Recherche fondamentale

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit chirurgicalement une plaie cutanée sur toute l'épaisseur de la peau puis on y greffe ou non un substitut dermique, chaque animal étant maintenu isolé en cage pour éviter l'arrachage des pansements. Le porteur compare la fonctionnalité d'un nouveau substitut dermique à base de collagène à un produit commercial. La mise à mort échelonnée sert à analyser la vascularisation et la régénération du tissu cutané.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris la fonctionnalité d’un nouveau substitut dermique acellulaire à base de collagène développé selon une nouvelle technique de fabrication brevetée, en comparaison avec un substitut dermique acellulaire commercial également à base de collagène. Les substituts dermiques seront greffés sur des souris possédant un système immunitaire fonctionnel après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut dermique afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts dermiques et l’environnement de l’hôte, plus spécifiquement sa colonisation par les cellules de la souris pour le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir donc du tissu environnant de la souris lors des phases précoces de la cicatrisation. Le substitut dermique nouvellement développé devrait en effet permettre d’accélérer la mise en place de ces interactions via une colonisation plus rapide et progressive du substitut dermique et donc d’accélérer le processus de cicatrisation. Un ensemble d'analyses effectuées sur les prélèvements cutanés collectés permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité du substitut dermique nouvellement développé par rapport à un substitut dermique commercial, et d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts dermiques et l’hôte.

Bénéfices attendus

Les substituts dermiques sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes autologues (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des allogreffes (donneur et receveur de même espèce) et des xénogreffes (donneur et receveur d'espèces différentes) peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autogreffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Le développement de nouveaux substituts dermiques acellulaires biosynthétiques, ne nécessitant donc pas l’utilisation de cellules humaines ou de prélèvement de peau sur une autre partie du corps, mais permettant d’accélérer le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du tissu périlésionnel de l’hôte constitue une des nouvelles voies envisagée pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… La caractérisation des interactions cellulaires se mettant en place entre le substitut dermique et l’hôte sur l’acceptation du substitut dermique, la colonisation du substitut dermique par les cellules de la souris, la rapidité de revascularisation et de régénération du tissu cutané au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée sont des paramètres importants qui vont permettre de mieux appréhender ces phénomènes précoces lors de greffes de substituts dermiques et de valider ou d’améliorer le process de fabrication du substitut dermique acellulaire nouvellement développé.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation ou non des greffes de substitut dermique, effectuée sous anesthésie générale et sous couverture antalgique. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements, la compresse et surtout le substitut dermique.

Impact sur les animaux

L’induction de la plaie cutanée suivie ou non de la réalisation de la greffe de substitut dermique peur engendrer une souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées ou non, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le substitut dermique, l’anneau en silicone, les pansements, la compresse et la bande de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 45 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe ou non de substitut dermique pour la réalisation d'un ensemble d’analyses permettant de caractériser les interactions cellulaires se mettant progressivement en place entre le substitut dermique et l’environnement de l’hôte (réseau vasculaire et régénération du tissu cutané notamment).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts dermiques greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, revascularisation, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation ou non de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation ou non de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation et leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement. Une grille de score et des points limites adaptés à ce modèle d'étude seront suivis avec un arbre décisionnel permettant de mettre fin si nécessaire à toute souffrance des animaux. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie cutanée représentative des plaies à traiter chez l’Homme. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur étudie le rôle de la protéine PTK7 dans le potentiel métastatique du cancer colorectal pour identifier des marqueurs et des cibles thérapeutiques. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des plus fréquents en France. Il touche, chaque année, plus de 43 000 personnes et cause 17 000 décès. A l'heure actuelle, nous cherchons toujours à comprendre les mécanismes de développement tumoral et métastatique afin d'améliorer la prise en charge, le traitement et le suivi des patients atteints de cancers colorectaux. L'identification de nouveaux marqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie, ainsi que de cibles thérapeutiques qui seraient au coeur des processus tumoraux clés (initiation tumorale, dissémination dans la voie sanguine, colonisation métastatique des organes) constitue un enjeu majeur en terme de lutte contre cette maladie. Chez les patients atteints de cancers colorectaux, la protéine PTK7 a été décrite comme un facteur de mauvais pronostic. On retrouve cette protéine dans les tumeurs primaires (étape initiale) ainsi que les métastases (étape finale) chez les patients atteints de forme aggressive. Nous avons découvert que, chez ces mêmes patients, cette protéine est absente des cellules tumorales qui sont dans le sang (étape intermédiaire de dissémination). De cette observation est né le présent projet qui vise à déterminer le mécanisme de régulation transitoire de PTK7 dans les cellules tumorales. En effet, la perte de PTK7 sur les cellules cancéreuses en circulation sanguine semble primordiale dans le développement métastatique et nous voulons valider cette hypothèse afin de pouvoir déterminer comment mieux cibler cette protéine en terme de stratégie thérapeutique. Pour ce projet, nous voudrions mettre en place un modèle murin de cancer colorectal métastatique qui récapitule les observations que nous avons faites chez les patients concernant la protéine PTK7. Dans cette optique, nous utiliserons une lignée cellulaire humaine de cancer colorectal exprimant un fort taux de PTK7 que nous injecterons à des souris immuno-déficientes. Sur la base de la validation de la régulation de PTK7 dans notre modèle, nous proposons dans un second temps, de déterminer si l'absence de PTK7 est requise au niveau des celulles pour leur survie dans la circulation et la formation de métastases. Récemment nous avons mis en évidence que l'induction de la perte de PTK7 in vitro avait pour effet d'augmenter l'expression de FAK, protéine impliquée dans la survie des cellules cancéreuses. Nous prosposons, dans un troisème temps, de tester l'effet d'inhibiteurs de FAK et sa voie de signalisation sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude chez la souris, nous pourrons valider et mieux comprendre un mécanisme nouvellement identifié chez l’homme. Sur la base des données obtenues, nous aurons déterminé l’implication de PTK7 dans la pathologie cancéreuse. Nous espérons, in fine, proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but final d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers colorectaux agressifs.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. Dans le contexte du suivi des cellules tumorales circulantes, les animaux feront l’objet de prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie. La fréquence des prélèvements respectera un délai de 15 jour minimum entre deux prélèvements (3 prélèvements maximum par animal). Le geste technique ne prend pas plus de 5 minutes par animal (induction de l’anesthésie comprise). Les animaux recevant les cellules tumorales par voie intraveineuse, en vue de mimer la dissémination des cellules à des foyers distants seront injectés (dose unique) dans la veine caudale (durée 2 minutes par animal). L’administration de traitement avec des inhibiteurs se fera par voie orale(gavage) à raison de deux administrations pour chaque animal concerné (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront les cellules par injection en voie sous-cutanée, manipulation pouvant entrainer de la douleur, du stress pour les individus concernés. La greffe de cellules ainsi que le suivi par prélèvement sanguin seront effectués sous anesthésie, procédure technique qui pourra induire une angoisse chez l’animal lors de la phase l’endormissement. De plus, le suivi de l’évolution de la pathologie cancéreuse nécessitera une préhension fréquente des animaux qui pourra également être source de stress. Lors du développement tumoral, la survenue de lésions cutanées est possible au niveau des greffons de croissance avancée. Dans le contexte du suivi de l’évolution métastatique de la pathologie, les animaux développeront des foyers tumoraux distants qui pourront induire des inconforts (tels que perte de poids, difficultés respiratoires) en fonction des sites touchés. L’administration par voie orale de composés pourra entrainer un stress / un inconfort pour les animaux. La prise en compte et l’anticipation de ces nuisances (phases d’acclimatation, d’habituation à la manipulation, enrichissement dans les cages, grille de score de bien-être et soins adaptés) nous permettront d’agir au mieux afin de réduire ces effets indésirables à leur maximum et le plus précocement possible dans le contexte du suivi des animaux, sans mettre en péril les conclusions expérimentales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure concernée en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. Les organes ainsi prélevés seront analysés par imagerie optique afin d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de la caractérisation du profil d’expression de notre protéine d’intérêt dans le contexte de la pathologie cancéreuse et de son évolution métastatique.

Remplacement

Dans cet objectif, chaque fois que cela a été possible, nous avons utilisé des approches substitutives in vitro et mis en place des techniques de culture cellulaire. Ces méthodes ont toutefois des portées limitées dans leur capacité à récapituler l’ensemble du processus physiopathologique de la croissance (pousse de la tumeur initiale) à la dissémination métastatique de la maladie. Le recours au modèle in vivo se fera dans la continuité de ces approches in vitro et ne sera utilisé qu’après validation de nos hypothèses au travers de ces méthodes complémentaires.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Le recours à l’outil statistique nous a permis en outre de déterminer le nombre d’animaux suffisants mais nécessaires pour permettre de fournir des résultats significatifs.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines). De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

1 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose du foie par des injections deux fois par semaine pendant quatre à douze semaines ou par un régime gras, puis certaines subissent sous anesthésie une coupure de la queue ou une lésion du foie au laser après ouverture du ventre pour provoquer un saignement observé au microscope. Le porteur étudie le rôle de la coagulation dans la cirrhose et les saignements associés, sur des mécanismes qu'il décrit comme mal connus. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

La fibrose hépatique est une cicatrisation anormale du foie en réponse à des agressions répétées (infection par un virus, consommation excessive d'alcool, consommation excessive d'aliments gras ou sucrés (maladie du foie gras). La maladie du foie gras est la première cause de maladie du foie dans le monde, affectant 25% de la population mondiale, et est caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie puis l'apparition d'une inflammation et à terme d'une fibrose. La fibrose du foie peut progresser vers la cirrhose qui est une maladie grave responsable de 150000 décès par an en Europe. Les mécanismes de la fibrose du foie sont incomplètement compris et il n'existe à ce jour aucun traitement approuvé. La coagulation est une cascade de réaction aboutissant à la formation d'un caillot qui va permettre d’arrêter un saignement. Le foie joue un rôle central dans la coagulation car il synthétise les facteurs qui servent à coaguler. En cas de cirrhose, la production de ces facteurs est perturbée ce qui peut favoriser les saignements, notamment après une biopsie. Mieux comprendre les mécanismes qui perturbent la coagulation au cours de la cirrhose permettrait de mieux prévenir les saignements. De plus, la coagulation favorise également le développement de la fibrose du foie, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous étudions une protéine enzymatique qui inhibe la coagulation et favorise donc les saignements. Elle est produite par les plaquettes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, et sa concentration est augmentée dans le sang des patients qui ont une cirrhose. Cette protéine enzymatique protége du développement de la fibrose pulmonaire mais son rôle dans le développement de la fibrose du foie est inconnu. Les deux objectifs du projet sont de comprendre le rôle de cette protéine enzymatique dans le développement de la fibrose du foie (en général et dans la maladie du foie gras) et son rôle dans la coagulation et les saignements survenant au cours de la cirrhose.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont nombreux 1) En déterminant les mécanismes de développement de la cirrhose et fibrose du foie, nous allons potentiellement trouver de nouvelles pistes pour développer des traitements de ces maladies chez les personnes avec un foie gras mais aussi chez les personnes qui ont de la fibrose liée à un virus ou à une consommation excessive d'alcool. 2) En étudiant la coagulation de la cirrhose, nous comprendrons mieux les mécanismes complexes qui entrainent une coagulation anormale chez les patients atteints de cirrhose. Nous allons voir si bloquer une protéine de la coagulation permet de diminuer les saignements sur des modèles de souris. Si c'est efficace, cela pourrait devenir un traitement préventif des saignements qui surviennent chez les patients qui ont une cirrhose après une biopsie et cela éviterait d'avoir à transfuser les patients dans un contexte actuel où on manque de poches de sang.

Procédures

La demande d’autorisation de projet concerne les procédures suivantes Sur animal vigile : - Injections dans le ventre d'un produit deux fois par semaines pendant 4 à 12 semaines pour développer de la fibrose au niveau du foie - Mise sous régime riche en matières grasses pour créer une maladie du foie gras pendant 4 à 12 semaines. Sur animal anesthésié: - Injection dans une veine de la queue d’un anticorps (molécule qui bloque la coagulation) pour stopper les saignements sous anesthésie - Coupure de la queue pour induire un saignement sous anesthésie - Lésion avec un laser du foie après ouverture du ventre pour induire un saignement et observation des cellules qui aident à arrêter le saignement à l'aide d'un microscope sur la souris encore vivante sous anesthésie - Prélèvement de sang dans une veine du ventre puis euthanasie sous anesthésie et prélèvements des organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont - Une perte de poids initiale puis une stabilisation du poids chez les souris traitées pour induire une cirrhose - Pour les souris qui ont un régime riche en graisses, une prise de poids modérée est attendue - Des douleurs temporaires au moment de l'injection de produit dans le ventre - Possible stress les premiers jours des injections dans le ventre lié à la nouveauté de la procédure qui devrait s’estomper avec le temps - Les procédures pouvant induire des douleurs ou un stress telles que le prélèvement dans la veine du ventre, l’injection de produit dans la queue, la coupure de la queue pour induire un saignement ou les lésions du foie induites par un laser - La fibrose du foie et la cirrhose sont des maladies indolores qui n'entraînent pas d'altération du bien être animal.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées à l'issue des procédures sous anesthésie car elles ne pourront pas être maintenues en vie (car on aura prélevé plusieurs organes vitaux ou prélevé une trop grande quantité de sang).

Remplacement

La coagulation et le développement de la fibrose du foie étant des processus complexes, il n’est actuellement pas possible de remplacer totalement le modèle animal par des modèles informatiques ou des modèles de cellules en laboratoire. Néanmoins, pour limiter l'utilisation de trop de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier la coagulation sur du sang prélevé sur des malades quand cela est possible.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous incluerons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les deux groupes. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles (souris qui n'ont pas de traitement toxique pour le foie) pour plusieurs procédures. De plus, nos souris contrôles seront issues des accouplements faits pour générer les souris des différentes lignées.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien être des animaux: surveillance quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (batonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée.

Choix des espèces

Le modèle murin permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l'étude. Enfin, la fibrose du foie et la cirrhose étant des maladies multifactorielles, la proximité génétique de la souris vis à vis de l’Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 8 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l'âge auquel apparaît cette maladie chez l'homme).

911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.

Objectifs

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.

Procédures

sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique

Remplacement

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.

Choix des espèces

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel