologiques et fonctionnelles des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP chez la souris par l’utilisation d’un éventail d’approches génétiques et moléculaires et ainsi mieux comprendre les causes neurologiques du TCSP. Si nos modèles d’étude nous permettent d’induire des signes de TCSP, nous aurons réussi à créer un nouveau modèle animal de cette pathologie qui nous permettra ensuite de comprendre l’origine des mouvements anormaux du TCSP et d’élaborer des traitements ciblés efficaces.

Bénéfices attendus

Malgré le nombre croissant d’études tentant de comprendre le sommeil paradoxal et ses fonctions physiologiques et cognitives, de nombreuses zones d’ombre persistent. A ce jour, une seule aire cérébrale a été définie comme directement impliquée dans le SP sans que son rôle exact soit clairement établi. Ce présent projet de recherche expérimentale vise donc à approfondir nos connaissances fondamentales sur le SP et préciser sa contribution fonctionnelle. Notre objectif translationel est également de développer de nouveaux modèles de souris mimant au plus près le tableau symptomatique du TCSP humain, plus pertinents pour la recherche de traitements que ceux actuellement disponibles. Le TCSP étant un biomarqueur avant courreur de la maladie de Parkinson, la compréhension de ses mécanismes neuro-pathologiques est un réel enjeu de santé publique pour tenter d’intervenir précocement chez les patients et empêcher ou à défaut retarder l’apparition de la maladie de Parkinson.

Procédures

Selon la procédure considérée, les souris seront soumises à 1 ou 2 intervention(s) chirurgicale(s) d’une durée moyenne de 90 minutes chacune, sous anesthésie réversible, pour l’infusion intracérébrale de substances pharmacologiques et la pose du dispositif d’enregistrement chronique du sommeil. Pendant toute la durée des procédures (4 semaines consécutives), les souris seront hébergées individuellement avec enrichissements. A la fin d’un protocole permettant la visualisation des neurones actifs pendant le SP (2 jours), toutes les souris seront euthanasiées sous anesthésie létale et leur cerveau prélevé pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les 3 procédures peuvent être classifiées de sévérité modérée. Les nuisances et effets indésirables envisagés sont : - Stress lié à l’isolement - Stress léger lié aux manipulations par l’expérimentateur - Dérèglement du SP sous la forme de TCSP - Inconfort au réveil à la suite des différentes chirurgies - Gêne dans les premiers jours lié au dispositif d’enregistrement des états de vigilence - Inconfort transitoire due au protocole permettant de marquer les neurones actifs lors du SP - Gêne transitoire liées à l’administration des molécules permettant de moduler l’activité des neurones

Devenir

Toutes les souris incluses dans chacune des 3 procédures seront euthanasiées afin de collecter les biopsies cérébrales pour analyses post-mortem.

Remplacement

Des animaux comme la mouche, le poisson rouge ou le vers C. elegans sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal spécifique aux mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour étudier des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques liées à des pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson. Il s’agit de recherche fondamentale supposant l’utilisation d’animaux vivants et en bonne santé. La dissection fine des réseaux neuronaux ne peut être réalisée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale et polysomnographie). Dans ce contexte, l’utilisation de la souris reste essentielle car elle est adaptée aux études physiologiques et comportementales longitudinales.

Réduction

La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Sur la base de nos nombreux travaux précédents publiés, nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe, avec 6 groupes expérimentaux, pour un total de 60 souris mâles et femelles. Ce nombre d’animaux tient compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données, des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales, de la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés et de la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps pouvant rendre leur interprétation aléatoire. De facto, le retrait de ces animaux sera requis pour garantir la validité de l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Pour minimiser le stress et maintenir les interactions sociales, les souris seront autant que possible hébergées groupées. Durant chacune des procédures, des enrichissements seront systématiquement ajoutés pour contribuer à leur bien-être. Après chaque chirurgie, elles seront hébergées en cage double pour faciliter le suivi post-opératoire (traitements médicamenteux et analgésiques si besoin) avant de les isoler dans un baril individuel pour toute la durée des expérimentations. Les produits chimiques testés seront utilisés aux plus faibles doses en se basant sur la littérature et notre expertise. Notre préoccupation quotidienne sera de détecter si l’état de santé général se dégrade subitement au cours des expérimentations. Ceci sera facilité par l’utilisation d’une grille de score de bien-être établie sur la base de critères classiques comme le poids, la mobilité, l’aspect du nid et le toilettage. Si un point limite est atteint, l’animal sera retiré des expérimentations et euthanasiés sans délai.

Choix des espèces

Le SP est une caractéristique commune aux mammifères incluant la souris, le rat et l’homme, avec une organisation anatomique cérébrale globalement très similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans) de plus en plus utilisés dans ce domaine de recherche sont cependant dépourvus de SP et donc sans pertinence pour nos travaux. Le rat a été largement utilisé dans la recherche sur le SP en raison de sa capacité à imiter les caractéristiques clés des pathologies humaines mais avec des limitations en particulier pour l’utilisation des nouveaux outils de biologie moléculaires et cellulaires. La souris permet de contourner ces limites et est de fait un modèle de choix pour la mise en œuvre d’approches génétiques et moléculaires afin de confirmer et d’approfondir nos connaissances sur le SP et ses pathologies. Des souris C57bl6 jeunes adultes de 10-12 semaines au début des procédures seront utilisées. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien veille-sommeil jour/nuit consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et dans la littérature chez la souris. Enfin, l’efficacité de la transfection neuronale par AAVs est maximale chez les souris jeunes adultes. Il s’agira de souris sauvages, mâles, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris. De plus, l’efficacité de la transfection neuronales par AAVs est maximale chez les souris juvéniles et jeunes adultes et décroit rapidement avec l’âge.