Recherche fondamentale

90 souris au système immunitaire humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules de leucémie pouvant induire une tumeur et des métastases, avec des prélèvements sanguins réguliers et une imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le porteur indique que les animaux développant des métastases douloureuses seront euthanasiés. Il qualifie ces souris humanisées d'approche "indispensable" et affirme que les interactions entre système immunitaire, pathologie et traitement ne peuvent être recréées in vitro.

Objectifs

Les lymphocytes T sont des cellules du système immunitaire qui présentent des fonctions « tueuses » puissantes et leur capacité à reconnaître et tuer spécifiquement des cellules tumorales est une promesse thérapeutique d'importance. Le but de cette expérimentation animale est de vérifier si des cellules précurseurs des lymphocyte T sont capables de migrer dans le thymus et s'y différencier afin d'acquérir les caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes T matures : c'est-à-dire, reconnaissant une cellule tumorale afin de s’activer et d’éliminer les cellules cibles l'exprimant.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T immatures peuvent au préalable être modifiés génétiquement pour leurs permettant de s'attaquer à des cellules tumorales cibles. Il s'agit donc de vérifier l'efficacité d'un modèle permettant de développer des nouvelles méthodes thérapeutiques pour guérir les cancers. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous validons en outre un modèle davantage spécifique de l'utilisateur final des ces cellules à visées thérapeutiques : l'Homme.

Procédures

Injection : 3 maximum, d'une durée de 10 à 15 secondes chacune; prélèvements sanguins : toutes les 2 semaines, d'une durée de 10 à 15 secondes chacun. Imagerie in vivo sous anesthésie générale : 5-10 minutes par souris 2 à 3 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales peut induire une tumeur et la présence de métastases.

Devenir

Les animaux ayant reçu une injection de cellules tumorales risquent de développer des métastases amenant une souffrance. Ils seront dès lors euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro ont été envisagés. Néanmoins, il n’est pas possible de recréer, in vitro, les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel (le système immunitaire), une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologies de composés à visées thérapeutiques les impliquant. Les souris aux organes humanisés constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de nouvelles thérapies.

Réduction

Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux par groupe (n=10) est réalisée sur la base de notre expérience, ainsi que sur la littérature scientifique tout en tenant compte du taux d’humanisation de 82,5%. Trois groupes sont prévus et un total de 3 études sera réalisé, au total, pour valider le modèle.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposes. A leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées a la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 3 fois par semaine. Une perte de plus de 20%, calculée à partir du poids le plus élevé sera considérée comme une raison de mise à mort. Toute anormalité non objectivable par l’échelle de score clinique devra être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NCG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de continuer sur cette espèce. La procédure expérimentale requiert des animaux entrant en étude vers l’âge de 3-4 semaines. Des animaux plus âgés présentent des taux de succès inférieurs pour la prise de greffe.

400 rats et 100 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale d'une prothèse crânienne sous anesthésie de 2 à 6 heures, puis jusqu'à une dizaine de sessions d'enregistrement, certaines en contention sur plateforme rotative, d'autres après une lésion vestibulaire provoquant des troubles de l'équilibre. Le porteur indique que la lésion vestibulaire entraîne des vertiges et une désorientation transitoires, et que les lignées modèles d'épilepsie-absence figent l'animal quelques secondes à minutes. Il affirme qu'aucune simulation ni organoïde ne reproduit ces interactions neuronales, l'euthanasie survenant entre 3 et 12 mois.

Objectifs

Le fonctionnement du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre les neurones, qui traitent l'information, et le réseau sanguin, qui répartit en permanence le soutien métabolique selon les contributions de différentes aires cérébrales. Ce couplage entre métabolisme et traitement cognitif sert de moyen d’exploration des processus cérébraux, grâce à l’imagerie des processus vasculaires et métaboliques pour identifier et comprendre les réseaux neuronaux associés à chaque comportement, activité physiologique ou pathologique. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment les différentes aires fonctionnelles du cerveau interagissent pour produire des processus cognitifs, des comportements, ou des anomalies handicapantes telles que les absences (brêves périodes de passivité associée à une perte de conscience). Ce projet associe trois axes d’analyse complémentaires : 1/Comment mesurer simultanément la dilatation des vaisseux sanguins et la charge en oxygène du sang pour estimer la charge métabolique des aires cérébrale à travers l’ensemble du cerveau ? On développe des méthodes pour la mesure du métabolisme tissulaire in vivo sur l’ensemble du cerveau de façon minimalement invasive, en combinant des moyens acoustiques et optiques. 2/L’orientation spatiale nécessite des repères visuels stables, i.e. dont le mouvement apparent est uniquement causé par les mouvements de l’animal. Comment le cerveau identifie et utilise de tels repères à partir des signaux visuels et vestibulaires ? On aborde une situation physiologique, la dynamique des réseaux impliqués dans des fonctions cognitives d’orientation spatiale, où des aires cérébrales spécialisées coopèrent pour produire une fonction intégrée. 3/Existe-t-il des marqueurs de l’activité cérébrale annonçant la survenue d’absence, et quels en sont les mécanismes déclencheurs? On explore une situation pathologique, l’épilepsie de type absence (non convulsive), où des réseaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre le comportement et figer l’animal de façon transitoire (typiquement 3s à 3min).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans ce projet apporteront une meilleure connaissance de mécanismes cérébraux physiologiques et pathologiques. D’un point de vue scientitifque on attend de mieux comprendre quelles aires cérébrales sont impliquées dans l’orientation et dans l’attention (interrompue par les absences) et globalement de mieux comprendre comment les différentes aires cérébrales spécialisées interagissent pour produire un effet de conscience. D’un point de vue technologique on développe des moyens d’observation donnant une vision étendue des liens entre mécanismes métaboliques et cognitifs. L’ensemble de ces progrès constitueront une base pour mieux comprendre et à terme traiter les pathologies impliquant l’orientation, les absences, ou les troubles métaboliques, dont l’impact sur la santé est significatif.

Procédures

Chaque animal est soumis à une unique procédure chirurgicale d'implantation d'une prothèse crânienne et d'un système d'attache permettant des mesures ultérieures non invasives (EEG, imagerie ultrasonore, imagerie optique). Cette étape est réalisée en une seule chirurgie sous anesthésie profonde d’une durée de 2-6h, suivie d’une période de récupération de 5-7 jours. Chaque animal participe ensuite à une campagne d’observation non invasive, composée au maximum d’une dizaine de sessions d’enregistrement espacées de 3 jours à 3 mois, étalée sur une durée totale maximale de 1 an. Chaque session nécessite une brêve anesthésie initiale, pour fixer le système d’enregistrement, pendant environ 30 minutes. Une fois le système attaché la session peut se dérouler de trois façons différentes : 1/L’animal est maintenu anesthésié pour la session de mesure, d’une durée maximale de 6h ; 2/L’animal réveillé reste en contention sur une plateforme rotative, pour évaluer des stimuli visuo-vestibulaires imposés, sur une durée maximale de 6h ; 3/L’animal est mobile, en restant attaché au système de mesure par un cordon léger, pour une durée d’enregistrement des mesures en continu de 6h à une semaine. Les animaux participant à l'étude de l'intégration visuo-vestibulaire sont soumis à une brève chirurgie de lésion vestibulaire (environ 30 minutes), sous anesthésie profonde, au milieu de la période d'observation. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la dernière session d'observation.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale d’implantation d’une prothèse crânienne est associée à un risque post-opératoire de douleur à traiter de façon préventive, d’infection ou de dégradation de la prothèse à surveiller. La procédure de lésion vestibulaire produit un stress lié à un défaut de sens de la verticale et des accélérations de la tête, se traduisant par des mouvements déséquilibrés de l’animal et/ou une immobilisation inhabituelle. Ce handicap est transitoire, grâce à compensation du système nerveux atteinte en une semaine environ. Les sessions d’observations avec l’animal en contention sur une plateforme rotative peuvent induire des vertiges brefs et du stress en cas de stimuli visuel et vestibulaire discordants. Les sessions d’observation sur animal éveillé peuvent produire un stress pendant la durée de la session, lié à la contention ou à la gêne occasionnée par le câble rattachant la tête au système de mesure. Les lignées établies comme modèles d’absence spontanée présentent des périodes de quelques secondes à quelques minutes pendant lesquelles l’animal est figé, interrompant son comportement pour le reprendre à la fin de l’absence. Bien que le comportement soit inhabituel pour des rongeurs il n’est pas dommageable dans le cadre sécurisé du laboratoire (notamment absence de prédateur). La rotation imposée sur une plateforme mobile, et la lésion vestibulaire provoquent des vertiges et perte d'équilibre. La récupération spontanée d'une lésion vestibulaire est de 3 jours.

Devenir

La qualité des mesures obtenues au moyen d'une prothèse crânienne permettant l'observation décroit avec le temps, ce qui ne permet pas de conserver les animaux pour obtenir plus de données. Les animaux sont gardés en vie durant au maximum 12 mois pour permettre d’obtenir des données suffisantes en qualité et quantité pour établir des observations répondant aux questions abordées par le projet. On prévoit une euthanasie entre un âge de 3 et 12 mois.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet concernent les propriétés émergentes des interactions entre assemblées de populations neuronales réparties à travers le système nerveux, en rapport avec des questions de physiologie et pathologies des mammifères. La diversité des types cellulaires, de leurs connexions, la richesse des intéractions moléculaires -d’ailleurs tous encore incomplètement décrits- font qu’il n’existe aucun moyen de simulation ou de remplacement par des organismes plus simples ou des organoïdes. En outre les mécanismes étudiés sont très dynamiques et propres aux animaux vivants, ce qui ne permet pas de les aborder sur des tissus fixés.

Réduction

On prévoit d’employer au maximum 400 rats et 100 souris sur 5 ans. Nos études déjà publiées ont montré que la bonne sensibilité des méthodes utilisées dans nos approches EEG-imagerie fonctionnelle permet typiquement de dresser un panorama de l’activité fonctionnelle et d’exhiber des variations statisiquement significatives avec un nombre limité d’animaux (par exemple sur la dynamique d’activation, la comparaison avec une situation contrôle). Ces animaux permettront d’aborder nos trois axes d’étude (méthode, orientation, absence). L’étude de méthode compare les variations temporelles des signaux cérébraux entre des activités de base et des activité induites pharmacologiquement sous anesthésie, suivant un protocol établi. L’étude sur l’orientation spatiale repose sur un groupe avec lésion vestibulaire et un groupe contrôle, tous deux soumis à des stimuli concordants ou discordants. L’étude sur les absences compare également deux groupes d’animaux, présentant des absences spontanées contre animaux contrôles. Pour réduire les effectifs, étant donné les similitudes techniques entre les procédures engagées pour ces 3 axes d’étude, des données pourront être partagées et le cas échéant des animaux pourront participer à plusieurs axes d’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés pendant 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d'humidité de l'animalerie. Les conditions de stabulations sont conformes aux standards: taille des cages, nourriture et eau ad libitum, éclairage suivant un cycle régulier jour/nuit. L'environnement est enrichi par des buchettes. Les animaux sont hébergés par groupes sauf lorsque cela représente un risque post-opératoire (détérioration des prothèses par un congénère). Le projet n’a pas de finalité associée à la douleur et ne prévoit pas l’occurrence de situation douloureuse, en dehors d’un épisode d’intensité au maximum modérée, post-opératoire sur une durée de 3 jours, pris en charge de façon systématique et anticipée. La survenue éventuelle d’autres épisodes douloureux pourrait se produire en cas de complication chirurgicale, impliquant une vigilance quotidienne. Afin de minimiser les douleurs post-opératoires les animaux recevront un traitement antalgique initié dès le début de la chirurgie. Durant toute l'étude : les animaux seront évalués quotidiennement par les zootechniciens pour des comportements tels qu'une posture ou des mouvements anormaux. En cas de comportement anormal, les animaux seront isolés et feront l'objet de soins adaptés par les expérimentateurs pendant 72h. Les animaux seront euthanasiés s'ils présentent des signes de douleur persistants ou perdent 10% ou plus de leur poids pendant cette période, selon une grille standard. L'atteinte d'un point limite exige une ou plusieurs des actions suivantes : -l'isolation et la surveillance bi-quotidienne, injection de solution glucosée en sous-cutanée en cas de dénutrition - l'administration d'un analgésique -l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les rats et souris forment un modèle des activités cérébrales et du couplage neuro-vasculaire des mammifères. Ils forment des modèles particulièrement développés pour étudier les circuits cérébraux de l’orientation spatiale, des comportements cognitifs simple et du sommeil. De plus, des lignées spécifiques (WAG/Rij, GAERS) sont des modèles de référence pour les absences. Le projet repose sur des rats et souris adultes, dès la fin du sevrage, soit un âge compris entre 4 semaines et 1 an, poids d'un animal sain (souris 10-20g, rat 150-500g). Des animaux adultes présentent un référentiel stable des capacités cognitives et du couplage neurovasculaire. Les lignées WAG/Rij et GAERS présentent des absences spontanées qui émergent dans les 2-4 semaines suivant la naissance, ce qui en fait d'excellents modèles. Les modèles rats et souris sont complémentaires : la taille du cerveau de rat est particulièrement adaptée à la technique d'imagerie ultrasonore (résolution spatiale, masse de la sonde fixée sur le tête de l'animal), la souris offre une perspective de comparaison avec un corpus d’études plus diversifié.

352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale pour injection de molécules ou implantation de fibres optiques et une chirurgie d'implantation d'un cathéter intraveineux, avant une autoadministration de cocaïne couplée à des chocs électriques de 0,5 mA que le porteur décrit comme "indolores". À la fin, le tissu cérébral est prélevé pour vérifier la précision des chirurgies. Le porteur affirme que l'addiction, "trouble du comportement", ne peut être reproduite in vitro ni in silico, le bénéfice annoncé restant une meilleure connaissance des bases neuronales de la prise de décision.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux qui traitent l'information relative aux conséquences négatives de la prise de cocaine. En effet, une hypothèses postule que la perte de contrôle de la prise de cocaine serait due au fait que certains individus ont des difficultés à associer leur prise de drogue aux conséquences néfastes sur la santé, car ces conséquences arrivent de manière retardée. Des études antérieures ont mis en lumière le circuit reliant le pallidum ventral (PV) au thalamus mediodorsal (TMD) dans les comportements de prise de cocaine. Selon les données de la littérature, ce circuit pourrait avoir un rôle clé dans la prise en compte des conséquences d'une action afin d'ajuster ses comportements futurs. L'objectif de ce projet sera donc d'évaluer le role de ce circuit dans la prise en compte des conséquences retardées de la prise de cocaïne.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de la prise en compte des conséquences tardives de la prise de cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires présentes chez les individus à risque de perdre le contrôle de leur consommation de cocaine.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale afin d'injecter les différentes molécules d'intérêt (272 sur 352 rats). Parmi eux, certains recevront également l'implantation de fibres optiques permettant l'enregistrements de l'activité neuronale (24 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure entre 45 min et 1h. De plus, la majorité des rats sera soumise à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (328 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. L'exposition au courant électrique ne dépasse pas le degré modéré. L'intensité choisie de 0,5mA durant 0,5 sec est considérée comme très faible. Il est également important de souligner que dans cette phase, les animaux ont le choix entre 2 leviers et auront donc la possibilité d’éviter le courant électrique.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie cérébrale, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Dans tous les cas nous veillerons à ce que ces nuisances soient réduites au maximum. Les courants électriques de 0,5mA sont indolores et n'engendreront pas d'effest indésirables.

Devenir

A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier la précision de nos chirurgies cérébrales mais également de prélever du tissu pour mesurer les niveaux de nos molécules d'intérêt. Aussi les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu cérébral.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Ce projet s'intéresse à la présence d'un sous groupe d'animaux (estimé à 30 pourcents des individus selon les données publiées). De plus, étant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20 pourcent en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 20 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 5 à 6 individus dans le sous groupe minoritaire. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique ainsi qu’une injection sous-cutanée de solution saline, pour favoriser la réhydratation. Une période de récupération de 7 à 10 jours est observée durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h par jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière 3 fois par semaine).

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue un modèle établi pour l'étude de l'addiction avec lequel de nombreuses données ont été obtenues par la communauté scientifique. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., age moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.

20 marmousets vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 10 à 18 heures, séparés de leur groupe puis anesthésiés pour subir jusqu'à 20 séances d'IRM, avec injection d'un agent de contraste au fer et d'un chélateur, pour comparer le traitement de la voix entre marmousets, macaques et humains. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des complications respiratoires ou cardiaques et que l'agent de contraste affecte le foie. Il revendique un bénéfice de connaissance fondamentale sur les bases cérébrales de la perception vocale, sans application médicale annoncée.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser des tests comportements en accès libre ainsi que l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les marmousets seront testés grâce à un système de test automatisé accroché à leurs cages et accessible à volonté, et ils seront scannés sous anesthésie en IRM 3T. Pour la partie comportement, deux expériences seront réalisées grâce à des boites de tests automatiques : catégorisation vocalisations par rapport à d'autres sons et discrimination du locuteur. En parallèle deux expériences seront menées dans le box expérimental : l'enregistrement des vocalisations et l'interaction vocale avec des 'singes virtuels' . Pour la partie IRMf, deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des marmousets) et comparaison inter-espèces; puis le codage normalisé de l'identité.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales et comportementales du traitement de l'information vocale chez les marmousets.

Procédures

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie. Lors de la préparation: les animaux vont être mis à jeun la veille de l'intervention (pour une durée minimale de 10 h et maximale de 18 h) et séparés de leur groupe le temps de la session (maximum 4h de séparation). L’imagerie dure environ 4h comprenant la capture de l’animal, le transport jusqu’au scanner, l’acquisition (environ 2h30), le retour à l’animalerie et la réintroduction de l’individu dans son groupe familial. Lors de l'acquisition : les animaux seront anesthésiés et pourront avoir une injection d’agent de contraste mais également être intubés si le protocole d'anesthésie ne nécessite. Après la séance : les animaux ayant eu une injection d'agent de contraste auront une injection d'un chélateur pour capturer le fer libéré dans le foie. L’injection se fait à la sortie de l’IRM quand le singe est pris en contention avant de le remettre dans sa boite de transport, elle dure environ 30 secondes. Au maximum chaque animal subira 20 sessions de scan IRM maximum espacés d’une semaine minimum.

Impact sur les animaux

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu. Cependant des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie lors de la préparation (mise à jeun, séparation de l'animal à son groupe, capture), lors de l'acquisition (l'anesthésie et ses potentielles complications respiratoires et/ou cardiaques, l'injection intraveineuse d’agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l'intubation si l'anesthésie le nécessite) et après la séance (injection d'un chélateur pour limiter l'effet de l'agent de contraste sur l'organisme et le foie en particulier).

Devenir

A la fin du projet les animaux seront gardés en vie. Ils pourront être réutilisés après avis favorable du vétérinaire désigné.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Un but essentiel de cette étude comparative est de comparer les performances comportementales et les activations cérébrales de macaques, de marmousets et d’humains de manière robuste. Or un problème majeur dans la littérature jusqu’ici est que les rares études publiées sur les marmousets, notamment en IRMf, rapportent des résultats chez un petit nombre de sujets, typiquement 2 ou 3) alors que le standard de publication pour l’IRMf humaine est d’étudier des groupes d’humains d’au moins 12 sujets permettant des analyses de groupe pour des inférences robustes au niveau de la population générale. Nous voulons dans ce projet adresser ce problème et étudier des groupes d’humains et de marmousets de taille comparable. C’est pourquoi nous prévoyons d’étudier un groupe d’une vingtaine de marmousets (les trois couples reproducteurs initiaux et leur descendance), espérant obtenir des données comportementales et IRMf chez au moins une douzaine d’entre eux, pour une comparaison statistique robuste avec une puissance comparable dans une analyse incluant humains et marmousets. Cette stratégie devrait notamment permettre une estimation puissante de la variabilité interindividuelle des performances comportementales et patrons d’activité cérébrale, un but important de ce projet, qui n’a pas encore pu être réalisée de manière adéquate chez les marmousets du fait du trop petit nombre de sujets typiquement étudié. Par ailleurs ces tailles de groupe familiaux, similaires à celles observées dans le milieu naturel, favoriseront des interactions sociales complexes qui sont une condition importante du bien-être du groupe et un facteur important pour le succès des systèmes de test automatiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes familiaux, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. La réduction du temps d’isolement du singe de sa famille permet de réduire le stress de tous les singes et également de réduire la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans son groupe familial. La modification de la mise à jeun n’affectera pas les autres animaux puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit, période durant laquelle les animaux dorment et ne s’alimentent pas. Le fait de donner la nourriture quand le singe retourne dans sa cage permet de s’assurer qu’il n’y a pas de tensions entre les individus et d’augmenter la cohésion grâce au partage de nourriture entre eux.

Choix des espèces

Cette étude comparative comparera les données du marmouset à celles observées chez l’humain et les macaques. Les raisons justifiant le choix du ouistiti sont les suivantes : Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; Les ouistitis utilisent des vocalisations complexes et variées spécifiques à chaque espèce, bien caractérisées acoustiquement. Il s'agit d’un modèle neuroscientifique hautement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires. Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. La boite de test sera en accès libre pour tous les individus de chaque cage, cependant nous n’effectuerons la procédure IRM que chez les individus jeunes adultes ou adultes (fin de la période juvénile environ 10-12 mois après la naissance). Les trois femelles reproductrices ne seront pas incluses dans la partie IRM afin de ne pas stresser les gestations ni séparer les enfants de la mère. Si un contrôle hydrique doit être mis en place pour encourager l’utilisation des systèmes de tests automatiques les femelles reproductrices et les juvéniles (

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant réalisée au deuxième jour après la naissance, pour valider des modèles de tumeur pédiatrique aujourd'hui incurable. Le porteur ne décrit qu'"un stress physique léger" lié à la manipulation avant anesthésie, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs cerveaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue la complexité tumorale in vivo et juge cette souche de souris "impossible" à remplacer.

Objectifs

Avec un taux de survie proche de zéro, les tumeurs du tronc cérébral ou DIPG sont les cancers les plus mortels chez l’enfant. L’étude de cette tumeur, toujours fatale en 2022, nécessite la validation de nouveaux modèles tumoraux et l’analyse des mécanismes responsables de son apparition.

Bénéfices attendus

Démontrer qu’une ou plusieurs des trois nouvelles lignées de tumeur du tronc cérébral forment des tumeurs chez la souris et que ces lignées constituent de bons modèles pour étudier le développement de la tumeur et ultérieurement, pour tester des médicaments.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues pour les animaux sont un stress physique léger dû à la manipulation de la cage et des animaux avant anesthésie générale.

Devenir

Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des cerveaux et leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris. Malgré tout, ces modèles pourraient ouvrir la voie au développement ultérieur de nouvelles approches ex vivo, notamment à l’aide d’organoïdes.

Réduction

Les effectifs des animaux utilisés sont déterminés et nos résultats sont analysés selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées aux animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. En ce qui concerne la manipulation des souris, celle-ci se fera en conditions stériles, sur tapis chauffant et sur des animaux sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

1. La souche de souris est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations d’hébergement. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale et la manipulation. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'ARN interférents puis, sous anesthésie, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou un test de thrombose par extériorisation des vaisseaux intestinaux pendant une heure. Le porteur indique que ces tests ne sont pas compatibles avec un réveil et que la perte de sang serait trop importante pour une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas "l'intégralité" du processus de coagulation.

Objectifs

La maladie hémorragique génétique la plus fréquente est la maladie de Willebrand qui affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. Cette pathologie est causée par des mutations sur le gène qui produit le facteur Willebrand, une protéine impliquée dans la coagulation sanguine. La maladie de Willebrand est très hétérogène et est divisée en plusieurs types et sous-types. Le sous-type 2B par exemple est caractérisé par la présence d’un facteur Willebrand anormal. Même si les mutations responsables de la maladie de Willebrand 2B ne sont présentes que sur une des copies du gène du facteur Willebrand (chaque gène est en double chez tous les individus, un qui vient de la mère et un qui vient du père), la protéine anormale va aller empêcher la protéine normale de faire son travail. Si trop peu de facteur Willebrand ou un facteur Willebrand anormal conduit à des hémorragies, à l’inverse, une quantité trop importante de facteur Willebrand entraîne un risque de thrombose ou survenue de caillots sanguins dans les vaisseaux. Dans les deux cas, il serait donc très utile de pouvoir inhiber la production de facteur Willebrand à partir d’une des deux copies du gène : soit pour empêcher la protéine anormale d’être produite (dans le premier cas), soit pour diminuer la quantité totale de facteur Willebrand (dans le deuxième cas). La difficulté est d’aller cibler spécifiquement une des deux copies du gène sans affecter l’autre. C’est donc le but de ce projet qui va consister à utiliser des inhibiteurs de la production du facteur Willebrand à partir d’une seule copie du gène. Pour cela le croisement de souris de deux souches génétiques différentes va permettre d’obtenir des souris avec deux gènes légèrement différents (reproduisant la situation humaine où les gènes reçus de ses deux parents sont différents) et ce sont ces petites différences qui vont être exploitées pour développer des inhibiteurs spécifiques d’une des copies du gène et non pas des inhibiteurs qui aboliraient totalement la production de facteur Willebrand.

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de montrer qu’il est possible de cibler une copie d’un gène directement chez un animal, ce qui important d’un point de vue preuve de concept bien au-delà de la maladie de Willebrand et 2) de déterminer si l’inhibition du gène anormal corrige les symptômes hémorragiques dans la maladie de Willebrand 2B. A long terme, le projet contribuera à renforcer l’idée de cibler le facteur Willebrand anormal dans la maladie de Willebrand dans le cadre d’une médecine personnalisée et éventuellement de réduire les quantités de facteur Willebrand chez les patients à fort risque de thrombose.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Les souris recevront une injection intraveineuse unique pour leur administrer les inhibiteurs de la production du facteur Willebrand. Quatre jours après cette injection, les souris seront anesthésiées et tout le reste de la procédure se déroulera pendant cette anesthésie. Pour toutes les souris, une prise de sang sera alors effectuée afin de mesurer divers paramètres biologiques. A la suite de la prise de sang un groupe de souris sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 10 minutes. Pour un autre groupe de souris, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans les vaisseaux intestinaux à l’aide d’un microscope. Ceci impliquera l’injection intra-veineuse d’un marqueur fluorescent sur les souris anesthésiées puis le test de thrombose sur une durée de 60 minutes, le tout sous anesthésie. Au terme des 10 minutes (pour le test de saignement) ou des 60 minutes (pour le test de thrombose), l’animal toujours sous anesthésie sera euthanasié par les méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse qui a lieu 4 jours avant les tests. La seconde partie de la procédure se fait entièrement sous anesthésie/analgésie chimique et sera sans réveil.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Les tests de thrombose impliquent d’extérioriser des vaisseaux intestinaux ce qui n’est pas compatible avec un réveil éventuel. Pour le test de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.

Réduction

Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. La mise au point et le développement des inhibiteurs a été conduit dans des modèles cellulaires afin qu’un seul d’entre eux soit testé sur des animaux. D’autre part, s’il s’avère après les premiers essais que le nombre d’animaux par groupe peut être réduit, nous adapterons les groupes suivants.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. D'autre part, nous appliquerons de manière stricte les points limites définis spécifiquement pour le projet.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui reproduit le pathologie étudiée (maladie de Willebrand 2B). Ce modèle a d’ores et déjà montré sa pertinence en tant que modèle de la pathologie humaine. Pour ce qui concerne les tests de saignement, des souris adultes jeunes (8 semaines environ) des deux sexes seront utilisées. En ce qui concerne le groupe de souris qui sera évalué dans le modèle de thrombose, des souris des deux sexes seront utilisées à un âge entre 3 et 4 semaines. Le modèle de thrombose ne peut être réalisé que sur des souris très jeunes car sinon le tissu adipeux autour des vaisseaux intestinaux empêche leur bonne visualisation sous microscope.