Recherche fondamentale

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime hyperlipidique ou contrôle pendant cinq à quinze semaines, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pouvant provoquer des signes d'hypoglycémie, puis à une échocardiographie avant euthanasie et collecte d'organes. Le projet vise surtout à tester la reproductibilité entre laboratoires européens de données sur le cœur des souris obèses. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas les régulations neuro-hormonales et conclut qu'un modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet consiste en une analyse de modèles murins avec études histologiques de divers tissus d'intérêt (cœur, rein, foie, tissu adipeux) visant à : 1/ Comparer la reproductibilité entre différents laboratoires européens des données à l'aide d'un protocole standardisé et unique sur des modèles murins de diabète de type 2 induit par l'obésité, et 2/ Mettre en place une biobanque d'échantillons sanguins et tissulaires pour réaliser des analyses multi-omiques

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité de ces données en comparant dans différents laboratoires en Europe l'impact d'un régime hyperlipidique chez les souris mâles et femelles sauvages sur la structure et la fonction cardiaques, ainsi que l'évaluation métabolique et l'impact sur d'autres organes (foie, rein, tissu adipeux).

Procédures

La moitié des animaux du projet sera soumise à un régime contrôle de 5 semaines ou de 15 semaines. L'autre moitié des animaux sera soumise à un régime hyperlipidique de 5 semaines ou de 15 semaines. A la fin du protocole expérimental, tous les animaux seront soumis à des tests métaboliques (tests de tolérance au glucose et à l'insuline) ainsi qu'à des analyses échocardiographiques, avant euthanasie et collecte de sang et d'organes. Les tests métaboliques seront réalisés une fois au début du régime et une fois à la fin du protocole. Les mesures seront réalisées à différents temps post-injection : t0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes pour une durée de quelques secondes chacune. Les échocardiographies seront réalisées une fois à la fin du protocole expérimental (environ 15 min par animal).

Impact sur les animaux

Certains animaux sont susceptibles de présenter des signes cliniques d’hypoglycémie durant les tests métaboliques (ex. inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher) ou encore une glycémie ≤ 3 mmol/l.

Devenir

A la fin du protocole expérimental, les animaux seront euthanasiés afin de procéder à une collecte multi-organes.

Remplacement

Pour ce type de projet visant à étudier l'impact de troubles métaboliques sur le remodelage et la dysfonction cardiaque, l'utilisation de modèles animaux est indispensable. Des modèles cellulaires seront utilisés en complément (cardiomyocytes de rats nouveau-nés, lignée cellulaire H9C2) afin de valider certaines cibles/voies métaboliques. En revanche, ces systèmes simplifiés ne récapitulent pas toutes les régulations neuro-hormonales d'un organisme complet, dont le rôle dans les régulations métaboliques est bien connu. En ce sens, un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en prenant en compte de l’apparition d'altérations et de la mortalité liée au vieillissement des animaux et suite à la mise sous régime HFD selon les données de la littérature. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris (sang, urine, fécès, organes). Avant sacrifice, des méthodes non invasives seront réalisées (tests cognitifs, échocardiographies, mise en cage métabolique) pour obtenir des informations sur plusieurs thématiques et disciplines (cardiaque, métabolique, physiologique, etc.). Après sacrifice, le sang sera prélevé à la veine cave et un grand nombre d’organes seront récupérés. Ce protocole permettra ainsi d’extraire un maximum de données sur le même animal et d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et pris en charge selon la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 4 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les souris seront au nombre de 5 par cage, et suivies quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress : apathie, prostration, perte de poids >20% (les souris seront pesées à leur arrivée puis toutes les semaines), agressivité, difficultés de déplacements. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés seront installés dans les cages (mouchoirs en papier, rouleaux en cartons, …).

Choix des espèces

Le développement de pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, la mise en place de pathologies cardiaques fait intervenir des systèmes hormonaux, neuro-hormonaux, des adaptations circulatoires, centrales, métaboliques, etc., si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. En outre, l'obésité étant un facteur de risque connu de dysfonction cardiaque chez l'Homme, il est intéressant de mettre en place des conditions expérimentales (facilement réalisables chez l’animal) pour étudier ces processus chez l’animal. Le modèle "souris" permet d’étudier ce phénomène dans un laps de temps court (quelques mois) et il permet l’utilisation de conditions expérimentales simples à mettre en place (régime HFD) afin d'induire ce processus, permettant des analyses précises. Les souris auront 5 mois au début de l'étude, âge auquel le développement cardiaque est terminé.

2 vaches vont être utilisées, gardées vivantes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la caillette, huit semaines de perfusions digestives continues de nutriments, puis l'obturation chirurgicale du cathéter, avec un suivi comportemental et des prises de sang pour mesurer le stress et l'inflammation. Le projet cherche à mettre au point une chirurgie moins invasive que la canule permanente du duodénum, présentée comme un raffinement au service d'études futures sur la digestion des ruminants. Le porteur affirme que les systèmes in vitro et in silico ne peuvent reproduire la répartition des nutriments entre organes et justifie le recours à l'espèce bovine.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’alternatives à l’utilisation de ruminants fistulés avec des canules permanentes pour développer de futurs essais sur la digestion et le métabolisme avec des vaches opérées par des techniques chirurgicales moins invasives. Il répond ainsi aux principes de réduction du nombre de bovins canulés de façon permanente et de raffinement des approches chirurgicales (règles des 3R). L’élevage des bovins doit faire face à de nombreux enjeux, tels que limiter les impacts environnementaux et la compétition avec l’alimentation humaine. Pour cela, il est nécessaire de bien connaitre les processus de digestion afin d’optimiser l’apport de nutriments (azotés, minéraux, vitamines) à l’animal et les processus métaboliques qui permettent à l’animal à la fois d'utiliser ces nutriments pour les différentes fonctions (immunitaire, reproduction, la synthèse de viande et de lait) et limiter leurs rejets dans l’environnement (pollutions). Du fait de la digestion microbienne dans le rumen, pour établir les recommandations sur les nutriments absorbés dans l’intestin grêle, il faut pouvoir maitriser leurs apports, ce qui ne peut se faire que par des perfusions de ces nutriments dans un compartiment post-rumen (comme la caillette ou le duodénum). L'objectif de cette demande d’autorisation est donc de soumettre à l’évaluation, une procédure chirurgicale moins lourde que la pose de la canule permanente du duodénum en la remplaçant par la pose d’un cathéter dans la caillette de petit diamètre. La chirurgie se fera sous anesthésie et analgésie locale. Une vérification de l’adéquation de la prise en charge de la douleur à la pose et de la bonne récupération des animaux à l’issue de la pose et après l’obturation du cathéter sera effectuée par un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et paramètres sanguins du stress et de l’inflammation). Une vérification de la fonctionnalité du système de perfusion des nutriments dans la caillette sur un temps comparable à un essai de perfusions de nutriments dans le duodénum sera également réalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de ce projet est de pouvoir réduire le nombre de bovins canulés du tube digestif de façon permanente et de raffiner les procédures en permettant de développer une approche chirurgicale (règles des 3R) moins invasive (anesthésie et analgésie multimodales locales vs. anesthésie et analgésie générale). Le bénéfice scientifique de la mise au point d’une telle procédure est de poursuivre le travail sur l’amélioration des systèmes d’alimentation des ruminants visant à calculer au plus juste les apports alimentaires en terme de nutriments absorbés dans l’intestin et leur effet sur le métabolisme. Ces différentes études nécessitent la connaissance / la maitrise des apports par perfusions digestives des nutriments étudiés. Pour éviter les modifications (transformations, utilisations, synthèses) dues à la digestion microbienne dans le rumen, ces perfusions doivent être réalisées dans les compartiments digestifs se situant en aval du rumen (comme la caillette équivalent de l’estomac chez les monogastriques). En effet, les recommandations alimentaires actuelles en acides aminés, vitamines et minéraux sont incomplètes en termes de composés et de situation d’élevage. Il est important, dans une démarche de transformation agroécologique des systèmes d’élevage, de pouvoir préciser les besoins des ruminants, les apports réels dans la ration, la biodisponibilité pour l’animal et le statut de déficit (carence en calcium, insuffisances en vitamine, acides aminés limitants), ou d’excès (pollutions) correspondant. Ces aspects ne peuvent être évalués qu’au travers d’expérimentations visant le plus souvent à relier des apports maitrisés de ces différents composés aux réponses de leurs biomarqueurs sanguins chez les ruminants. Ainsi, des projets sur l’étude de l’effet de certaines vitamines, minéraux et acides aminés (méthionine) sur la fourniture d’antioxydants et la santé des ruminants laitiers dans un concept d'une seule Santé (nutrition de l’animal et santé de l'animal et de l’homme par les produits laitiers) sont en cours d’évaluations. De plus, des études seront menées pour maitriser l’apports de nutriments tels que les acides aminés et le phosphore pour établir leurs recommandations tout en limitant leurs impacts environnementaux (excès d’azote ou de phosphore, deux sources de pollutions). Ces études nécessiteront le recours à l’apport de nutriments pour l’intestin par perfusions digestives dans la caillette.

Procédures

Les 2 vaches subiront 3 étapes décrites ci-dessus : - Etape 1 : Pose d'un cathéter dans la caillette sous anesthésie locale et analgésie. Dans cette procédure qui dure 14 jours, l’animal aura une intervention chirurgicale et la douleur sera gérée grâce à des antalgiques adaptés, et grâce à un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress). - Etape 2 : Perfusions digestives de nutriments sur deux vaches munies d'un cathéter dans la caillette. Ces perfusions seront réalisées en continue (24h/24) durant 4 séquences de 7 jours (soit 8 semaines, ce qui correspond aux temps de perfusions de nutriments dans le duodénum). Ces perfusions ne sont pas douloureuses, et sont réalisées sur animal vigile. - Etape 3 : Obturation du cathéter de la caillette placé en sous-cutané sous anesthésie locale. Dans cette procédure qui dure 14 jours, le suivi de la bonne cicatrisation se fera par une approche mutiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress).

Impact sur les animaux

La présence d'un cathéter de la caillette n'engendre pas de nuisance pour les animaux, une fois qu'ils ont récupéré de la chirurgie (sous anesthésie locale, anti-inflammatoire et analgésique de type dérivé morphinique). La contention physique pour la réalisation des prises de sang (via des cathéters à la jugulaire) sera brève et très légère (tenue de la tête avec un licol) par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Ce stress sera de courte durée et sans douleur pour les animaux. Lors des essais de perfusions de nutriments il existe un petit risque de développement d'un point d'infection à la sortie du cathéter au niveau de la peau. Pour pallier à ce risque, une surveillance quotidienne de cette zone sera effectuée avec un nettoyage par des antiseptiques de la zone deux fois par semaine. En cas de début d'infection, notre vétérinaire sera consulté. Ce cathéter ne peut pas être retiré car il est cousu à la caillette mais il peut être raccourci (coupé au raz de la peau) et obturé par un nœud avant d'être placé en sous-cutané. Ceci permet une cicatrisation complète de la peau au niveau du point de sortie. Pour éviter toute nuisance au moment de l'obturation du cathéter et de son placement en sous cutanée, les animaux seront de nouveau placés sous anesthésie locale et un suivi multiparamétrique sera effectué sur les jours suivants. Une fois le point de sortie du cathéter cicatrisé, nos collègues n'ont constaté aucun développement d'infection sous cutanée. Cependant, la zone sous-cutanée où se trouve placé le cathéter fera l'objet d'une surveillance hebdomadaire des animaux tout au long de leurs vies (par exemple au moment de la traite ou de l’alimentation) pour vérifier l’absence de rejets.

Devenir

A chaque étape (pose d'un cathéter à la caillette, perfusions de nutriments et obturation du cathéter en sous-cutanée) l'animal est gardé en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement utilisateur ou son délégataire.

Remplacement

Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives en remplacement de la pose de canules permanentes du duodénum, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal à ces variations de flux de nutriments digérés. Les réponses multiples des animaux en termes de digestion et répartition des nutriments entre différentes fonctions comme la synthèse de lait par la mamelle (ex : exportation de calcium dans le lait), la reconstitution des réserves (ex : calcification osseuse) et les fonctions de santé ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants ; les cultures cellulaires de différents tissus ne miment en effet pas la répartition des nutriments qui s’opère entre différents organes et fonctions. Des systèmes ayant été mis en œuvre par le passé pour étudier des phénomènes d’absorption épithéliale (type cellules ou chambres de Ussing) nécessitent d’utiliser des fragments de paroi du tube digestif fraichement prélevés mais sont peu reproductibles et donc peu utilisables pour des comparaisons entre groupes d’individus recevant des alimentations contrastées, par exemple. Leur intérêt repose plutôt pour l’étude de mécanismes biologiques d’absorption ou de transfert trans-épithélial. Enfin, les systèmes in vitro d’étude des phénomènes de digestion intestinale (comme le TIM gastro-intestinal system proposé par le TNO) ne sont pas adaptés aux modèles ruminants dont l’étape de digestion et fermentation ruminale entraine une modification trop importante du bol alimentaire pour le mimer dans un système in vitro de ce type et les spécificités des phénomènes biologiques d’absorption (liés à l’espèce ou au type de composés d’intérêt dont certains nécessitent des protéines de transport membranaires ou intracellulaires) ne sont pas transposables à des systèmes de membranes non biologiques. Compte tenu de l’absence presque totale de données dans la littérature pour certains de composés d’intérêt (vitamines par exemple), une approche in silico est actuellement impossible.

Réduction

Notre stratégie d’expérimentation est de réduire au maximum le nombre d’animaux participant à ces tests méthodologiques de raffinement des procédures chirurgicales. Pour la procédure de pose de cathéters dans la caillette, il s’agit d’adapter une technique pratiquée couramment en médecine vétérinaire, l'omentopexie, qui consiste en la fixation de la caillette sur le flanc droit. L’introduction d’un cathéter dans la caillette est pratiquée par nos collègues Canadiens (Doepel et al., 2006) qui nous ont guidé dans le développement du mode opératoire. Nous souhaitons faire la demande pour seulement 2 chirurgies pour 2 vaches, sachant que 2 autres vaches ont déjà été utilisées pour réaliser la même procédure sur un autre site. Notre vétérinaire maitrise à la fois la technique d’omentopexie et celle de poses de cathéters. Ce nombre de deux animaux a été raisonné avec notre vétérinaire pour rester faible mais suffisant pour être capable de reproduire le geste. Ainsi 4 animaux auront (2 par sites) été utilisés pour mettre au point cette nouvelle méthodologie sachant que les essais futurs nécessitant ces techniques utiliseraient également 3 à 5 animaux.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement des conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose du cathéter à la caillette, et de son obturation, le protocole médicamenteux est adapté afin de s'assurer de la prise en charge de toute douleur lors de ces actes. Pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien-être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en œuvre (au moment de la pose et de l'obturation du cathéter à la caillette) deux fois par jour de J-2, J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et des critères liés à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour vérifier si une douleur résiduelle existait malgré l’analgésie multimodale pratiquée.

Choix des espèces

Ces techniques permettront de continuer de travailler sur les recommandations alimentaires en nutriments et micronutriments des vaches dans un concept d’évolution agroécologique. En effet, il s’agit de réduire certains apports nutritionnels pour diminuer les rejets polluant pour l’environnement tout en maitrisant le volume et la qualité technologique du lait. Il s’agit aussi d’intégrer dans ces conditions le concept d’une seule santé pour l’animal et l’homme en apportant les nutriments nécessaires à une bonne santé de la vache, du veau, tout en améliorant la qualité nutritionnelle des laits pour l’homme (protéine idéale, calcium, vitamines, antioxydants, micronutriments etc.). Pour cela, des études de digestion et métabolisme de certains nutriments et métabolites spécifiques sur les vaches laitières sont requises pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes. Il faut donc travailler sur l'espèce bovine. Le troupeau est constitué de vaches Prim'Holstein, la race de vaches laitières la plus utilisée.

30 xénopes femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée et le reste réopéré à plusieurs reprises. Chacune subit une chirurgie de prélèvement d'ovocytes d'une dizaine de minutes sous anesthésie, répétée jusqu'à dix fois au cours de sa vie avec un intervalle minimal de six mois, pour étudier des systèmes de transport végétaux. Le porteur indique qu'une infection au site opératoire reste possible et que les femelles de plus de onze ans ou ayant subi dix laparotomies ne sont pas réveillées puis euthanasiées. Il qualifie l'ovocyte de xénope de modèle "indispensable" reconnu depuis plus de trente ans, difficilement remplaçable par des cellules en culture plus petites.

Objectifs

Notre laboratoire étudie les mécanismes permettant aux plantes de mieux répondre aux stress environnementaux liés notamment au changement climatique. Nous nous intéressons en particulier aux systèmes de transport membranaires nécessaires à l'acquisition et au transport d'eau et de minéraux par les plantes et les champignons vivant en symbiose avec les plantes. Pour nos travaux, l'utilisation d'ovocytes de grenouilles xénopes est cruciale. Ce système est reconnu depuis plus 30 ans comme modèle pour l'étude des transporteurs et canaux ioniques de plantes. Dans notre laboratoire, l'utilisation d'ovocytes de xénopes a par exemple contribué de manière déterminante à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des canaux potassiques végétaux impliqués dans les mouvements des stomates (pores qui assurent les échanges gazeux avec le milieu extérieur et permettent la résistance des plantes au déficit hydrique) et des aquaporines qui permettent le transport de l’eau depuis la racine. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de caractériser les systèmes de transport impliqués en combinant des approches pluridisciplinaires (génomique, biophysique, physiologie moléculaire, modélisation) pour comprendre comment les plantes coordonnent leur développement en s'adaptant aux contraintes environnementales.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes gouvernant la nutrition minérale des plantes et leur réponse aux stress environnementaux est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en Sciences des Plantes. Les résultats de nos travaux devraient notamment permettre à court terme d'avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces systèmes de transports chez la plante (conditions ioniques saturant leur activité, sélectivité, régulation de leur activité en fonction de différents stimuli environnementaux, ...), des voies de signalisation qu’ils déclenchent et des régulations cellulaires qui en résultent. A plus long terme ils pourraient contribuer au développement d’une agriculture durable, économe en ressources naturelles et respectueuse de l’environnement.

Procédures

Le projet ne comporte qu'une seule procédure permettant l'obtention d'ovocytes par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes). La durée de vie de ces animaux étant longue (une quinzaine d'années en captivité, une dizaine d'années dans notre animalerie) les femelles issues de la procédure pourront être opérées à plusieurs reprises au cours de leur vie (jusqu'à 10 fois en respectant un intervalle de repos de 6 mois au minimum entre chaque opération), en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du vétérinaire chaque année.

Impact sur les animaux

Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. Une infection au site de prélèvement restant possible, l’animal sera mis en observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères.

Devenir

La durée de vie des xénopes est longue (une quinzaine d'années). Les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 6 mois entre chaque opération et après accord du vétérinaire. Le suivi du poids de l'animal à une fréquence semestrielle et la pesée avant chaque opération permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations (5 à 10% de tolérance de perte de poids) et les animaux seront sytématiquement mis "au repos" pendant un an au moindre doute. Les animaux âgées de plus de 11 ans ou ayant subi 10 laparotomies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.

Remplacement

L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude de certaines protéines végétales permettant le passage des éléments minéraux, des sucres, des hormones au travers des membranes des cellules de la plante : les canaux ioniques et les transporteurs. Les ovocytes de xénopes sont de grosses cellules (1 mm de diamètre) capables de produire en quantité importante des protéines végétales fonctionnelles sur leur membrane qu’il est ensuite facile de caractériser, notamment car la grande taille des ovocytes rend leur manipulation simple à réaliser. De plus, cette cellule étant d'origine animale, les canaux ioniques et transporteurs animaux initialement présents dans les ovocytes sont de nature clairement différente de celle des canaux ioniques et transporteurs végétaux que nous souhaitons caractériser, et il est donc aisé de distinguer les deux. Les autres alternatives à l'expression en ovocyte de xénopes ont été envisagées et nous réaliserons, quand cela sera possible et parallèlement aux expérimentations sur ovocyte de xénopes, des études sur cellules animales en culture (non humaines) et/ou végétales. Cependant, les cellules animales en culture et les cellules végétales sont beaucoup plus petites (quelques dizaines de micromètres), ce qui nécessite d'autres savoir-faire et équipements beaucoup plus délicats à mettre en oeuvre que sur ovocytes, et engendre des temps de caractérisation rallongés d'un facteur 5 à 10. Les cellules végétales possèdent de plus une paroi autour des cellules qui rend l'accès à la membrane plasmique impossible pour des mesures directes et elles ont de plus de nombreux systèmes de transport natifs actifs sur leur membrane contrairement aux ovocytes qui sont des cellules "au repos". Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour étudier de façon précise les systèmes de transport végétaux.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (2-3 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Il pourra également être envisagé de mutualiser les opérations avec d'autres établissements utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 5000 ovocytes qui peuvent être conservés une semaine environ pour l'étude).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre du projet. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 4-5 individus (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) et en laissant à leur disposition des cachettes dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. Enfin une attention particulière sera apportée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier personnalisé de l'animal opéré. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal au vu du nombre limité d'animaux par bac. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 30 ans comme modèle de choix pour l'étude des canaux ioniques et transporteurs animaux comme végétaux. Les ovocytes permettent de réaliser facilement des études fonctionnelles car ils sont capables d’exprimer de nombreuses protéines en grande quantité qu’il est ensuite aisé de caractériser. Les autres modèles de cellules animales en culture ou de cellules végétales modifiées pour éliminer leur paroi (protoplastes), sont beaucoup plus difficiles utiliser et à mettre en oeuvre notamment en raison de leur très petite taille (de l'ordre du micromètre alors qu'un ovocyte de xénope fait un millimètre de diamètre). Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans. Les ovocytes doivent être obtenus par chirurgie et non après ponte afin que les systèmes de transport endogènes de l'ovocyte restent peu actifs (ce qui n'est pas le cas lorsque la grenouille a été stimulée par injection d'hormones pour pondre). Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire et les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser.

1 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales d'injection virale et d'implantation d'électrodes et de fibres optiques, l'implantation sous-cutanée de puces RFID, puis une exposition à la nicotine et une manipulation optogénétique de leurs circuits neuronaux. Le porteur indique que les bagarres entre animaux peuvent les blesser gravement, que les manipulations répétées peuvent diminuer leur bien-être et qu'une trop forte dose de nicotine risque une overdose. Il affirme que seul l'animal vivant permet cette étape d'intégration entre comportement social et neurophysiologie, le bénéfice annoncé visant les troubles addictifs et psychiatriques.

Objectifs

L’addiction au tabac est un problème majeur de santé publique. Cependant nous ne sommes pas tous égaux devant l’addiction et les raisons pour lesquelles nous fumons sont souvent très variées. Les mécanismes qui sous-tendent des différences de vulnérabilité, bien qu’essentiels pour comprendre pourquoi un individu devient et reste dépendant, sont peu étudiés d’un point de vue neurobiologique. Dans ce projet, nous développerons une approche intégrative pour lier les variations dans les traits individuels et la vulnérabilité aux drogues. Nous analyserons l’histoire individuelle de souris au sein d’un groupe pour étudier, sur de longues périodes, les dynamiques sociales entre congénères et les différentes stratégies utilisées dans des tâches de prise de décision. La consommation et le sevrage nicotiniques seront ensuite évalués pour lier les variations de comportements individuels observées avant exposition à la drogue et la vulnérabilité à la nicotine. Nous étudierons électrophysiologiquement comment les relations sociales et les prises de décision individuelles façonnent l’activité des circuits neuronaux impliqués dans la réponse à la nicotine et la susceptibilité à la drogue. Nous insisterons sur les circuits dopaminergiques impliqués dans la motivation et la réponse aux récompenses, ainsi que leurs innervations cholinergiques à travers les récepteurs nicotiniques. Ces circuits seront ensuite manipulés à l’aide d’outils optogénétiques, chémogénétiques ou de « modifications de l’environnement de l’animal » afin de modifier la vulnérabilité individuelle. Tous ces paramètres neuronaux et comportementaux seront des facteurs prédictifs utiles pour comprendre la mise en place des dépendances. Ce projet aborde donc le problème de l’individu face à la drogue. Cela représente un effort unique pour comprendre, à plusieurs niveaux d'analyse (de la molécule au comportement), le rôle des caractéristiques et des histoires individuelles dans le processus d’addiction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle aux substances addictives, mais aussi comment un individu adapte ses stratégies face à celles-ci, dans un milieu social. Les prises de décision dans un environnement social sont d'une importance majeure pour s'adapter à son environnement. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité dans un environnement complexe et social, notamment les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les conduites addictives, souvent favorisées par un contexte favorable à leur développement. Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique, permettra donc d'appréhender plus efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à un enjeu sociétal majeur.

Procédures

Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, mais aussi d'implantations d'électrodes d'enregistrements et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Les chirurgies d'injection durent environ 45 mins à 1h. Les chirugies d'implantation d'électrodes et de fibres aux alentours de 1h aussi. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. A leur réveil, le comportement des animaux sera évalué pour coupler la neurophysiologie et l'aspect comportemental. Des micropuces RFID seront implantées en sous-cutané pour permettre de suivre la position de l'animal au sein de l'environnement étudié. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 semaines où ceux-ci vivront en communauté dans une grande cage enrichie de 50cm sur 50cm et seront placés par 3. Pour la procédure où l'animal sera étudié seul, le comportement dans la cage durera 5 jours pour limiter l'isolement. En fin de certaines procédures, les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir. Les bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris lors du comportement en groupe. Une même souris passera dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation d'animaux. Le fait de passer dans plusieurs expériences d'affilées peut possiblement diminuer le bien-être de l'animal avec les manipulations répétées. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice. Si de tels troubles sont visibles, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. L'administration de nicotine en eau de boisson ou injection intrapéritonéale peut induire un risque d'overdose à trop forte concentration.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure si aucune autre procédure n'est nécessaire à effectuer sur ces animaux. Les animaux n'ayant effectué que du comportement seront euthanasiés. - Soit pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous devons confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité du comportement de la souris. Nous souhaitons utiliser cette méthodologie afin de mesurer de manière automatique les comportements sociaux, la hiérarchie et son incidence sur les comportements individuels ainsi que sur la susceptibilité de certains profils comportementaux à s'administrer des drogues d'abus. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Au sein du laboratoire, l'expérience sur les animaux a été préparée en amont par des méthodes ex-vivo (telle que le patch-clamp recording). Cette dernière étape d'intégration ne peut être réalisée in silico et nécessite donc de se faire sur des animaux vivants. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une litterature vaste et robuste dans des domaines similaires. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. De plus, notre projet s'inscrit dans un temps long, avec l'observation d'une même souris sur une période étirée, limitant de ce fait l'utilisation répétée d'animaux. Les effectifs d'animaux à utiliser ont été calculés au plus juste grâce à des tests de puissance statistique effectuées en amont des expériences. De plus, l'analyse de la littérature dans ce domaine, qui est vaste, nous permet d'estimer au mieux le nombre d'animaux à utiliser pour chaque expérience. Enfin, de notre propre expérience au sein du laboratoire, ayant l'habitude d'effectuer ce genre de procédures, tout ceci nous permet d'estimer un nombre juste d'animaux afin de générer des résultats consistants et interprétables.

Raffinement

Dans nos environnements, l'espace pour chaque souris, ainsi que l'enrichissement, sont supérieurs aux cages conventionelles de stabulation. La taille de la cage, les différentes zones accessibles, la présence d'un nid au centre de l'environnement ainsi que d'un levier permettant d'obtenir de la nourriture ad libitum permettent de diversifier les actions locomotrices et exploratrices des animaux, contribuant à leur bien-être. Tout ceci relève donc d'un plus grand enrichissement. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras nous permettant de monitorer à distance le comportement des animaux. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles et de points limites lors des procédures visant à réduire les éventuelles souffrances animales. Par exemple, en cas d'agression entre animaux, des soins seront apportés aux souris blessées et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Si l'animal n'a pas pu récupérer dans une temps raisonnable, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Une fois le regroupement effectué, une surveillance accrue sera effectuée pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si les comportements aggressifs persistent, la procédure sera arrêtée pour l'animal. Notre design d'électrode pour enregistrer l'activité des neurones est plus léger et moins encombrant que les autres systèmes connus et vendus sur le marché. Lors des chirurgies, certaines douleurs peuvent survenir en post-opératoire. Pour diminuer et abolir ces douleurs, des anesthésiques locaux et des anti-douleurs seront administrés. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse controlée durant la totalité de la chirurgie afin de permettre un rétablissement rapide de l'animal. Si l'animal n'a pas récupéré dans les 48h, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Un tapis chauffant sera placé sous l'animal afin d'éviter l'hypothermie.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Les récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de l’addiction clairement établis chez la souris. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de renforcement aux drogues, l’organisation anatomique est trop différent pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Enfin, notre environnement élargi et enrichi a été spécifiquement développé et adapté à l'étude de la souris. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. Avant 8 semaines, les souris sont considérées comme étant au stade adolescent. Ainsi, sachant que le comportement à cet âge est différent de l'âge adulte, et que notre étude porte sur l'âge adulte uniquement, nous éviterons d'étudier le comportement de souris avant 8 semaines. De plus, l'implantation de fibres et d'électrodes représentant une certaine charge de poids sur la tête de l'animal, nous préférons le faire une fois que ceux-ci sont plus grands et ne pas influencer leur comportement avant 8 semaines. Ainsi, les procédures qui nécessitent des injections virales uniquement se feront sur l'animal entre 4 et 6 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression). Les souris qui se verront implanter des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement subiront une chirugie à partir de 8 semaines (âge adulte pour une souris). Les expériences comportementales se feront aussi à partir de 8 semaines d'âge.