Recherche fondamentale

Un frottis vaginal sur animal vigile, sans anesthésie pour ne pas ajouter de stress selon le porteur, ouvre le protocole en confirmant le premier jour de gestation des rates. 625 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les rates gestantes passent les 22 jours de gestation sous régime pauvre en protéines, et leurs ratons reçoivent après la naissance des injections répétées de lipopeptide dans l'abdomen, sous anesthésie gazeuse, avant des mesures de vocalisation et des IRM pour 36 d'entre eux. Le porteur mentionne dix femelles sous régime hypoprotéiné, 586 rats analysés entre 3 et 30 jours et six rats par lot expérimental, sans qu'on puisse déduire de ces nombres comment se répartissent les 625 rats demandés.

Objectifs

Les pathologies pré- et postnatales telles que le retard de croissance intra-utérin (RCIU) et l’inflammation chronique sont des facteurs de risque importants d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Mieux comprendre leurs effets est donc crucial pour identifier des approches thérapeutiques efficaces visant à minimiser ces risques. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est de comprendre et traiter les lésions induites par ces pathologies pré- et postnatales individuelles et combinées, en mettant en lien ces lésions cérébrales avec l’altération des barrières sang-cerveau que nous avons précédemment mise en évidence, et en testant l’efficacité à long terme d’agents pharmacologique neuroprotecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Less données antérieures montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions combinées à court terme. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables incluant des altérations des fonctions des interfaces sang-cerveau à long terme. Par exemple des différences de signal à P21 pourraient être visualisées en micro-IRM chez les animaux ayant subi une inflammation chronique postnatale en sus du RCIU. Les deux types de stress que nous explorons, retard de croissance intra-utérin et inflammation chronique telles qu’induite par une infection périnatale, sont des facteurs de risque reconnus d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Ces travaux évaluant un défaut de neuroprotection assurée par les interfaces sang-cerveau vont générer les données mécanistiques indispensables à l’identification d’approches thérapeutiques efficaces visant à prévenir les effets neurologiques à court et à long termes induits par ces conditions délétères.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagné ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse. Les analyses sont ensuite effectuées entre 3 et 30 jours (586 animaux). Certains animaux sont soumis à des mesures de vocalise, et des IRM qui s'effectuent également sous anesthésie gazeuse (36 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une prise de poids réduite associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. Les ratons soumis à l'exposition au lipopetide se nourrissent moins pendant les Premières 24h (augmentation de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles), différence qui disparait ensuite. Les ratons pourront être impactés par la séparation d’avec la mère pendant la période d’analyse de comportement, par les injections répétées sur plusieurs jours, ainsi que par les réveils d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à différents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance intrautérin. Par ailleurs, la circulation du liquide cérébrospinal dont le rôle est reconnu dans les processus neuroinflammatoires, en particulier comme vecteur de cellules immunes et de cytokines, ne peut être reproduite in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

- Les rates gestantes non soumises à un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle), puisque seuls les ratons subissent des traitements ultérieurs à la naissance. - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin de remplir les conditions statistiques de test de significativité réalisés précédemment pour ce type d’expérimentation. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée.

Raffinement

- Le poids des rates gestantes soumises à un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - Cette méthode est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). - Les ratons seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral journalier jusqu’à P6, puis tous les trois jours, jusqu’à P15 puis à P21 ou P30. Le traitement des animaux se fera sos anesthésie gazeuse. Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport (500 m). La cage de transport présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen, qui s'effectuera sous anesthésie gazeuse. Enfin une étude pilote sera menée pour tester si la voie sous-cutanée peut être utilisée pour l’injection de traceurs ou médicaments en place de l’injection intrapéritonéale très utilisée chez les animaux en développement mais pouvant engendrer de la variabilité et moins pertinente vis-à-vis de la médecine humaine.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats, espèce utilisée dansles APAFiS précédente. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort soit à 8 jours postnatal (P8), soit à P30. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU associés ou non à l'inflammation chronique sur l'intégrité des interfaces sang-cerveau au cours du développement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermées (Impact sur la programmation foetale, P30).

Sur 300 rats, 180 seront mis à mort et 120 orientés vers d'autres protocoles déjà autorisés, selon leur génotype, leur sexe, leur âge et ce que réclament ces protocoles. Ils relèvent de procédures d'un niveau de souffrance modéré, limitées ici au tatouage des phalanges et à un prélèvement d'oreille de 2 mm pour génotypage, sous anesthésie locale, vers l'âge de quatre semaines. Ces rats appartiennent à une lignée transgénique qui développe progressivement des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, et le porteur prévoit de limiter à dix mois l'âge des reproducteurs pour rester en deçà des déficits les plus marqués. Il retient le rat pour sa taille, qui permet selon lui de réaliser mesures physiologiques et imagerie cérébrale dans de bonnes conditions.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place et maintenir une colonie de rats présentant certaines caractéristiques de la maladie d’Alzheimer afin de disposer d’un modèle animal adapté aux futurs projets de recherche. Ces recherches visent à mieux comprendre les liens entre le sommeil, les mouvements naturels des vaisseaux sanguins du cerveau, les mécanismes d’élimination des déchets cérébraux et le développement de la maladie d’Alzheimer. Pour cela, une lignée de rats génétiquement modifiés sera importée depuis un laboratoire partenaire européen puis reproduite au sein de l’établissement utilisateur afin de produire les animaux nécessaires aux futurs projets de recherche autorisées.

Bénéfices attendus

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative fréquente dont les mécanismes restent encore partiellement compris. Les connaissances obtenues grâce à ce projet permettront d’améliorer la compréhension des liens entre le sommeil, le fonctionnement des vaisseaux sanguins cérébraux et l’accumulation de substances impliquées dans la maladie. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour la prévention, le diagnostic précoce ou le développement de stratégies thérapeutiques destinées aux patients atteints de maladie d’Alzheimer.

Procédures

À l’âge d’environ 4 semaines, chaque animal fera l’objet d’une procédure d’identification par le tatouage des phalanges et d'un génotypage réalisé au moyen d'un prélèvement auriculaire par ear punch de 2 mm, effectué au cours de la même manipulation. Une anesthésie locale par lidocaïne sera appliquée avant le prélèvement afin de limiter la douleur liée à cette procédure. L'ensemble de la manipulation dure environ 5 minutes et n'est réalisé qu'une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont principalement liés aux manipulations nécessaires au maintien de la lignée, à la reproduction, à l'identification et au génotypage des animaux. Le tatouage et le prélèvement auriculaire par punch peuvent provoquer une douleur légère et transitoire ainsi qu'un stress temporaire lié à la contention. Les mises en reproduction, les changements de cage et le sevrage des jeunes animaux peuvent également entraîner un stress de courte durée. Les animaux appartenant à cette lignée développent progressivement certaines caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Toutefois, ils seront majoritairement utilisés aux stades précoces et intermédiaires de la maladie, avant l'apparition des déficits les plus sévères. Leur état de bien-être fera l'objet d'une surveillance régulière afin de détecter rapidement toute altération de leur état général.

Devenir

A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux seront orientés selon leur génotype, leur sexe, leur âge, leur état sanitaire et les besoins d'un autre projet. Les animaux nécessaires aux expériences futures autorisées seront maintenus jusqu’à leur inclusion dans les protocoles correspondants. Les animaux WT issus des mêmes portées pourront être conservés comme contrôles ou comme reproducteurs, afin d’assurer la pérennité de la colonie. Les animaux non retenus pour les expériences ou la reproduction, ou atteignant un point limite, seront mis à mort conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

La maladie d’Alzheimer implique des mécanismes complexes faisant intervenir de nombreux systèmes biologiques, notamment les interactions entre activité cérébrale, sommeil, système vasculaire, neuroinflammation et neurodégénérescence. Des approches de remplacement seront utilisées autant que possible dans le projet, notamment des modèles in silico, des analyses de données existantes et des systèmes expérimentaux simplifiés tels que des dispositifs in vitro ou des hydrogels mimant certaines propriétés du tissu cérébral. Ces approches permettront de réduire le recours à l’animal et d’orienter les hypothèses expérimentales. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions physiologiques nécessaires à cette étude, notamment l’organisation du sommeil, les régulations vasculaires cérébrales, les interactions neurovasculaires, les réponses inflammatoires progressives et l’évolution neuropathologique dans un organisme vivant. Le recours à un modèle animal reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le modèle rat choisit est adapté à cette question car il reproduit progressivement plusieurs caractéristiques de la maladie d’Alzheimers. Le maintien de cette lignée est donc nécessaire afin de produire les animaux requis pour les expériences autorisées dans le cadre du projet.

Réduction

Les stratégies de reproduction seront organisées afin d’optimiser la production d’animaux expérimentaux tout en limitant le nombre total d’animaux produits. Les animaux WT issus des mêmes portées que les animaux transgéniques seront utilisés comme contrôles afin de limiter les biais liés à l’origine des portées et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires. Les reproductions seront planifiées de manière à obtenir des lots homogènes d’animaux correspondant aux différents groupes d’âge étudiés dans des projets de recherche autorisés à venir (3, 6 et 9 mois). Cette organisation permettra de limiter la production excédentaire d’animaux. Le génotypage des descendants permettra de sélectionner uniquement les animaux nécessaires au maintien de la lignée ou aux futurs projets expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec enrichissement du milieu, accès ad libitum à l’eau et à l’alimentation, et surveillance quotidienne par du personnel qualifié. L’état général, le poids, le comportement, l’activité, l’aspect du pelage et la présence éventuelle de chromodacryorrhée seront suivis afin de détecter précocement toute altération du bien-être. Les animaux seront manipulés régulièrement et de manière adaptée afin de limiter le stress lié à la contention, aux interventions de suivi et aux procédures réalisées dans le cadre de l’élevage. Les procédures d’identification et de génotypage seront réalisées par du personnel formé, selon les pratiques en vigueur, afin de réduire la durée de manipulation et l’inconfort. Le tatouage au doigt et la biopsie d’oreille seront réalisés avec le matériel approprié, en limitant le nombre de manipulations et en surveillant les animaux après la procédure afin de détecter toute réaction locale ou tout signe d’inconfort persistant. Une surveillance particulière des animaux reproducteurs sera mise en place, notamment chez les animaux vieillissants, afin de détecter les signes éventuellement associés au phénotype dommageable de la lignée transgénique, tels qu’une perte de poids, une modification du comportement ou une chromodacryorrhée. Dans ce projet, l’âge maximal des animaux maintenus pour la reproduction sera limité à 10 mois, ce qui réduit le risque d’apparition de déficits cognitifs ou de signes cliniques majeurs, généralement décrits à des âges plus avancés. Des points limites adaptés seront appliqués afin de permettre une prise en charge rapide des animaux présentant une altération du bien-être. Selon la situation, les mesures pourront inclure une surveillance renforcée, des soins adaptés, le retrait de la reproduction ou une mise à mort anticipée si nécessaire, afin de limiter toute souffrance inutile. Les pratiques de raffinement seront réévaluées pendant toute la durée du projet. Toute amélioration validée permettant de réduire le stress, la douleur ou l’inconfort des animaux pourra être intégrée aux procédures, en concertation avec la structure chargée du bien-être animal, les vétérinaires et le personnel compétent.

Choix des espèces

Le projet utilise des rats, incluant une lignée transgénique développant progressivement certaines caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude des interactions entre sommeil, fonctionnement des vaisseaux sanguins cérébraux et progression de la maladie. Le rat a été choisi car sa taille permet la réalisation de mesures physiologiques et d’imagerie cérébrale dans de bonnes conditions. Les animaux seront utilisés à différents âges correspondant à plusieurs étapes de l’évolution de la pathologie. Les reproducteurs seront utilisés à partir de leur maturité sexuelle, tandis que les descendants pourront être suivis jusqu’à l’âge de 10 mois, période correspondant à des stades précoces et intermédiaires de la maladie avant l’apparition des symptômes.

180 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant environ cinq heures par séance dans un dispositif qui mesure sa consommation d'oxygène puis le fait nager contre un courant dont la vitesse augmente progressivement. Chaque poisson reçoit d'abord un marquage sous la peau sous anesthésie, de dix à quinze minutes, puis vit à 20, 25 ou 30 degrés pendant une semaine ou environ deux mois selon le groupe. À chaque étape, deux poissons par aquarium sont anesthésiés profondément, saignés et mis à mort sans réveil, les autres subissant le même sort à la fin du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur justifie le choix du médaka par sa tolérance de 0 à 40 degrés, sa reproduction rapide, et par la plateforme d'élevage dont l'INRAE d'Aix-en-Provence dispose déjà.

Objectifs

Le réchauffement climatique entraîne une augmentation de la température des rivières, des lacs et des autres milieux aquatiques. Cette hausse peut avoir des conséquences importantes pour les poissons d’eau douce, car leur température corporelle dépend directement de celle de l’eau. Lorsque l’eau se réchauffe, leurs besoins en énergie et en oxygène augmentent. On ne comprend cependant pas encore complètement comment les poissons parviennent à s’adapter lorsqu'ils sont exposés à des températures élevées pendant une longue période. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux poissons de s’adapter à ces changements de température. Les chercheurs étudieront notamment la manière dont leur organisme utilise l’oxygène et produit l’énergie nécessaire à leur fonctionnement, afin de déterminer pourquoi certains poissons supportent mieux la chaleur que d’autres. Pour cela, l’étude sera réalisée sur une espèce de petit poisson appelée médaka (Oryzias latipes). Les poissons seront maintenus dans des aquariums à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Une partie des animaux sera étudiée après une semaine d’exposition, et une autre après environ deux mois, afin de comparer les effets à court et à long terme. Les chercheurs mesureront leur consommation d’oxygène, leurs capacités physiques ainsi que certains paramètres de leur sang et du fonctionnement de leurs cellules. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la capacité des poissons à s’adapter au réchauffement des eaux. Ils contribueront à mieux prévoir les effets du changement climatique sur les espèces aquatiques et pourront aider à orienter les actions de protection de ces milieux.

Bénéfices attendus

L’étude des effets du changement climatique sur les poissons d’eau douce est essentielle pour mieux comprendre et protéger les milieux aquatiques. Lorsque la température de l’eau augmente, le fonctionnement de leur organisme peut être perturbé. Cette augmentation de température entraîne également une diminution de la solubilité de l’oxygène dans l’eau, réduisant ainsi sa disponibilité pour les organismes aquatiques. Les poissons sont donc confrontés à une double contrainte physiologique : une augmentation de leurs besoins en oxygène liée à l’accélération de leur métabolisme, alors même que la quantité d’oxygène disponible dans leur environnement diminue. Toutefois, la réponse des poissons au réchauffement ne dépend pas uniquement de la disponibilité en oxygène du milieu, mais également de leur capacité à transporter, diffuser et utiliser cet oxygène au niveau des tissus.. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre comment les poissons réagissent lorsque l’eau se réchauffe. Les chercheurs étudieront la manière dont leur organisme transporte et utilise l’oxygène, depuis la respiration de l’animal jusqu’au fonctionnement de ses cellules. En mesurant leur consommation d’oxygène, en analysant certaines caractéristiques de leur sang et le fonctionnement de leurs cellules, ils chercheront à déterminer si les difficultés rencontrées à haute température sont dues à un transport insuffisant de l’oxygène, à une mauvaise utilisation de celui-ci par les cellules, ou à une combinaison de ces deux phénomènes. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre pourquoi certaines espèces supportent mieux le réchauffement que d’autres. Ils aideront à mieux prévoir les conséquences du changement climatique sur les populations de poissons et apporteront des connaissances utiles pour la protection et la gestion des écosystèmes aquatiques.

Procédures

Après leur arrivée et une période d’adaptation dans l’animalerie, les médakas seront répartis dans des aquariums maintenus à trois températures différentes : 20, 25 ou 30 °C. Chaque poisson recevra un petit marquage sous la peau, réalisé sous anesthésie, afin de pouvoir le reconnaître et suivre son évolution tout au long de l’étude. Cette intervention durera environ 10 à 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite étudiés dans un dispositif permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ils seront placés dans ce dispositif environ une à deux heures avant les mesures afin de réduire le stress lié aux manipulations. Les chercheurs mesureront d'abord leur consommation d’oxygène au repos, puis leur demanderont de nager face à un courant dont la vitesse augmentera progressivement afin d'évaluer leurs capacités physiques. Chaque séance de mesure durera environ cinq heures par poisson. Au début de l'étude, puis après une semaine et après environ deux mois d'exposition aux différentes températures, les poissons seront pesés, mesurés et soumis à ces mesures de consommation d’oxygène. À chacun de ces moments, deux poissons par aquarium seront anesthésiés profondément afin de réaliser un prélèvement de sang. Ils seront ensuite mis à mort pour permettre l'analyse de certains organes et cellules, indispensable pour comprendre comment leur organisme produit et utilise l'énergie.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes pour les poissons sont liées aux différentes manipulations nécessaires au suivi de l’étude. Ils recevront un petit marquage individuel sous anesthésie, seront régulièrement manipulés pour être pesés et mesurés, et participeront à des tests permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ces manipulations peuvent provoquer un stress temporaire, une respiration plus rapide pendant un court moment, ainsi qu'une fatigue passagère après les tests de nage. Le marquage peut également entraîner une légère irritation au niveau de la zone d’injection. Après chaque anesthésie, les poissons seront surveillés jusqu’à leur récupération complète avant d’être replacés dans leur aquarium. Les poissons seront maintenus à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Ces températures sont adaptées à cette espèce et correspondent à des conditions qu'elle peut rencontrer dans son environnement. Les changements de température seront réalisés progressivement afin de limiter le stress. La qualité de l’eau, notamment sa température, son oxygénation et ses autres paramètres, sera contrôlée régulièrement tout au long de l’étude pour garantir de bonnes conditions de vie. Les poissons seront observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Les chercheurs surveilleront notamment leur comportement, leur alimentation, leur respiration et leur façon de nager. Si un poisson présente des signes de souffrance ou un problème de santé persistant, il sera retiré de l’étude et pris en charge selon les procédures prévues. Les prélèvements de sang et de tissus seront réalisés uniquement sur des poissons profondément anesthésiés. Ils seront ensuite mis à mort sans être réveillés. L'ensemble du projet a été conçu pour limiter autant que possible le nombre de manipulations, le stress et les effets sur les animaux, tout en permettant de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude.

Devenir

À l’issue des différentes étapes expérimentales, certains poissons seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements sanguins et tissulaires indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Ces prélèvements doivent être effectués immédiatement après la mise à mort afin de préserver l’intégrité fonctionnelle des tissus et des cellules utilisés pour les analyses, notamment celles portant sur la respiration mitochondriale. Les autres poissons seront maintenus dans leurs conditions expérimentales jusqu’à la fin du protocole. Ils seront ensuite également mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses terminales prévues dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés et mis à mort a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses, conformément au principe de Réduction.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode permettant de remplacer l’utilisation de poissons vivants pour cette étude. Les chercheurs doivent observer le fonctionnement de l’animal dans son ensemble afin de comprendre comment il réagit lorsque la température de l’eau augmente. Les expériences réalisées sur des cellules ou les modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement le fonctionnement d’un organisme vivant. L’utilisation de poissons est donc indispensable pour comprendre comment ils s’adaptent au réchauffement de leur environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet tout en obtenant des résultats fiables. Les poissons seront répartis dans plusieurs aquariums et exposés à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Les mêmes poissons seront suivis tout au long de l’étude afin de réaliser plusieurs mesures sur les mêmes individus, ce qui permet de recueillir davantage d’informations sans utiliser plus d’animaux. Seul un petit nombre de poissons sera mis à mort à chaque étape de l’étude pour réaliser les analyses qui nécessitent des prélèvements de sang et de tissus. Enfin, le marquage individuel des poissons permettra de suivre chaque animal au cours de l’étude et de limiter le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les poissons sont maintenus dans des conditions adaptées à leurs besoins afin de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Ils sont élevés en groupes dans des aquariums aménagés avec des refuges et des plantes pour limiter le stress et favoriser leurs comportements naturels. Ils sont nourris quotidiennement et la qualité de l’eau est contrôlée régulièrement. Les animaux sont observés chaque jour et, en cas de problème, des mesures sont prises immédiatement. Si nécessaire, le vétérinaire est consulté et un poisson peut être isolé en aquarium de quarantaine. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé. Les procédures susceptibles d’être stressantes sont effectuées sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress. Les poissons sont manipulés avec précaution, dans un environnement calme, puis replacés dans leur aquarium après une période de récupération. Leur état est surveillé tout au long de l’étude et tout animal présentant des signes persistants de souffrance est retiré de l’expérimentation conformément aux points limites définis dans le projet.

Choix des espèces

Le médaka est un petit poisson particulièrement adapté à cette étude, car il peut vivre dans une large gamme de températures (de 0 à 40 °C). Il permet ainsi de mieux comprendre comment les poissons s’adaptent au réchauffement de leur environnement. Cette espèce se reproduit rapidement, est facile à élever et supporte bien les manipulations nécessaires à l’étude. L’INRAE d’Aix-en-Provence dispose déjà d’une plateforme d’élevage dédiée à cette espèce, avec des installations adaptées et du personnel expérimenté, garantissant de bonnes conditions d’hébergement et le bien-être des animaux.

Vingt-et-une injections sous-cutanées en trois semaines, une chirurgie crânienne d'environ cinq heures sous anesthésie générale, puis douze séances de test avec imagerie cérébrale de vingt à cent quarante minutes sur six semaines : 64 rats subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le produit administré appartient à la famille du cannabis, et il s'agit de voir comment une exposition répétée à l'adolescence modifie les connexions cérébrales et la mémoire à l'âge adulte. Le porteur qualifie ces administrations de procédures "bien tolérées" et prévoit une douleur post-opératoire de 24 à 48 heures. Tous les rats sont mis à mort à la fin, la chirurgie et le traitement cannabinoïde excluant selon lui qu'ils servent ensuite à autre chose, et les tests de mémoire qui occupent six semaines du protocole ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet vise à mettre en place et à valider une technique d’imagerie cérébrale chez le rat en mouvement libre, afin d’étudier comment une exposition répétée à des substances psychoactives (de la même famille que le cannabis) pendant l’adolescence modifie les connections entre différentes régions du cerveau et les capacités de mémorisation. Les animaux utilisés bénéficieront d’une intervention chirurgicale (réalisée sous anesthésie complète et avec traitement de la douleur) permettant l’accès à l’imagerie cérébrale, ainsi que d’administrations de substances apparentées aux cannabinoïdes, procédures considérées comme bien tolérées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment une exposition aux cannabinoïdes à l’adolescence modifie durablement les circuits cérébraux liés à la mémoire. Ces connaissances pourront contribuer à identifier des marqueurs biologiques de vulnérabilité et à informer les politiques de prévention.

Procédures

Les interventions sur les animaux comprennent : • Injections sous-cutanées répétées (21 injections sur 3 semaines, environ 5 secondes chacune) • Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement antidouleur (environ 5h), permettant l’imagerie cérébrale • 2 injections sous-cutanées post-chirurgicales (5 secondes chacune) • Sessions d’habituation (5 jours, 10 à 20 minutes par session) • 12 sessions de test comportemental avec imagerie cérébrale (20 à 140 minutes par session sur 6 semaines)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : • Douleur post-opératoire modérée (24 à 48h), prise en charge par analgésie • Douleurs brèves lors des injections sous-cutanées (quelques secondes) • Léger stress lors des séances d’imagerie cérébrale en état d’éveil (bruit modéré, changement d’environnement) • Modifications transitoires de la locomotion et de l’état général liées au traitement

Devenir

Les animaux seront mis à mort car pas de réutilisation possible dû à la chirurgie et au traitement cannabinoïde.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet d’étudier simultanément le comportement complexe, la dynamique cérébrale en mouvement libre et de manière longitudinale sur plusieurs semaines. Le recours à l’animal est indispensable.

Réduction

Cette étude pilote utilise le nombre minimal d’animaux nécessaire. Les sessions longitudinales répétées évitent de multiplier les animaux. Les animaux serviront pour plusieurs types d’expériences (imagerie et comportement).

Raffinement

La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie complètes, avec suivi post-opératoire. Une grille de score et une liste de points limites permettent d’assurer le bien-être animal et d’interrompre l’expérience ou de procéder à la mise à mort dès qu’un point limite est atteint. Des analgésiques sont utilisés pour prévenir la douleur. Des séances d’habituation à l’imagerie et au comportement sont réalisées. Les souris [rats] sont élevés en groupes sociaux avec enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est adapté à l’implantation chronique d’un dispositif d’imagerie cérébrale, offre un volume cérébral suffisant pour l’imagerie des structures d’intérêt, et montre une robustesse comportementale pour les tests de mémoire. L’effet du traitement cannabinoïde a déjà été documenté chez cette espèce. Le traitement est administré au stade adolescent (en raison de la sensibilité accrue du cerveau en développement) et les enregistrements sont réalisés au stade adulte (cerveau mature, ossature crânienne plus résistante).

625 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les rates gestantes sont soumises à un régime pauvre en protéines pendant les 22 jours de gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, dont les barrières sang-cerveau seront ensuite examinées, et les ratons reçoivent après la naissance des injections répétées de lipopeptide dans l'abdomen, sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que ces ratons se nourrissent moins pendant les premières 24 heures, avec une prise de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles, et signale aussi l'effet de la séparation d'avec la mère pendant les mesures de vocalisation et les IRM. Les petits sont mis à mort entre 3 et 30 jours pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, et le porteur écrit que l'analyse in vivo reste "incontournable" pour ce projet de recherche.

Objectifs

Les pathologies pré- et postnatales telles que le retard de croissance intra-utérin (RCIU) et l’inflammation chronique sont des facteurs de risque importants d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Mieux comprendre leurs effets est donc crucial pour identifier des approches thérapeutiques efficaces visant à minimiser ces risques. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est de comprendre et traiter les lésions induites par ces pathologies pré- et postnatales individuelles et combinées, en mettant en lien ces lésions cérébrales avec l’altération des barrières sang-cerveau que nous avons précédemment mise en évidence, et en testant l’efficacité à long terme d’agents pharmacologique neuroprotecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Less données antérieures montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions combinées à court terme. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables incluant des altérations des fonctions des interfaces sang-cerveau à long terme. Par exemple des différences de signal à P21 pourraient être visualisées en micro-IRM chez les animaux ayant subi une inflammation chronique postnatale en sus du RCIU. Les deux types de stress que nous explorons, retard de croissance intra-utérin et inflammation chronique telles qu’induite par une infection périnatale, sont des facteurs de risque reconnus d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Ces travaux évaluant un défaut de neuroprotection assurée par les interfaces sang-cerveau vont générer les données mécanistiques indispensables à l’identification d’approches thérapeutiques efficaces visant à prévenir les effets neurologiques à court et à long termes induits par ces conditions délétères.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagné ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse. Les analyses sont ensuite effectuées entre 3 et 30 jours (586 animaux). Certains animaux sont soumis à des mesures de vocalise, et des IRM qui s'effectuent également sous anesthésie gazeuse (36 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une prise de poids réduite associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. Les ratons soumis à l'exposition au lipopetide se nourrissent moins pendant les Premières 24h (augmentation de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles), différence qui disparait ensuite. Les ratons pourront être impactés par la séparation d’avec la mère pendant la période d’analyse de comportement, par les injections répétées sur plusieurs jours, ainsi que par les réveils d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à différents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance intrautérin. Par ailleurs, la circulation du liquide cérébrospinal dont le rôle est reconnu dans les processus neuroinflammatoires, en particulier comme vecteur de cellules immunes et de cytokines, ne peut être reproduite in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

- Les rates gestantes non soumises à un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle), puisque seuls les ratons subissent des traitements ultérieurs à la naissance. - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin de remplir les conditions statistiques de test de significativité réalisés précédemment pour ce type d’expérimentation. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée.

Raffinement

- Le poids des rates gestantes soumises à un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - Cette méthode est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). - Les ratons seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral journalier jusqu’à P6, puis tous les trois jours, jusqu’à P15 puis à P21 ou P30. Le traitement des animaux se fera sos anesthésie gazeuse. Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport (500 m). La cage de transport présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen, qui s'effectuera sous anesthésie gazeuse. Enfin une étude pilote sera menée pour tester si la voie sous-cutanée peut être utilisée pour l’injection de traceurs ou médicaments en place de l’injection intrapéritonéale très utilisée chez les animaux en développement mais pouvant engendrer de la variabilité et moins pertinente vis-à-vis de la médecine humaine.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats, espèce utilisée dansles APAFiS précédente. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort soit à 8 jours postnatal (P8), soit à P30. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU associés ou non à l'inflammation chronique sur l'intégrité des interfaces sang-cerveau au cours du développement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermées (Impact sur la programmation foetale, P30).

Pour comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire, 640 souris reçoivent une injection de cellules tumorales, parfois au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour prélever la tumeur, les ganglions lymphatiques drainants, le foie, la rate et le sang. Entre-temps, elles reçoivent des injections de traitements expérimentaux une à deux fois par semaine pendant deux à quatre semaines, leur tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que les souris dont la perte de poids devient importante, dont le comportement s'altère ou dont la tumeur grossit trop seront mises à mort immédiatement.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire. Dans certains cas, les défenses de l’organisme ne reconnaissent pas ou n’attaquent pas efficacement les cellules cancéreuses. L’objectif est de comprendre les mécanismes responsables de cette perte d’efficacité du système immunitaire et d’identifier des moyens de le réactiver. À terme, ce projet vise à améliorer l’efficacité des traitements existants, notamment l’immunothérapie, et à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire et le rôle des ganglions lymphatiques proches de la tumeur dans ce phénomène. Les résultats devraient : • identifier les mécanismes qui empêchent le système immunitaire d’attaquer efficacement les cellules tumorales ; • comprendre comment les tumeurs modifient leur environnement pour favoriser leur développement ; • déterminer si certaines approches thérapeutiques peuvent améliorer l’efficacité des immunothérapies en réactivant les défenses immunitaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des principaux cancers du foie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur. Dans certains cas, cette injection pourra être réalisée lors d’une intervention chirurgicale courte sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement, avec des mesures de la taille de la tumeur deux fois par semaine lorsque cela est possible. Ils recevront également des injections de traitements expérimentaux, généralement 1 à 2 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume pourront être réalisés, au maximum une fois par semaine. Chaque injection dure quelques minutes. Les interventions chirurgicales durent environ 15 à 20 minutes et sont réalisées sous anesthésie avec prise en charge de la douleur. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront des tumeurs au cours de l’étude, pouvant entraîner une gêne progressive et une altération de leur état général. Les principales nuisances attendues sont : - le développement de la tumeur, - le stress lié aux manipulations, - les injections répétées, - et, dans certains cas, les suites d’une intervention chirurgicale. L’état des animaux sera surveillé régulièrement. Des critères stricts d’arrêt seront appliqués afin d’éviter toute souffrance, notamment en cas de perte de poids importante, d’altération du comportement ou d’augmentation excessive de la taille tumorale. Dans ces situations, les animaux seront euthanasiés immédiatement.

Devenir

La mise à mort de l’ensemble des animaux est nécessaire afin de réaliser les prélèvements terminaux indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Les analyses nécessitent notamment le prélèvement de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants et d’autres tissus et organes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que le foie, la rate et le sang. Ces prélèvements permettent de caractériser conjointement la tumeur et la réponse immunitaire locale, ganglionnaire et systémique et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons recours autant que possible à des méthodes alternatives, comme des études sur des cellules en laboratoire ou l’analyse de données humaines. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre une tumeur et le système immunitaire dans un organisme vivant. L’utilisation de modèles animaux reste donc nécessaire pour répondre aux questions posées dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les expériences sont soigneusement planifiées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la validité scientifique. Plusieurs analyses sont réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les informations obtenues. De plus, certaines expériences ne sont réalisées que lorsque cela est nécessaire, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour limiter la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Leur état de santé est surveillé régulièrement tout au long de l’étude. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie lorsque cela est nécessaire, avec une prise en charge de la douleur. Des critères stricts sont définis pour arrêter l’expérience dès qu’un animal présente des signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été retenue comme espèce modèle pour ce projet en raison de sa pertinence largement démontrée dans l’étude de l’immunologie tumorale et des cancers du foie. Les modèles murins permettent d’étudier dans un organisme immunocompétent les interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques drainants, qui ne peuvent être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro. Les lignées tumorales murines utilisées sont bien caractérisées et permettent de reproduire différents phénotypes immunitaires observés chez l’homme, notamment des tumeurs pauvrement infiltrées par les cellules immunitaires. Par ailleurs, la disponibilité d’outils génétiques, immunologiques et thérapeutiques adaptés chez la souris permet d’explorer de manière contrôlée les mécanismes d’immunotolérance et d’évaluer des stratégies immunothérapeutiques pertinentes pour les cancers primitifs du foie. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent une physiologie stable et un système immunitaire mature, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales.